Спосіб визначення вірулентності збудників дерматомікозів тварин

Реферат: Спосіб визначення вірулентності штамів збудників дерматомікозів тварин ґрунтується на застосуванні скарифікованої шкіри тварин під час визначення патогенності дерматофітів, вирощених на щільному живильному середовищі. Культуру дерматофіту наносять опосередковано на мацеровану шкіру молодих статевонезрілих тварин. UA 90118 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ВІРУЛЕНТНОСТІ ЗБУДНИКІВ ДЕРМАТОМІКОЗІВ ТВАРИН UA 90118 U UA 90118 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, а саме до ветеринарної мікології, зокрема до способів визначення вірулентності штамів патогенних дерматофітів в процесі селекції виробничих і контрольних штамів - продуцентів ефективних протективних антигенів дерматофітів під час створення засобів специфічної профілактики. Перший етап застосування шкіри як тест-об'єкту розпочали під час визначення токсичності плісеневих культур грибів та кормів, контамінованих токсигенними грибами. Відомо, що Ятель у 1937-1938 роках під час розшифрування "невідомого захворювання" на території України застосував шкіру кролів для визначення токсичності виділеного гриба St. alternans та токсичності грубого корму. При цьому на стегно або лопатку кроля ефірний екстракт від гриба або корму наносився двічі з інтервалом 24 години на попередньо вистрижену шерсть шкіри розміром 4×6 см, шляхом аплікації. Реакцію враховували щодня, протягом 7 діб [Пидопличко М.М.. Грибная флора грубых кормов. - К.: Изд-во АН УССР, 1953. - 486 c.]. Недоліком цього методу є те, що не гриб проявляв дію на шкіру епідерміса, а вторинні продукти метаболізму мікроміцету - мікотоксини. Експрес-метод визначення токсичності концентрованних кормів на шкірі поросят (М.С. Даньшина, Н.С. Даньшин, Л.T. Цимбалюк, Ф.І. Мандрик, 1985). Метод шкірної проби на 1,5-2місячних поросят дозволяє скоротити на 3-7 діб час проведення дослідження та своєчасно запобігти отруєнню тварин кормів, що містять мікотоксини. Суть експрес-методу полягає в наступному: для екстрагування мікотоксину наважку 100 г досліджуваного корму поміщають в 3 конічну колбу ємністю 500 мл з притертою пробкою і заливають 200 см ефіру або спиртовоефірною сумішшю в рівних об'ємах, настоюють протягом 24 годин при кімнатній температурі, періодично струшуючи колбу. Потім рідку частину суміші фільтрують у фарфорову чашку через паперовий фільтр, попередньо промитий невеликою порцією ефіру, і чашку поміщають в витяжну шафу для випаровування ефіру. Готовий екстракт має вигляд рослинної олії. Якщо екстракт сухий в таких випадках додають 2-3 краплі рослинної олії або риб'ячого жиру і змішують. Для постановки шкірної проби використовують 1,5-2-місячних поросят з непігментованою шкірою. На лопатці, боці або стегні гладко вистригають та оголюють ділянку розміром 4×6 см і пластмасовим шпателем наносять 0,70-0,75 г екстракту, втираючи його в шкіру. Ураження шкіри під час підготовки до зараження не допускається, тому що, при попаданні екстракту в рани розвивається запальна реакція і оцінювання шкірної проби не можливо. Екстракт наносять двічі з інтервалом в 24 години. На одного порося можна наносити екстракти не більш 4-х проб корму. Повторно можна використовувати одного і того ж порося тільки в тому випадку, якщо всі поставлені шкірні проби дали негативні результати. Оцінювання реакції проводять щодня. Найбільш характерні зміни відзначають на 3-5-й день, але іноді реакція досягає свого найбільшого розвитку тільки на 7-й день. За глибиною та характером запальної реакції на місці нанесення екстракту судять про токсичності корму, ураженого грибами. Розрізняють чотири ступені запальної реакції: I ступінь - гіперемія, підвищена чутливість шкіри, лущення (виникає під дією дуже слаботоксичних кормів); II ступінь - гіперемія, болючість потовщення шкіри, дрібні поодинокі пухирці, ексудація, лущення (викликають слаботоксичні корми); III ступінь - гіперемія, сильне потовщення шкіри, болючість, складчастість шкіри, тріщини, сухий поверхневий некроз, іноді виразки, суцільний тонкий струп (виникають під дією токсичного корму); IV ступінь - гіперемія, сильний набряк, який виступає у вигляді масивного валу на нижній межі вогнища, глибокий сухий некроз, захоплюючий і підшкірну клітковину, нерідко виникають виразки, що довго не загоюються, струп товстий, суцільний (викликають сильнотоксичні корми). За Н.А. Спесивцевой (1964), реакція на шкірі кроля дозволяє визначити чотири ступені токсичності кормів і культури грибів: І ступінь (дуже слаботоксичні) - почервоніння, підвищена чутливість шкіри, лущення; II ступінь (слаботоксичні) - почервоніння, болючість, незначне потовщення шкіри, лущення, дрібні одиночні, з просяне зерно або менше, жовтуваті бульбашки; III ступінь (токсичні) - почервоніння, сильне потовщення, болючість, складчастість шкіри, на всій поверхні вогнища жовтуваті бульбашки, сухий поверхневий некроз, іноді виразки і суцільний тонкий струп; IV ступінь (різкотоксичні) - почервоніння, сильний набряк, який виступає у вигляді валика на нижній межі вогнища, глибокий сухий некроз. Другий етап застосування шкіри тварин, як тест-об'єкта почали використовувати під час 1 UA 90118 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 визначення патогенності дерматофітів - збудників дерматомікозів тварин. Під час вивчення патогенності збудників дерматомікозів [Курасова В.В. та ін., 1971] з метою відтворення шкірних захворювань, було запропоновано два прийоми нанесення культури гриба на шкіру тварин: аплікації та втирання. Суть першого способу полягає в тому, що на гладко вистрижену, неуражену шкіру накладають культуру (плівку) гриба і закривають зверху пластиром або пов'язкою. Цей метод зараження інакше називають аплікаційним. Аплікацію роблять 3 дні підряд. Спостереження за розвитком патологічного процесу ведуть протягом 10 діб. Можна використовувати патологічний матеріал (волосся, лусочки) або культуру гриба. Цей матеріал або культуру разом з агаром розтирають між двома листочками наждачного паперу, потім цим листочком обережно (уникаючи не до появи крові) втирають культуру (патологічний матеріал) в епільовану поверхню шкіри. Під час такого втирання пошкоджується епідерміс шкіри, що сприяє проникненню патогенного гриба. Суть другого способу полягає в тому, що досліджуваний матеріал розтирають у ступці і наносять на попередньо скарифіковану шкіру. Щоб уникнути зализування чи розчісування, на вражені місця накладають суху пов'язку. Втирання матеріалу проводять протягом 2-3 днів, один раз на день (одноразово). Перші ознаки розвитку патологічного процесу спостерігають на 3-4-й день. Характерна картина ураження настає на 8-10-й день після втирання. Розвиток гриба встановлюють при мікроскопічному дослідженні волосся і лусочок з уражених ділянок. Проте цей метод не дозволяє об'єктивно оцінювати вірулентність штамів грибів, що вивчаються оскільки при нашкірній аплікації не відоме фактичне число клітин, що викликало експериментальний дерматомікоз. С.В. Петрович (1976) після нанесення нашкірне культур дерматофітів з метою вивчення напругі імунітету при трихофітії розрізняє наступні клінічні ознаки: - сильний ступінь ураження - значна гіперемія, масивна інфільтрація, товсті кірочки; - середній ступінь ураження - значна гіперемія, інфільтрація та ексудативні явища виражені менш яскраво, помітні окремі вогнища; - слабкий ступінь ураження - незначна гіперемія, поява декількох невеликих вогнищ, значне лущення. Так, Іванова Л.Г. у 1978 році під час встановлення патогенності дерматофітів, виділених від сприйнятливих до дерматомікозів тварин, застосовувала метод нашкірного зараження на морських свинках і кролях. Суть методу полягає в тому, що культури грибів, які виросли протягом 10-20 днів у пробірках на твердих живильних середовищах, витягували посівною голкою разом із середовищем і, суворо дотримуючи асептику, гомогенізували у стерильній ступці до здобуття однорідної кашкоподібної маси. У морських свинок і кроликів в області стегна, спини або лопаток вистригали ділянку шкіри розміром 3×3 см, протирали її 70°-ним спиртом і злегка скарифицировали лезом бритви або наждачним папіром, не допускаючи при цьому появи крові. На підготовлену ділянку шкіри скляною лопаткою втирали невелику кількість грибної маси так, щоб вона покривала шкіру тонкою плівкою. Описаний спосіб приготування культур для зараження тварин можна з успіхом замінити іншим, менш трудомістким, а саме у пробірку з вирослою культурою гриба додати невелику кількість стерильної води або фізіологічного розчину, піпеткою провести по поверхні колонії, добре перемішати грибний інокулят і нанести дві-три краплі суспензії на скарифіковану шкіру. Заражали тварин одноразово. Проте цей метод не дозволяє об'єктивно оцінювати вірулентність штамів грибів, які вивчаються, оскільки аплікації невідомо фактична чисельність клітин, яка викликала експериментальний дерматомікоз, бо з поверхні шкіряно-волосяного покриву частину нанесеної суспензії збудника може бути механічно усунено злизуванням або почухуванням об стіни вольєрів тощо. Проте, спроби диференціації вірулентності штамів патогенних дерматоміцетів, збудників дерматомікозів тварин на основі будь-якого тест-критерію практично відсутні у науковій літературі. В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб простий, доступний для виконання навіть у скромно оснащених лабораторіях та ефективний для визначення вірулентності патогенних штамів дерматофітів, виділених від хворих тварин під час постановки діагнозу на дерматомікоз у великих та дрібних свійських тварин, з використанням доступних тест-об'єктів - молодих статевонезрілих тварин: миші, морські свинки, цуценята, кошенята, кроленята, телята тощо. У кожному конкретному випадку підбирають окремий вид тварин із високою чутливістю шкіри до комплексної дії всіх елементів гриба (міцелій, мікроконідії, 3 макроконідії, артроспори, хламідоспори). Доводили концентрації суспензії до 2-4 млн/см елементів гриба. 2 UA 90118 U 5 10 15 20 25 30 Поставлена задача вирішується cпособом визначення вірулентності штамів збудників дерматомікозів тварин, що ґрунтується на застосуванні скарифікованої шкірі тварин під час визначення патогенності дерматофітів вирощених на щільному живильному середовищі, згідно з корисною моделлю, культуру дерматофіту наносять опосередковано на мацерировану шкіру молодих статевонезрілих тварини. При цьому оцінювання ступеня вірулентності дерматофітом проводять після повторного рецидиву патологічного вогнища. За характером розвитку дерматофіту в шкірних покривах і терміном перебігу шкірну реакцію поділяють на чотири ступені вірулентності: високовірулентні, середньовірулентні, слабовірулентні, авірулентні. В кожному випадку підбирають відповідний до виду тест-об'єкт, використовуючи шкіру молодих статевонезрілих сприйнятливих до захворювань тварин (миші, щури, морські свинки, цуценята, кошенята, кроленята, телята тощо). На користь застосування шкіри статевонезрілих молодих тварин для визначення вірулентності штамів патогенних дерматоміцетів вказує наступне: - висока чутливість шкіри молодих статевонезрілих тварин до патогенних штамів дерматофітів; - оцінювання проводять після повторного рецидиву вогнища (через 10-14 діб); - у кожному випадку під час захворювання дерматомікозом підбирають відповідний чутливий тест-об'єкт до певного виду тварин; - фізична і економічна доступність тест-об'єктів; - гуманітарний підхід, пов'язаний зі збереженням здоров'я тварин. Спосіб здійснюють наступним чином. 1. Приготування суспензії клітин дерматоміцетів і підрахунок їх концентрації В пробірки з вирощеною протягом 15-20 діб культурою гриба на сусло-агарі, добавляють по 3 5 см стерильного фізіологічного розчину, мікологічним гачком розпушують поверхню культури і ретельно перемішують отриману суспензію. Далі готують послідовні розведення суспензії, використовуючи стерильний 0,85 %-й розчин NaCl у співвідношенні 1:10; 1:20 або 1:40, в залежності від її густини. Кількість мікроконідій (усіх елементів гриба) підраховують за допомогою камери Горяєва. Спочатку визначають концентрацію мікроконідій у найменшому розведенні, а, за необхідності, коли вона надто велика, - у наступних розведеннях. Підрахунок мікроконідій здійснюють у 5 великих квадратах (4 по кутах та 1- в центрі). 3 Вміст мікроконідій (усіх елементів гриба) в 1 см суспензії визначають за формулою. ПВ  Р  10 4  5 , 2 де K - шукане число мікроконідій; П - кількість мікроконідій у 5 великих квадратах першої сітки; В - число мікроконідій у 5 великих квадратах другої сітки; Р - розведення. K 35 40 45 50 55 Після підрахунку мікроконідій у вихідній суспензії концентрацію останніх доводять, додаючи 8 7 0,85 %-й розчин NaCl, до 1×10 . Далі готують ряд послідовних 10-кратних розведень (1×10 ; 6 5 4 3 3 1×10 ; 1×10 ; 1×10 ; 1×10 ). Для цього у 5 пробірок наливають по 4,5 см стерильний 0,85 %-й 3 розчин NaCl. У першу з них вносять 0,5 см суспензії мікроконідій, що досліджується, ретельно 3 перемішують і новою піпеткою відбирають 0,5 см суспензії цього розведення та переносять у наступну пробірку і т. д., щоразу використовуючи нову стерильну піпетку. Таким чином, концентрація клітин в кожній наступній пробірці зменшується в 10 разів і становить у першій 7 6 5 1×10 , у другій - 1×10 , у третій - 1×10 і т.д. Враховуючи, що при зараженні дослідним тваринам 3 6 5 буде введено по 0,1 см суспензії, загальна доза, що заражує, складатиме 1×10 ; 1×10 і так 3 далі клітин в 0,1 см . На відміну від загальноприйнятих методів визначення концентрації, де підраховують лише мікроконідії, в запропонованій методиці враховуються всі елементи гриба (макроконідії, міцелій, мікроконідії, артроспори, тощо), все що зустрічається в полі зору, оскільки вони також являються носіями вірулентності. Даний прийом дозволяє найбільш точно оцінювати вірулентність дерматофітів. 2. Зараження молодих тварин Зараження молодих тварин (миші, щури, морські свинки, цуценята, кошенята, кроленята, телята тощо) проводять нашкірне в ділянці спини, за лопатками. Заздалегідь, залежно від виду тварини, ділянку розміром від 0,5×0,5 см до 6×6 см, вистригають та голять. Шкіру обробляють 70 %-м розчином етилового спирту та мацерують зворотною стороною скальпеля до прояву ознак виразної гіперемії. Далі кожне розведення інфікуючого матеріалу суспензії комплексом 3 елементів гриба (міцелій, мікроконідій, макроконідій, артросмори тощо) в об'ємі 0,1 см наносять на підготовлену ділянку шкіри та легенько втирають шпателем. Кожним розведенням заражають як найменше 4 тварин. Не менше двох тварин залишають контрольними. Їх 3 UA 90118 U 5 "заражають" плацебо - розчином 0,85 % NaCl. Результати зараження визначають на 10-14-ту добу з моменту інфікування, спостереження здійснюють через кожні 3 доби, до зникнення клінічних ознак хвороби. В разі позитивного результату зараження, у місці аплікації суспензії виявляють характерні для дерматомікозу ознаки (утворення струпів, лусочок або скориночок та ін.). Інфікуючу середню дозу (ІД 50) визначають за методикою Кербера. Розрахунок середньої інфікуючої дози (ІД50) здійснюють за формулою: Ig IД 50  Ig Д  10 15 20 25 Ig d  Ig d   r , n 2 де Д - вища доза, що обумовлює 100 % ефект зараження; d - коефіцієнт розведення; n - число заражених тварин на кожне розведення; r - кількість хворих на кожне розведення;  - сума відношення хворих тварин до інфікованих для усіх розведень, що дають ефект зараження 0-100 %. 3. Оцінювання ступеня вірулентності штамів патогенних дерматофітів В залежності від вірулентності штаму дерматофіту, він не викликає дерматомікоз або ж обумовлює у заражених тварин різний прояв захворювання. За цією характеристикою штами збудників дерматофітів поділяють на високовірулентні, середньовірулентні, слабовірулентні, авірулентні. Високовірулентні штами (+++) обумовлюють яскраві клінічні ознаки захворювання, з утворенням великих струпів та лусочок, значну гіперемію. Середньовірулентні (++) - розвиток патологічного процесу з утворенням великих і дрібних лусочок, гіперемію. Слабовірулентні (+) - ледь помітні ознаки дерматомікозу - утворення дрібних лусочок, незначну гіперемію. Авірулентні (±) штами ознак захворювання не проявляють. Порівняльні результати оцінювання ступеня вірулентності патогенних дерматофітів на молодих статевонезрілих тваринах на 10-14 добу спостережень після зараження їх суспензією 3 комплексом всіх елементів дерматофіту дозою 2-4 млн/см (див. табл. 1). 30 Таблиця 1 Вид тварин 1 Миші Щури Морські свинки Крольчата Кошенята Цуценята Телята Ступінь вірулентності дерматофітів Trichophyton Microsporum Trichophyton Microsporum canis, mentagrophytes, штам gypseum, штам verrucosum, штам 8 штам 33 134 201 2 3 4 5 ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ + Порівняльні результати оцінювання ступеня вірулентності патогенних дерматофітів на статевозрілих тваринах на 10-14 добу спостережень після зараження їх суспензією комплексом 3 всіх елементів дерматофіту дозою 2-4 млн/см (див. табл. 2). 35 4 UA 90118 U Таблиця 2 Вид тварин 5 10 15 20 25 30 Ступінь вірулентності дерматофітів Trichophyton Microsporum Trichophyton Microsporum canis, mentagrophytes, штам gypseum, штам verrucosum, штам 8 штам 33 134 201 + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ Миші Щури Морські + ++ ++ + свинки + ++ + + Кролі + ++ ++ ++ Коти + ++ ++ ++ Собаки Велика рогата ++ ++ + ± худоба Отже заявлюваний спосіб дозволить визначення вірулентності збудників дерматомікозів тварин навіть у скромно оснащених лабораторіях та ефективний для визначення вірулентності патогенних штамів дерматофітів, виділених від хворих тварин під час постановки діагнозу на дерматомікоз у великих та дрібних свійських тварин, з використанням доступних тест-об'єктів молодих статевонезрілих тварин: миші, морські свинки, цуценята, кошенята, кроленята, телята тощо. Джерела інформації: 1. Даньшина М.С., Даньшин Н.С., Тимчук В.Ф. Атлас токсичных грибов, поражающих корма / Даньшина М.С., Даньшин Н.С., Тимчук В.Ф. - Кишинев: Изд-во Штиница, 1985. - 91 с. 2. ГОСТ 13496.7-92. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности. - М.: Изд-во стандартов, 1976, 1992. 3. Зайченко О.М. Микотоксины микромицетов / О.М. Зайченко. - К. Наукова думка, 2006. 320 с. 4. Иванова Л.Г. Результаты сравнительного изучения патогенности дерматофитозов на лабораторных животных/ Л.Г. Иванова. - М.: Бюллетень ВИЭВ, 1978. - № 32. - С. 40-42. 5. Курасова В.В. Методы исследования в ветеринарной микологии / Курасова В.В., Костин В.В., Малиновская Л.С. - М.: Колос, 1971. - С. 117-119. 6. Лабораторные исследования в ветеринари: биохимические и микологические: справочник / под ред. В.Я. Антонова. -М.: Агропромиздат, 1991. - 287 с. 7. Методы экспериментальной микологии / под ред. В.Й. Билай.- К.: Наукова думка, 1991 - с. 8. Пидопличко Н.М. Грибная флора грубых кормов / Н.М. Пидопличко. - К.: Изд-во АН УССР, 1953. - 482 с. 9. Петрович С.В. Экспериментальное изучение иммунитета при трихофитии // С.В. Петрович. - Вестн. дерматологи и венерологи. - 1976. -№ 5. - С. 36-40. 10. Рухляда В. Трихофітія кролів / Рухляда В., Петельна О., Денисенко І. та ін. // Ветеринарна медицина України. - 1998. - № 2. - С. 12-23. 11. Саркисов А.Х. Диагностика грибных болезней (микозов и микотоксикозов) животных / Саркисов А.Х., Королева В.П., Квашнина Е.С., Г резин В.Ф. - М.: Колос, 1971. - 142 с. 12. Спесивцева Η.А. Микозы и микотоксикозы / Η.Α. Спесивцева. -Μ.: 1964. - 517 с. 13. Харченко С.М. Справочник по микозам и микотоксикозам сельскохозяйственных животных / Харченко С.Μ., Литвин В.П., Тарабара И.М. - К.: Уражай, 1982. - 167 с. 12 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 1. Спосіб визначення вірулентності штамів збудників дерматомікозів тварин, що ґрунтується на застосуванні скарифікованої шкіри тварин під час визначення патогенності дерматофітів, вирощених на щільному живильному середовищі, який відрізняється тим, що культуру дерматофіту наносять опосередковано на мацеровану шкіру молодих статевонезрілих тварини. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що оцінювання ступеня вірулентності дерматофітом проводять після повторного рецидиву патологічного вогнища, а за характером розвитку дерматофіту в шкірних покривах і терміном перебігу шкірну реакцію поділяють на чотири ступені вірулентності: високовірулентні, середньовірулентні, слабовірулентні, авірулентні. 5 UA 90118 U 3. Спосіб за п. 1 , який відрізняється тим, що в кожному випадку підбирають відповідний до виду тест-об'єкт, використовуючи шкіру молодих статевонезрілих, сприйнятливих до захворювань тварин (миші, щури, морські свинки, цуценята, кошенята, кроленята, телята тощо). Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6