4-(n-бензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид (амізон) – інгібітор вірусу епштейна-барр

4-(N-бензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид (амізон) - інгібітор вірусу Епштейна-Барр. (19) (21) u200707597 (22) 06.07.2007 (24) 25.10.2007 (72) НЕСТЕРОВА Н АДІЯ ВІТАЛІЇВН А, U A, ЗАГОРОДНЯ СВІТЛАН А ДМИТРІВН А, U A, ДАНИЛЕНКО ВАЛЕНТИНА ПИЛИПІВНА, U A, БУХТІАРОВА ТЕТЯН А АН АТОЛІЇВН А, U A, БАРАНОВА ГАЛИН А ВАСИЛІВН А, U A, БОБКОВА ЛЮДМИЛА СТАНІСЛАВІВНА, UA, РИБАЛКО СВІТЛАН А ЛЕОНТІЇВН А, UA 3 27400 В якості аналога по антивірусній активності використовували Ацикловір (Acycloguanosine (lot 117F0756), молекулярна мас 225,2), виробництва Sigma, США. Амізон та Ацикловір розчиняли в середовищі RPMI-1640, фільтрували через стерилізуючі фільтри фірми "Sarstredt", Німеччина з розміром пор 0,22мкм. Робочі розведення Амізону та Ацикловіру готували на ростовому середовищі (90% середовища RPMI-1640, 5% сироватки ембріона теляти та антибіотики). Приклад 1 Визначення цитотоксичної дії препарату Для визначення рівня цитотоксичності препарату визначали цитотоксичну дозу (СД 50), тобто концентрацію препарату, яка знижує життєздатність культури клітин на 50%. Цитотоксичну концентрацію визначали в системі лімфобластоїдних клітин Rajі з використанням колориметричного МТТ (3,4,5-диметилтріазол-2іл)-2,5-дифеніл-тетрозоліум бромід) методу. Він базується на функціонуванні дигідрогеназної системи мітохондрій інтактних клітин, які в нормальних умовах переробляють штучний субстрат МТТ в формазан, який в свою чергу можна вирахува ти спектрофотометрично. Перетворення МТТ в формазан значно дозозалежно зменшується при загибелі клітин під дією вірусу або досліджуваних токсичних для клітин речовин. Даний метод широко застосовується за кордоном для визначення CD50 потенційних лікарських засобів при дослідженні цитопатичної дії вірусів in vitro. МТТ розчиняли в стерильному фосфатному буфері (рН 7,2) при кімнатній температурі в концентрації 5мг/мл та фільтрували (фільтри 0,22мкм). Особливу увагу приділяли стандартизації умов експериментів. Клітини Raji розсівали в 96 лункові культуральні планшети по 100мкл клітинної суспензії, додавали по 25мкл МТТ та інкубували 3 год. при 37°С Після інкубації клітини відмивали та ресуспендували в 96% етанолі для розчинення формазана. Результати аналізували спектрофотометрично на рідері "Dynatech" (Швеція) при довжині хвилі 570нм. Було досліджено цитотоксичну дію Амізону в діапазоні концентрації від 2820-28мкМ. Кожну концентрацію аналізували в трьох паралельних лунках з наступним вираховуванням середнього значення. В результаті проведеної роботи показано, що до концентрації 847мкМ рівень проліферації клітинної популяції знаходиться практично на рівні контрольного значення. При концентрації 2260мкМ йде поступове зменшення рівня життєздатності культури і даний показник зменшується на 48% у порівнянні з контролем. 3 метою визначення дози препарату, котра викликає 50% зниження проліферативної активності лімфобластоїдной культури клітин, був використаний регресійний аналіз. Визначали коефіцієнт кореляції, який становив - 0,97. Такий високий коефіцієнт свідчить про наявність тісного зв'язку між концентрацією препарату і рівнем його впливу на проліферацію клітин, тобто підтверджується дозозалежна дія Амізону. 4 Визначено показник CD50, котрий склав 2375мкМ, що свідчить при низьку токсичність досліджуваного препарату в системі лімфобластоїдної клітинної лінії Rajі. Результати представлено на Фіг.1. Даним методом був проаналізований препарат Ацикловір. Показано, що в концентрації 222-444мкМ йде зниження проліферативної активності клітин на 4%, потім в діапазоні 4443300мкМ даний показник залишається незмінним, в концентрації 4400мкМ він знижується ще на 4%, що у порівнянні з контролем складає 17%. Застосува вши рівняння лінійної регресії, обчислили показник CD 50, який склав 22000мкМ. Таким чином, визначені показники цитотоксичності Амізону та Ацикловіру МТТметодом, який включає колориметричне виявлення живих клітин та обчислені за допомогою лінійного регресійного аналізу CD50. Для Амізону цей показник становить 2375мкМ, для Ацикловіру - 22000мкМ. Приклад 2 Вивчення антиВЕБ активності препарату Амізон в культурі клітин Raji Для визначення антивірусної дії досліджуваного зразка було визначено ефективну дозу (ED50), тобто концентрацію, яка знижує рівень репродукції вірусу на 50%. Дослідження проводили з препаратом Амізон в концентраціях 0,071, 0,141, 0,282, 1,4, 2,82мкМ. Кожну концентрацію досліджували в трьох повторах. Препарат Амізон залишався в середовищі на протязі всього циклу дослідження. В якості аналогу по антивірусній активності використовували Ацикловір в концентраціях 2,2, 22,2, 282, 550, 1100мМ. Для визначення рівня репродукції вірусу Епштейна-Барр в досліджуваних клітинах застосовували метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Аналіз антивірусної дії препаратів здійснювали через 48 годин, оскільки дана часова точка є оптимальною як з точки зору динаміки росту клітинної лінії Raji, так і репродуктивного циклу ВЕБ. Для цього відбирали по 350000 клітин, шляхом низькошвидкісного центрифугування осаджували їх та ресуспендували в 100мкл ростового середовища без сироватки. Рівень впливу препаратів на репродукцію ВЕБ визначали за допомогою ПЛР, використовуючи "АмпліСенс-100R" ПЛР тест-систему. В якості ділянки для вірусу Епштейна-Барр було обрано ділянку геному розміром 308 нуклеотидних послідовностей, яка кодує білок VCA вірусу. Контролем були клітини, які після інфікування вірусом інкубували у ростовому середовищі без додавання речовини. Визначали відсоток інгібування рівня накопичення вірусної ДНК в оброблених досліджуваними речовинами зразках по відношенню до контрольного варіанту, значення якого приймали за 100%. Була визначена ефективна концентрація, при якій препарат зменшував рівень накопичення вірусної ДНК на 50%. Показано, що доза препарату, яка інгібує репродукцію ВЕБ на 50% (ЕД50) для Амізону 5 27400 становить 0,282мкМ, для Ацикловіру - 975мкМ (Фіг.2, 3 відповідно). Таким чином, було досліджено цитотоксичну дію Амізону у широкому діапазоні концентрацій від 2820 до 28мкМ в культурі лімфобластоїдних клітин. Зниження проліферативної активності в культурі клітин Raji на 50% визначено при додаванні 2375мкМ речовини, що відповідало значенню показника CD50. Для Ацикловіру CD50 становив 22000мкМ. При вивченні антивірусної активності препаратів Амізон і Ацикловір в культурі клітин Raji визначена їх е фективна доза ED50, тобто концентрація, яка знижує рівень репродукції вірусу Епштейна-Барр на 50%. Показано, що ЕД50 для Амізону становить 0,282мкМ, для Ацикловіру 975мкМ. Хіміотерапевтичний індекс (ХТІ), або індекс селективності (IS) визначали по співвідношенню CD50 до ЕД50. IS Амізону становив 8400, а Ацикловіру - 22,6. Амізон має більш високу антивірусну активність у порівнянні з Ацикловіром і може бути перспективним препаратом для лікування хвороб, спричинених ВЕБ. Джерела інформації: 1. Деклараційний патент на корисну модель №10889. Застосування 4-(N-бензил)амінокарбоніл1-метилпіридиній йодиду як профілактичного інгібітора цитомегаловірусної інфекції людини. 15.12.2005. Бюл. №12. 2. Кононенко В.В. Ураження нервової системи вірусом Епштейна-Барр: проблеми діагностики та лікування // Современная онкология. - 2002. - 4 №3. 3. Патент України №6752. 4-(Nбензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид знеболюючий засіб з інтерфероногенними, протизапальними та жарознижуючими властивостями. 29.12.94. Бюл. №8-1. 4. Посібник з хіміотерапії вірусних інфекцій. Під ред. Дзюблик І.В. // Київ, 2004. - 176с. 5. Серебряная Н.Б., Жилбурт Е.Б., др. Связь инфекции ВЭБ с HLA-фенотипом и особенностями цитокинового статуса у больных со злокачественными неходжинскими лимфомами // Вопр. вирусологии. - 1998. - №2. - с.79-82. 6. Kawa К. Epstein-Barr virus-associated diseases in humans // Int. J. Hematol. - 2000. - 71 №2. - p.108-117. 7. Khanna R.K., Burrows S.R. et al. Immune regulation in EBV-associated diseases. // Microbiol. Rev., - 1995 - 59, N.3. - p.387-405. 8. Pagano Joseph S. and Gershburg Edward. Epstein-Barr virus infections: prospects for treatment // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. - 2005. 56. p.277-281. 9. Practical guidelines in antiviral therapy. Edited by Charles A. B. Boucher, George J.Galasso. // Elsevier, 2002. - 344p. 6