Людський r-lh

1. Людський г-LH, який має питому біоактивність від 20522 МО/мг до 31229 МО/мг та складається з -ланцюга і β-ланцюга, які мають такі послідовності амінокислот: -ланцюг: , (11) 92145 (21) a200612399 (22) 22.01.2001 (24) 11.10.2010 (31) 00103692.0 (32) 22.02.2000 (33) EP (62) 2002086889, 22.01.2001 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) ПАРАДІЗІ ДЖАНФРАНКО, IT, РОССІ МАРА, IT, СКАГЛІЯ ЛАУРА, IT (73) МЕРК СЕРОНО С.А., CH (56) WO9002757 A, 22.03.90. WO9858957 A, 30.12.98. WO9009800 A, 07.09.90. WO9820039 A, 14.05.98. EVANGELISTA DYR AND J. SUTTNAR: "Separation and purification of recombinant proteins" J. 2 (13) 1 (19) UA β-ланцюг: 2. Людський r-LH за п. 1, який має питому біоактивність приблизно 25000 МО/мг. 3 Галузь, якої стосується винахід Цей винахід стосується способу очищення лютеїнізуючого гормону (LH), зокрема, очищення рекомбінантного LH (r-LH) зі зразка неочищеного рекомбінантного LH, який включає комбіноване використання іонообмінної хроматографії та рідинної хроматографії високої ефективності (РХВЕ) з оберненою фазою. Лютеїнізуючий гормон (LH) є гонадотропіном, який виділяється передньою часткою гіпофізу разом з іншим гонадотропіном, гормоном стимуляції яєчників (FSH). Ці гормони являють собою гетеродимери, що складаються з - і -субодиниць, зв'язаних нековалентно. Ці гонадотропіни стимулюють нормальне функціонування гонад та секрецію статевих гормонів як у чоловіків, так і в жінок. У жінок гормон стимуляції яєчників стимулює розвиток та визрівання фолікулів та яйцеклітин. В процесі розвитку фолікул виділяє у зростаючій кількості естроген, який в середній фазі циклу стимулює вивільнення LH. Це викликає перфорацію фолікула з овуляцією і перетворення фолікула в жовте тіло, яке виділяє прогестерон. У чоловіків лютеїнізуючий гормон стимулює інтерстиціальні клітини яєчок, що виділяють тестостерон, який, у свою чергу, безпосередньо впливає на сім'явиносні канальці. Гонадотропні речовини, що мають здатність стимулювати яєчники або лютеїнізуючу здатність, або обидві ці здатності, використовуються при лікування безплідності, головним чином, у жінок, але також і в чоловіків. До таких речовин належать хоріонічний гонадотропін, який має активність LH, та менопаузні гонадотропіни людини, які мають одночасно активність LH та FSH. Рекомбінантний лютеїнізуючий гормон людини (rechLH), одержаний із ДНК, досліджується як альтернатива хоріонічному гонадотропіну або як засіб, придатний для вживання в комбінації із FSH. Для виділення та очищення LH використовувалися різноманітні способи, такі як іонообмінна, гель-фільтраційна та імуноафінна хроматографія (дивись роботу Джека, Блазека, Джеймса та інших (G.W. Jack, R. Blazek, K. James, I.E. Boyd and L.R. Micklem) "Автоматизоване виробництво глікопротеїнових гормонів гіпофізу людини - тиротропіну, фолітропіну та лютропіну - з використанням імуноафінної хроматографії" (Journal of Chemical Technology and Biotechnology 39, 45-58 (1987)). Для виділення цих гормонів використовується іонообмінна хроматографія, проте цей спосіб, як виявилося, є пов'язаний з деякими проблемами, спричиненими значною гетерогенністю зарядів LH у тканині гіпофізу. По-перше, оскільки значення заряду згаданих глікопротеїнів та FSH взаємно перекриваються, їх повне розділення утруднене та трудомістке. По-друге, очищення цих гормонів у формі окремих фракцій може бути утрудненим (Стокел-Хартрі, Томас, Фурніваль та інші (A. Stockel Hartree, Μ. Thomas, B.E. Furnival, T.W. Bums and P. Langley), "Тироїд-стимуляційна та ліполітична активність очищених препаратів тироїд-стимулювального гормону людини", Journal of 92145 4 Endocrinology 53, 95-100, 1972). Як наслідок, в процесі очищення можуть бути відібрані деякі заряджені форми гормону, як це пропонується у випадку LH (Сторрінг, Заїці, Містрі та інші (P.L. Storring, А.А. Zaidi, Y.G. Mistry, M. Lindberg, B.E. Stenning and E. Diczfalusi), "Зіставлення високочистих препаратів лютеїнізуючого гормону гіпофізу людини: відмінності в ефективності лютеїнізуючого гормону, визначені шляхом біопроб in vitro, in vivo та імунологічних проб", Acta Endocrinologica 101, 339-347, 1982). Селективне очищення додатково ускладнює визначення характеристик цих гетерогенних форм, в тому числі структурний аналіз їхніх вуглеводних компонентів. Основною причиною гетерогенності зарядів LH, можливо, є непостійність вмісту аніонних олігосахаридів, що містять сіалільні та сульфатні групи. Описано використання звичайних способів фракціонування для виготовлення сечового лютеїнізуючого гормону людини (LH) з ефективністю 982 міжнародні одиниці (МО) на міліграм за результатами біопроб та 1166 МО/мг за результатами радіоімунологічного аналізу (С. Доніні, П. Доніні (S. Bonini and P. Donini, Acta endocrin., Copenhagen, 63, Suppl. 142, 257-277, 1969)). Імуноабсорбент сироваткового антитіла кролика до очищеного хоріонічного гонадотропіну людини (HCG) був використаний для очищення LH з основної та побічної фракцій, одержаних у процесі приготування гормону стимуляції яєчників (FSH) з менопаузної сечі (ван-Гелл, Шуурс, Голландер (Н. van Hell, A.H.W.M. Schuurs and F.C. Hollander, in: Symposium on gonadotropins, New York, 17 June 1971, Eds. B.B. Saxena, C.G. Beling and H.M. Gandy, New York, John Wiley & Sons, Inc., 1972). Одержаний препарат мав вищу ефективність LH, але водночас і вищі значення відношення FSH:LH, ніж препарати, виготовлені Доніні та Доніні (1969). Перевага рекомбінантного LH полягає в відсутності в ньому інших гонадотропних гормонів, таких як FSH та TSH. Неочищений препарат рекомбінантного LH містить, однак, усі інші протеїни та домішки клітин, використаних при одержанні рекомбінантного гормону, отже, дуже бажаним є створення способу досягнення абсолютної чистоти рекомбінантного лютеїнізуючого гормону. Короткий опис винаходу Автори цього винаходу з'ясували, що неочищений препарат LH, одержаний з культурального середовища після рекомбінаційного процесу або з неочищеного концентрату постменопаузної сечі, можна очистити до такого ступеня, що одержаний LH буде практично вільний від протеїнів та/або інших домішок, які містилися в неочищеному препараті LH. Залежно від вихідного матеріалу, протеїни та інші домішки походять або з людського організму (якщо вихідним матеріалом є менопаузні гонадотропіни людини), або з організму-носія (наприклад, СНО, якщо носієм є клітини СНО). Спосіб очищення базується на використанні іонообмінної хроматографії та рідинної хроматографії високої ефективності з оберненою фазою. Факультативне подальше використання гель 5 92145 6 проникної колонки дозволяє видалити з чистого При виконанні елюювання через колонку для препарату LH будь-які залишкові кількості доміРХВЕ з оберненою фазою на стадії (с) перевага шок. Оптимальні результати досягаються при вивіддається використанню 2-пропанолу з ацетатом користанні двох стадій іонообмінного хроматограамонію як рухомої фази. фування та двох стадій рідинного При виконанні елюювання через колонку для хроматографування високої ефективності з оберРХВЕ з оберненою фазою на стадії (d) перевага неною фазою. віддається використанню 2-пропанолу із Трис-НСІ Спосіб за цим винаходом можна використати як рухомої фази. для очищення рекомбінантного LH, при цьому виLH за цим винаходом у варіанті, якому віддахідним матеріалом є препарат культурального ється перевага, є LH людини, а найбільша перевасередовища, одержаний після рекомбінаційного га віддається рекомбінантному LH людини, одерпроцесу, таким чином, що одержаний LH високої жаному з культурального середовища клітин чистоти буде практично вільним, наприклад, від ссавців (перевага віддається клітинам СНЮ), які протеїнів сироватки зародка великої рогатої худовикористовуються в рекомбінаційному процесі. би (FBS), які часто містяться в культуральному Іншою метою цього винаходу є запропонувати середовищі, нуклеїнових кислот або інших доміфармацевтичну композицію, яка містить терапевшок, присутніх у клітинах носія, які використовутично ефективну кількість рекомбінантного LH, ються в рекомбінаційному процесі. одержаного з рекомбінаційного процесу, як описаСпосіб за цим винаходом можна використати но вище, разом із придатними для цього наповнютакож для очищення сечового LH, при цьому вихівачами, такими як сахароза, необхідними для стадним матеріалом є неочищений концентрат постбілізації ліофілізованого продукту. Фармацевтична менопаузної сечі, та для очищення LH, одержанокомпозиція рекомбінантного LH особливо придатго з інших джерел, зокрема, з організмів ссавців, в на для підшкірного введення. тому числі, наприклад, великої рогатої худоби, Детальний опис винаходу коней, свиней, овець, пацюків, мишей та мавп. Цей винахід пропонує спосіб очищення LH, зоТаким чином, метою цього винаходу є запрокрема, спосіб очищення рекомбінантного LH із понувати спосіб очищення LH із вихідного матерінеочищеного препарату культурального середоалу з використанням іонообмінної хроматографії в вища рекомбінаційного процесу. Спосіб забезпекомбінації з рідинною хроматографією високої чує одержання рекомбінантного LH людини з виефективності (РХВЕ) з оберненою фазою. Спосіб соким ступенем чистоти та високою питомою включає стадії піддавання вихідного матеріалу (в активністю, практично вільного від протеїнів сироразі необхідності концентрованого) іонообмінному ватки зародка великої рогатої худоби в разі їх прихроматографуванню та піддавання елюату рідинсутності в згаданому культуральному середовищі ному хроматографуванню високої ефективності з та від нуклеїнових кислот та інших домішок, що оберненою фазою. Може бути використана додатмістяться в клітинах носія, використовуваних у кова подальша стадія пропускання елюату через рекомбінаційному процесі. гель-проникну колонку. Винахід розрахований для застосування до біЗалежно від чистоти вихідного препарату, пеологічних матеріалів, зокрема, до неочищених ревага віддається двократному використанню іосумішей, які містять LH та інші протеїнові забруднообміної хроматографії та РХВЕ з оберненою нювачі. Такі суміші в цьому описі позначено терміфазою з метою досягнення оптимальних резульном "вихідні матеріали". У прикладах, детально татів процесу очищення. Такий спосіб може вклюописаних нижче, використовуються зразки вихідчати стадії: ного матеріалу, що містять r-hLH, одержані з супе(a) елюювання вихідного матеріалу через корнатантного середовища культури в біореакторі. лонку для іонообмінної хроматографії зі стаціонаАльтернативним різновидом вихідного матеріалу є рною фазою ДЕАЕ-Сефароза (DEAE-Sepharose); менопаузний гонадотропін людини (hMG), що яв(b) елюювання через колонку для іонообмінної ляє собою неочищений концентрат постменопаузхроматографії зі стаціонарною фазою Q-Сефароза ної сечі. (Q-Sepharose); Як вихідний матеріал використовують свіжозі(c) елюювання через колонку для РХВЕ з обебране супернатантне середовище культури клітин, рненою фазою на силікагелі С18 Silica C18; що пройшло через біореактор. Його у варіанті, (d) повторне елюювання через колонку для якому віддається перевага, освітлюють фільтруРХВЕ з оберненою фазою на силікагелі С18 Silica ванням. Потім неочищений розчин можна в разі C18 [факультативно з використанням іншого елюнеобхідності концентрувати, після чого піддати енту, ніж на стадії (с)]; і ультрафільтруванню для видалення матеріалу, (е) елюювання через гель-проникну колонку. що має молекулярну масу меншу ніж 10 кДа. При У варіанті здійснення винаходу, якому віддазастосуванні ультрафільтрування можна також ється перевага, елюювання через колонку для замінити буферну сполуку на фосфат натрію, рН іонообмінної хроматографії з ДЕАЕ-Сефарозою 8. здійснюють у натрій-фосфатному буферному розПісля попередніх стадій вихідний матеріал чині при рН 8. піддають іонообмінному хроматографуванню та При елююванні через колонку для іонообмінРХВЕ з оберненою фазою, причому перевага відної хроматографії з Q-Сефарозою перевага віддадається двократному виконанню кожної з цих стається використанню буферного розчину ацетату дій. При виконанні першої стадії ірнообмінного амонію при рН 7,5. хроматографування перевага віддається використанню ДЕАЕ-Сефарози. На цій стадії LH практично 7 92145 8 повністю проходить через колонку, при цьому вичерез мембрани з верхньою межею пропускання даляється значна частка протеїнів, інших ніж LH. молекулярної маси 10 кДа в натрій-фосфатному На другій стадії іонообмінного хроматографування буферному розчині, рН 8. Після фільтрування перевага віддається використанню колонки з Qочищений нерозфасований розчин LH доцільно Сефарозою. На цій стадії LH також проходить чезберігати в стерильних пляшках при низькій темрез колонку; стадія призначена для видалення пературі. потенціальних домішок ДНК та клітин носія або ПРИКЛАД 1 протеїнів із середовища. У варіанті, якому віддаРеагенти ється перевага, цю стадію виконують при темпеОцтова кислота льодяна для аналізу (за Євратурі приблизно 5°С з елююванням буферним ропейською Фармакопеєю) (далі ЄФ) розчином ацетату амонію при рН 7,5. Ацетат амонію для аналізу Хроматографування з оберненою фазою на Бікарбонат амонію для аналізу (за Британсьсилікагелі С18 також краще виконувати двічі; воно кою Фармакопеєю) (далі БФ) забезпечує ефективне видалення залишкових кіВторинний кислий фосфат натрію для аналізу лькостей сироватки зародка великої рогатої худоХлористоводнева кислота для аналізу (ЄФ) би, домішок клітинних протеїнів та ендотоксинів. Фосфорна кислота для аналізу (ЄФ) На першій стадії РХВЕ перевага віддається вико2-Пропанол для аналізу (ЄФ) ристанню суміші 2-пропанолу/ацетату амонію як Хлорид натрію для аналізу (ЄФ) рухомої фази. На другій стадії РХВЕ з оберненою Первинний кислий фосфат натрію для аналізу фазою перевага віддається використанню як руГідроксид натрію гранульований для аналізу хомої фази 2-пропанолу/Трис-НСІ. Потім розчин (ЄФ) затриманої фракції концентрують, і продукт можна Трифтороцтова кислота (ТФК) для РХВЕ виділити з нього бікарбонатом амонію, рН 8. КонТрис-(гідроксиметил)амінометан для аналізу центрований продукт у варіанті, якому віддається Вода для ін'єкцій (ВДІ) (ЄФ) перевага, піддають гель-проникній хроматографії Схема послідовності технологічних операцій на сорбенті "Сефакрил" (Sephacryl S 100 HR). На процесу очищення у короткому викладі цій стадії досягається розділення за розміром моТаблиця 1 являє собою схему послідовності лекул з елююванням бікарбонатом амонію (рН 8); технологічних операцій, що коротко представляє потім елюат у варіанті, якому віддається перевага, процес очищення r-hLH і характеризує принципи піддають фільтруванню з метою видалення вірусвиконання кожної із проміжних стадій. них забруднювачів, а потім ультрафільтруванню 9 Просвітлення, концентрування, діаліз та фільтрування первинного матеріалу (Стадія І) На цій стадії (Стадія І) замінюють буферну сполуку для регулювання складу та досягають попереднього концентрування. Цю стадію виконують при температурі приблизно +5°С і повторюють окремо для кожної партії первинного матеріалу, зібраної на протязі виробничого циклу біореактора. Перевага віддається робочій температурі в діапазоні +5±3° С. (і) Просвітлення первинного матеріалу Перероблення свіжовідібраних партій культурального середовища з біореактора доцільно починати із просвітлення супернатантного розчину шляхом фільтрування. (іі) Концентрування/діаліз первинного матеріалу Мембрани, які в проміжках між операціями зберігають в 0,05 Μ розчині гідроксиду натрію, промивають водою для ін'єкцій до зниження рН приблизно до 8. Воду замінюють зрівноважувальним буферним розчином - 0,025 Μ розчином фосфату натрію, рН 8. Після кондиціонування неочищений розчин rhLH із біореактора концентрують і діалізують для видалення речовин із молекулярними масами меншими ніж 10 кДа (верхня межа пропускання мембрани 10 кДа). Одержаний концентрат зберігають при температурі приблизно -15°С. Іонообмінне хррматографування на ДЕАЕСефарозі CL-6B (Стадія II) На цій стадії хроматографування r-hLH проходить через колонку, де з розчину видаляється значна частка протеїнів, інших ніж r-hLH, а розчин піддають подальшому концентруванню та діалізу. Хроматографічні стадії, де продукт проходить через колонку, виконують в холодному приміщенні. (і) Іонообмінне хроматографування на ДЕАЕСефарозі CL-6B Колонку заповнюють слабко зарядженою аніонообмінною смолою - діетиламіноетан-(ДЕАЕ)Сефарозою, зрівноваженою на початок процесу 0,15 Μ розчином фосфату натрію, рН 8. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 8±0,3. Потім колонку кондиціонують пропусканням буферного розчину - 0,025 Μ розчину фосфату натрію, рН 8. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 8±0,3. 92145 10 Розчин г-hLH завантажують у верхню частину колонки через фільтрувальний засіб, який змонтовано на колонці як запобіжний засіб. В колонку подають 0,025 Μ розчин фосфату натрію, рН 8. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 8±0,3. Хроматографічний процес контролюють способом УФ спектрофотометрії на довжині хвилі 280 нм. Головну фракцію елюату відкидають, доки поглинання на базовій лінії не перейде відмітку 5%. Незатриману (незв'язану) фракцію, що містить r-hLH, збирають, доки поглинання на базовій лінії на знизиться до 10%. (іі) Ультрафільтрування Пристрій для ультрафільтрування, обладнаний мембраною з верхньою межею пропускання молекулярної маси 100 кДа, - яку зберігали в 0,05 Μ розчині гідроксиду натрію, промивають водою для ін'єкцій, доки рН промивної води (що пройшла через мембрану) не досягне приблизно 8. Замінюють воду зрівноважувальним 0,08 Μ буферним розчином ацетату амонію з рН 7,5. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 7,5±0,3. Розчин r-hLH, одержаний зі стадії іонообмінного хроматографування, піддають ультрафільтруванню через мембрану з верхньою межею пропускання 100 кДа і збирають фракцію, яка пройшла через мембрану. Ультрафільтр промивають аліквотними об'ємами 0,08 Μ розчину ацетату амонію з рН 7,5, і всі промивні фракції додають до основної фракції, що пройшла через мембрану. (іїі) Концентрування/Діаліз Пристрій для ультрафільтрування, обладнаний мембраною з верхньою межею пропускання молекулярної маси 10 кДа, яку зберігали в 0,05 Μ розчині гідроксиду натрію, промивають водою для ін'єкцій, доки рН промивної води (що пройшла через мембрану) не досягне приблизно 8. Замінюють воду зрівноважувальним 0,08 Μ буферним розчином ацетату амонію з рН 7,5. Концентрують розчин r-hLH. До затриманої фракції додають 0,08 Μ ацетату амонію з рН 7,5 і концентрують розчин. Діаліз продовжують, доки рН та електропровідність затриманої фракції не зрівняються з відповідними показниками буферного розчину. Одержану затриману фракцію відбирають. 11 92145 12 Іонообмінне хроматографування на Qдодають фільтрат до розчину r-hLH. Діапазон рН, Сефарозі при високій швидкості потоку (Стадія III) якому віддається перевага, становить 7±0,2. На цій стадії r-hLH також проходить через ко(ν) Очищення r-hLH на першій колонці С18 для лонку. Стадія призначена для видалення потенціРХВЕ з оберненою фазою альних домішок ДНК та клітин носія або протеїнів Розчин r-hLH завантажують у верхню частину із середовища. колонки і контролюють хроматографічний процес (і) Зрівноважування колонки способом УФ спектрофотометрії на довжині хвилі Кондиціонування колонки виконують шляхом 280 нм. пропускання буферного розчину 0,08 Μ ацетату В колонку подають 12,4%-ний (мас.) розчин 2амонію з рН 7,5. Діапазон рН, якому віддається пропанолу в 0,05 Μ буферному розчині ацетату перевага, становить 7,5±0,3. амонію, рН 7, доки показник поглинання на довжи(іі) Очищення r-hLH на Q-Сефарозі FF ні хвилі 280 нм (А280) не повернеться до значення, Розчин r-hLH завантажують у верхню частину що відповідає базовій лінії. При цьому незв'язану колонки через фільтрувальний засіб, який змонтофракцію відкидають. вано на колонці з Q-Сефарозою як запобіжний Потім виконують елюювання r-hLH із викорисзасіб. танням як рухомої фази сумішей 2-пропанолу з Потім елюювання продовжують 0,08 Μ розчи0,05 Μ розчином ацетату амонію з лінійним градієном ацетату амонію з рН 7,5. нтом концентрації 2-пропанолу від 14,7% (мас.) до Головну фракцію елюату відкидають, доки по20,7% (мас.). глинання на базовій лінії не перейде відмітку 5%. Фракції r-hLH починають відбирати, коли А280 Незв'язану фракцію, що містить r-hLH, збирапочинає зростати. Всі фракції піка r-hLH, яким відють, доки поглинання на базовій лінії не знизиться повідають значення висоти понад 20% повної до 10%. шкали приладу, збирають в один збірник. Розчин r-hLH зі стадії III можна зберігати в заДруга стадія РХВЕ з оберненою фазою (Стамороженому стані для подальшого використання. дія V) В разі зберігання при температурі -15°С або нижНа цій стадії, яку виконують при кімнатній темче, проміжний розчин r-hLH перед РХВЕ з обернепературі, забезпечується ефективне видалення ною фазою (Стадія IV) розтоплюють при темперазалишкових кількостей сироватки плоду корови, турі +5±3°С, як правило, протягом 24+8 год. домішок клітинних (СНО) протеїнів та ендотоксиПерша стадія РХВЕ з оберненою фазою (Станів. дія TV) (і) Заповнення колонки та активація сорбенту На цій стадії, яку виконують при кімнатній темКолонку заповнюють широкопористим силікапературі, забезпечується ефективне видалення гелем С18. В разі використання нової партії сорзалишкових кількостей сироватки плоду корови, бенту C18 її кондиціонують 2-пропанолом. домішок клітинних (СНО) протеїнів та ендотокси(іі) Зрівноважування колонки нів. Колонку зрівноважують 14,7%-ним (мас.) роз(і) Заповнення колонки та активація сорбенту чином 2-пропанолу в 0,5 Μ буферному розчині Колонку заповнюють широкопористим силікаТрис-НСІ, рН 7. Діапазон рН, якому віддається гелем С18. В разі використання нової партії сорперевага, становить 7±0,2. бенту С18 її кондиціонують 2-пропанолом. (ііі) Регулювання рН та об'єму розчину r-hLH зі (іі) Зрівноважування колонки стадії IV Колонку зрівноважують 12,4%-ним (мас.) розДо розчину r-hLH додають 2 Μ буферний розчином 2-пропанолу в 0,05 Μ буферному розчині чин Трис-НСІ, рН 7, для зниження концентрації 2ацетату амонію, рН 7. пропанолу приблизно до значення його концент(ііі) Регулювання рН та об'єму розчину r-hLH зі рації у зрівноважувальному буферному розчині стадії ІІІ (14,7% (мас.)). Розчин r-hLH доводять до рН 7 із використанРозчин r-hLH доводять до рН 7 із використанням концентрованої оцтової кислоти. Діапазон рН, ням 12 Μ хлористоводневої кислоти. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 7±0,2. якому віддається перевага, становить 7±0,2. Потім об'єм розчину r-hLH додаванням 2(iv) Очищення r-hLH на другій колонці С18 для пропанолу доводять до такого значення, щоб кінРХВЕ з оберненою фазою цева концентрація 2-пропанолу становила 12,4% Розчин r-hLH завантажують у колонку і конт(мас.) ролюють хроматографічний процес способом УФ (iv) Фільтрування відрегульованого розчину rспектрофотометрії на довжині хвилі 280 нм. hLH В колонку подають 14,7%-ний (мас.) розчин 2Фільтрувальний пристрій, обладнаний фільтпропанолу в 0,5 Μ буферному розчині Трис-НСІ, ром із розміром пор 0,22 мкм, промивають 12,4%рН 7. Діапазон рН, якому віддається перевага, ним (мас.) розчином 2-пропанолу в 0,05 Μ буферстановить 7±0,2. Незв'язану фракцію відкидають. ному розчині ацетату амонію, рН 7. Діапазон рН, Потім виконують елюювання r-hLH із викорисякому віддається перевага, становить 7±0,2. танням як рухомої фази сумішей 2-пропанолу з 0,5 Фільтрують розчин r-hLH із відрегульованими Μ розчином Трис-НСІ з лінійним градієнтом концехарактеристиками. нтрації 2-пропанолу від 14,7% (мас.) до 20,7% Завантажувальну посудину промивають алік(мас.). вотними об'ємами 12,4%-ного (мас.) розчину 2Фракції r-hLH починають відбирати, коли А280 пропанолу в 0,05 Μ буферному розчині ацетату починає зростати. Всі фракції піка r-hLH, яким відамонію, рН 7, фільтрують промивальні розчини і 13 92145 14 повідають значення висоти понад 20% повної Розбавлений розчин r-hLH діалізують проти шкали приладу, збирають в один приймач. ВДІ на ультрафільтрувальних мембранах із верх(ν) Діаліз ньою межею пропускання 10 кДа. Потім додають Розчин r-hLH із другої стадії РХВЕ з обернеаліквотні частки 0,01 Μ розчину натрійною фазою розбавляють водою для ін'єкцій (ВДІ). фосфатного буферу, рН 8, і продовжують діаліз до Перевага віддається використанню 8 об'ємів ВДІ. досягнення показників буферного розчину. Розбавлений розчин r-hLH діалізують шляхом Затриманий на мембрані розчин в разі необультрафільтрування через мембрану з верхньою хідності концентрують до кінцевого об'єму приблимежею пропускання 10 кДа (дивись Таблицю 1, зно 500 мл і відбирають. Ультрафільтр промивастадія VI) проти ВДІ. Потім додають аліквотні частють 0,01 Μ розчином натрій-фосфатного буферу, ки 0,5 Μ розчину бікарбонату амонію, рН 8, і прорН 8, і промивний розчин додають до затриманого довжують діаліз до досягнення показників буферрозчину. ного розчину бікарбонату амонію. Залежно від обраних умов зберігання, можлиЗатриманий на мембрані розчин концентрують ве виконання факультативної стадії додаткового до кінцевого об'єму приблизно 1 л і відбирають. концентрування LH. Ультрафільтр промивають 0,5 Μ розчином бікарРозчин r-hLH фільтрують і збирають фільтрат бонату амонію, рН 8, і промивний розчин додають у стерильний посуд. до затриманого розчину і факультативно піддають Очищений нефасований розчин r-hLH у варіаподальшому концентруванню. Це подальше коннті, якому віддається перевага, зберігається в стецентрування залежить від розміру колонки, яку рильних пляшках при температурі приблизно використовують на наступній стадії, тобто на Ста15°С. дії VI. Реагенти, буферні розчини, елюенти та реакГель-проникне хроматографування на сорбентиви ті Сефакрил S100 HR та рпьтрафільтрування Хроматографічні сорбенти (Стадія VI) В процесі очищення на цей час використовуНа цій стадії здійснюють розділення за розміються хроматографічні сорбенти, перелічені нижром молекул та ультрафільтрування розчину. Усі че. При очищенні можуть використовуватися також операції на цій стадії виконують при температурі їх еквіваленти. приблизно +5°С. Температурний діапазон, якому Стадія II: ДЕАЕ-Сефароза CL-6B (DEAEвіддається перевага, становить +5±3°С. Sepharose CL-6B) (фірма Pharmacia) (і) Гель-проникне хроматографування на сорСтадія III: Q-Сефароза для великої швидкості бенті Сефакрил S100 HR потоку (Q-Sepharose Fast Flow) (фірма Pharmacia) Колонку заповнюють сорбентом Сефакрил Стадія IV: Силікагель С18 для РХВЕ з обернеS100 HR і зрівноважують спочатку водою для ін'єною фазою (C18 Silica RP-HPLC) (фірма Waters) кцій. Стадія V: Силікагель C18 для РХВЕ з обернеПотім колонку зрівноважують 0,5 Μ розчином ною фазою (C18 Silica RP-HPLC) (фірма Waters) бікарбонату амонію, рН 8. Стадія VI: Сефакрил S 100 HR (Sephacryl S В колонку подають 0,5 Μ розчин бікарбонату 100 HR) (фірма Pharmacia) амонію, рН 8. Контролюють хроматографічний Постачальники: процес способом УФ спектрофотометрії на довжиPharmacia - Amersham Pharmacia Biotech, ні хвилі 280 нм. Bjorkgatan 30, S-751 84, Uppsala, Sweden. Фракції r-hLH починають відбирати, коли А280 Waters - Waters Corporation, 34 Maple Street, починає зростати. Всі фракції піка r-hLH, яким відMilford, MA 01757, USA повідають значення висоти понад 20% повної Результати шкали приладу, збирають в один приймач. Біологічна активність Розчин r-hLH, елюйований з колонки із сорбеБіологічна активність різних партій r-hLH після нтом Сефакрил S100 HR, потім у варіанті, якому очищення за способом цього винаходу відображевіддається перевага, пропускають через фільтр, на в Таблиці 2. Концентрацію протеїну (1 мг протеїну LH на 1 мл) визначали спектрофотометричним наприклад, Virosolve , для видалення вірусних методом на довжині хвилі 276,5 нм із використанзабруднювачів. ням значення коефіцієнта поглинання а=0,812, (іі) Діаліз та концентрування r-hLH визначеного на основі аналізу амінокислотної посМембрани (ультрафільтрувальні мембрани з лідовності. верхньою межею пропускання молекулярної маси Середня питома активність препаратів r-LH 10 кДа), які у проміжках між операціями очищення має особливо високе значення і досягає приблиззберігають в 0,05 Μ розчині гідроксиду натрію, но 25000 МО/мг (протеїну LH). промивають водою для ін'єкцій, доки рН не досягне приблизно 8. 15 92145 Таблиця 2 Питома активність партій г-hLH № партії BLCA 9802 BLCA 9803 BLCA 9804 BLCA 9805 BLCA 9806 BLCA 9808 BLCA 9809 BLCA 9810 BLCA 9811 BLCA 9812 BLCA 9813 BLCA 9814 BLCA 9815 Питома активність (МО/мг) 28173 25819 27472 31229 26995 26279 20522 22275 27642 29941 28345 27581 24541 Композиції Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 16 Розроблено ліофілізовані композиції на основі рекомбінантного r-hLH високої чистоти, очищеного способом за цим винаходом. Як типовий приклад нижче описана ліофілізована композиція з ефективністю 75 МО, приготована у флаконах за стандартом DIN 2R із використанням сахарози як наповнювача (Таблиця 3), яка залишалася стабільною при зберіганні при 4°С протягом кількох місяців. Таблиця 3 Назва інгредієнта Кількість на одиницю Активний інгредієнт Рекомбінантний LH людини 3,4 мкг (75 МО) Інші інгредієнти Сахароза 47,75 мг Твін20 0,05 мг Вторинний кислий фосфат на0,825 мг трію (дигідрат) Первинний кислий фосфат на0,052 мг трію (моногідрат) Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601