5-[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арен як інгібітор протеїнтирозинфосфатази 1в

Реферат: 5-[Біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арен загальної формули HO HO O O P P OH OH OH X Y Y X де Х=ОН, Y=OCH2CH2CH3, як інгібітор протеїнтирозинфосфатази 1В. UA 70748 U (12) UA 70748 U HO HO O O P P OH X Y Y X X=OH, Y=OPr A OH OH UA 70748 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до органічної хімії, а саме до синтезу і вивчення нової біологічно активної сполуки 5-[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28дигідроксикалікс[4]арену, яка може бути використана в біології, фармакології та медицині. Нова запропонована сполука, спосіб її отримання, властивості і застосування в науковій літературі і патентних виданнях не описані. Фосфорилювання і дефосфорилювання тирозинових залишків білків є ключовою стадією сигнальних процесів, які регулюють ріст, проліферацію, диференціацію, метаболізм та міграцію клітин живих організмів. Порушення функцій протеїнтирозинфосфатаз (РТРаз) приводить до порушення балансу між фосфорильованими і дефосфорильованими білками, що супроводжується виникненням і перебігом ряду хвороб, включаючи рак і діабет [1-3]. Протеїнтирозинфосфатаза IB (PTP1B) здатна дефосфорилювати тирозинові залишки інсулінових рецепторів, що приводить до блокування приєднання інсуліну та наступних інсулінзалежних процесів [1-4]. Крім того, РТР1В впливає на передачу сигналу від лептину [5]. Тому інгібітори РТР1В розглядаються як ліки нової генерації від діабету 2 типу та ожиріння [1, 2]. Останнім часом спостерігається зростаючий інтерес до синтезу і подальших досліджень потенційних інгібіторів РТР1В [6, 7]. Найпершими інгібіторами РТР1В, що вивчалися in vivo, були сполуки ванадію, але фізіологічна дія цих сполук не була специфічною [8, 9]. Було також синтезовано і вивчено in vitro ряд органічних похідних карбонових, фосфонових і сульфонових кислот [10-13], гетероциклічних та інших сполук [6, 14, 15]. Хоч це й привело до виявлення потужних інгібіторів РТР1В, проте їх дослідження не вийшли за межі доклінічної стадії [1, 6]. Так, подальші тестування одного з інгібіторів під назвою "ертіпротафіб" було припинено, оскільки ця сполука впливає не лише на РТР1В, але й активує деякі рецептори клітинного ядра [16, 17]. Однією з інших причин, що стримують впровадження інгібіторів РТР1В, є низька селективність у порівнянні з іншими ферментами, особливо Т-клітинною протеїнтирозинфосфатазою (ТС-РТР), що є модулятором запальних процесів в організмі людини [18]. Раніше нами було встановлено, що ковалентне закріплення фрагментів фосфонових кислот на верхньому ободі калікс[4]арену приводить до значного зростання інгібуючої активності фосфорильованих макроциклів по відношенню до лужних фосфатаз [19, 20]. Такі сполуки можуть мати переваги через здатність утворювати комплекси з іонами металів або амінокислотними залишками білків [21] та кращу проникність через біологічні мембрани завдяки наявності ліпофільної макроциклічної платформи [22]. Подальші результати наших досліджень показали, що калікс[4]аренметиленбісфосфонові і калікс[4]аренметилфосфонові кислоти є потужними інгібіторами РТРази з Єрсинії (Yop51*) та РТР з константами інгібування в низькомікромолярному діапазоні значень [23-26]. З огляду на те, що похідні 1-гідроксиметилен-1,1-бісфосфонової кислоти, такі як алендронат або памідронат, здатні інгібувати фосфатази [27, 28], можна було сподіватися, що наявність фрагменту гідроксиметиленбісфосфонової кислоти на платформі каліксарену надасть макроциклічній сполуці властивості інгібітора РТР1В. Але до цього часу нанорозмірні каліксаренфосфонові кислоти не були синтезовані і не були досліджені як інгібітори РТР1В. Задачею корисної моделі є синтез 5-[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену (А) загальної формули HO HO O O P P OH OH OH X Y Y X X=OH, Y=OPr A 1 UA 70748 U 5 10 15 і дослідження його властивостей як інгібітора РТР1В. Структурно ця сполука через наявність фрагменту метиленбісфосфонової кислоти належить до групи калікс[4]аренметиленбісфосфонових кислот. Однак сполука (А) має в своїй структурі залишок 1гідроксиметилен-1,1-бісфосфонової кислоти, що відрізняє її від раніше відомої калікс[4]аренметилен-1,1-бісфосфонової кислоти [24]. Так як РТР1В характеризується високою гомологічністю з еукаріотичним сімейством РТРаз, інгібуючий вплив сполуки А на активність РТР1В необхідно було оцінити з огляду на його ефективність та селективність по відношенню до інших фосфатаз, особливо до Т-клітинної РТР (ТС-РТР). Сполуку (А) синтезовано у відділі фосфоранів Інституту органічної хімії НАН України. Вивчення інгібуючого впливу сполуки (А) на активність РТР1В виконано у відділі механізмів біоорганічних реакцій Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Поставлена задача вирішується розробкою методу синтезу і встановленням ефективності та селективності інгібуючого впливу 5-[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил|-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену (А) на активність людської РТР1В. 5-[Біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28-дигідроксика-лікс[4]арен (А) отримують послідовною реакцією калікс[4]аренкарбонілхлориду (Б) з тристриметилсилілфосфітом та метанолом. HO O Cl HO 1. (Me3SiO)3P 2. MeOH 30 35 40 P OH OH OH PrO Y OPr Y (А) (Б) 25 P OH OH 20 O OH OH OPr PrO O В результаті дослідження біологічних властивостей in vitro з'ясувалося, що 5[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арен (А) інгібує активність РТР1В в мікромолярному діапазоні концентрацій. За умов дослідів при використанні як субстрату n-нітрофенілфосфату (концентрація 2 мМ) значення ІС50 сполуки (А) складає 3,8±0,2 мкМ (Рис. 1). Важливим є те, що вплив запропонованого інгібітора (А) на РТР1В є значно більшим у порівнянні з впливом на інші фосфатази з тканин людини. Так, значення ІС 50 інгібування таких протеїнтирозинфосфатаз як ТС-РТР, РТР(3, LAR-PTP сполукою (А) складають 23 мкМ, 41 мкМ, 90 мкМ, відповідно. Значення ІС50 інгібування плацентарної лужної фосфатази перевищує 200 мкМ (Таблиця). Отже, інгібуючий вплив 5[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену (А) на активність людської РТР1В є селективним у порівнянні з його впливом на людські протеїнтирозинфосфатази ТС-РТР, РТР, LAR-PTP та лужну фосфатазу з плаценти людини. Таким чином, нова сполука 5-[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси26,28-дигідроксикалікс[4]арен (А) є ефективним інгібітором РТР1В і діє селективно у порівнянні з іншими РТРазами. Сполука (А) може знайти застосування в біології, фармакології і медицині при дослідженні інгібіторів РТРаз та створенні нових лікарських засобів. Корисна модель ілюструється наступними прикладами: Приклад 1. Синтез 5-[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28дигідроксикалікс[4]арену (А). Калікс[4]аренкарбонілхлорид (Б) (0,5 г, 0,875 ммоль) розчиняють в 15 мл тетрагідрофурану і до отриманого розчину додають тристриметилсилілфосфіт (0,78 г, 2,63 ммоль). Реакційну суміш перемішують при кімнатній температурі впродовж 24 год. Потім розчинник випарюють і залишок 2 UA 70748 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 висушують у вакуумі (0,05 мм рт. ст., 10 год.) при температурі 50 °C. Отриманий силіловий естер розчиняють в абсолютному метанолі (15 мл). Реакційну суміш перемішують при температурі 30 °C протягом 2 год., метанол випарюють при зниженому тиску. Залишок висушують у вакуумі (0,05 мм рт.ст.) протягом 2 год. Отримують 0,56 г калікс[4]арену (А) у 1 вигляді світлого порошку (вихід близько 93 %). Тпл. >200 °C Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6): , м.ч.: 8,41, 8,47 (два с, 1Н + 1Н, АrОН); 7,19 (с, 2 Н, м-АrН), 7,09 (м, 2Н + 2Н + 2Н, м-АrH); 6,51, 6,73 (два т, 2Н + 1Н, J 7,5 Гц, р-АrН), 4,22 (д, 4Н, J 13,2 Гц АrСН2ах), 3,93 (уш. с, 4Н, ОСH2СН2СН3), 3,15, 3,43 (два д, 4Н, J 13,2 Гц, ArCH2eq), 2,06 (м, 4Н, ОСН2СH2СН3), 1,35 (т, 6Н, J 7,5 Гц, 31 -1 + ОСН2СН2СH3). ЯМР Р (ДМСО-d6), , млн : 19,9; m/z (FAB MASS) 700,3 ([M+H] , 75 %). Приклад 2. Ефективність інгібування РТР1В 5-[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]ареном (А). Інгібуюча здатність сполуки (А) була досліджена in vitro з використанням препаратів рекомбінантної РТР1В, що були придбані у фірми "Sigma". Фермент був прототипом нетрансмембранного білка з масою 37,4 кДа, отриманого шляхом експресії в Е. соlі (1-322 амінокислотних залишків людської РТР1В). Підготовлений до роботи розчин РТР1В зберігався при -70 °C в середовищі з 45 мМ трис-НСІ (рН 8,0), 3 мМ DTT, 124 мМ NaCl, 2,4 мМ КСl, 18 мМ глутатіоном та 10 %-ним гліцерином. Реакційна суміш вміщувала 0,05 М біс-трис-буфер (рН 7,2), 100 мМ NaCI, 2,0 мМ ЕДТА, 3,0 мМ DTT та 40 нМ РТР1В і 2 мМ n-нітрофенілфосфат як субстрат (реактиви фірми "Sigma"). Загальний об'єм реакційної суміші складав 0,5 мл. Кожну пробу витримували 10 хв. при 30 °C. Реакцію розпочинали додаванням ферменту. Активність ферменту розраховували за швидкістю утворення n-нітрофенолу в результаті ферментативного гідролізу n-нітрофенілфосфату, вимірюючи оптичну густину розчину при 410 нм. Інгібітор був попередньо розчинений в системі диметилсульфоксид - вода. Вміст диметилсульфоксиду в реакційній суміші складав 1 об. %. Для визначення значення ІС50 5[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену (А) було вивчено залежність залишкової активності РТР1В від концентрації інгібітора (2 мкМ, 3,6 мкМ, 4 мкМ, 6 мкМ). Залишкову активність ферменту розраховували в процентах до активності ферменту в дослідах без інгібітора. Величина ІС 50 відповідала концентрації інгібітора, яка спричиняла зниження активності ферменту на 50 %. Обраховували середнє значення ІС 5о та стандартну похибку. Креслення демонструє залежність інгібуючої дії 5-[біс(дигідроксифосфо-рил)гідроксиметил]25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену (А) від його концентрації в реакційній суміші. Видно, що при концентрації інгібітора 4 мкМ залишкова активність ферменту складає приблизно 46 %. Зі збільшенням концентрації інгібітора до 6 мкМ інгібування ферменту перевищує 80 %. Розраховане значення ІС50 для сполуки (А) дорівнює 3,8±0,2 мкМ. Приклад 3. Селективність інгібування РТР1В 5-[біс(дигідроксифосфорил)гідрокси-метил]25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]ареном (А). Для дослідження селективності інгібування РТР1В сполукою (А) використовували такі ферменти з тканин людини: РТР1В, ТС-РТР, РТР, LAR-PTP, а також плацентарну лужну фосфатазу (Таблиця). Реакційна суміш при дослідженні інгібуючої здатності сполуки (А) на ТСРТР (30 °C) вміщувала 0,05 М біс-трис-буфер (рН 7,0), 100 мМ NaCI, 1,0 мМ EDTA, 1,0 мМ DTT, 0,8 % DMSO та 1,0 мМ n-нітрофенілфосфат як субстрат. При дослідженні інгібування РТР реакційна суміш (30 °C) складалася з 0,05 М біс-трис-буфера (рН 7,2), 100 мМ NaCI, 2,0 мМ DETA, 3,0 мМ DTT, 1 % DMSO та 2,0 мМ n-нітрофенілфосфату як субстрату. Вплив інгібітора на активність PTP-LAR досліджували при 30 °C в 0,05 М біс-трис-буфері (рН 7,2) в присутності 100 мМ NaCI, 1,0 мМ EDTA, 1,0 мМ DTT, 0,8 % DMSO та 2,0 мМ n-нітрофенілфосфату як субстрату. При дослідженні інгібування плацентарної лужної фосфатази реакційна суміш (25 °C) вміщувала 0,1 М трис-НСІ-буфер (рН 9,0), 0,25 % DMSO та 0,75 мМ n-нітрофенілфосфату. Утворення n-нітрофенолу внаслідок ферментативного гідролізу n-нітрофенілфосфату вимірювали за зростанням оптичної густини реакційної суміші при 410 нм, використовуючи -1 -1 молярний коефіцієнт абсорбції n-нітрофенолу 18300 М см . Залишкову активність ферменту оцінювали в процентах до активності ферменту в дослідах без інгібітора. Обраховували середнє значення IC50 та стандартну похибку. Таблиця Значення ІС50 5-[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28дигідроксикалікс[4]арену (А) як інгібітора РТР1В та інших РТРаз Фермент IC50, мкМ 3 Відносне значення IC50 UA 70748 U Продовження таблиці РТР1В ТС-РТР РТР PTP-LAR Лужна фосфатаза (плацентарна) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 3,8±0,2 23±1 41±10 90±9 >200 1 6 11 24 >53 Одержані результати свідчать про те, що за умов дослідів вплив 5[біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену (А) на активність РТР1В є селективним у порівнянні з іншими людськими РТРазами (ТС-РТР, РТР, PTP-LAR) і плацентарною лужною фосфатазою. Відносне значення ІС 50 для РТР1В, ТС-РТР, РТР і PTP-LAR складає 1, 6, 11, 24, відповідно. Вплив інгібітора на активність РТР1В більше ніж у 50 разів перевищує його вплив на плацентарну лужну фосфатазу. Перелік посилань: 1. Blaskovich M.A. Drug discovery and protein tyrosine phosphatases// Curr. Med. Chem.-2009. Vol. 16. - P. 2095-2176. 2. Montalibet J., Kennedy B. P. Therapeutic strategies for targeting PTP1B in diabetes// Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies.-2005. - Vol. 2, No. 2.-129-135. 3. Lessard L., Stuible M, Tremblay M. L. The two faces of PTP1B in cancer// Biochim. Biophys. Acta.-2010. - Vol. 1804. P. 613-619. 4. Yip S.-C, Saha S., Chernoff J. PTP1B: a double agent in metabolism and oncogenesis// Trends Biochem. Scienc.-2010. - Vol. 35. - P. 442-449. 5. Cheng A., Uetani N., Simoncic P.D., Chaubey V.P., Lee-Loy A., McGlade C.J., Kennedy B.P., Tremblay M.L. Attenuation of leptin action and regulation of obesity by protein tyrosine phosphatase IB// Dev. Cell.-2002. - Vol. 2, No. 4. - P. 497-503. 6. Vintonyak V.V., Antonchick A.P., Rauh D., Waldmann H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors// Curr. Opin. Chem. Biol.-2009. - Vol. 13. - P. 272-283. 7. Zhang S., Zhang Z.Y. PTP1B as a drug target: recent developments in PTP1B inhibitor discovery// Drug Discovery Today.-2007. - Vol. 12. - P. 373-381. 8. Posnera B.I., Faureb R., Burgessc W.J., Bevand A.P., Lachancee D., Zhang-Sund G., Fantusf I.G., Ne J.B., Hallg D.A., Lumg B.S., Shavers A. Peroxovanadium compounds: a new class of potent phosphotyrosine phosphatase inhibitors which are insulin mimetics// J. Biol. Chem.-1994. - Vol. 269. P. 4596-4604. 9. Fantus I.G., Tsiani E. Multifunctional actions of vanadium compounds on insulin signaling pathways: evidence for preferential enhancement of metabolic versus mitogenic effects// Моl. Cell. Biochem.-1998. - Vol. 182, No. 1-2. - P. 109-119. 10. Chen Y.T., Seto C.T. Divalent and Trivalent a-Ketocarboxylic Acids as Inhibitors of Protein Tyrosine Phosphatases// J. Med. Chem.-2002. - Vol. 45. - P. 3946-3952. 11. Zhang Z.Y. Functional studies of protein tyrosine phosphatases with chemical approaches// Biochim. Biophys. Acta.-2005. - Vol. 1754. - P. 100-107. 12. Li X., Bhandari A., Holmes C.P., Szardenings A.K. ,-Difluoro--ketophosphonates as potent inhibitors of protein tyrosine phosphatase lB// Bioorg. Med. Chem. Lett.-2004. - Vol. 14. - P. 43014306. 13. Tautz L., Mustelin T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors// Methods.-2007. - Vol. 42. - P. 250-260. 14. Kumar A., Ahmad P., Maurya R.A., Singh А.В., Srivastava A.K. Novel 2-aryl-naphtho[1,2d]oxazole derivatives as potential PTP-1B inhibitors showing antihyperglycemic activities// Eur. J. Med. Chem.-2009. - Vol. 44. - P. 109-116. 15. Lau C.K., Bayly C.I., Gauthier J.Y., Li C.S., Therien M., Asante-Appiah E., Cromlish W., Boie Y., Forghani F., Desmarais S., Wang Q., Skorey K., Waddleton D., Payette P., Ramachandran C, Kennedy B.P., Scapin G. Structure based design of a series of potent and selective non peptidic PTP1B inhibitors// Bioorg. Med. Chem. Lett.-2004. - Vol. 14. - P. 1043-1048. 16. Tobin J.F., Tarn S. Recent advances in the development of small molecule inhibitors ofPTP1B for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes// Curr. Opin. Drug Discovery Develop.2002. - Vol. 5, No. 4-P. 500-512. 17. Erbe D.V., Wang S., Zhang Y.L. et al. Ertiprotafib improves glycemic control and lowers lipids via multiple mechanisms// Моl. Pharm.-2005. - Vol. 67, No. 1. - P. 69-77. 4 UA 70748 U 5 10 15 20 25 30 35 18. Stuible M., Doody K.M., Tremblay M.L. PTP1B and TC-PTP: regulators of transformation and tumorigenesis// Cancer Metastasis Rev.-2008. - Vol. 27. - P. 215-230. 19. Vovk A., Kalchenko V., Cherenok S., Kukhar V., Muzychka O., Lozynsky M. Calix[4]arene methylenebisphosphonic acids as calf intestine alkaline phosphatase inhibitors// Org. Biomol. Chem.2004. - Vol. 2, N 21. - P. 3162-3166. 20. Cherenok S., Vovk A., Muravyova 1., Shivanyuk A., Kukhar V., Lipkowski J., Kalchenko V. Calix[4]arene a-aminophosphonic acids: asymmetric synthesis and enantioselective inhibition of an alkaline phosphatase// Org. Lett.-2006. - Vol. 8, N 4. - P. 549-552. 21. Asfari Z., Bohmer V., Harrowfield J., Vicens J. Netherlandes Eds. Calixarenes.// Kluwer Academic Publishers: Dordrecht.-2001. - P. 642. 22. Lalor R., Baillie-Johnson H., Redshaw C, Matthews S. E., Mueller A… Cellular uptake of a fluorescent calix[4]arene derivative// J. Am. Chem. Soc.-2008. - Vol. 130, N 10. - P. 2892-2893. 23. Vovk A.I., Kononets L.A., Tanchuk V.Yu., Cherenok S.O., Drapailo А.В., Kalchenko V.I., Kukhar V.P. Inhibition of Yersinia protein tyrosine phosphatase by phosphonate derivatives of calixarenes// Bioorg. Med. Chem. Lett.-2010. - Vol. 20. - P. 483-487. 24. Пат. на корисну модель № 45551, Україна, МПК С07С 15/006 C12N 9/12, А61К 31/662. Застосування 5,17-біс[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27-дипропокси-26,28дигідроксикалікс[4]арену як інгібітора протеїнтирозинфосфатази// Кононець Л.А., Вовк А.І., Танчук В.Ю., Черенок CO., Кальченко В.І., Кухар В.П. - Заявл. 06.07.2009; Опубл. 10.11.2009, Бюл. № 21. 25. Пат. на корисну модель № 48049, Україна МПК С07С 15/006 C12N 9/12, А61К 31/662. Застосування 5,11,17,23-тетракіс[(дигідроксифосфорил)метил]-25,26,27,28тетрагідроксикалікс[4]арену як інгібітора протеїнтирозинфосфатази// Кононець Л.А., Вовк А.І., Танчук В.Ю., Драпайло А.Б., Кальченко В.І., Кухар В.П. Заявл. 06.07.2009. Опубл. 10.03.2010, Бюл. № 5. 26. Пат. на корисну модель № 48050. Застосування 5,11,17,23тетракіс[(дигідроксифосфорил)метил]-25,26,27,28-тетрагідрокситіакалікс[4]арену як інгібітора гіротеїнтирозинфосфатази / Кононець Л.А., Вовк А.І., Танчук В.Ю., Драпайло А.Б., Кальченко В.І., Кухар В.П. Заявл. 06.07.2009. Опубл. 10.03.2010, Бюл. № 5. 27. Моrеlli S., Bilbao P.S., Katz S., Lezcano V., Roldan E., Boland R., Santillan G. Protein phosphatases: Possible bisphosphonate binding sites mediating stimulation of ostcoblast proliferation// Arch. Biochem. Biophys.-2011. - Vol. 507, N 2. - P. 248-253. 28. Skorey K., Ly H. D., Kelly J., Hammond M., Ramachandran C, Huang Z., Gresser M. J., Wang Q. How Does Alendronate Inhibit Protein-tyrosine Phosphatases// J. Biol. Chem.-1997. - Vol. 272, No. 36. - P. 22472-22480. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 5-[Біс(дигідроксифосфорил)гідроксиметил]-25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арен загальної формули HO HO O O P P OH OH OH X Y Y X , де Х=ОН, Y=OCH2CH2CH3, як інгібітор протеїнтирозинфосфатази 1В. 5 UA 70748 U Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6