Спосіб лікування пухлин та протипухлинна комбінація, що містить 42-складний ефір рапаміцину з 3-гідрокси-2-(гідроксиметил)-2-метилпропіоновою кислотою (ссі-779) та гемцитабін або 5-фторурацил

Даний винахід відноситься до протипухлинних комбінацій, більш конкретно, до використання комбінацій інгібітору mTOR [наприклад, 42-складний ефір_рапаміцину з 3-гідрокси-2-(гідроксиметил)-2-метілпропіонової кислотою (ССІ-779)) і антиметаболічного протипухлинного засобу для лікування пухлин. Рапаміцин є макроциклічним триєновим антибіотиком, продукованим Streptomyces hygroscopicus, що, як було виявлено, володіє протигрибковою активністю, зокрема, у відношенні до Candida albicans, як in vitro, так і in vivo [C. Vezina et al., J. Antibiot. 28, 721 (1975); S.N. Sehdal et. al, J. Antibiot. 28, 727 (1975); H.A. Baker et al., J. Antibiot. 31, 539 (1978); патент США 3929992; і патент США 3993749]. Крім того, один рапаміцин [патент США 4885171] або в сполученні з піцибанілом [патент США 4401653], як було показано, володіють протипухлинною активністю. Імунодепресивні ефекти рапаміцину були описані в [FASEB 3, 3411 (1989)]. Циклоспорин А і FK-506, інші макроциклічні молекули, також, як було показано, ефективні як імунодепресивні засоби, і тому придатні для профілактики відторгнення трансплантатів [FASEB 3, 3411 (1989); FASEB 3, 5256 (1989); R.Y. Calne et al., Lancet 1183 (1978); і патент США 5100899]. R. Martel et al. [Can. J. Physiol. Pharmacol. 55, 48 (1977)] відкрили, що рапаміцин ефективний на моделі експериментального алергійного енцефаломієліту, моделі множинного склерозу; на моделі ад'ювантного артриту, моделі ревматоїдного артриту; і ефективно придушував утворення IgE-подібних антитіл. Рапаміцин також придатний для профілактики або лікування системного червоного вовчака [патент США 5078999], запалення легень [патент США 5080899], інсулінозалежного цукрового діабету [патент США 5321009], шкірних хвороб, таких як псоріаз [патент США 5286730], захворювань кишечнику [патент США 5286731], проліферації клітин гладких м'язів і потовщення інтими після ушкодження судин [патенти США 5288711 і 5516781 ], Т-клітинної лейкемії/лімфоми дорослих [Європейська патентна заявка 525960 А1], запалення очей [патент США 5387589], злоякісних карцином [патент США 5206018], запальних захворювань серця [патент США 5496832] і анемії [патент США 5561138]. 42-складний ефір рапаміцину з 3-гідрокси-2-(гідроксиметіл)-2-метилпропіонової кислотою (ССІ-779) є складним ефіром рапаміцину, що демонструє значну пригнічуючу дію на ріст пухлини як на моделях in vitro, так і in vivo. Одержання і використання складних гідроксіефірів рапаміцину, включаючи ССІ-779, описані в патенті США 5362718. ССІ-779 виявляє цитостатичні, на противагу цитотоксичним, властивості і може сповільнювати розвиток пухлин або віддаляти час рецидиву пухлини. Як вважають, ССІ-779 має механізм дії, що подібний до механізму дії сиролімусу. ССІ-779 зв'язується й утворює комплекс із цитоплазматичним білком FKBP, що придушує фермент mTOR (мішень дії рапаміцину в ссавців, також відома, як зв'язаний із РКВР12-рапаміцином білок [FRAP]). Придушення активності mTOR-кінази пригнічує ряд шляхів передачі сигналів, включаючи стимульовану цитокінами клітинну проліферацію, трансляцію мРНК для декількох ключових білків, що регулюють Gl-фазу клітинного циклу і індуковану ІЛ-2 транскрипцію, приводячи до придушення розвитку клітинного циклу від G1 до S. Механізм дії ССІ-779, що приводить до блокування G1-S фази, є новим для протиракових ліків. In vitro ССІ-779, як було показано, придушує ріст ряду гістологічно відмінних пухлинних клітин. Серед найбільш чутливих до ССІ-779 відзначають лінії клітин раку центральної нервової системи (ЦНС), лейкемії (ТклІтинна), раку молочних залоз, раку простати і меланоми. Дана сполука зупиняє розподіл клітин у фазі G1 клітинного циклу. Дослідження in vivo на голих мишах показало, що ССІ-779 має активність проти ксенотрансплантатів людських пухлин різних гістологічних типів. Гліоми були особливо чутливі до ССІ-779, і дана сполука була активною на моделі ортотопічної гліоми на голих мишах. Викликана фактором росту (тромбоцитарним) стимуляція лінії клітин людської гліобластоми помітно придушувалася ССІ-779 in vitro. ССІ-779 також придушував ріст декількох пухлин людської підшлункової залози, а також одну з двох ліній клітин раку молочних залоз, досліджуваного in vivo. Даний винахід зв'язаний із застосуванням комбінацій інгібітору mTOR і антиметаболічного протипухлинного засобу як протипухлинної комбінованої хіміотерапії. Зокрема, ці комбінації придатні для лікування раку нирок, раку м'яких тканин, раку молочної залози, нейроендокринної пухлини легень, раку шийки матки, раку матки, раку голови і шиї, гліоми, недрібноклітинного раку легень, раку простати, раку підшлункової залози, лімфоми, меланоми, дрібноклітинного раку легень, раку яєчників, раку товстої кишки, раку стравоходу, раку шлунка, лейкемії, колоректального раку і первинного раку нез'ясованого походження. Даний винахід зв'язаний також з комбінаціями інгібітору mTOR і антиметаболічного протипухлинного засобу і з їхнім застосуванням як протипухлинної комбінованої хіміотерапії, при якій дозування або інгібітору mTOR, або антиметаболічного протипухлинного засобу, або їх обох застосовується в терапевтично субефективних дозах. Відповідно до даного винаходу термін «лікування» означає лікування ссавця, що має пухлинне захворювання, шляхом уведення даному ссавцю ефективної кількості комбінації інгібітору mTOR і антиметаболічного протипухлинного засобу з метою придушення росту пухлини в такого ссавця, ліквідації пухлини або тимчасового полегшення стану ссавця. Відповідно до даного винаходу термін «забезпечення» у відношенні забезпечення комбінації означає або безпосереднє введення комбінації, або введення проліків, похідного або аналога одного компонента або обох компонентів комбінації, з якого в організмі буде утворюватися ефективна кількість комбінації. mTOR є мішенню дії рапаміцину в ссавців, відомої також, як зв'язаний із FKBP12-рапаміцином білок [FRAP]. Придушення активності mTOR-кінази пригнічує ряд шляхів передачі сигналу, включаючи викликувану цитокінами проліферацію клітин, трансляцію мРНК для декількох ключових протеїнів, що регулюють Gl-фазу клітинного циклу, і викликувану ІЛ-2 транскрипцію, що приводить до придушення розвитку клітинного циклу від G1 до S. mTOR регулює активність щонайменше двох білків, що беруть участь у трансляції специфічних регуляторних протеїнів клітинного циклу [Burnett, P.E., PNAS 95: 1432 (1998) і Isotani, S., J. Biol. Chem. 274: 33493 (1999)]. Один з цих білків, р70з6-кіназа, фосфорилюється mTOR по серину 389, а також треоніну 412. Це фосфорилювання можна спостерігати в клітинах, оброблених фактором росту за допомогою вестернблотингу цільних клітинних екстрактів цих клітин зі специфічними антитілами до фосфосеринового залишку 389. Відповідно до даного винаходу «інгібітор mTOR» означає сполуку або ліганд, що придушує реплікацію клітин блокуванням розвитку клітинного циклу від G1 до S шляхом придушення фосфорилювання серину 389 у р70з6-кіназі mTOR. Наступна стандартна процедура фармакологічного дослідження може використовуватися для визначення того, чи є сполука інгібітором mTOR, якому дане визначення в даному описі. Обробка стимульованих фактором росту клітин інгібітором mTOR, подібним рапаміцину, цілком блокує фосфорилювання серину 389, що показано методом вестерн-блотингу, і як така являє собою добре дослідження на придушення mTOR. Так, цільні клітинні лізати з клітин, стимульованих фактором росту (наприклад, IGF1) у культурі в присутності інгібітору mTOR не повинні давати смугу на акриламідному гелі, яку можна позначити специфічними антитілами до серину 389 у p70s6K. Матеріали: Буфер для зразка для NuPAGE LDS Відновлювальний засіб для зразка для NuPAGE 4-12% біс-трис гель для NuPAGE Буфер, що рухається, для NuPAGE з MOPS і SDS Нітроцелюлоза Буфер, що переносить, для NuPAGE Hyperfilm ECL Реагент для проявлення Вестернблотингу ECL (NovexCat#NP0007) (NovexCat#NP0004) (NovexCat#NP0321) (NovexCat#NP0001) (NovexCat#LC2001) (NovexCat#NP0006) (Amersham Cat # RPN3114H) (Amersham Cat # RPN2134) Первинне антитіло: Фосфо-р70 86-кіназа (Thr389) (Cell Signalling Cat # 9205) Вторинне антитіло: Козячі антитіла проти кон'югата кролячий IgG-HRP (Santa Cruz Cat # sc-2004) Методи: А. Одержання клітинних лізатів Лінії клітин вирощували на оптимальному основному середовищі, доповненому 10% ембріональною бичачою сироваткою і пеніциліном/стрептоміцином. Для дослідження на фосфорилювання клітини субкультивували в 6-лункових планшетах. Після того, як клітини повністю прикріплювалися, їх у кожному випадку позбавляли сироватки. Обробка інгібіторами mTOR коливалася в межах від 2 до 16 годин. Після обробки лікарським препаратом клітини промивали один раз ЗФФР (забуференним фосфатом фізіологічний розчин без Мд-н- і Са++) і потім лізували в 150-200мкл буфера для зразка для NuPAGE LDS на ямку. Лізати протягом короткого інтервалу часу обробляли ультразвуком і потім центрифугували протягом 15 хвилин при 14000 об./хв. Лізати зберігали при -80°С до використання. Процедура дослідження може бути також проведена шляхом інкубації клітин у ростовому середовищі протягом ночі, після чого вони повністю прилипали. Результати при обох сполученнях умов повинні бути для інгібітору mTOR однаковими. В. Аналіз методом вестерн-блотингу 1) Готують сумарні зразки білка шляхом внесення 22,5 мкл лізату в пробірку, і потім додають 2,5мкл NuPAGE засобу, що відновлює, для зразка для NuPAGE. Прогрівають зразки при 70°С протягом 10 хвилин. Проводять електрофорез, використовуючи гелі NuPAGE і буфери для NuPAGE SDS. 2) Переносять гель на нітроцелюлозну мембрану за допомогою переносного буфера для NuPAGE. Мембрану блокують протягом 1 години блокуючим буфером (забуферений трис-буфером фізіологічний розчин з 0,1% Tween і 5% нежирного молока). Промивають мембрани 2* буфером, що відмиває, (забуферений трис-буфером фізіологічний розчин з 0,1% Tween). 3) Блот/мембрани інкубують з первинним антитілом Р-р70 S6K (Т389) (1:1000) у блокуючому буфері протягом ночі при 4°С на обертаючій платформі. 4) Блоти промивають 3x протягом 10 хвилин, кожний, буфером, що відмиває, і інкубують із вторинним антитілом (1:2000) у буфері, що блокує, протягом 1 години при кімнатній температурі. 5) Після зв'язування вторинного антитіла блоти промивають 3х протягом 10 хвилин, кожний, буфером, що відмиває, і 2* протягом 1 хвилини, кожен, забуференим трис-буфером фізіологічним розчином з наступним хемілюмінесцентним (ECL) визначенням, і потім піддають впливу хемілюмінесцентних плівок. Відповідно до даного винаходу термін «рапаміцин» визначає клас імунодепресивних сполук, що містять основне рапаміциновое ядро (показане нижче). Рапаміцини відповідно до винаходу містять у собі сполуки, що можуть бути хімічно або біологічно модифіковані як похідні рапаміцинового ядра, при цьому усе ще зберігаючи імуносупресивні властивості. Відповідно, термін «рапаміцин» містить у собі складні ефіри, прості ефіри, оксими, гідразони і гідроксиламіни рапаміцину, а також рапаміцини, у яких функціональні групи на рапаміциновому ядрі були модифіковані, наприклад, шляхом відновлення або окислювання. Термін «рапаміцин» містить у собі також фармацевтично прийнятні солі рапаміцинів, що здатні до утворення таких солей завдяки вмісту або кислотної, або основної груп. Рапаміцин Переважно, щоб складні ефіри і прості ефіри рапаміцину були ефірами по гідроксильних групах у 42- і/або 31-положенні рапаміцинового ядра, складними і простими ефірами по гідроксильній групі в 27-положенні (після хімічного відновлення 27-кетону), і щоб оксими, гідразони і гідроксиламіни були похідними кетону в 42положенні (після окислювання 42-гідроксильної групи) і 27-кетону рапаміцинового ядра. Переважні 42- і/або 31-складні ефіри і прості ефіри рапаміцину описані в наступних патентах, що включені сюди у вигляді посилання: складні алкілові ефіри [патент США 4316885], аміноалкілові складні ефіри [патент США 4650803]; фторовані складні ефіри [патент США 5100883]; аміди складних ефірів [патент США 5118677]; карбаматні ефіри [патент США 5118678]; прості силілові ефіри [патент США 5120842]; складні аміноефіри [патент США 5130307]; ацеталі [патент США 551413]; амінодискладні ефіри [патент США 5162333]; сульфонатні і сульфатні ефіри [патент США 5177203]; складні ефіри [патент США 5221670]; алкоксильні складні ефіри [патент США 5233036]; О-арил-, -алкіл, -алкеніл і -алкінілові прості ефіри [патент США 5258389]; карбонатні ефіри [патент США 5260300]; арилкарбоніл і алкоксикарбонілкарбамати [патент США 5262423]; карбамати [патент США 5302584]; складні гідроксіефіри [патент США 5362718]; утруднені складні ефіри [патент США 5385908]; гетероциклічні складні ефіри [патент США 5385909]; гемдизаміщені складні ефіри [патент США 5385910]; ефіри аміноалканових кислот [патент США 5389639]; фосфорилкарбаматні ефіри [патент США 5391730]; карбаматні ефіри [патент США 5411967]; карбаматні ефіри [патент США 5434260]; амідинокарбаматні ефіри [патент СІЛА 5463048]; карбаматні ефіри [патент СИІА 5480988]; карбаматні ефіри [патент США 5480989]; карбаматні ефіри [патент США 5489680]; утруднені N-оксидскладні ефіри [патент США 5491231]; біотинові складні ефіри [патент США 5504091]; О-алкілові ефіри [патент США 5665772] і складні ефіри рапаміцину і ПЕГ [патент США 5780462]. Одержання цих складних ефірів і простих ефірів описано в патентах, перерахованих вище. Переважні 27-складні ефіри рапаміцину описані в [патенті США 5256790], що включений сюди у вигляді посилання. Одержання цих складних ефірів і простих ефірів описано в патентах, перерахованих вище. Переважні оксими, гідразони і гідроксиламіни рапаміцину описані в [патентах США 5373014, 5378836, 5023264 і 5563145], що включені сюди у вигляді посилання. Одержання цих оксимів, гідразонів і гідроксиламінів описано в перерахованих вище патентах. Одержання 42-оксорапаміцину описано в [5023263], що включений сюди у вигляді посилання. Особливо переважні рапаміцини містять у собі рапаміцин [патент США 3929992], ССІ-779 [рапаміцин-42складний ефір із 3-гідрокси-2-(гідроксиметил)-2-метилпропіоновою кислотою; патент США 5362718] i 42-О-(2гідрокси)етилрапаміцин [патент США 5665772]. Коли застосовно, можуть бути отримані фармацевтично прийнятні солі рапаміцину з органічними і неорганічними кислотами, наприклад, оцтовою, пропіоновою, молочною, лимонною, винною, бурштиновою, фумаровою, малеїновою, малоновою, мигдалевою, яблучною, фталевою, хлористоводневою, бромистоводневою, фосфорною, азотною, сірчаною, метансульфоновою, нафталінсульфоновою, бензолсульфоновою, толуолсульфоновою, камфорсульфоновою і подібними відомими прийнятними кислотами, коли рапаміцин містить придатну основну групу. Солі можуть бути також утворені з органічними і неорганічними основами, такими як солі лужних металів (наприклад, натрію, літію або калію), солі лужноземельних металів, солі амонію, солі алкіламонію, що містять 1-6 атомів вуглецю, або солі діалкіламонію, що містять 1-6 атомів вуглецю в кожній алкільній групі, і солі триалкіламонію, що містять 1-6 атомів вуглецю в кожній алкільній групі, коли рапаміцин містить прийнятну кислотну групу. Переважно, щоб інгібітор mTOR, використовуваний у протипухлинних комбінаціях відповідно до винаходу, був рапаміцином, і більш переважно, щоб інгібітор mTOR був рапаміцином, ССІ-779, або 42-О-(2гідрокси)етилрапаміцином. Як описано в даному винаході, ССІ-779 оцінювали як типовий представник інгібіторів mTOR у комбінаціях інгібітору mTOR плюс антиметаболіту відповідно до винаходу. Одержання ССІ-779 описано в [патенті США 5362718], що включений сюди у вигляді посилання. Коли ССІ779 використовують як протипухлинний засіб, мається на увазі, що первинні дози для в/в введення будуть укладені приблизно між 0,1 і 100мг/м2 при застосуванні в режимі добового дозування (щодня протягом 5 днів, кожні 2-3 тижні), і приблизно між 0,1 і 1000мг/м2, при режимі дозування один раз на тиждень. Пероральне або внутрішньовенне введення є переважними шляхами введення, причому внутрішньовенне введення є більш прийнятним. Відповідно до даного винаходу термін «антиметаболіт» означає речовину, що структурно подібна до необхідної природної проміжної сполуки (метаболіту) в біохімічному шляху, що приводить до синтезу ДНК або РНК, які використовуються організмом хазяїна в цьому шляху, але діє так, що придушує завершення цього шляху (тобто синтез ДНК або РНК). Більш конкретно, антиметаболіти звичайно діють шляхом (1) конкуренції з метаболітами у відношенні каталітичного або регуляторного сайту ключового ферменту в синтезі ДНК або РНК, або (2) заміни метаболіту, що у нормі включається в ДНК або РНК, і тим самим одержання ДНК або РНК, що не може підтримувати реплікацію. Головні види антиметаболітів містять у собі (1) аналоги фолієвої кислоти, що є інгібіторами дигідрофолатредуктази (ДГФР); (2) пуринові аналоги, що імітують природні пурини (аденін або гуанін), але структурно відрізняються, так що вони конкурентно або безповоротно придушують ядерний процесинг ДНК або РНК; і (3) піримідинові аналоги, що імітують природні піримідини (цитозин, тимідин і урацил), але структурно відрізняються, так що вони конкурентно або безповоротно придушують ядерний процесинг ДНК або РНК. Далі представлені типові приклади антиметаболітів відповідно до винаходу. 5-фторурацил (5-ФУ; 5-фтор-2,4(1Н, ЗН)піримідиндіон) є доступним для придбання у вигляді крему для місцевого застосування (FLUOROPLEX (фтороплекс) або EFUDEX (ефудекс)), розчину для місцевого застосування (FLUOROPLEX (фтороплекс) або EFUDEX (ефудекс)) і у вигляді ін'єкційного препарату, що містить 50мг/мл 5-фторурацилу (ADRUCIL (адруцил) або фторурацил). Флоксурадин (2'-дезокси-5-фторуридин) доступний для придбання у вигляді ін'єкційного препарату, що містить 500 мг/флакон флоксурадину (FUDR (фудр) або флоксурадину). Тіогуанін (2-аміно-1,7-дигідро-6-Н-пурин-6-тіон) доступний для придбання у вигляді 40мг таблеток для перорального прийому (тіогуанін). Цитарабін (4-аміно-1-(бета)-В-арабінофуранозил-2(1Н)-піримідинон) доступний для придбання у вигляді ліпосомного ін'єкційного препарату, що містить 10мг/мл цитарабіну (DEPOCYT (депоцит)) або у вигляді рідкого ін'єкційного препарату, що містить від 1мг до 1г/флакон або 20мг/мл (цитарабіну або CYTOSAR-U (цитозаруU)). Флударабін (9-Н-пурин-6-амін-2-фтор-9-(5-О-фосфоно-(бета)-Б-арабінофуранозил) доступний для придбання у вигляді рідкого ін'єкційного препарату, що містить 50 мг/флакон (FLUDARA (флудару)). 6-меркаптопурин (і,7-дигідро-6Н-пурин-6-тіон) доступний для придбання у вигляді 50 мг таблеток для перорального прийому (PURINETHOL (пуринетол)). Метотрексат (МТКС; N-[4-[[(2,4-діаміно-6-птеридиніл)метил]метиламіно]бензоїл]-L-глютамова кислота доступна для придбання у вигляді рідкого ін'єкційного препарату, що містить від 2,5 до 25мг/мл і 20мг 1г/флакон (метотрексату або натрію FOLEX (фолекс)) і 2,5мг таблеток для перорального прийому (метотрексат натрію). Гемцитабін (2'-дезокси-2',2'-дифторцитидину моногідрохлорид ((бета)-ізомер)) доступний для придбання у вигляді рідкого ін'єкційного препарату, що містить між 200 мг і 1 г/флакон (GEMZAR (гемзар)). Капацитабін (5'-дезокси-5-фтор-К-[(пентилокси)карбоніл]цитидин) доступний для придбання у вигляді 150 або 500мг таблетки для перорального прийому (XELODA (кселода)). Пентостатин ((R)-3-(2цезокси-(бета)D-еритропентофуранозил)-3,6,7,8-тетрагідроімідазо[4,5-d][1,3]діазепін8-ол) доступний для придбання у вигляді рідкого ін'єкційного препарату, що містить 10 мг/флакон (NIPENT (ніпент)). Триметрексат (2,4-діаміно-5-метил-6-[(3,4,5-триметоксіаніліно)метил]хіназоліну моно-D-глюкуронат) доступний для придбання у вигляді рідкого ін'єкційного препарату, утримуючого між 25 і 200 мг/флакон (NEUTREXIN (неутрексин)). Кладрибін (2-хлор-6-амино-9-(2-дезокси-(бета)-D-еритропентофуранозил)пурин) доступний для придбання у вигляді рідкого ін'єкційного препарату, що містить 1 мг/мл (LEUSTATIN (лейстатин)). В наведеній далі таблиці коротко узагальнені деякі з дозувань, що рекомендуються, для антиметаболітів, перерахованих вище. Лікарський препарат 5-фторурацил Дозування 12 мг/кг, перорально 6 мг/кг, перорально Флоксурадин (FUDR, фудр) Цитарабін (DEPOCYT, депоцит) 0,1-0,6 мг/кг Цитарабін (ін'єкційний) 100 мг/м2 2-3 г/м2 Флударабін (FLUDARA, флудара) 25 мг/м2 6-меркаптопурин (PURINETHOL, пуринетол) 2,5-5 мг/кг Режим введення щодня протягом 4 днів дні 6, 8, 10, 12 немає прийому ліків по днях 5, 7,9 і 11; дози знижуються вдвічі, якщо спостерігається токсичність щоденно протягом 5 днів, кожні 3-4 тижні щодня, внутрішньовенним введенням кожні 14 днів для 5 доз під час періоду індукції; у наступному кожні 28 днів для підтримки щодня протягом 7 днів двічі на добу протягом 2-6 днів 30 хв введення протягом 5 послідовних днів; кожні 28 днів щодня для індукції 1,5-2,5 мг/кг щоденно для підтримки 370-600 мг/м2, в/в 50 мг Метотрексат 15-30 мг перорально Гемцитабін (GEMZAR, гемзар) 1000мг/м2/30хв 1000-1250 мг/м2/30хв Капецитабін (XELODA, кселода) 2500 мг/м2 Пентостатин (NIPENT, ніпент) мг/м2 Триметрексат (NEUTREXIN, неутрексин) Кладрибін (LEUSTATIN, лейстатин) 0,45 мг/м1 0,09 мг/кг/доба курсом щодня протягом 5 днів; повторні 3-5 разів єдиний препарат: один раз на тиждень протягом 7 тижнів, з наступним 1тижневим відпочинком, потім один раз на тиждень протягом 3 з кожних 4 тижнів комбінована терапія: дні 1, ї, 15 у 28-денному циклі або дні 1 і 8 у 21-денному циклі щодня протягом 2 тижнів з наступним 1 тижнем періоду відпочинку у вигляді навантажувальної ін'єкції або розведений у вигляді в/в введення; через тиждень в/в введення один раз у добу протягом 21 днів безперервне введення протягом 7 послідовних днів Даний винахід містить у собі також застосування інгібітору mTOR плюс антиметаболіту, у якому біохімічний засіб, що модифікує, є частиною хіміотерапевтичного режиму. Термін «біохімічний засіб, що модифікує» є добре відомим і розуміється фахівцями в даній області як доповнення до антиметаболічної терапії, що служить для потенціювання протипухлинної активності, а також як протидія побічним діям антиметаболіту. Лейковорин і левофолІнат звичайно використовують як біохімічні засоби, що модифікують, при терапії метотрексатом і 5-ФУ. Лейковорин (5-форміл-5,6,7,8-тетрагідрофолієва кислота) доступний для придбання у вигляді ін'єкційної рідини, що містить від 5 до 10мг/мл або 50-350мг/флакон (лейковорину кальцію, або WELLCOVORTN, велковорин) і у вигляді 5-25мг пероральних таблеток (лейковорин кальцію). ЛевофолІнат (фармакологічно активний ізомер 5-формілтетрагідрофолієвої кислоти) доступний для придбання у вигляді ін'єкційного препарату, що містить 25-75мг левофолінату (ISOVORIN (ізоворин)) або 2,57,5мг таблеток для перорального прийому (ISOVORIN (ізоворин)). Кращі комбінації інгібітору mTOR плюс антиметаболіту відповідно до винаходу містять у собі ССІ-779 плюс гемцитабін; ССІ-779 плюс 5-фторурацил; і ССІ-779 плюс 5-фторурацил плюс лейковорин. Переважно, щоб комбінація ССІ-779 плюс гемцитабін використовувалася для лікування раку підшлункової залози і щоб комбінація ССІ-779 плюс 5-фторурацил (з лейковорином або без нього) використовувалася для лікування колоректального раку. Протипухлинна активність комбінації ССІ-779 плюс антиметаболіт підтверджений in vitro і in vivo стандартними методами фармакологічного дослідження з використанням комбінацій ССІ-779 плюс гемцитабін і ССІ-779 плюс 5-фторурацил як типові приклади комбінацій відповідно до винаходу. Далі коротко описані використані методики й отримані результати. Лінії людської рабдоміосаркоми Rh30 і Rhl і лінію людської гліобластоми SJ-GBM2 використовували для вивчення in vitro комбінацій з ССІ-779 і антимегаболічних засобів. У дослідженнях in vivo використовували лінію людської нейробластоми (NB1643) і лінію (пухлини) людського товстого кишечнику GC3. Криві залежності доза-відповідь будували для кожних з ліків, що представляють інтерес. Лінії клітин Rh30, Rhl і SJ-G2 висівали на планшети із шістьма лунками, 6x103, 5х103 і 2,5х104 клітин/лунку, відповідно. Після 24годинного періоду інкубації додавали ліки або 10% ФБР+RPMI 1640 у випадку Rh30 і Rhl, або 15% ФБР+ДМЕ у випадку SJ-G2. Після 7-денного витримування на утримуючому ліки середовищі виділяли ядра шляхом обробки клітин гіпотонічним розчином з наступною обробкою детергентом. Потім ядра підраховували за допомогою лічильника Коултера. Результати експериментів наносили на графік і визначали ІС50 (концентрація лікарської речовини, що дає 50% придушення росту) для кожних ліків шляхом екстраполяції. Так як ІС50 дещо змінювалася від експерименту до експерименту, при вивченні взаємодії використовували два значення, що укладені в дужки для ІС50 для кожних ліків. Максимальний ступінь взаємодії між двома ліками відбувається, коли вони присутні в співвідношенні 1:1, якщо ізобола має стандартну форму. Тому кожну з трьох приблизних концентрацій ІС50 ССІ-779 змішували в співвідношенні 1:1 з кожної з трьох приблизних ІС50гемцитабіну або 5ФУ. Це давало в результаті дев'ять комбінацій ліків 1:1 у кожному експерименті плюс три концентрації ІС50 Для ССІ-779 і кожних ліків. Ця методика звичайно дає в результаті для кожних ліків щонайменше одну комбінацію, що містить значення ІС 50- Комбінацію 1:1 концентрацій ІС5о для ССІ-779 і кожного хіміотерапевтичного лікарського засобу потім використовували для розрахунку адитивності, синергізму або антагонізму, використовуючи формулу Беренбаума: x/X50+y/Y50, 1. Якщо три концентрації ССІ-779, випробувані окремо, не давали ІС, що підходила б під пару кожної з трьох ІС іншої сполуки, випробуваної окремо, перевіряли всі комбінації 1:1, щоб побачити, чи попадають їхні ІС між відповідними ІС лікарських засобів, випробуваних по одному. Якщо вони попадають, ефект вважають адитивним. Результати, отримані за стандартною методикою фармакологічного дослідження in vitro, показали, що в жодному випадку комбінації не давали менше 50% придушення росту, показуючи, що комбінації були щонайменше адитивними і не давали даних про антагонізм. Самок мишей CBA/CaJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) 4-тижневого віку позбавляли імунного захисту шляхом тимектомії з наступним, через 3 тижні, опроміненням усього тіла (1200 cGy) при використанні джерела 137Cs. Миші одержували 3x106 клітин кісткового мозку, що мають ядро, через 6-8 годин опромінення. Шматочки пухлини розміром приблизно 3 мм імплантували в ділянці дорзальної латеральної частини боку мишей, щоб викликати ріст пухлин. Мишей, що мають пухлини, по випадковій вибірці розділяли на групи по сім штук перед початком терапії. Кожна миша, що має пухлину, одержувала ліки, коли розмір пухлини складав приблизно 0,20-1 см по діаметру. Розмір пухлини визначали з 7-денними інтервалами, використовуючи цифровий кронциркуль Верньє, зв'язаний з комп'ютером. Обсяги пухлин розраховували, приймаючи, що пухлини є сферичними, використовуючи формулу [(p/6)xd 3], де d є середнім діаметром. ССІ-279. давали в режимі 5 послідовних днів протягом 2 тижнів з повторенням цього циклу кожні 21 день протягом 3 циклів. Це приводило до того, що ССІ-779 давали в дні 1-5, 8-12 (цикл 1); 21-25, 28-32 (цикл 2); і 42-46, 49-53 (цикл 3). Режим введення іншого хіміотерапевтичного засобу для кожного дослідження був наступним: гемцитабін у дні 1,4, 8 тільки 1 циклу. Комбінацію ССІ-779 і гемцитабІну оцінювали за методикою дослідження на ксенотрансплантатах клітин людської товстої кишки (GC3) у мишей. При цій методиці дослідження ССІ-779 давали щодня х5 протягом 2 послідовних тижнів кожні 21 день протягом 3 циклів, і гемцитабін давали в дні 1, 4 і 8 тільки протягом першого циклу. Присутність ССІ-779 не підвищувало регресії пухлини, що спостерігається при першому циклі лікування гемцитабіном. Однак у групах, що одержували ССІ-779, був збільшений час, необхідний для того, щоб первинний обсяг пухлини до лікування досяг 2-3 х (у порівнянні з одним гемцитабіном), що показує щонайменше перевагу адитивності, одержувану, від комбінованого лікування. За результатами цих стандартних методів фармакологічного дослідження комбінації інгібітору mTOR плюс антиметаболічного хіміотерапевтичного засобу придатні як протипухлинна терапія. Більш конкретно, ці комбінації придатні для лікування ниркової карциноми, саркоми м'яких тканин, раку молочних залоз, нейроендокринної пухлини легені, раку шийки матки, раку матки, раку голови і шиї, гліоми, недрібноклітинного раку легень, раку простати, раку підшлункової залози, лімфоми, меланоми, дрібноклітинного раку легень, раку яєчників, раку товстого кишечнику, раку стравоходу, раку шлунка, лейкемії, колоректального раку і первинного раку нез'ясованого походження. Так як ці комбінації містять щонайменше дві активних протипухлинних речовини, застосування таких комбінацій також забезпечує використання комбінацій кожного з даних лікарських засобів, у якій один або обидва з засобів використовуються в субтерапевтичних ефективних дозуваннях, і тим самим зменшується токсичність, зв'язана з окремим терапевтичним засобом. При проведенні хіміотерапії багато засобів, що мають різні механізми дії, звичайно використовують у вигляді частини хіміотерапевтичного «коктейлю». Очікується, що комбінації відповідно до винаходу будуть використовуватися у вигляді частини хіміотерапевтичного коктейлю, що може містити один або більше з додаткових протипухлинних засобів, у залежності від походження пухлини, яку потрібно лікувати. Наприклад, даний винахід охоплює також застосування комбінації інгібітору mTOR/антиметаболіту, застосовуваної в сполученні з іншими хіміотерапевтичними засобами, такими як алкілуючі засоби (тобто цисплатин, карбоплатин, стрептазоїн, мелфалан, хлорамбуцил, кармустин, метхлоретамін, ломустин, бісульфан, тіотепа, іфофамід або циклофосфамід); гормональні засоби (тобто естрамустин, тамоксифен, тореміфен, анастрозол або летрозол); антибіотики (тобто пликаміцин, блеоміцин, мітоксантрон, ідарубіцин, дактиноміцин, митоміцин, доксорубіцин або даунорубіцин); імуномодулятори (тобто інтерферони, ІЛ-2 або БЦЖ); антимітотичні засоби (тобто вінбластин, вінкристин, теніпозид або вінорелбін); інгібітори топоізомерази (тобто топотекан, іринотекан або етопозид) і інші засоби (тобто гідроксисечовина, тразтузумаб, алтретамін, ретуксимаб, паклітаксел, доцетаксел, L-аспарагіназа або гемтузумаб озогаміцин). Відповідно до винаходу комбінований режим може відповідати одночасному прийому або прийому, що чергується, причому інгібітор mTOR дають у різний з антиметаболітом час протягом курсу хіміотерапії. Ця різниця в часі може коливатися в межах декількох хвилин, годин, днів, тижнів або більше між уведенням двох засобів. Тому термін комбінація не обов'язково означає введені в один і той же час або у вигляді об'єднаної дози, але означає, що кожний з компонентів уводять під час бажаного періоду лікування. Дані засоби можна також уводити різними шляхами. Наприклад, при комбінації інгібітору mTOR плюс антиметаболіт передбачається, що інгібітор mTOR буде вводитися перорально або парентерально, причому переважно парентерально, тоді як антиметаболіт можна вводити парентерально, перорально або іншими прийнятними способами. Що стосується комбінації ССІ-779 з гемцитабіном, переважно, щоб гемцитабін уводився парентерально. Що стосується комбінації ССІ-779 з 5-ФУ і лейковорином, переважно, щоб 5-ФУ і лейковорин уводилися парентерально. Ці комбінації можна вводити щодня, один раз на тиждень або навіть один раз на місяць. Що типово для режимів хіміотерапії, курс хіміотерапії може бути повторений через кілька тижнів і може слідувати тим самим тимчасовим рамкам у відношенні введення двох лікарських засобів, або може бути змінений на основі реакції пацієнта. Відповідно, даний винахід також представляє продукт, що складається з інгібітору mTOR і антиметаболічного протипухлинного засобу у вигляді комбінованого препарату для одночасного, окремого або послідовного застосування при лікуванні пухлини в ссавця. Що типово для хіміотерапії, режими дозування ретельно регулює лікуючий лікар на підставі багатьох факторів, включаючи тяжкість захворювання, реакцію на захворювання, будь-яку зв'язану з лікуванням токсичність, вік, стан здоров'я пацієнта й інші супутні захворювання або лікування. На основі результатів, отриманих з характерними прикладами комбінацій ССІ-779 плюс антиметаболіт, передбачається, що первинне дозування для в/в введення інгібітору mTOR буде укладене приблизно між 0,1 і 100мг/м , причому переважніше, приблизно між 2,5 і 70мг/м2. Також переважно, щоб інгібітор mTOR вводився в/в, звичайно за 30 хвилин, і вводився приблизно один раз на тиждень. Первинні дози антиметаболічного компонента будуть залежати від використовуваного компонента і будуть грунтуватися в першу чергу на досвіді лікаря у відношенні обраних лікарських засобів. На основі результатів, отриманих з комбінаціями ССІ-779 плюс антиметаболіт, припускають, що для комбінації інгібітору mTOR плюс гемцитабін первинне дозування інгібітору mTOR для в/в введення буде укладена приблизно між 0,1 і 100мг/м , причому переважніше, приблизно між 2,5 і 70мг/м , а первинне дозування гемцитабіну для в/в введення буде укладена приблизно між 400 і 1500мг/м2, причому переважніше, приблизно між 800 і 1000мг/м2. Спочатку планується, що пацієнти будуть одержувати 30-хвилинне введення інгібітору mTOR з наступним або безпосередньо попереднім 30-хвилинним введенням гемцитабіну в дні 1 і 8 з 21-денного циклу лікування. Після одного або більш циклів лікування дозування можуть бути підвищені або знижені, у залежності від отриманих результатів І побічних ефектів, що спостерігаються. На основі отриманих результатів, коли ССІ-779 використовують у комбінації з 5-ФУ і лейковорином, передбачається, що при режимі інгібітор mTOR плюс 5-ФУ плюс лейковорин первинне дозування для в/в введення інгібітору mTOR буде укладене приблизно між ОД і 100 мг/м2, причому переважніше, приблизно між 2,5 і 70мг/м2, первинне дозування для в/в введення лейковорину буде складати від 50 до 500 мг/м2, причому переважніше буде складати приблизно 200мг/м2; і первинне дозування 5-ФУ для в/в введення буде складати приблизно від 500 до 7500мг/м , причому переважніше, приблизно від 1000 до 5000мг/м2. Спочатку припускають введення комбінації у відповідності з наступним режимом: пацієнти будуть одержувати 1-годинне в/в введення лейковорину один раз на тиждень під час кожного 6-тижневого циклу лікування; відразу після введення кожної дози лейковорину вводять 5-ФУ у вигляді 24-годинного безперервного в/в введення. Інгібітор mTOR буде вводитися, починаючи з 8 дня циклу 1, і буде даватися один раз на тиждень у вигляді 30хвилинного в/в введення. За кожним 6-тижневим циклом лікування випливає 1 тиждень відпочинку перед початком наступного 6-тижневого циклу лікування. Після 1 циклу лікування або більш дозування можуть бути підвищені або знижені, у залежності від отриманих результатів і побічних ефектів, що спостерігаються. Що стосується комерційно доступних антиметаболітів, можна використовувати існуючу дозовану форму з дозами, розділеними, як необхідно. Альтернативно, такі засоби або антиметаболіти, які недоступні для придбання, можуть бути отримані у відповідності зі стандартною фармацевтичною практикою. Пероральні препарати, що містять активні сполуки відповідно до винаходу, можуть містити в собі будь-які звичайно застосовувані пероральні форми, включаючи таблетки, капсули, захисні форми, коржі, пастилки і пероральні рідини, суспензії або розчини. Капсули можуть містити суміші активної (их) сполуки (к) з інертними наповнювачами і/або розріджувачами, такими як фармацевтично прийнятні крохмалі (наприклад, кукурудзяний, картопляний або крохмаль тапіоки), цукри, штучні підсолоджувані, порошкові целюлози, такі як кристалічні або мікрокристалічні целюлози, борошно, желатин, камедь і т.д. Придатні таблеткові композиції можуть бути виготовлені звичайним пресуванням, методами вологої грануляції або сухої грануляції, і при цьому можна використовувати фармацевтично прийнятні розріджувачі, зв'язувальні речовини, змащувальні речовини, дезінтегратори, речовини, що поверхнево-модифікують [(включаючи поверхнево-активні речовини (ПАР)], суспендуючі речовини або стабілізатори, включаючи, але не обмежуючись цим, стеарат магнію, стеаринову кислоту, тальк, лаурилсульфат натрію, мікрокристалічну целюлозу, кальційкарбоксиметилцелюлозу, полівінілпіролідон, желатин, альгінову кислоту, камедь акації, ксантановую камедь, цитрат натрію, комплексні силікати, карбонат кальцію, гліцин, декстрин, сахарозу, сорбіт, двозаміщений фосфат кальцію, сульфат кальцію, лактозу, каолін, маніт, хлорид натрію, тальк, сухі крохмалі і порошковий цукор. Переважні речовини, що поверхнево-модифікують, містять у собі неіонні і аніонні речовини, що поверхнево-модифікують. Типові приклади речовин, що поверхнево-модифікують, містять у собі, але не обмежуються цим, полоксамер 188, бензалконію хлорид, кальцію стеарат, цетостеариловий спирт, цетомакрогольний емульгуючий віск, складні ефіри сорбіту, колоїдний двоокис кремнію, фосфати, додецилсульфат натрію, алюмосилікат магнію і триетаноламін. Серед пероральних препаратів, названих тут, можуть використовуватися стандартні форми з уповільненим або регульованим вивільненням для зміни всмоктування активної (их) сполуки (к). Пероральний препарат може також являти собою введення активного інгредієнта в воді або фруктовому соку, що містить відповідні солюбілізатори або емульгатори, якщо необхідно. У деяких випадках може бути бажано вводити дані сполуки безпосередньо в дихальні шляхи у вигляді аерозолю. Дані сполуки можна також уводити парентерально або внутрішньочеревинно. Розчини або суспензії даних активних сполук у вигляді вільної основи або фармакологічно прийнятної солі можуть бути приготовлені у воді, відповідно, змішаної з ПАР, таким як гідроксипропілцелюлоза. Дисперсії також можуть бути виготовлені в гліцерині, рідких пропіленгліколях і їхніх сумішах в маслах. При звичайних умовах збереження і використання ці препарати містять консервант для запобігання росту мікроорганізмів. Фармацевтичні форми, придатні для ін'єкційного застосування, містять у собі стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для екстемпорального приготування стерильних ін'єкційних або розчинів дисперсій. В усіх випадках форма повинна бути стерильною і повинна бути рідкою в такій мірі, щоб легко було вводити через шприц. Вона повинна бути стабільної в умовах виробництва і збереження, і повинна бути законсервованою проти забруднення мікроорганізмами, такими як бактерії і гриби. Носій може бути розчинником або середовищем, що містить дисперсію, наприклад, водою, етанолом, поліолом (наприклад, гліцерином, пропіленгліколем і рідким поліетиленгліколем), їх придатними сумішами і рослинними оліями. Для цілей даного відкриття, як зрозуміло, трансдермальні введення містять у собі усі варіанти введення через поверхню тіла і внутрішню вистілку порожнин тіла, включаючи епітеліальні або слизуваті тканини. Такі введення можуть проводитися з використанням даних сполук або їх фармацевтично прийнятних солей у лосьйонах, кремах, пінках, пластирах, суспензіях, розчинах і супозиторіях (ректальних і вагінальних). Трансдермальне введення може здійснюватися за допомогою використання трансдермального пластиру, що містить активну сполуку і носій, що є інертним по відношенню до активної сполуки, є нетоксичним для шкіри і дає можливість забезпечення засобу системного усмоктування в кровотік через шкіру. Носій може мати ряд форм, таких як креми і мазі, пасти, гелі й оклюзивні засоби. Креми і мазі можуть бути в'язкими рідинами або напівтвердими емульсіями типу масло-в-воді або вода-в-маслі. Також можуть бути придатні пасти, що складаються з абсорбуючих порошків, диспергованих у вазеліні або гідрофільному вазеліні, що містить активний інгредієнт. Ряд оклюзивних засобів може бути використаний для вивільнення активного інгредієнта в кровотік, такі як напівпроникна мембрана, яка закриває резервуар, що містить активний інгредієнт з носієм або без нього, або матриця, що містить активний інгредієнт. Інші оклюзивні пристрої відомі з літератури. Супозиторні препарати можуть бути виготовлені з традиційних матеріалів, включаючи масло какао, з додаванням воску для зміни температури плавлення супозиторію і гліцерину або без додавання. Також можна використовувати водорозчинні основи для супозиторіїв, такі як поліетиленгліколі з різною молекулярною вагою.