Біореактор для функціональної тканинної інженерії

Реферат: Біореактор для вирощування тканинних замінників, зокрема хрящів, що складається з окремої герметично закритої камери, в якій впорядковано устаткування для впливу механічним навантаженням, зокрема на тканинні замінники. Устаткування для механічного навантаження складається з ємності для культивування з підкладкою, розташованою у її верхній частині, і з як мінімум одним притискним обертовим індентором, з'єднаним з повідцем. При цьому повідець, з'єднаний з лінійним мотором, має щільну посадку по відношенню до ємності для культивування. UA 80513 U (33) Код держави-учасниці CZ UA 80513 U UA 80513 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель пов'язана з біореактором для функціональної тканинної інженерії, що складається з герметично відокремленої камери, в якій знаходиться пристрій для механічного навантажування, зокрема, тканинних замінників хрящів. Для успішного створення замінників хрящової тканини необхідно на окремі тканинні матриці з нанесеними клітинами впливати механічним навантаженням. Необхідно також забезпечити середовище, в якому дані клітини можуть далі розвиватися. При виконанні цих вимог відбувається формування функціонального тканинного імплантата, який готовий до імплантації в середовище, де на нього буде впливати біологічне навантаження. Для моделювання циклів навантаження в процесі дозрівання хрящової тканини використовуються тканинні біореактори. Метою сучасних пристроїв, призначених для культивування тканин, є імітація умов середовища "in-vivo", насамперед, з хімічної та біологічної точки зору. Це середовище формується в сучасних типах біореакторів залежно від типу бажаної тканини. Загалом можна констатувати, що мова йде про пристрій, в якому забезпечена хімічна та біологічна стійкість живильного середовища, де регулюється і контролюється температура інкубації простору культивування і де забезпечується необхідний тиск і концентрація суміші у робочому і живильному середовищі. Однак для того, щоб була забезпечена можливість вирощування життєздатної тканини, пристрій повинен відповідати вимогам що до простоти стерилізації, легкого доступу живильного середовища до клітин, які вирощуються, та його обміну. Однією з найбільш базових версій є т. зв. Flask (колби) система, яка містить середовище для культивування і може містити кілька матриць, залежно від розміру. Колба(и) працює або статично, або при перемішуванні. Окремим варіантом можна вважати біореактори для вирощування серцевих тканин, які пристосовані для проходження пульсуючого одно- і двонаправленого потоку живильного середовища через конструкцію опорних матриць. Тобто вони сконструйовані так, щоб моделювали серцево-судинне середовище. Представниками таких біореакторів є системи HARV (High Aspect Ratio Vessels) і STLV (Slow Turning Lateral Vessels). STLV сконфігурований як кільцевий простір між двома концентричними циліндрами, з яких внутрішній є мембраною для газообміну, тоді як HARV - це циліндрична ємність з мембраною для газообміну в її дні. Обидві ємності працюють в горизонтальній площині і обертаються по відношенню одна до одної. Іншою використовуваною системою є система RWPV (Rotating Wall Perfused Vessels), яка була розроблена в НАСА і, крім іншого, використовувалася для вирощування хрящів в умовах мікрогравітації і в нормальних умовах. Середовище безперервно циркулює в стовпцях з перфузією. Камері з перфузією сконструйовані так, щоб середовище безперервно протікало між камерою і зовнішньою мембраною. До цих пір не було знайдено рішення конструкції біореактора, яке б достатньо задовольнило вимоги щодо умов вирощування замінників хрящів, особливо щодо моделювання реальних умов навантаження. Існуючі реактори для хрящових тканин впливають на окремі імплантати простими навантаженнями типу тиску або зсуву. У хрящі в умовах "in-vivo" завжди має місце поєднання даних навантажень внаслідок специфічної геометрії, кінематики і властивостей контактних поверхонь. Недоліком існуючих рішень є непряма механічна стимуляція тканин, яка є фактором, дуже істотним для відповідного розвитку вирощуваних тканин. Зазначені вище недоліки значною мірою усуває біореактор для функціональної тканинної інженерії, що складається з герметично відокремленої камери, в якій знаходиться пристрій для механічного навантаження, зокрема, тканинних замінників хрящів, вироблений за цим технічним рішенням. Суть рішення полягає в тому, що пристрій складається з ємності для культивування з підставкою для укладання вирощуваних зразків і мінімально одним обертовим затискним індентором, з'єднаним з повідцем, причому повідець має щільну посадку по відношенню до посудини для культивування. Пристрій складається з лінійного мотора, до статора якого приєднується нижня частина ємності для культивування, а до рухомої частини лінійного мотора приєднаний повідець з, як мінімум, одним індентором, що обертається, з посадкою підшипником кочення на вісь. Вісь має рухому посадку в вертикальному напрямку в напрямних вертикальних стійок для рівномірного циклічного навантаження індентором вирощуваних зразків. До осі вдало приєднана як мінімум одна піднімальна пружина розтягування та/або пружина стиснення, причому між віссю і пружинами встановлений датчик напруги. Обертовий індентор може бути оперезаний парою гальмівних стрічок, прикріплених до сполучного профілю. До гальмівних стрічок приєднаний балансир для забезпечення симетрії тягового зусилля в стрічках для регуляції відкатки, проковзування або повного волочіння індентора по підкладці. 1 UA 80513 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Верхня частина ємності для культивування виготовлена розділеною поздовжніми і поперечними перегородками на комірки для культивування, в яких встановлені підкладки з отворами для вирощуваних зразків. Підкладка виготовлена з матеріалу з механічними властивостями, схожими на механічні властивості майбутньої необхідної тканини, для забезпечення стабільності та рівномірного розподілу навантаження на зразки. Суть технічного рішення полягає в розміщенні столу з обертовим індентором в камері для росту в біореакторі. Від навколишнього середовища лабораторна камера герметично відокремлена, а всередині підтримується захисна атмосфера. Практично, камера біореактора це ламінований лабораторний бокс, який пристосований своїми розмірами до ванночки для культивування зразків. На відміну від використовуваних технічних рішень тут відбувається пряме механічне стимулювання вирощуваної тканини обертовим індентором, який імітує реальне навантаження на суглоб. Обертовий індентор має форму циліндра з поворотним підшипником, який з різною заданою величиною притиску пересувається по вирощуваних зразках тканини. Іншою важливою перевагою є можливість відкочування, часткового проковзування або повного волочіння, в результаті якого досягається не тільки стимуляція від нормального навантаження, але застосовується і компонент навантаження зсувом в тангенціальному напрямку. Завдяки цьому рішення ми суттєво наблизилися "in-vivo" до умов розвитку тканин в організмі. Зразки вирощуваних тканин знаходяться в отворах циліндричної форми. Інший простір, де відбувається культивування, заповнений підкладкою з матеріалу з механічними властивостями, подібним до механічних властивостей майбутньої необхідної тканини. Обертовий індентор рухається по підкладці із зразками рівномірно і з константними притиском, причому в ході культивування окремі параметри руху і притиску можна міняти і реєструвати. Зразки та підкладка знаходяться у ванночці з підігрівом. Рішення конструкції усуває деякі недоліки існуючого стандартно використовуваного обладнання. Технічне рішення стосується нової концепції пристрою, що стимулює тканину під час росту. Біореактор з обертовим індентором для функціональної тканинної інженерії замінників хрящів і з безперервним доповненням поживних речовин є трифазним обладнанням, в якому присутня контрольована внутрішня атмосфера, а також регулюється надходження поживних речовин і, не в останню чергу, відбувається механічна стимуляція культивованих клітин обертовим індентором. Завдяки своєму впорядкуванню пропоноване технічне рішення підвищує ефективність механічної стимуляції тканин. Воно полягає, насамперед, у можливості застосувати зсувне навантаження при одночасному застосуванні нормального притиску. Використання двох циліндрів з п'ятьма функціональними поверхнями дозволяє одночасно культивувати до 50 зразків, що означає значний економічний ефект і економію часу. У порівнянні з простими типами устаткування, представником яких є вищезгадана система "Flask", пропоноване рішення є економічно і технічно більш складним устаткуванням, яке з точки зору технічної складності управління є, в кінцевому підсумку, більш зручним для оператора. Вся система оснащена значною кількістю елементів управління та контролю, які дозволяють краще контролювати, що відбувається всередині пристрою й більш точно виконати налаштування робочих параметрів. При порівнянні з більш складними і спеціальними системами взаємне порівняння є більш складним в тому, що вищевказані системи "HARV, STLV і RWPV" призначені, в першу чергу, для вирощування інших типів тканин, ніж розроблений нами біореактор. Проте, виходячи з конструкції, можна припустити, що кінцевий механічний вплив на механічну стимуляцію буде нижчим, ніж при прямому контакті циліндра і тканини. Біореактор за цим технічним рішенням буде більш докладно описаний на конкретному прикладі реалізації за допомогою доданих креслень, де на фіг. 1 в аксонометричній проекції схематично зображено систему механічної стимуляції, на фіг. 2 докладно показано посадку індентора, на фіг. 3 зображено технічне виконання для часткового проковзування і повного волочіння. Пристрій за фіг. 1 і 2 складається з лінійного сервомотора 1, який у верхній частині прикріплений гвинтами до поздовжніх ребер жорсткості 3, а в нижній частині прикріплений до камери біореактора. До рухомої частини лінійного сервомотора 1 кріпиться гвинтами повідець 2 обертового індентора 13, а до нього прикріплені гвинтами 4 чотири вертикальні стійки 11, які мають поздовжні пази для напрямної ковзання. Кожна пара стійок 11 з'єднана для забезпечення жорсткості з'єднувальним профілем 10, в якому виконана нарізка для регулювальних гвинтів 12 притиску. Поздовжні ребра жорсткості 3. прикріплені до нижньої частини ємності для культивування 5. На нижній частині 5 виконана канавка с-подібної форми для проходження теплоносія, а сама нижня частина з'єднана з верхньою частиною 6 так, щоб не виникало витоку 2 UA 80513 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 теплоносія. Нижня частина 5 має також канавку по всьому периметру для видалення надлишків живильної речовини. Верхня частина 6 ємності для культивування 5 розділена поздовжніми перегородками 7 і перегородкою 14 на менші комірки для культивування. Усередині комірки для культивування знаходиться підкладка 8 з матеріалу з механічними властивостями, подібними як механічні властивості майбутньої необхідної тканини, з отворами для укладання вирощуваних зразків 9 циліндричної форми. По підкладці 8 повністю відкочується, частково проковзується або рухається з повним волочінням обертовий індентор, обертально посаджений підшипниками 15 на вісь 16. На фіг. 2 зображена застосована система притиску з відмірюванням виробленого зусилля. З віссю 16 нерухомо з'єднаний і зафіксований гайкою 17 датчик 18 напруги розтягнення/стиснення. На протилежному боці датчика 18 пригвинчена опорна миска 19 пружини стиснення 22, частиною якої є також підвіска пружини розтягування 21. На протилежній стороні пружини стиснення 22 знаходиться підвіска 20 пружини розтягування 21, яка одночасно служить як опорна підкладка для пружини стиснення 22. Переміщення гвинта 12 дозволяє виконати настройку трьох режимів роботи. Початкове положення - режим І означає, що гвинт 12 знаходиться в положенні, коли натягнута пружина розтягування 21, а індентор 13 не стикається зі зразками 9. Режим II настає тоді, коли гвинт 12 знаходиться в такому положенні, при якому індентор 13 вступає в контакт з підкладкою 8 і вирощуваними зразками 9. Величина притиску є в даному випадку від 0 до значення, викликаного власною вагою індентора 13. Режим III настає тоді, коли до притиску від індентора 13 додається навантаження в результаті деформації пружини стиснення 22, викликаної гвинтом 12. З метою забезпечення симетрії навантаження необхідно відрегулювати навантаження гвинтами 12 з тотожністю парних значень, а для цього служать дані з датчика 18. На фіг. 3 зображено використання з гальмуванням або повним блокуванням індентора 13. Гальмування індентора 13 здійснюється парою стрічок 23, які оперезані в поглибленнях поза функціональною поверхнею. Стрічки 23 з одного боку жорстко з'єднані з з'єднувальним профілем 10, а з другого боку прикріплені гвинтами 25, гайками 24, стопорними шайбами 26 до прямокутного балансира 27, який з'єднаний гайкою 32 і гвинтом 33 з тягою 30. Використання балансира 27 з обертовою посадкою навколо гвинтів 25 і 33 забезпечує рівномірне тягове зусилля в стрічках 23. Величину тягового зусилля в стрічках 23 можна регулювати гайкою 29 з шайбою 30. Для вимірювання тягового зусилля в стрічках 23 можна вкласти датчик між підкладку 30 і з'єднувальний профіль 10. Обертовий індентор зі всіма його компонентами - верхня частина 6, поздовжні перегородки 7, які вступають в контакт з вирощуваною тканиною, виготовлені з корозієстійкого біологічно сумісного матеріалу. Інші компоненти виготовлені з нержавіючої сталі. Частина для культивування має розміри 200×650 мм. Окремі комірки для культивування мають розміри 30×300 мм. У кожну з них можна помістити 5 вирощуваних зразків 9. Таким чином пристрій дозволяє вирощувати одночасно до 50 зразків. Вкладені зразки 9 складаються з матриці з нанесеними клітинами тканини для культивування. Навколишній простір навколо зразків заповнено підкладкою 8, яку виготовлено з матеріалу, подібного до колагену, зі специфічним хімічним складом, що забезпечує відповідні хімічні та механічні властивості. У процесі культивування у точно заданих біофізичних умовах, таких як температура, концентрація поживного розчину і склад захисної атмосфери, здійснюється механічне стимулювання зразка 9 обертовим індентором 13. Пристрій дозволяє здійснювати навантаження безперервно або з інтервалами між навантаженням, які задає користувач. Фактичну настройку притиску вибирає і налаштовує обслуговуючий персонал. У кожного з циліндрів індентора 13 можна налаштувати інші параметри навантаження і завдяки цьому використовувати його для різних умов культивування. Притиск можна регулювати за допомогою гвинтів 12 і відмірюванням за допомогою датчика 18. Значеннях притиску можна контролювати в процесі культивування та реєструвати, використовуючи ПК. Біореактор для функціональної тканинної інженерії, виконаний згідно з цим технічним рішенням, знайде застосування, перш за все, в галузі тканинної інженерії та в медицині. Нинішні тенденції свідчать про те, що саме в цьому напрямку і просуваються дослідження і розробки. 55 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 60 1. Біореактор для вирощування тканинних замінників, зокрема хрящів, що складається з окремої герметично закритої камери, в якій впорядковано устаткування для впливу механічним навантаженням, зокрема на тканинні замінники, який відрізняється тим, що устаткування для механічного навантаження складається з ємності для культивування з підкладкою 8, 3 UA 80513 U 5 10 15 розташованою у її верхній частині 6, і з як мінімум одним притискним обертовим індентором 13, з'єднаним з повідцем 2, причому повідець 2, з'єднаний з лінійним мотором 1, має щільну посадку по відношенню до ємності для культивування 5. 2. Біореактор згідно з п. 1, який відрізняється тим, що до статора лінійного мотора 1 під'єднано нижню частину 5 і верхню частину 6 ємності для культивування, а до рухомої частини лінійного мотора 1 під'єднано повідець 2 з як мінімум одним обертовим індентором 13 з посадкою підшипників кочення на вісь 16 з ковзаючою посадкою в вертикальному напрямку в напрямних вертикальних стійок 11. 3. Біореактор згідно з п. 1 або 2, який відрізняється тим, що до осі 16 приєднана як мінімум одна піднімальна пружина розтягування 21 і/або пружина стиснення 22, причому між віссю 16 і пружинами 21, 22 вставлений датчик 17 напруги. 4. Біореактор згідно з пп. 1, 2 або 3, який відрізняється тим, що навколо обертового індентора 13 оперезана пара гальмівних стрічок 23, прикріплених до з'єднувального профілю 10, причому до гальмівних стрічок 23 приєднаний балансир 27 для забезпечення симетрії тягового зусилля в стрічках 23. 5. Біореактор згідно з будь-яким з вищезазначених пп., який відрізняється тим, що верхня частина 6 ємності для культивування розділена подовжніми перегородками 7 і поперечною перегородкою 14, причому в підкладці 8 виконано отвори для укладання зразків для культивування 9. 4 UA 80513 U 5 UA 80513 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6