Спосіб стимуляції росту незапліднених насіннєвих зародків перцю солодкого (capsicum spec. l.) для одержання апоміктичного насіння

Реферат: Спосіб стимуляції росту незапліднених насіннєвих зародків перцю солодкого (Capsicum spec. L.) для одержання апоміктичного насіння включає обробку кастрованих нерозкритих квіток водною сумішшю регуляторів росту (цитокінінів і гіберелінів), нанесення на приймочки кастрованих пуп'янків пилку рослин петунії садової (Petunia axillaris Petunia integrifolia, група Petunia multiflora), яка є несумісною з рослинами перцю солодкого (вид Capsicum spec L.). UA 83962 U (12) UA 83962 U UA 83962 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, і може бути використана в генетиці і селекції перцю солодкого (Capsicum spec. L.) для прискореного одержання генетично стабільних ліній, які будуть диплоїдними гомозиготами, утвореними в результаті індукованого нерегулярного апоміксису. Головним методом в селекції перцю солодкого є гібридизація у поєднанні з індивідуальним добором на всіх етапах селекційного процесу, а також масовий і родинний добори. Гібридизація - є основний метод селекції рослин для одержання цінних вихідних популяцій. Гібридна популяція може мати практичну цінність в селекційному процесі, як проміжний продукт для створення нових ліній, сортів і гібридів шляхом додаткового проведення доборів за бажаним комплексом ознак. На теперішній час найбільше поширення у сортовій і гібридній селекції перцю солодкого набув досить трудомісткий за кількістю операцій та часовою тривалістю спосіб генетичної стабілізації селекційного матеріалу, який ґрунтується на використанні родинного відбору із гібридних популяцій рослин. Такий процес відбору може тривати протягом 5-7 поколінь залежно від досягнення потрібної стабільності успадкування досліджуваних господарсько-цінних ознак [1]. Селекційна технологія цього відбору ґрунтується на постійному відборі рослин із популяцій родин, які в принципі не можуть бути стопроцентними диплоїдними гомозиготами за всіма комплексами генів, оскільки завжди знаходяться у гетерозиготному стані [1]. Так навіть при самозапиленні протягом 10 поколінь гомозиготність за двома алелями одного гена буде дорівнювати 98 %, чим більше генів використовується у процесі родинного добору, тим менший ступінь гомозиготності буде спостерігатиметься у рослин, що входять до популяції родин [2]. Тому для підвищення результативності селекції перцю солодкого існує нагальна потреба у розробці більш ефективних та прискорених способів генетичної стабілізації селекційно-цінного матеріалу. З експериментальної практики відомий біотехнологічних метод прискореного створення гомозиготних форм перцю солодкого, які одержують з гаплоїдних регенерантів [3]. Даний спосіб передбачає культивування ізольованих пиляків на штучних живильних середовищах in vitro [35]. Недоліком цього методу є те, що утворення регенерантів методом прямого чи непрямого ембріогенезу (через проходження стадії калюсогенезу) може відбуватись із соматичних клітин пиляка, які не мають диплоїдний набір хромосом і не забезпечують гомозиготності отриманого матеріалу. Реалізація генетичного явища нерегулярного апоміксису дає можливість у досліджуваних генотипів перцю солодкого досягти практично 100 % гомозиготизації вже у наступному поколінні. Нерегулярний апоміксис - специфічний спосіб розмноження, який дозволяє одержувати абсолютно ідентичні копії материнської форми рослин. З генетичної точки зору це явище полягає у розвитку насіннєвого зародку з яйцеклітини або іншої клітини зародкового мішка за відсутністю факультативного самозапилення. Такий тип апоміксису зустрічається у -6 природі з досить низькою частотою прояву (10 ) [6-8]. Останнім часом дослідниками здійснюються спроби для індукції нерегулярного апоміксису у найважливіших сільськогосподарських рослин. На жаль, у більшості з них майже цілком відсутня здатність до апогамії. З літературних джерел відомі дані щодо одержання апоміктичного насіння у м'якої пшениці, гречки, кукурудзи та деяких інших сільськогосподарських рослин [8]. Нам невідомі випадки застосування в селекційній практиці на перці солодкім генетичного явища - апоміксису. На інших сільськогосподарських культурах індукувати апоміксис вдавалося в разі використання екзогенної обробки незапліднених насіннєвих зав'язей водною сумішшю регуляторів росту для стимуляції мітотичного поділу і подвоєння числа хромосом у яйцеклітин [8-10]. За даними літератури на ініціацію апоміксису в значній мірі впливають такі фактори як генотип рослини, фаза розвитку зародкового мішка, фітогормональний статус регуляторів росту, вагові співвідношення регуляторів в апоміктичному агенті та норми витрати агенту на одну незапліднену яйцеклітину [8-10]. На теперішній час в селекції перцю солодкого домінує два метода одержання міжсортових гібридів - на фертильній та стерильній основі. Для одержання міжсортових гібридів на фертильній основі використовують декілька способів. Перший передбачає використання генетичного явища гетеростилії для схрещуванні рослин, а саме пилок з батьківських форм рослин, що мають квітки з короткими стовпчиками наносять на приймочки квіток материнських форм рослин з подовженими стовпчиками [1]. Другий спосіб передбачає кастрацію квіток материнської форми перед нанесенням на їх приймочки пилку батьківської форми безпосередньо після кастрації або у найближчі 1-2 доби [1]. 1 UA 83962 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Якщо гібридна селекція ведеться на стерильній основі, то для цієї мети використовується декілька експериментальних підходів: присутність ознаки ядерної стерильності або індукування чоловічої стерильності у материнських форм за допомогою поверхневої обробки рослин різними хімічними речовинами (регуляторами росту - ГМК (гідразит малеїнової кислоти), НОК (нафтилоцтової кислоти), 2,4-Д та гаметоцидами), обробка рентгенівськими променями. За умов ядерної стерильності перед схрещуванням у материнських форм видаляються фертильні рослини [1]. Гібриди перцю на стерильній основі також одержують на основі використання маркерної ознаки у поєднанні із чоловічою стерильністю материнської лінії. За наявністю такої ознаки негібридні рослини видаляють у фазі проростків, перед посадкою на постійне місце та за умов проведення контролю чистоти гібридного насіння під час появи сходів [10]. Усі вищенаведені способи одержання гібридів F1 потребують підтримання генетичної стабільності як батьківських компонентів, так і їх гібридного потомства. Перспективне впровадження способу одержання апоміктичного насіння дасть можливість значно спростити і здешевити селекційний процес, оцінити більшу кількість генетичних джерел для створення батьківських ліній та провести прискорену генетичну стабілізацію покоління F1. Задачею корисної моделі є розробка ефективного способу одержання апоміктичного насіння селекційно-цінних генотипів перцю солодкого. Для вирішення поставленої задачі пропонуються наступні маніпуляції з рослинним матеріалом (креслення). В ранкові часи (6-8 години доби) на рослинах перцю солодкого, на яких планується отримати апоміктичне насіння, виділяють пуп'янки, які мають розкритися за 2-3 доби і у зав'язях яких, відповідно, містяться вже повністю сформовані зародкові мішки. У пуп'янків пінцетом видаляють колонку з пиляків. Чистоту кастрації контролюють окомірно за допомогою лупи. На приймочки стовпчиків кастрованих пуп'янків перцю солодкого наносять пилок рослин несумісного з видом Capsicum spec. L. міжвидового гібриду - петунії садової (Petunia axillaris Petunia integrifolia), яка за розміром квітки належить до групи мультифлора (Petunia multiflora). Потім за допомогою мікропіпетки на основу стовпчиків кастрованих нерозкритих квіток наносять 10-30 мкл апоміктичного агенту, який складається з водної суміші регуляторів росту гіберелінової дії (гіберелової кислоти, промислова марка речовини – ГК3) та цитокінінової дії (6бензиламінопурину, промислова марка речовини 6-БАП). Молярне співвідношення суміші ГК3 і 6-БАП у апоміктичному агенті 163:140 мкмоль/л, діючі концентрації ГК3-56,4 мг/л і 6-БАП31,5мг/л. Оброблені вищевказаним способом кастровані пуп'янки ізолюють ватяними або пергаментними ізоляторами і проводять у подальшому спостереження за їх ростом. Після зняття ізоляторів проводять фенологічні спостереження за ростом плодів до стадії біологічної стиглості. Для одержання апоміктичного насіння ліній, гібридів F1 та інших селекційно-цінних генотипів перцю солодкого використовують рослини репродуктивної фази розвитку на початковій стадії формування квіток першого і другого ярусів. На кресленні зображено черговість проведення маніпуляцій з рослинним матеріалом. Запропонований спосіб одержання апоміктичного насіння був апробований на селекційноцінних генотипах перцю солодкого української селекції протягом 2008-2012 років. Для демонстрації ефективності даного способу в описі до патенту наведено результати його випробувань за 2008, 2011 і 2012 роки. Як об'єкти досліджень у 2008 році використовувалися 44 генотипи, у 2011 році - 6 генотипів, у 2012 році -13 генотипів перцю солодкого. Аналіз отриманих результатів свідчить про високий вплив генотипу перцю на формування апоміктичного насіння. У більшості вивчених генотипів у 2008 році спостерігалося формування безнасінних, партенокарпічних плодів, які фенотипово були схожими з плодами, утвореними в результаті факультативного самозапилення (табл. 1). З 44 вивчених селекційно-цінних форм перцю солодкого у 5 була знайдена здатність до формування апоміктичного насіння за запропонованих способів обробки. Серед них сорти Антей і Ніжність, лінії - Л-32/1, т№ 10 і LХП16/9. Кількість сформованого апоміктичного насіння варіювала у різних генотипів перцю солодкого. В фазі біологічної стиглості, в одному плоді у лінії Л-32/1 виявлено 25 насінин, у лінії т№ 10 сформовано два плоди з 46 і 113 насінинами, відповідно, у лінії LXI1-16/9 сформувався один плід із 13 насінинами. У сорту Ніжність сформувався один плід з 1 насіниною і у сорту Антей один плід з 5 насінням. Після рандомізованої вибірки 5 плодів в контрольному варіанті досліду при звичайному факультативному запиленні середньостатистична кількість насіння, утвореного в плодах у всіх випробуваних ліній варіювала від 100,4±15,7 до 234,5±19,6 зразків. У сортів 2 UA 83962 U Ніжність і Антей, даний статистичний показник був на рівні 209,2±21,8 і 225,5±21,8 зразків, відповідно (табл. 1). Таблиця 1 Формування апоміктичного насіння у генотипів перцю солодкого після запропонованого способу обробки кастрованих пуп'янків, 2008 р. Генотип перцю солодкого с. Антей с. Ніжність лінія Л-32/1 лінія т№ 10 лінія LХП-16/9 Всього: Спосіб одержання насіння в результаті запропонованого способу обробки кастрованих пуп'янків з метою стимуляції росту в результаті незапліднених насіннєвих зародків факультативного самозапилення*, шт. плодів з всього одержано сформованих (контроль) апоміктичним апоміктичного насіння у плодів, шт. насінням, шт. плодах, шт. 225,5±21,8 5 1 5 209,2±18,4 6 1 1 100,4±15,7 4 1 25 234,5±19,6 6 2 159 148,7±18,5 3 1 13 24 6 203 * Примітка - обчислення кількості сформованого насіння у плодах за умов факультативного самозапилення представлено у формі середньостатистичного показника за умов 5-ти кратній повторності досліду, при цьому плоди відбиралися з тих же рослин, на яких формувалися дослідні зразки плодів. 5 10 15 У 2011 році запропонований метод одержання апоміктичного насіння був застосований до 2 сортів перцю солодкого Фея і Велетень та 4 ліній - Світлячок сторчкуватий, Світлячок пониклий, Лада χ Антей і Валюша типова. У цьому досліді зі 100 кастрованих пуп'янків сформувалося 38 плодів, з яких 7 мали апоміктичне насіння. Зокрема, в одному плоді лінії Валюша типова було виявлено 5 шт. насіння, в одному плоді лінії Лада х Антей - 10 шт. насіння, у двох плодах лінії Світлячок пониклий - 42 шт. насіння, у трьох плодах лінії Світлячок сторчкуватий - 68 шт. насіння. У всіх досліджених генотипів перцю солодкого сформувалися, також, безнасінні партенокарпічного типу плоди (загальною кількістю 31 шт.), які за фенотипом були схожі на плоди, які зазвичай утворюються в результаті факультативного самозапилення (табл. 2). Після рандомізованої вибірки 5 плодів в контрольному варіанті досліду при звичайному факультативному запиленні середньостатистична кількість насіння, утвореного в плодах у всіх випробуваних ліній варіювала від 137,8±19,8 до 167,4±15,5 зразків. У сортів Фея і Велетень апоміктичного насіння виявлено не було. 3 UA 83962 U Таблиця 2 Формування апоміктичного насіння у генотипів перцю солодкого після запропонованого способу обробки кастрованих пуп'янків, 2011 р. Генотип перцю солодкого лінія Валюша типова лінія Лада  Антей лінія Світлячок пониклий лінія Світлячок сторчкуватий Всього: Спосіб одержання насіння в результаті запропонованого способу обробки кастрованих пуп'янків з метою стимуляції росту в результаті незапліднених насіннєвих зародків факультативного самозапилення *, шт. плодів з всього одержано сформованих (контроль) апоміктичним апоміктичного насіння у плодів, шт. насінням, шт. плодах, шт. 137,8±19,8 5 1 5 145,3±24,7 8 1 10 158,5±20,2 11 2 42 167,4±15,5 14 3 68 38 7 125 *Примітка - обчислення кількості сформованого насіння у плодах за умов факультативного самозапилення представлено у формі середньостатистичного показника за умов 5-ти кратній повторності досліду, при цьому плоди відбиралися з тих же рослин, на яких формувалися дослідні зразки плодів. 5 10 Як показали подальші дослідження здатність до апогамії є генетично успадкованою ознакою, оскільки ті відібрані, первинні генотипи, які виявилися лабільними до застосованих умов обробки кастрованих пуп'янків були здатними формувати апоміктичне насіння протягом наступних поколінь. Завдяки цьому встановленому експериментальному факту вдалося протягом 2009-2011 років прискорено отримати генетично-стабільні лінії перцю солодкого, які по суті є першим і другим поколінням, утвореним в результаті апоміктичного розмноження. У 2012 році в умовах захищеного ґрунту вирощувалося 10 ліній-апоміктів перцю солодкого (К-30314 Д183А, К-30315 Д184А, К-30316 Д185А, К-30317 Д185А, К-30318 Д187А, К-30319 Д194А, К-30320 Д195А, К-30321 Д201А, К-30325 Д204А, К-30323 Д203А), які у попередні роки випробувань виявилися чутливими на запропоновану обробку кастрованих пуп'янків і формували апоміктичне насіння. Дані по цьому досліду зведені у таблиці 3. 4 UA 83962 U Таблиця 3 Вплив генотипу лінії перцю солодкого на формування апоміктичного насіння, 2012 р. № п/п Генотип перцю солодкого 1. К-30314 Д183А 2. К-30315 Д184А 3. К-30316 Д185А 4. К-30317 Д185А 5. К-30318 Д187А 6. К-30319Д194А 7. К-30320 Д195А 8 К-30321 Д201А 9. К-30325 Д204А 10. К-30323 Д203А 11. 01k-30489L.б.к. 12. К-30487 с. Піонер 13. К-30486 с. Дружок Всього: Спосіб одержання насіння в результаті запропонованого способу обробки кастрованих пуп'янків з метою стимуляції росту незапліднених насіннєвих зародків в результаті факультативного всього самозапилення*, плодів з апоміодержано сформованих шт. (контроль) ктичним апоміктичного плодів, шт. насінням, шт. насіння у плодах, шт. 161,2±1,3 1 1 2 256,1±0,6 1 1 6 93,4±2,2 1 1 4 55,3±1,7 1 1 5 413,3±2,8 1 1 12 332,9±4,5 1 1 7 388,4±2,9 2 2 28(16+12) 271,4±2,5 1 1 8 267,5±3,9 1 1 2 89,3±4,7 1 1 8 351,4±3,9 2 2 26(14+12) 283,5±3,1 2 2 20 (8+12) 464,2+6,9 1 1 12 16 16 140 *Примітка - обчислення кількості сформованого насіння у плодах за умов факультативного самозапилення представлено у формі середньостатистичного показника за умов 5-ти кратній повторності досліду, при цьому плоди відбиралися з тих же рослин, на яких формувалися дослідні зразки плодів. 5 10 15 20 25 У чутливих ліній перцю після кастрації 5-7 пуп'янків і використання запропонованого способу їх обробки загалом зав'язувалося по 1-2 плоди на одній експериментальній рослині. Майже всі вирощені плоди були з наявністю повністю сформованого апоміктичного насіння, формування партенокарпічних плодів нами не спостерігалося. Залежно від генотипу лінії його кількість варіювала від 2 до 16 насінин в одному плоді. Всього від 13 чутливих ліній одержано 16 плодів, у яких виявлено 140 зразків апоміктичного насіння. Найбільшу його кількість зареєстрованого у лінії К-30320Д195А - 16 зразків, найменшу у ліній К-30314Д183А і К-30325Д204А - по 2 зразки. У ліній К-30320 Д195А, 01к-30489 L.б.к… і К-30487 с. Піонер, вдалося одержати по 2 плоди зі сформованим насінням, ці ж лінії відзначилися найвищою насіннєвою продуктивністю - 28, 26 і 20 насінин з однієї рослини, відповідно. За умов факультативного самозапилення у випробуваних генотипів кількість сформованого насіння варіювало в межах від 55,3±1,7 до 464,2±6,9 зразків. При цьому у різних генотипів частка апоміктичного насіння відносно насіння, що утворилося внаслідок факультативного самозапилення становило 0,7-9 %. За морфологією вегетативних органів, габітусу куща та іншими морфологічними ознаками рослини-апомікти були ідентичними материнським формам, від яких вони були похідні. Джерела інформації: 1. Куракса Н.П. Рід перець (Capsicum Tourn.) / Н.П. Куракса, А.В. Мельник // Сучасні методи селекції овочевих і баштанних культур. - Харків, 2001.-С. 287-300. 2. Тоцький В.М. Генетика / Владлен Николаевич Топкий. - Одесса: Агропринт, 2002.-712 с. 3. Ivett Barany. Microspore-derived embryogenesis in pepper (Capsicum annuum L.): subcellular rearrangements through development / Ivett Barany., Pablo Gonzalez-Melendi, Begona Fadon, Judit Mitykof and other // Biol. Cell-2005. -V. 97. - P. 709-722. 5 UA 83962 U 5 10 15 20 4. Pawei Nowaczyk. Short communication Effect of selected factors on the effectiveness of Capsicum annuum L. anther culture / Pawei Nowaczyk, Anna Kisiaia. // J. Appl. Genet. - V. 47(2). - P. 113-117. 5. Тимина O.O. Морфогенез сладкого перца в культуре in vitro I O.O. Тимина, Г.И. Седов, П.К. Кинтя, Е.С. Демидов // Известия АН МССР, серия биологических и химических наук.-1987, №2. - С. 35-37. 6. Yudin В. F. Towards regular apomixis in maize, achieved by experiment / B. F. Yudin, V. A. Sokolov // Genetic Manipulation in Plants-1989, V.5. - P. 36-40. 7. Кашин А.С. Гаметофитный апомиксис: анализ причин и последствий реализации у цветковых: На примере популяций некоторых видов Asteraceae: дис. … доктора биол. наук: 03.00.05 / Кашин А.С. - Саратов, 2004.-390 с. 8. Пат. 2035134 Российская Федерация, МПК А01Н 1/04, A 01N 43/40, 61/00. / Способ получения гомозиготных диплоидов сельскохозяйственных культур. Курбатов В.Г.; заявитель и патентообладатель Курбатов Владимир Геннадиевич. - № 4928829/13; заявл. 23.01.91; опубл. 20.05.95, Бюл. № 14. 9. Eenink А.Н. Matromorphy in Brassica oleracea L. Ш. The influence of temperature, delayed prickle pollination and growth regulation on the number of matromorphic seeds formed / Eenink A.H. // Euphytica-1974. - V. 23. - P. 711-718. 10. Eenink A.H. Matromorphy in Brassica oleracea L. IV. Formation of homozygous and heterozygous diploid products of gametogenesis and qualitative genetical research on matromorphic plants / Eenink A.H. // Euphytica-1974. - V. 23. -P. 719-724. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб стимуляції росту незапліднених насіннєвих зародків перцю солодкого (Capsicum spec. L.) для одержання апоміктичного насіння, який відрізняється тим, що включає обробку кастрованих нерозкритих квіток водною сумішшю регуляторів росту (цитокінінів і гіберелінів), нанесення на приймочки кастрованих пуп'янків пилку рослин петунії садової (Petunia axillaris Petunia integrifolia, група Petunia multiflora), яка є несумісною з рослинами перцю солодкого (вид Capsicum spec L.). Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6