Стабілізована рідка композиція, що містить інтерферон

1. Композиція, яка містить: а) бета-інтерферон 1а, у концентрації приблизно 88 мкг/мл; b) лізин, у концентрації приблизно 27,3 мг/мл; с) метіонін, у концентрації приблизно 0,12 мг/мл; d) полоксамер 188 (Poloxamer 188), у концентрації приблизно 0,5 мг/мл, та е) водний розчин ацетатного буфера при рН від 3,5 до 5,5. 2. Композиція, яка містить бета-інтерферон 1а, лізин, метіонін та полоксамер 188 у водному розчині ацетатного буфера, який має рН від приблизно 3,5 до 5,5, причому співвідношення бетаінтерферон 1а:лізин:метіонін:полоксамер 188 становить приблизно 1:310:1,4:5,7. Галузь техніки, якої стосується винахід Цей винахід стосується фармацевтичних композицій без HSA (людського сироваткового альбуміну), що містять інтерферон, конкретніше, композицій бета-інтерферону, що містять буфер, амінокислоту та антиоксидант. Передумови створення винаходу Інтерферони є цитокінами, тобто розчинними білками, що передають інформаційні повідомлення між клітинами і відіграють суттєву роль у імунній системі завдяки тому, що допомагають знищувати мікроорганізми, які викликають інфекцію, і заліковують будь-яке наслідкове пошкодження. Природні інтерферони секретуються інфікованими клітинами, і вперше вони були ідентифіковані у 1957 році. їхня назва виникла унаслідок того, що вони "втручаються (interfere)" у процес реплікації та продукування вірусів. Інтерферони демонструють як антивірусну, так і антипроліферативну активність. На основі біохімічних та імунологічних властивостей, природні людські інтерферони розподіляються на три голо вні класи: альфа-інтерферон (лейкоцитарний), бета-інтерферон (фібробластний) та гаммаінтерферон (імунний). Альфа-інтерферон на цей час є схваленим у Сполучених Штатах та інших країнах для лікування лейкозу ворсистих клітин, гострокінцевих кондилом, саркоми Капоші (рак, який звичайно уражує хворих, що страждають на синдром набутого імунодефіциту (СНІД)) та хронічного гепатиту ні А ні В. Окрім того, інтерферони є глікопротеїнами, що продукуються організмом у відповідь на вірусну інфекцію. Вони пригнічують розмноження вірусів у захищених клітинах. Складаючись з білка більш низької молекулярної маси, інтерферони є найвищою мірою неспецифічні за своєю дією, тобто IFN, індукований одним вірусом, є ефективним проти широкого діапазону інших вірусів. Вони, однак, є видоспецифічними, тобто IFN, продукований одним видом, буде стимулювати антивірусну активність у клітинах лише того самого або близькоспорідненого виду. Інтерферони були першою групою цитокінів, які почали застосовуватись завдяки сво UA (11) 92146 (13) (21) a200612406 (22) 27.05.2005 (24) 11.10.2010 (86) PCT/EP2005/052414, 27.05.2005 (31) 04076626.3 (32) 01.06.2004 (33) EP (31) 60/616,378 (32) 06.10.2004 (33) US (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) САМАРІТАНІ ФАБРІЦІО, IT, ДЕЛЬ РІО АЛЕССАНДРА, IT (73) ЕЙРЕС ТРЕЙДІНГ С.А., CH (56) US A1 2002172661, 21.11.2002. EP A 1224940, 24.07.2002. EP A 1250932, 23.10.2002. US A 5762923, 09.06.1998. LAM XANTHE M ET AL: "The effect of benzyl alcohol on recombinant human interferon-gamma" PHARMACEUTICAL RESEARCH (NEW YORK), vol. 14, no. 6, 1997, pages 725-729, XP002303727 ISSN: 0724-8741. C2 2 (19) 1 3 їм потенційним протипухлинним та антивірусним активностям. Три головні інтерферони позначаються як IFN, IFN- та IFN- . Ці головні види інтерферонів початково були класифіковані за клітинами їх походження (лейкоцит, фібробласт або Т-клітина). Очевидним стало, однак, що однією клітиною може продукуватись декілька типів. З цієї причини лейкоцитарний IFN зараз називають IFN- , фібробластний IFN називають IFN- , а інтерферон, що продукується Т-клітинами, називають IFN- . Існує також IFN четвертого типу, а саме лімфобластний інтерферон, що продукується лінією клітин "Namalwa" (яку одержали з лімфоми Бьоркіта), яка, як видається, продукує суміш як лейкоцитарного, так і фібробластного інтерферонів. Одиниця інтерферону (U) або Міжнародна одиниця інтерферону (IU) є показником активності IFN, що визначається як кількість, необхідна для захисту 50% клітин проти вірусного пошкодження. Аналізом, що може застосовуватись для визначення біологічної активності, є аналіз пригнічення цитопатичного ефекту. Опис цього аналізу наведено у літературних джерелах (Рубінштейн (Rubinstein) та інші, 1981; Фаміллетті П.К. (Familletti P.C.) та інші, 1981). За цим антивірусним аналізом, приблизно 1 Од/мл відповідає кількості інтерферону, яка пригнічує репродукцію вірусу на 50%. Одиниці визначають за Міжнародним стандартом людського бета-інтерферону, який надається Національним інститутом здоров'я (США) (Пестка С. (Pestka S.), 1986). Інтерферон кожного класу включає декілька різних типів. Кожен з IFN- і IFN- є продуктом одного гена. Білки, що класифікуються як альфаінтерферони, є найбільш різноманітною групою, що включає приблизно 15 типів. В хромосомі 9 єкластер генів для IFN- , що включає щонайменше 23 члени, 15 членів з яких є активними і транскрибуються. Зрілі альфа-інтерферони не гліколізуються. Усі альфа- і бета-інтерферони мають однакову довжину (165 амінокислот або 166 амінокислот) і схожі біологічні активності. Гамма-інтерферони мають 146 амінокислот у довжину і меншою мірою походять на класи та . Лише гаммаінтерферони можуть активувати макрофаги або індукувати визрівання Т-клітин-кілерів. Ці терапевтичні засоби нових типів подеколи називають модуляторами біологічних реакцій (BRM), оскільки вони впливають на реакцію організму на пухлину, впливаючи на розпізнавання через імуномодуляцію. Людський фібробластний інтерферон (IFN- ) має антивірусну активність і може також стимулювати природні клітини-кілери проти пухлинних клітин. Він являє собою поліпептид із приблизною масою 20000 Да, що індукується вірусами і двонитковими РНК. Повну амінокислотну послідовність цього білка визначили (Дерінк (Derynk) та інші, 1980) за нуклеотидною послідовністю гена для фібробластного інтерферону, клонованого методами рекомбінантних ДНК. Його довжина становить 166 амінокислот. 92146 4 Шепард (Shepard) та інші (1981) описали мутацію на основі 842 (Cys Tyr у положенні 141), що ліквідує його антивірусну активність, і варіантний клон із делецією нуклеотидів 1119-1121. Марк (Mark) та інші (1984) ввели штучну мутацію шляхом заміни основи 469 (Т) на (А), унаслідок чого у положенні 17 відбулась амінокислотна заміна Cys Ser. Повідомлялось, що одержаний IFNє таким самим активним, як і "нативний" IFN- і стійким впродовж довготривалого зберігання (70°С). Ребіф (Rebif ) (фірма Serono - рекомбінатний людський бета-інтерферон), найостанніша розробка у галузі інтерферонотерапії розсіяного склерозу (MS), являє собою інтерферон (IFN)-бета-1a, що продукується клітинними лініями ссавців. Рекомендованою міжнародною непатентованою назвою (INN) для нього є "Інтерферон-бета-1а". Як і з усіма фармацевтичними засобами на основі білків, однією з головних перепон, яку необхідно подолати у разі застосування бетаінтерферону як терапевтичного засобу, є втрата фармацевтичної придатності, що може бути наслідком його нестійкості у фармацевтичних композиціях. Фізичними нестійкостями, що загрожують активності та ефективності поліпептиду у фармацевтичних композиціях, є денатурація і утворення розчинних і нерозчинних агрегатів, у той час як хімічними нестійкостями є гідроліз, утворення імідів, окиснення, рацемізація і деамідування. Відомо, що деякі з цих змін ведуть до втрати або зниження фармацевтичної активності білка, що становить інтерес. У інших випадках точні наслідки цих змін є невідомими, однак одержані продукти розкладу все ще розглядаються як фармацевтично неприйнятні унаслідок потенційних або небажаних побічних ефектів. Стабілізація поліпептидів у фармацевтичних композиціях залишається ділянкою, на якій головну роль відіграє метод спроб та помилок (оглядові статті Ванг (Wang) (1999), Int. J. Pharm., 185:129188; Ванг (Wang), Хансон (Hanson) (1988), J. Parenteral Set Tech., 42:S3-S26). Наповнювачами, які додають до поліпептидних фармацевтичних композицій для підвищення їх стійкості, є буфери, цукри, поверхнево-активні речовини, амінокислоти, поліетиленгліколі і полімери, однак стабілізувальні ефекти цих хімічних домішок різняться у залежності від білка. У заявці на патент США № 2002/0172661 описують композиції бета-інтерферону, які відрізняються своєю низькою іонною силою та рН, що приблизно дорівнює 3,0-5,0. У сучасних композиціях на основі IFN- HSA (людський сироватковий альбумін) застосовують як засіб, що підвищує розчинність IFN- . Застосування HSA, однак, має певні вади. HSA є продуктом людської крові і повинен, таким чином, відбиратись у людей. Незважаючи на заходи, що вживаються для зменшення ризику, застосування продуктів людської крові, наприклад, HSA, тягне за собою потенційне введення людських вірусів, наприклад, ВІЛ або вірусу гепатиту С. 5 Унаслідок цього існує необхідність у додаткових фармацевтичних композиціях на основі IFN- , що містять фізіологічно сумісні стабілізатори, які поліпшують розчинність цього білка і стабілізують білок проти утворення агрегатів, збільшуючи тим самим його фармацевтичну придатність. Опис винаходу Цей винахід спрямовано на стабілізовані фармацевтичні композиції, що містять інтерферон (IFN), і способи їх одержання. Ці композиції одержують без людського сироваткового альбуміну (HSA). Такі композиції у цьому описі називають фармацевтичними композиціями IFN без HSA ("вільними від HSA"), і вони містять інтерферон (IFN) або його ізоформу, мутеїн, гібридний білок, функціональну похідну, активну фракцію або сіль, де згадана композиція являє собою розчин, що містить буфер, поверхнево-активну речовину, ізотонічний агент і антиоксидант. Відповідно до варіанта здійснення цього винаходу, згадана композиція містить також бактеріостатичний препарат. Термін "інтерферон" або "IFN", що застосовується у цьому описі, означає будь-яку молекулу, що у літературі визначається як така, і включає, наприклад, інтерферони будь-яких типів, згадані у вищенаведеному розділі "Передумови створення винаходу". Вищенаведене визначення включає, зокрема, IFN- , IFN- і IFN- . IFN- за цим винаходом є інтерфероном, якому віддають перевагу. Придатний за цим винаходом IFN- є комерційно доступним, наприклад, як Rebif (фірма Serono), Avonex (фірма Biogen) або Betaferon (фірма Schering). Перевагу за цим винаходом віддають застосуванню інтерферонів людського походження. Термін "інтерферон", що застосовується у цьому описі, означає його ізоформу, мутеїн, гібридний білок, функціональну похідну, активну фракцію або сіль. Термін "бета-інтерферон (IFN-бета або IFN)", що застосовується у цьому описі, означає фібробластний інтерферон, зокрема, людського походження, який одержують шляхом виділення з біологічних рідин або за допомогою методів рекомбінантних ДНК із прокаріотних або еукаріотних клітин-хазяїв, а також його солі, функціональні похідні, варіанти, аналоги і активні фрагменти. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, IFN-бета означає інтерферон-бета-1а. Термін "мутеїни", що застосовується у цьому описі, означає аналоги IFN, у яких один або декілька амінокислотних залишків природного IFN замінені різними амінокислотними залишками чи видалені, або один чи декілька амінокислотних залишків додані до природної послідовності IFN без значної зміни активності одержаних продуктів, порівняно з IFN дикого типу. Ці мутеїни одержують відомими методами синтезу та/або сайтспрямованого мутагенезу чи будь-яким іншим відомим придатним способом. До мутеїнів, яким віддають перевагу, належать, наприклад, мутеїни, описані Шепард (Shepard) та іншими (1981) або Марк (Mark) та іншими (1984). Амінокислотна послідовність будь-якого з таких мутеїнів, відповідно до варіанта, якому відда 92146 6 ється перевага, достатньою мірою повторює амінокислотну послідовність IFN, завдяки чому активність мутеїну є по суті подібною або навіть кращою за активність IFN. Біологічна функція інтерферону є добре відомою фахівцю у цій галузі. Встановлені біологічні стандарти, які є доступними, наприклад, від Національного інституту біологічних стандартів та контролю (http://immunology.org/links/NIBSC). Описані біологічні аналізи для визначення активності IFN. Аналіз IFN може, наприклад, здійснюватись за описом, наведеним Рубінштейн (Rubinstein) та іншими, 1981. Так, за допомогою стандартних експериментальних методів можна визначити, чи є активність будь-якого даного мутеїну по суті подібною або навіть кращою за активність IFN. Мутеїни IFN, які можуть застосовуватись за цим винаходом, або нуклеїнові кислоти, що їх кодують, включають кінцевий набір, по суті відповідних послідовностей, як замінних пептидів або полінуклеотидів, які можуть бути поточним чином одержані пересічним фахівцем у цій галузі без зайвого експериментування, виходячи з інструкцій та настанов, наведених у цьому описі. Змінами для мутеїнів, яким віддають перевагу за цим винаходом, є зміни, відомі як "консервативні" заміни. Консервативні амінокислотні заміни поліпептидів або білків за цим винаходом можуть включати синонімічні амінокислоти у межах групи, які мають достатньо подібні фізико-хімічні властивості, завдяки чому заміни між членами групи збережуть біологічну функцію цієї молекули. Зрозуміло, що у вищезазначених послідовностях можуть також здійснюватись інсерції або делеції без зміни функції згаданих послідовностей, зокрема, якщо інсерції або делеції залучають лише декілька амінокислот, наприклад, менше тридцяти, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, менше десяти, і не видаляють або зміщують амінокислоти, що є критичними для функціональної конформації, наприклад, цистеїнові залишки. Білки та мутеїни, одержані шляхом таких делецій та/або інсерцій, входять до сфери дії цього винаходу. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, синонимічними амінокислотними групами є групи, зазначені у Таблиці І. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, синонимічними амінокислотними групами є групи, зазначені у Таблиці II; і відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, синонимічними амінокислотними групами є групи, зазначені у Таблиці III. Таблиця І Групи синонімічних амінокислот, яким віддається перевага Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Синонімічна група Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gln, Lys, Glu, His IIe, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Gly, Thr, Pro, Ala 7 Val Gly IIe Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp 92146 Met, Tyr, Phe, IIe, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, IIe Trp, Met, Tyr, IIe, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, IIe, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gln, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Phe, IIe, Val, Leu, Met Trp Таблиця II Групи синонімічних амінокислот, яким віддається більша перевага Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly IIe Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser His, Lys, Arg Leu, lle, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, lle Gly IIe, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, IIe, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, IIe, Val, Leu Trp Таблиця III Групи синонімічних амінокислот, яким віддається найбільша перевага Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly IIе Phe Tyr Cys His Синонімічна група Ser Arg Leu, IIe, Met Pro Thr Ala Val Gly IIe, Met, Leu Phe Tyr Cys, Ser His 8 Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Gln Asn Lys Asp Glu Met, IIe, Leu Met Прикладами здійснення амінокислотних замін у білках, що можуть застосовуватись для одержання мутеїнів IFN для застосування у цьому винаході, є стадії будь-яких відомих методів, наприклад, наведені у патентах США № 4,959,314, № 4,588,585 і № 4,737,462, які були видані на ім'я Марк (Mark) та інші; № 5,116,943, який був виданий на ім'я Коте (Koths) та інші; № 4,965,195, який був виданий на ім'я Неймен (Namen) та інші; № 4,879,111, який був виданий на ім'я Чонг (Chong) та інші; і № 5,017,691, який був виданий на ім'я Лі (Lee) та інші; та білки із заміною лізину, наведені у патенті США № 4,904,584 (Шоу (Shaw) та інші). Конкретні мутеїни IFN-бета були описані, наприклад, Марк (Mark) та іншими, 1984. Термін "гібридний білок" означає поліпептид, що містить IFN або його мутеїн, злитий з іншим білком, який, наприклад, має тривалий час перебування у загальній воді організму людини. IFN може, таким чином, зливатись з іншим білком, поліпептидом тощо, наприклад, імуноглобуліном або його фрагментом. Словосполучення "функціональні похідні", що застосовується у цьому описі, означає похідні IFN та їхні мутеїни і гібридні білки, які можна одержати з функціональних груп, що існують у вигляді бічних ланцюгів на залишках, або N- чи С-кінцевих груп, способами, відомими у цій галузі, і які включають до цього винаходу доти, доки вони залишаються фармацевтично прийнятними, тобто доки вони не знищують активності білка, яка є по суті подібною до активності IFN, і не наділяють токсичними властивостями композиції, що їх містять. До цих похідних можуть належати, наприклад, бічні ланцюги поліетиленгліколю, які можуть маскувати імунодомінантні сайти і подовжувати тривалість перебування IFN у рідинах у тілі людини. До інших похідних належать аліфатичні складні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, одержані шляхом реакції з аміаком або з первинними чи вторинними амінами, N-ацильні похідні вільних аміногруп залишків амінокислот, які були одержані з ацильними складовими (наприклад, алканоїльними або карбоциклічними ароїльними групами), або О-ацильні похідні вільних гідроксильних груп (наприклад, вільних гідроксильних груп серильних або треонільних залишків), які були одержані з ацильними складовими. Під "активними фракціями" IFN або мутеїнів і гібридних білків у цьому винаході розуміються будь-які фрагменти або попередники поліпептидного ланцюга білкової молекули самостійно або разом із пов'язаними молекулами або залишками, зв'язаними з ними, наприклад, залишки цукру чи фосфату або агрегати білкової молекули чи залишки цукру самі по собі, за умови, що згадана фра 9 кція не має значно зниженої активності, порівняно з відповідним IFN. Термін "солі" у цьому описі означає як солі карбоксильних груп, так і солі аміногруп білків, опис яких було наведено вище, або їхніх аналогів, одержані шляхом додання кислоти. Солі карбоксильної групи можна одержати засобами, відомими у цій галузі, і до них належать неорганічні солі, наприклад, солі натрію, кальцію, амонію, заліза або цинку тощо, і солі, одержані за допомогою органічних основ, наприклад, солі, одержані з амінами, наприклад, триетаноламіном, аргініном або лізином, піперидином, прокатом тощо. До солей, одержаних доданням кислоти, належать, наприклад, солі, одержані з мінеральними кислотами, наприклад, хлористоводневою кислотою або сірчаною кислотою, і солі, одержані з органічними кислотами, наприклад, оцтовою кислотою або щавлевою кислотою. Звичайно, будь-які з таких солей повинні зберігати біологічну активність білків (IFN) за цим винаходом, тобто здатність до зв'язування відповідного рецептора і ініціювання передачі сигналу рецептором. Відповідно до цього винаходу, застосуванню рекомбінантного людського IFN-бета і сполук за цим винаходом віддається особлива додаткова перевага. Нещодавно було наведено опис варіанта інтерферону особливого роду. Так звані "консенсусні інтерферони" є штучними варіантами IFN (патент США № 6,013,253). За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, сполуки за цим винаходом застосовують у комбінації з консенсусним інтерфероном. Словосполучення "людський консенсусний інтерферон (IFN-con)", що застосовується у цьому описі, означає штучний поліпептид, який переважно включає ті амінокислотні залишки, що є спільними для субпопуляції IFN-альфа, репрезентативної для більшості послідовностей підтипу природного людського лейкоцитарного інтерферону, і який включає, у одному або декількох із тих положень, де немає амінокислоти, спільної для всіх підтипів, амінокислоту, яка переважно зустрічається у цьому положенні і у жодному разі не включає будь-якого амінокислотного залишку, який не існує у цьому положенні у принаймні одного природного підтипу. IFN-con включає (однак ними не обмежується) амінокислотні послідовності, позначені як IFN-con1, IFN-con2 і IFN-соn3, які розкривають у патентах США № 4,695,623, № 4,897,471 і № 5,541,293. Послідовності ДНК, що кодують IFN-con, можна одержати, як описано у вищезгаданих патентах або за допомогою інших стандартних методів. Відповідно до додаткового варіанта здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, гібридний білок включає злиття з Ig. Злиття може бути прямим або здійснюватись через короткий лінкерний пептид, довжина якого може не перевищувати 1-3 амінокислоти або який може бути довшим, наприклад, він може складатись з 13 амінокислотних залишків. Згаданий лінкер може бути, наприклад, трипептидом із послідовністю E-F-M (Glu-Phe-Met) або являти собою лінкерну послідо 92146 10 вність із 13 амінокислот (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-LeuVal-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met), введену між послідовністю IFN і послідовністю імуноглобуліну. Одержаний гібридний білок може мати поліпшені властивості, наприклад, триваліший час перебування у рідинах у тілі людини (період напіввиведення), підвищену питому активність, підвищений рівень експресії або полегшення процесу очищення згаданого гібридного білка. Відповідно до додаткового варіанта здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, IFN зливається з константною ділянкою молекули Ig. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, він зливається з ділянками важкого ланцюга, наприклад, доменами СН2 і СН3 людського IgG1. Інші ізоформи молекул Ig є також придатними для одержання гібридних білків за цим винаходом, наприклад, ізоформи IgG2, IgG3 або IgG4 чи інших класів Ig, наприклад, IgM або IgA. Гібридні білки можуть бути мономерними або мультимерними, гетеро- або гомомультимерними. Відповідно до додаткового варіанта здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, функціональні похідні включають щонайменше одну складову, приєднану до однієї або декількох функціональних груп, що зустрічаються у вигляді одного або декількох бічних ланцюгів на амінокислотних залишках. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згаданою складовою є поліетилен (PEG). Поліетиленгліколізація може здійснюватись відомими способами, наприклад, способами, опис яких наведено, наприклад, у WO 99/55377. Кількість, введена індивіду у вигляді одноразової дози або багаторазових доз, буде змінюватись у залежності від ряду факторів, у тому числі фармакокінетичних властивостей, шляху введення, стану і характеристик хворого (стать, вік, маса тіла, стан здоров'я, розміри), ступеня розвитку симптомів, одночасно здійснюваного лікування, частоти лікування і бажаного ефекту. Доза бета-інтерферону у разі лікування рецидивно-ремітуючого розсіяного склерозу, за цим винаходом, залежить від типу бета-IFN, що застосовується. Відповідно до цього винаходу, у разі, коли інтерфероном є рекомбінантний бета-IFN 1b, який продукується Е. соlі, комерційно доступний під товарним знаком Betaseron , він, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, може вводитись підшкірним шляхом через день у дозі від приблизно 250 мкг до 300 мкг або від 8 МОд до 9,6 МОд на людину. Відповідно до цього винаходу, у разі коли інтерфероном є рекомбінантний бета-IFN 1b, який продукується клітинами яєчника китайського хом'ячка (клітини СНО), комерційно доступний під товарним знаком Avonex , він відповідно до варіанта, якому віддається перевага, може вводитись внутрішньом'язовим шляхом один раз на тиждень у дозі від приблизно 30 мкг до 33 мкг або від 6 МОд до 6,6 МОд на людину. Відповідно до цього винаходу, у разі коли інтерфероном є рекомбінантний бета-IFN 1b, який продукується клітинами яєчника китайського хо 11 м'ячка (клітини СНО), комерційно доступний під товарним знаком Rebif , він відповідно до варіанта, якому віддається перевага, може вводитись підшкірним шляхом тричі на тиждень (TIW) у дозі від приблизно 22 мкг до 44 мкг або від 6 МОд до 12 МОд на людину. Введення активних інгредієнтів за цим винаходом може здійснюватись внутрішньовенним, внутрішньом'язовим або підшкірним шляхом. Шляхом введення IFN, якому віддається перевага, є підшкірний шлях. Додатковим шляхом введення, якому віддається перевага, є внутрішньом'язове введення, яке може здійснюватись, наприклад, один раз на тиждень. IFN може вводитись щоденно, через день або рідше. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, IFN вводять один раз, двічі або тричі на тиждень. Термін "стійкість" означає фізичну, хімічну і структурну стійкість композицій інтерферону за цим винаходом (зі збереженням біологічної активності). Нестійкість білкової композиції може спричинюватись хімічним розкладом або агрегацією білкових молекул з утворенням полімерів вищого порядку, дегліколізацією, модифікацією гліколізації, окисненням або будь-якою іншою структурною модифікацією, що знижує щонайменше одну біологічну активність поліпептиду інтерферону, включеного до цього винаходу. "Стійким" розчином або композицією є такий розчин або така композиція, де ступінь розкладу, модифікації, агрегації, втрати біологічної активності тощо білків цього розчину або композиції є прийнятно контрольованим і з часом не підвищується до неприйнятного рівня. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, композиція зберігає вказану активність інтерферону впродовж періоду часу тривалістю від 12 міс до 24 міс щонайменше на рівні або приблизно на рівні 60%, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, щонайменше на рівні або приблизно на рівні 70%, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, щонайменше на рівні або приблизно на рівні 80%. Стабілізовані композиції IFN без HSA за цим винаходом, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, мають строк зберігання щонайменше приблизно 6 місяців, 12 місяців, 18 місяців, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, щонайменше 20 місяців, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 22 місяців, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, щонайменше приблизно 24 місяців при температурі зберігання 2-8°С. Способи контролювання стійкості фармацевтичних композицій IFN без HSA за цим винаходом є доступними у цій галузі, з включенням тих способів, опис яких наведено у прикладах, що розкриваються у цьому описі. Так, утворення агрегатів IFN під час зберігання рідкої фармацевтичної композиції за цим винаходом може легко визначатись шляхом вимірювання зміни кількості розчинного IFN у розчині з часом. Кількість розчинного поліпептиду у розчині може легко піддаватись кількісному визначенню за допомогою ряду аналітичних 92146 12 аналізів, адаптованих для виявлення IFN. Такі аналізи включають, наприклад, високоефективну рідинну хроматографію з оберненою фазою (RPHPLC) і УФ-абсорбційну спектроскопію, як описано у наведених нижче Прикладах. Визначення у рідких композиціях як розчинних, так і нерозчинних агрегатів під час зберігання може здійснюватись, наприклад, за допомогою аналітичного ультрацентрифугування, як вказується у Прикладах, наведених нижче, для розрізнення тієї частини розчинного поліпептиду, що є присутньою у вигляді розчинних агрегатів, і тієї частини, що є присутньою у неагрегованій, біологічно активній молекулярній формі. На додаток до цього, швидкісне ультрацентрифугування є здатним до забезпечення як кількісного, так і якісного виявлення як нековалентних, так і ковалентних олігомерів. Таким самим чином, новий метод високоефективної рідинної витіснювальної хроматографії за розміром молекул (SE)-HPLC (опис якого наведено у прикладах), який у цьому описі називають "NEW SEC", є здатним до забезпечення як кількісного, так і якісного виявлення як нековалентних, так і ковалентних олігомерів. Словосполучення "багатодозове застосування" включає застосування одного флакона, ампули або капсули композиції інтерферону для більше ніж однієї ін'єкції, наприклад, для 2, 3, 4, 5, 6 або більше ін'єкцій. Ін'єкції, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, здійснюють впродовж періоду часу, який щонайменше дорівнює приблизно 12 год, 24 год, 48 год тощо, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, впродовж періоду часу, який дорівнює приблизно 12 дням. Ін'єкції можуть відокремлюватись у часі," наприклад, часовим періодом тривалістю 6 год, 12 год, 24 год, 48 год або 72 год. Термін "амінокислота" означає амінокислоту або комбінацію амінокислот, де будь-яка дана амінокислота є присутньою у формі вільної основи або у формі солі. У разі застосування комбінації амінокислот, усі амінокислоти можуть бути присутніми у формі вільних основ, усі можуть бути присутніми у формі солей або деякі можуть бути присутніми у формі вільних основ, у той час як інші є присутніми у формі солей. Амінокислотами для застосування за цим способом або у композиції відповідно до цього винаходу, яким віддається перевага, є амінокислоти, що несуть заряджений бічний ланцюг, які у цьому описі називають "амінокислотою(-ами) із зарядженим бічним ланцюгом", наприклад, аргінін, лізин, аспарагінова кислота і глутамінова кислота. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, згаданою амінокислотою є лізин. Будь-який стереоізомер (тобто L, D або DL ізомер) конкретної амінокислоти або комбінації цих стереоізомерів, може застосовуватись відповідно до цього способу або у комбінації відповідно до цього винаходу доти, доки згадана конкретна амінокислота є присутньою у формі вільної основи або у формі солі. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, застосовують Zстереоізомер. У композиції відповідно до цього винаходу можуть застосовуватись також аналоги цих амінокислот, яким віддається перевага. Термін 13 "аналог амінокислоти" означає похідну природної амінокислоти. Відповідні аналоги аргініну включають, наприклад, аміногуанідин і N-моноетил-Lаргінін. Як і у разі амінокислот, яким віддається перевага, аналоги амінокислот застосовують у відповідно до цього винаходу у формі вільної основи або у формі солі. Амінокислоти у цьому описі називають також стабілізаторами. Амінокислота(-и), яку (які) застосовують у композиції відповідно до цього винаходу, захищає(ють) терапевтично активний поліпептид проти різних напружень із забезпеченням, тим самим, підвищення або/та підтримки стабільності композиції бета-інтерферону. Термін "напруження" у цьому описі включає (але без обмеження) нагрівання, заморожування, рН, світло, збовтування (перемішування), окиснення, дегідратацію, поверхневий натяг, зсувне зусилля, заморожування/розморожування, тиск, важкі метали, сполуки фенолу, денатуруючі речовини тощо. Термін "напруження" включає будь-який фактор, який модулює (тобто зменшує, підтримує або підвищує) стабільність композиції, що містить бета-інтерферон. Підвищення та/або підтримання стабільності у разі додання амінокислоти відбувається залежним від концентрації чином, тобто наслідком підвищення концентрації амінокислоти є підвищення та/або підтримання стабільності композиції, що містить бета-інтерферон відповідно до цього винаходу, коли ця композиція, що містить бета-інтерферон, за нормальних умов демонструє утворення агрегатів або олігомерів за відсутності амінокислоти. Визначення кількості конкретної амінокислоти для застосування у композиції відповідно до цього винаходу для зниження ступеня утворення олігомерів або агрегатів і, тим самим, підвищення стабільності мономерного білка, може легко здійснюватись без зайвого експериментування за допомогою способів, як правило, відомих фахівцю у цій галузі техніки. Термін "буфер" або "фізіологічно прийнятний буфер" означає розчини сполук, які, як відомо, є безпечними для фармацевтичного або ветеринарного застосування у композиціях і які мають ефект підтримування або регулювання рівня рН композиції у діапазоні рН, бажаному для згаданої композиції. Прийнятними буферами для регулювання рівня рН у межах від помірно кислого рН до помірно лужного рН є (але ними не обмежуються) такі сполуки, як фосфат, ацетат, цитрат, аргінін, трис і гістидин. "Трис" означає 2-аміно-2-гідроксиметил1,3-пропандіол і будь-яку його фармацевтично прийнятну сіль. Буферами, яким віддають перевагу, є ацетатні буфери з фізіологічним розчином або прийнятна сіль. "Ізотонічний агент" являє собою сполуку, що є фізіологічно прийнятною і яка наділяє композицію прийнятною ізотонічністю для запобігання результуючого току води через клітинні мембрани, що контактують зі згаданою композицією. З цією метою, як правило, застосовуються такі сполуки як гліцерин із відомими концентраціями. Іншими придатними ізотонічними агентами є (але ними не обмежуються) маніт, амінокислоти або білки (наприклад, гліцин або альбумін), солі (наприклад, 92146 14 хлорид натрію) і цукри (наприклад, декстроза, маніт, цукроза і лактоза). Термін "антиоксидант" означає сполуку, що запобігає взаємодії кисню або вільних радикалів кисню з іншими речовинами. Антиоксиданти входять до ряду наповнювачів, які, як правило, додають до фармацевтичних систем для підвищення фізичної та хімічної стійкості. Антиоксиданти додають для зниження до мінімального рівня або уповільнення процесів окиснення, що відбуваються з деякими лікарськими засобами або наповнювачами у разі піддання дії кисню або у присутності вільних радикалів. Ці процеси часто можуть каталізуватись світлом, температурою, воднем (у разі підвищення концентрації), присутністю металевих мікроелементів або пероксидів. Як антиоксиданти у лікарських засобах часто застосовуються сульфіти, бісульфіти, тіосечовина, метіонін, солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA), бутилований гідрокситолуол (ВНТ) і бутилований гідроксіанізол (ВНА). Було встановлено, що натрійEDTA підсилює активність антиоксидантів завдяки утворенню хелатних сполук з іонами металів, які інакше каталізували б реакцію окиснення. Антиоксидантом, якому віддають найбільшу перевагу, є метіонін. Антиоксиданти у цьому описі називають також стабілізаторами. Метіонін може бути присутнім у формі вільної основи або у сольовій формі. Будь-який стереоізомер (тобто L, D або DL ізомер) метіоніну може застосовуватись відповідно до цього способу або у цій композиції відповідно до цього винаходу доти, доки метіонін присутній у формі вільної основи або у сольовій формі. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, застосовують Ζ,стереоізомер. У композиції відповідно до цього винаходу можуть також застосовуватись аналоги метіоніну. Термін "аналог метіоніну" означає похідну природного метіоніну. Аналоги метіоніну можуть також застосовуватись у композиції відповідно до цього винаходу у формі вільної основи або у сольовій формі. Підвищення та/або підтримка стабільності у разі додання антиоксидантів (наприклад, метіоніну) відбувається залежним від концентрації чином. Тобто наслідком підвищення концентрації антиоксидантів є підвищення та/або підтримка стабільності композиції, що містить бета-інтерферон, відповідно до цього винаходу, у разі коли ця композиція, що містить бета-інтерферон, як правило, демонструє окиснення або агрегування/утворення олігомерів за відсутності антиоксиданту. Визначення кількості антиоксиданту (наприклад, метіоніну), яка повинна застосовуватись у композиції відповідно до цього винаходу для зниження окиснення або утворення олігомерів/агрегатів, може легко здійснюватись без зайвого експериментування за допомогою способів, відомих, як правило, фахівцю у цій галузі. Термін "бактеріостатичний препарат" означає сполуку або композиції, що додаються до лікарської форми для відіграння ролі антибактеріального агента. Прикладами бактеріостатичних препаратів є фенол, м-крезол, n-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловий спирт, алкілпарабен (метил, етил, 15 пропіл, бутил тощо), бензалконію хлорид, бензетонію хлорид, натрію дигідроацетат і тимеросал. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, бактеріостатичним препаратом є бензиловий спирт. Термін "поверхнево-активна речовина" означає розчинну сполуку, що знижує поверхневий натяг рідин або знижує міжфазний натяг між двома рідинами або рідиною і твердим тілом, де поверхневий натяг являє собою силу, що діє на поверхню рідини із намаганням звести до мінімуму площу поверхні. Поверхнево-активні речовини подеколи застосовують у фармацевтичних композиціях, у тому числі для спрямованої доставки лікарських засобів і поліпептидів низької молекулярної маси для модифікування абсорбції лікарського засобу або його спрямованої доставки до цільових тканин. Добре відомими поверхнево-активними речовинами є полісорбати (похідні поліоксіетилену; твій), а також плуроник (Pluronic). За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, було встановлено, що завдяки об'єднанню інтерферону з поверхневоактивною речовиною, вибраною з групи, що включає плуроник F77 (Pluronic F77), плуроник F87, плуроник F88 і плуроник F68 (Pluronic F68), за варіантом, якому віддають особливу перевагу, з плуроник F68 (фірма BASF, плуроник F68 є також відомим під назвою полоксамер 188 (Poloxamer 188)), одержують стійкі композиції, які зводять до мінімального рівня втрату активного компонента, що спричинюється адсорбцією на поверхнях флакона та/або засобу для спрямованої доставки (наприклад, шприца, насоса, катетера тощо). Було встановлено також, що завдяки об'єднанню інтерферону з поверхнево-активною речовиною, вибраною з групи, що включає плуроник F77 (Pluronic F77), плуроник F87, плуроник F88 і плуроник F68 (Pluronic F68), за варіантом, якому віддають особливу перевагу, з плуроник F68 (фірма BASF, плуроник F68 є також відомим під назвою полоксамер 188 (Poloxamer 188)), одержують стійку композицію, що є більш стійкою до окиснення і утворення білкових агрегатів. Поверхнево-активні речовини типу плуроник є блокспівполімерами етиленоксиду (ЕО) і пропіленоксиду (РО). Блок пропіленоксиду (РО) знаходиться між двома блоками етиленоксиду (ЕО). Поверхнево-активні речовини типу плуроник синтезують двостадійним способом: 1. Гідрофобну речовину бажаної молекулярної маси одержують шляхом контрольованого додання пропіленоксиду до двох гідроксильних груп пропіленгліколю; і 2. Етиленоксид додають для того, щоб гідрофобна речовина опинилась між гідрофільними групами. 92146 16 У разі плуроник F77 (Pluronic F77) відсотковий вміст поліоксіетилену (гідрофільна речовина) становить 70%, а молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілену) досягає приблизно 2306 Да. У разі плуроник F87 відсотковий вміст поліоксіетилену (гідрофільна речовина) становить 70%, а молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілену) досягає приблизно 2644 Да. У разі плуроник F88 відсотковий вміст поліоксіетилену (гідрофільна речовина) становить 80%, а молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілену) досягає приблизно 2644 Да. У разі плуроник F68 відсотковий вміст поліоксіетилену (гідрофільна речовина) становить 80%, а молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілену) досягає приблизно 1967 Да. Нижче наведені типові властивості плуроник F77: - середня молекулярна маса: 6600; - точка плавлення/плинності: 48°С; - фізична форма при температурі 20°С: тверде тіло; - в'язкість (за Брукфілдом): 480 сП (0,48 Па·с) [рідини при температурі 25°С, пасти при температурі 60°С і тверді речовини при температурі 77°С]; - поверхневий натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25°С: 0,1% концентрація: 47,0 (0,047); 0,01% концентрація: 49,3 (0,0493); 0,001% концентрація: 52,8 (0,0528); - міжфазний натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25°С порівняно з вазеліновим маслом: 0,1% концентрація: 17,7 (0,0177); 0,01% концентрація: 20,8 (0,0208); 0,01% концентрація: 25,5 (0,0255); - змочування (за Дрейвсом), у секундах при температурі 25°С: 1,0% концентрація: >360; 0,1% концентрація: >360; - висота піни: (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 50°С: 100; (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 26°С: 47; (за результатами динамічних випробувань), 0,1%, мм при 400 мл/хв: >600; - температура помутніння у водному розчині, °С: 1,0% концентрація: >100; 10% концентрація: >100; - HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 25. Нижче наведені типові властивості плуроник F87: - середня молекулярна маса: 7700; - точка плавлення/плинності: 49°С; - фізична форма при температурі 20°С: тверде тіло; - в'язкість (за Брукфіддом): 700 сП (0,7 Па·с) [рідини при температурі 25°С, пасти при температурі 60°С і тверді речовини при температурі 77°С]; - поверхневий натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25°С: 0,1% концентрація: 44,0 (0,044); 0,01% концентрація: 47,0 (0,047); 17 0,001% концентрація: 50,2 (0,0502); - міжфазний натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25°С порівняно з вазеліновим маслом: 0,1% концентрація: 17,4 (0,0174); 0,01% концентрація: 20,3 (0,0203); 0,01% концентрація: 23,3 (0,0233); - змочування (за Дрейвсом), у секундах при температурі 25°С: 1,0% концентрація: >360; 0,1% концентрація: >360; - висота піни: (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 50°С: 80; (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 26°С: 37; (за результатами динамічних випробувань), 0,1%, мм при 400 мл/хв: >600; - температура помутніння у водному розчині, °С: 1,0% концентрація: >100; 10% концентрація: >100; - HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 24. Нижче наведені типові властивості плуроник F88: - середня молекулярна маса: 11400; - точка плавлення/плинності: 54°С; - фізична форма при температурі 20°С: тверде тіло; - в'язкість (за Брукфілдом): 2300 сП (2,3 Па·с) [рідини при температурі 25°С, пасти при температурі 60°С і тверді речовини при температурі 77°С]; - поверхневий натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25°C: 0,1% концентрація: 48,5 (0,0485); 0,01% концентрація: 52,6 (0,0526); 0,001% концентрація: 55,7 (0,0557); - міжфазний натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25°С порівняно з вазеліновим маслом: 0,1% концентрація: 20,5 (0,0205); 0,01% концентрація: 23,3 (0,0233); 0,01% концентрація: 27,0 (0,027); - змочування (за Дрейвсом), у секундах при температурі 25°С: 1,0% концентрація: >360; 0,1% концентрація: >360; - висота піни: (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 50°С: 80; (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 26°С: 37; (за результатами динамічних випробувань), 0,1%, мм при 400 мл/хв: >600; - температура помутніння у водному розчині, °С: 1,0% концентрація: >100; 10% концентрація: >100; - HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 28. Нижче наведені типові властивості плуроник F68: - середня молекулярна маса: 8400; - точка плавлення/плинності: 52°С; - фізична форма при температурі 20°С: тверде тіло; 92146 18 - в'язкість (за Брукфілдом): 1000 сП (1,0 Па·с) [рідини при температурі 25°С, пасти при температурі 60°С і тверді речовини при температурі 77°С]; - поверхневий натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25°С: 0,1% концентрація: 50,3 (0,0503); 0,01% концентрація: 51,2 (0,0512); 0,001% концентрація: 53,6 (0,0536); - міжфазний натяг, дин/см (Н/м) при температурі 25°С порівняно з вазеліновим маслом: 0,1% концентрація: 19,8 (0,0198); 0,01% концентрація: 24,0 (0,024); 0,01% концентрація: 26,0 (0,026); - змочування (за Дрейвсом), у секундах при температурі 25°C: 1,0% концентрація: >360; 0,1% концентрація: >360; - висота піни: (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 50°C: 35; (за методикою фірми Ross Miles), 0,1%, мм при температурі 26°С: 40; (за результатами динамічних випробувань), 0,1%, мм при 400 мл/хв: >600; - температура помутніння у водному розчині, °С: 1,0% концентрація: >100; 10% концентрація: >100; - HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 29. У композиціях за цим винаходом можуть також застосовуватись інші полімери, що мають властивості, подібні до наведених вище. Поверхневоактивною речовиною, якій віддають перевагу, є плуроник F68 і поверхнево-активні речовини, що мають подібні властивості. Плуроник, зокрема плуроник F68, присутній у композиції, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, у концентрації, яка є достатньою для підтримування стійкості інтерферону впродовж необхідного періоду зберігання (наприклад, від 12 місяців до 24 місяців), а також у концентрації, яка є достатньою для запобігання втратам білка унаслідок адсорбції на поверхнях, наприклад, флакона, ампули, капсули або шприца. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація плуроник, зокрема плуроник F68, у рідких композиціях становить від приблизно 0,01 мг/мл до приблизно 10 мг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від приблизно 0,05 мг/мл до приблизно 5 мг/мл, за варіантом, якому віддають значно більшу перевагу, від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 2 мг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, вона дорівнює приблизно 0,5 мг/мл. Концентрація IFN-бета у композиції, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, становить від приблизно 10 мкг/мл до приблизно 800 мкг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від приблизно 20 мкг/мл до приблизно 500 мкг/мл, за варіантом, якому віддають значно більшу перевагу, від приблизно 30 мкг/мл до приблизно 300 мкг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, вона дорівнює приблизно 22 мкг/мл, 44 мкг/мл, 88 мкг/мл або 264 мкг/мл. 19 рН композицій за цим винаходом, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, знаходиться у межах приблизно від 3,5 до приблизно 5,5, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, рН дорівнює приблизно 4,7. Буфером, якому віддають перевагу, є ацетат, протиіонами, яким відають перевагу, є іони натрію або калію. Ацетатно-сольові буфери є добре відомими у цій галузі. Концентрації буфера у загальному об'ємі розчину можуть змінюватись і дорівнювати або приблизно дорівнювати 5 мМ, 9,5 мМ, 10 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ і 500 мМ. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація буфера дорівнює приблизно 10 мМ. За варіантом, якому віддають особливу перевагу, концентрація буфера становить 10 мМ у ацетатних іонах при рН 4,7±0,2. У композиції за цим винаходом, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, антиоксидант, наприклад, метіонін, присутній у концентрації від приблизно 0,01 мг/мл до приблизно 5,0 мг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від приблизно 0,05 мг/мл до приблизно 0,3 мг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, вона дорівнює приблизно 0,12 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, у композиції відповідно до цього винаходу, амінокислота, наприклад, лізин, присутня у концентрації, яка становить від приблизно 1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, становить від приблизно 10 мг/мл до приблизно 50 мкг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, становить приблизно 27,3 мг/мл. Цей винахід включає рідкі композиції. Розчинником, якому віддають перевагу, є вода для ін'єкцій. Рідкі композиції можуть бути однодозовими або багатодозовими. Згадані рідкі композиції інтерферону за цим винаходом, які є призначеними для багатодозового застосування, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, містять бактеріостатичний препарат, наприклад, фенол, мкрезол, n-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловий спирт, алкілпарабен (метил, етил, пропіл, бутил тощо), бензалконію хлорид, бензетонію хлорид, натрію дигідроацетат і тимеросал. Особливу перевагу віддають фенолу, бензиловому спирту і м-крезолу, більшу перевагу віддають бензиловому спирту. Згаданий бактеріостатичний препарат застосовують у кількості, яка забезпечує концентрацію, що є ефективною для підтримання згаданої композиції по суті вільною від бактерій (придатною для ін'єкцій) впродовж періоду введення багатодозових ін'єкцій тривалістю від приблизно 12 год або 24 год до приблизно 12 днів, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, від приблизно 6 днів до приблизно 12 днів. Концентрація бактеріостатичного препарату, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, становить від приблизно 0,1% (маса бактеріостатичного препарату/маса розчинника) до приблизно 2,0%, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від приблизно 0,2% до приблизно 1,0%. У разі бе 92146 20 нзилового спирту, особливу перевагу віддають концентраціям 0,2% або 0,3%. Однак застосування консерванта, наприклад, бензилового спирту, не обмежується багатодозовими композиціями, але він може додаватись також до однодозових композицій. Одним із варіантів здійснення цього винаходу є однодозові композиції, що містять бензиловий спирт. Відповідно до додаткового варіанта композицій за цим винаходом, бета-інтерферон знаходиться щонайменше приблизно на 96% або щонайменше приблизно на 98% у мономерній формі (менше ніж 4%, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, менше ніж 2% агрегатів) при кімнатній температурі або при температурі 28°С, за результатами визначення шляхом аналізу швидкості осадження, опис якого наведено нижче. Композиція, якій віддається перевага, містить бета-інтерферон 1а, бензиловий спирт, лізин, метіонін, Pluronic F-68 та водний розчин ацетатного буфера, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, для доведення рН до рівня 3,7-4,7. Кількість інтерферону у композиціях за цим винаходом забезпечує після відновлення одержання концентрацій від приблизно 1,0 мкг/мл до приблизно 50 мг/мл, хоча придатними є більш низькі і більш високі концентрації, що залежить від передбачуваного носія для спрямованої доставки, наприклад, розчинні композиції будуть відрізнятись від композицій, призначених для доставки за допомогою черезшкірного пластиру, легеневим, трансмукозним шляхами або за допомогою осмотичного чи мікронасоса. Концентрація інтерферону, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, становить від приблизно 5,0 мкг/мл до приблизно 2 мг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від приблизно 10 мкг/мл до приблизно 1 мг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 30 мкг/мл до приблизно 100 мкг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, активність інтерферону у композиціях за цим винаходом під час фасування зберігається щонайменше на рівні або приблизно на рівні 60%, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, щонайменше на рівні або приблизно на рівні 70%, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, щонайменше на рівні або приблизно на рівні 80% впродовж 24 міс. Відповідно до додаткового варіанта здійснення, якому віддається перевага, цей винахід пропонує спосіб виготовлення рідкої фармацевтичної композиції, як описувалось вище. Відповідно до ще одного варіанта здійснення, якому віддається перевага, цей винахід пропонує спосіб виготовлення фасованої фармацевтичної композиції, що включає фасування розчину, що містить активний інгредієнт і наповнювачі, як описувалось вище. Відповідно до ще одного варіанта здійснення, якому віддається перевага, цей винахід пропонує готовий виріб для людського фармацевтичного застосування, що включає флакон, який містить фармацевтичні композиції, як описувалось вище, і письмовий матеріал, у якому вказується, що такий 21 розчин може зберігатись після першого застосування впродовж періоду часу, що дорівнює приблизно двадцяти чотирьом годинам або більше. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, письмовий матеріал вказує, що такий розчин може зберігатись впродовж періоду часу, що дорівнює приблизно 12 дням. Після першого застосування багатодозової композиції, вона може зберігатись і застосовуватись щонайменше впродовж приблизно 24 год, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, щонайменше впродовж приблизно 4 днів, 5 днів або 6 днів, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, впродовж періоду часу тривалістю до 12 днів. Після першого застосування композицію, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, зберігають при температурі нижче кімнатної (тобто нижче приблизно 25°С), відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, нижче приблизно 10°С, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, нижче приблизно 2-8°С, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, нижче приблизно 4-6°С. Композиції за цим винаходом можна одержати способом, який включає додання визначеної кількості наповнювачів до забуференого розчину, з подальшим доданням інтерферону. Після цього одержаний розчин фасують у флакони, ампули або капсули. Пересічним фахівцем у цій галузі можуть бути визначені варіанти цього процесу. Наприклад, порядок, у якому додаються компоненти, чи застосовуються додаткові додатки, температура і рН, при яких одержують композицію, усе це є факторами, які можуть оптимізуватись відносно концентрації та застосованих засобів введення. У разі композицій для багатодозового застосування, бактеріостатичний препарат може додаватись до розчину, що містить активний інгредієнт (інтерферон), або за альтернативним варіантом, він може зберігатись у окремому флаконі або капсулі з подальшим змішуванням з розчином, що містить активний інгредієнт, у момент застосування. Композиції за цим винаходом можуть вводитись за допомогою визнаних засобів. Прикладами таких одноампульних систем є автоматичні ін'єктори або шприци-ін'єктори для спрямованої доставки розчину, наприклад, Rebiject . Продукти, що заявляються у пунктах формули цього винаходу, включають пакувальний матеріал. Пакувальний матеріал, окрім інформації, яка вимагається органами державного регулювання, забезпечує умови, за яких згаданий продукт може застосовуватись. Пакувальний матеріал за цим винаходом, у разі продукту, розфасованого у двох флаконах (вологий/сухий), надає хворому, у разі необхідності, інструкції щодо одержання розчину і застосування такого готового розчину впродовж періоду часу тривалістю 24 год або більше. У разі розфасованого до одного флакона розчинного продукту, етикетка вказує, що такий розчин може застосовуватись впродовж періоду часу тривалістю 24 год або більше. Продукти, що заявляються у 92146 22 пунктах формули цього винаходу, є придатними для фармацевтичного застосування для людини. Стійкі консервовані композиції можуть надаватись хворим у вигляді прозорих розчинів. Згаданий розчин може призначатись для одноразового застосування або може застосовуватись декілька разів, і його може вистачити для одного або декількох циклів лікування хворого і, таким чином, цей розчин надає можливість застосування більш зручної схеми лікування, аніж та, що є доступною на цей час. Інтерферон у формі стійких або консервованих композицій або розчинів, опис яких наведено, може вводитись хворому за цим винаходом різноманітними способами спрямованої доставки, у тому числі шляхом підшкірної або внутрішньом'язової ін'єкції; черезшкірним, легеневим, трансмукозним шляхом, шляхом імплантації, за допомогою осмотичного насоса, капсули, мікронасоса, пероральним шляхом або іншими засобами, які визначаються досвідченим фахівцем як добре відомі у цій галузі. Термін "флакон" означає, у широкому значенні, резервуар, придатний для утримування інтерферону у твердій або рідкій формі у фасованому стерильному стані. Прикладами флакона, за цим описом, є ампули, капсули, витяжні прозорі упаковки або інший подібний резервуар, придатний для спрямованої доставки інтерферону хворому за допомогою шприца, насоса (у тому числі осмотичного), катетера, черезшкірного пластиру, легеневого або трансмукозного спрею. Флакони, придатні для фасування продуктів для парентерального, легеневого, трансмукозного або черезшкірного введення, є добре відомими і загальновизнаними у цій галузі. Термін "лікування" у контексті цього винаходу означає будь-який сприятливий ефект на розвиток хвороби, у тому числі послаблення, зменшення, зниження або полегшення патологічного розвитку після початку хвороби. Фармацевтичні композиції за цим винаходом, що містять IFN або ізоформу, мутеїн, гібридний білок, функціональну похідну, активну фракцію або сіль, є придатними для діагностування, запобігання або лікування (місцевого або системного) клінічних показань, що реагують на лікування цим поліпептидом. Такі клінічні показання включають, наприклад, розлади або хвороби центральної нервової системи (ЦНС), головного мозку та/або спинного мозку, у тому числі розсіяний склероз; автоімунні захворювання, у тому числі ревматоїдний артрит, псоріаз, хворобу Крона; і рак, у тому числі рак молочної залози, передміхурової залози, сечового міхура, нирок і товстої кишки. До цього опису шляхом посилання у повному обсязі включені усі посилання, наведені у цьому описі, у тому числі журнальні статті або реферати, опубліковані або неопубліковані американські або іноземні заявки на патенти, видані американські або іноземні патенти або будь-які інші посилання, у тому числі усі дані, таблиці, фігури і текст, подані у наведених посиланнях. Окрім того, до цього опису у повному обсязі включено шляхом посилання 23 повний зміст посилань, які наводяться у наведених у цьому описі посиланнях. Посилання на стадії відомих способів, стадії традиційних способів, відомі способи або традиційні способи у жодному разі не є визнанням того, що будь-який аспект, опис або варіант здійснення цього винаходу розкривається, описується або пропонується у відповідній галузі. Наведений далі опис конкретних варіантів здійснення цього винаходу з такою повнотою розкриє загальну природу винаходу, що інші зможуть, вживши знань у межах цієї галузі (з включенням змісту посилань, що згадувались у цьому описі), легко модифікувати та/або адаптувати для різних варіантів застосування такі конкретні варіанти здійснення без зайвого експериментування і без відхилення від загальної концепції цього винаходу. Таким чином, вважається, що усі подібні адаптації та модифікації входять до діапазону еквівалентів розкритих варіантів здійснення, виходячи з розкриття та методичних вказівок, наведених у описі. Слід розуміти, що фразеологія або термінологія, вжита у цьому описі, призначена для опису, а не для обмеження, завдяки чому термінологія або фразеологія цього опису повинна тлумачитись досвідченим фахівцем у світлі розкриття та методичних вказівок, наведених у цьому описі, у поєднанні зі знаннями пересічного фахівця у цій галузі. Приклади Приклад 1 - Аналітичні методи Високоефективну рідинну витіснювальну хроматографію за розміром молекул (SE)-HPLC, яку у цьому описі називають також "новою SE-HPLC" або "NEW SEC", та швидкісне ультрацентрифугування (AUC) застосовували для визначення рівнів агрегатів і олігомерів рекомбінантного людського бета-інтерферону 1a (r-h IFN-beta 1a або r-h IFN1a). Представлені нижче методи SE-HPLC та AUC є здатними до виявлення (як кількісного, так і якісного) як ковалентних, так і нековалентних олігомерів. а) Аналіз на чистоту - SE-HPLC Виявлення сумарного вмісту агрегатів здійснюють на колонці TSK G2000SWXL (фірма TosoHaas) або BioSuite (фірма Waters); елюювання здійснюють у ізократичному режимі (0,5 мл/хв) із застосуванням 50 мМ розчину натрійацетатного буфера, 50 мМ розчину NaCl (pH 3,8); довжину хвилі встановлюють на 215 нм. Тривалість роботи дорівнює 30 хв. Зразки (88 мкг/мл) аналізують у вигляді, як є, шляхом введення 100 мкл. b) Аналіз швидкості осадження - AUC 1) Опис методу Зразки вводять у кювети з 2-канальними центральними перегородками з деревного вугілляепону з 12 мм оптичною довжиною шляху. Центральні перегородки і сапфірові оглядові вікна очищають детергентом, після чого зволожують водою з метою одержання максимально можливо чистих поверхонь. Відповідне плацебо вносять до еталонного каналу (прилад функціонує подібно двопроменевому спектрофотометру). Після цього завантажені кювети вміщують до аналітичного ротора AN-50Ti, що знаходиться у аналітичній 92146 24 центрифузі Beckman Optima XL-1, і доводять температуру до рівня 20°С. Після цього частоту обертання ротора доводять до 3000 об/хв і здійснюють сканування зразків (при 280 нм, максимальна оптична густина) для підтвердження правильного завантаження кювет. Після цього частоту обертання ротора доводять до кінцевого рівня у 50000 об/хв. При згаданій частоті обертання ротора здійснюють 50 сканувань кожного зразка. Дані аналізують за методом c(s), розробленим Пітером Шук (Peter Schuck) (N.I.H. (Національний Інститут Здоров'я (США)), і застосовують його у розробленій ним аналітичній програмі SEDFIT (версія 8.7; Шук П. (Schuck P.) (2000). Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophys. J. 78, 1606-1619). Відповідно до цього варіанта підходу, багато необроблених даних безпосередньо підбирають для визначення розподілу коефіцієнтів осадження з одночасним моделюванням впливу дифузії на дані з метою підвищення роздільної здатності. Цей метод здійснюють шляхом призначення коефіцієнта дифузії кожному значенню коефіцієнта осадження, виходячи із припущення, що всі види мають однакову загальну гідродинамічну форму (де форма визначається відношенням коефіцієнта тертя до коефіцієнта тертя для сфери, f/f0). Після цього значення f/f0 змінюють для встановлення найкращої загальної відповідності даних для кожного зразка. Розподіли обчислюють із застосуванням максимально ентропійного згладжування 0,51. 2) Аналітичні параметри - Тип ротора: ротор з 8 отворами - Частота обертання ротора: 50000 об/хв - Центральні прокладки: деревне вугілля-епон - Довжина каналу: 12 мм - Температура під час ультрацентрифугування: 20°С - Довжина хвилі детектування: 280 нм - Об'єм зразка: 432 мкл - Еталонний об'єм: 442 мкл 3) Обладнання і програмне забезпечення Аналітична ультрацентрифуга, модель XL-I (фірма Beckman Coulter) Програма SEDFIT, версія 8.70b (Пітер Шук (Peter Schuck - Національний Інститут Здоров'я (США)) Програма Origin, версія 6.03 (фірма Beckman Coulter) Програма Proteome, Lab XL-A/XL-I версія 5.0 (фірма Beckman Coulter) с) Кількісне визначення -IFN 1a засобами RPHPLC - QUANT-HPLC Метод хроматографування з оберненою фазою, опис якого наведено нижче, надає можливість кількісного визначення -IFN 1а у зразках. Кількісне визначення білка здійснюють на 5 мкм колонці С4, Wide-Pore Butyl (фірма Baker); довжину хвилі встановлюють на 214 нм, елюювання здійснюють зі швидкістю потоку 1 мл/хв за допомогою наведеної нижче рухомої фази і градієнта: 25 92146 А - вода/трифтороцтова кислота, 0,1%; В ацетонітрил/трифтороцтова кислота, 0,1%; С ацетонітрил. Зразки аналізують шляхом введення 50 мкл зразка у вигляді, як є (зразки з концентрацією 88 мкг/мл). Таблиця 4 Час (хв) % елюенту А % елюенту В % елюенту С 0 70 30 0 5,0 70 30 0 6,0 58 42 0 15,0 57 43 0 30,0 46 54 0 35,0 45 55 0 40,0 40 60 0 40,1 20 80 0 45,0 20 80 0 45,1 0 0 100 50,0 0 0 100 50,1 70 30 0 65,0 70 30 0 Час роботи=65 хв Кількісне визначення зразків здійснюють у зіставленні зі стандартною кривою у діапазоні 0,0125 мкг/мл-0,2 мг/мл, яку одержали із застосуванням еталонного стандартного матеріалу. d) Визначення чистоти засобами RP-HPLC (високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою) - DEG/OX Метод хроматографування з оберненою фазою, опис якого наведено нижче, надає можливість виявлення окиснених форм -IFN 1а, елюювання яких відрізняється від елюювання інтактної молекули. Кількісне визначення окиснених форм здійснюють на колонці С4, Supelcosil LC-304 (фірма Supelco), температуру якої підтримують на рівні 40°С; довжину хвилі встановлюють на 208 нм, елюювання здійснюють зі швидкістю потоку 1 мл/хв за допомогою наведеної нижче рухомої фази і градієнта: Одержують наведені нижче розчини: А вода 60%/ацетонітрил 40%/гептафтормасляна кислота 0,14%; В - вода 20%/ацетонітрил 80%/гептафтормасляна кислота 0,14%; С вода 20%/ацетонітрил 80%/трифтороцтова кислота 0,1%. Таблиця 5 0' 5' 58' 63' 68' 69' 70%А 70%А 62%А 0%А 0%А 70%А 30%В 30%В 38%В 100%В 0%В 30%В 0%С 0%С 0%С 0%С 100%С 0%С Крива 6 Крива 1 Крива 1 Крива 6 Час роботи=96 хв (70 хв+26 хв врівноваження) 26 Зразки аналізують у вигляді, як є, шляхом введення 200 мкл (зразки з концентрацією 88 мкг/мл). e. Біологічний аналіз пригнічення цитопатичного ефекту - СРЕ Біопотенціал (противірусна активність) Противірусну активність -IFN 1а визначають за допомогою аналізу пригнічення цитопатичного ефекту (СРЕ). Біологічну активність визначають за допомогою противірусного аналізу, основу якого становить індукований -IFN захист клітин (клітини WISH - амніотична тканина людини) проти цитопатичного ефекту вірусу (вірус везикулярного стоматиту). Принцип біологічного аналізу на інтерферон полягає у тому, що ряд вірусів, наприклад, вірус везикулярного стоматиту (VSV), спричинює смерть клітин, що може бути візуалізоване прижиттєвим забарвленням. Цитопатичний ефект може у подальшому застосовуватись для кількісного визначення захисту клітин інтерфероном. Аналіз здійснюють шляхом непрямого визначення смерті клітини, яка визначається за кількістю забарвленої солі тетразолію, МТТ (диметилтіотетразолій), яка була поглинута живими клітинами. При здійсненні цього методу вдаються до автоматичного спектрофотометричного визначення відсотку захищених клітин та трифакторного аналізу паралельних ліній для статистичного визначення титру. Методика Аналіз здійснюють на титраційних мікропланшетах. a) До кожної лунки вносять 50 мкл живильного середовища для культивування клітин ((MEM (мінімальне підтримувальне середовище)/5% FBS (сироватка зародка великої рогатої худоби)). b) До лунок додають 100 мкл зразок -IFN 1а або стандартний розчин (60-100 МОд людського ΙΡΝ/мл). Від ряду до ряду на планшетах здійснюють три послідовні розведення 1:1,5. c) До кожної лунки додають 50 мкл суспензії клітин WISH (0,78-0,82 106 клітин/мл), і планшети інкубують при температурі 37°С впродовж 18-20 год у вологій камері з 5% СО2. d) До кожної лунки додають суспензію VSV, за виключенням лунок із контрольними клітинами, заповнених MEM/2,5% FBS. e) Планшети інкубують при температурі 37°С впродовж 24 год у вологій камері з 5% СО2. f) Після перевірки за допомогою інвертованого мікроскопа того, що (1) у контрольному ряді VSV досягнуто щонайменше 80% пошкодження клітин і (2) середнє відсоткове значення захисту у присутності стандарту -IFN становить 84% для нерозбавленого стандарту, 45% для розведення 1:1,5 і 27% для розведення 1:3 культури забарвлюють специфічним барвником, МТТ. 27 92146 g) Інтенсивність забарвлення визначають шляхом автоматичного спектрофотометричного зчитування при 592 нм. h) Для кількісного визначення активності -IFN 1а, значення оптичної густини у подальшому аналізують за допомогою комп'ютерної програми (фірма Colombo Software). Приклад 2 - Стабілізація вільних від HSA композицій, що містять бета-інтерферон 1а Наведений нижче експеримент здійснили для перевірки захисного ефекту, який виявляє композиція, що містить амінокислоту (тобто лізин) та антиоксидант (тобто метіонін) на зберігання композиції r-h IFN-beta 1a при різних температурах (28°С, 25°С та 40°С). Під час розробки були застосовані наведені нижче аналітичні випробування і методи (дивись Приклад 1): - аналіз біологічної активності (in vitro біоаналіз) - хроматографічний аналіз (метод RP-HPLC) - аналіз продуктів окиснення (метод Deg-ox) - аналіз димерів/агрегатів (NEW SEC-HPLC та AUC, обидва методи є здатними до виявлення як ковалентних, так і нековалентних олігомерів) - кількісна RP-HPLC (Quant-HPLC) - рН (потенціометричний метод) Результати представлені у Таблицях 6-8. 1) Методика: а) Композицію одержали із застосуванням нерозбавленого розчину, який зберігали/транспортували при температурі 2-8°С. Конце 28 нтрація r-h -IFN 1a нерозбавленого розчину становила приблизно 0,5 мг/мл. b) Композицію, що містить лізин (як вказано у розділі 2), одержали шляхом розбавлення лікарського засобу носієм, із одержанням, таким чином, кінцевої композиції (концентрація r-h -IFN 1a - 88 мкг/мл). c) Одержаний розчин після цього фільтрували із застереженням асептичних умов через 0,2 мк найлоновий мембранний фільтр і збирали до стерильного контейнера; після цього шприци заповнювали (0,5 мл) за допомогою розливної машини. d) Зразок після цього зберігали у термостатованих шафах при температурі 2-8°С, 25°С та 40°С і випробували за планом випробування на стабільність із застосуванням різних методів/тестів впродовж періоду зберігання, тривалість якого становила приблизно 2 місяці (1-3 тижні для зразків, які зберігали при температурі 40°С). 2) Склад композиції: a) r-h бета-інтерферон 1а (0,088 мг/мл) b) L-лізину моногідрохлорид (27,3 мг/мл (код 1.05701, фірма Merck) c) L-метіонін (0,12 мг/мл) (1.05707, фірма Merck) d) Pluronic F-68 (0,5 мг/мл) (Lutrol F68 DAC (Німецька фармакопея), USP (Фармакопея CШA)/NF (додаток до Американської фармакопеї), Basf), 5163315 e) 10 мМ розчин ацетату натрію, рН 4,7. 3) Результати: Таблиця 6 Зберігання при температурі 2-8°С Quant-HPLC (мкг/шприц) Deg-ox HPLC (% окиснення) AUC (% мономерів) New-SEC (% мономерів) рН Біоаналіз (МОд/мл) Осмотичний тиск (Осмотичний тиск/кг) 2-8°С Т=0 39,0 1,3 98,7 100,0 4,7 24,1 0,303 4 тижні 38,2 1,5 100,0 4,7 24,6 6 тижнів 39,8 1,5 98,8 100,0 8 тижнів 39,2 1,5 100,0 4,7 Таблиця 7 Зберігання при температурі 25°С Quant-HPLC (мкг/шприц) Deg-ox HPLC (% окиснення) AUC (% мономерів) New-SEC (% мономерів) рН Біоаналіз (МОд/мл) 25°С Т=0 39,0 1,3 98,7 100,0 4,7 24,1 2w 42,8 1,5 99,0 100,0 4,7 4w 38,0 1,4 100,0 4,7 24,0 6w 39,4 2,3 98,2 100,0 8w 37,8 2,3 100,0 4,7 29 92146 30 Таблиця 8 Зберігання при температурі 40°С 40°С T=0 39,0 1,3 98,7 100,0 4,7 Quant-HPLC (мкг/шприц) Deg-ox HPLC (% окиснення) AUC (% мономерів) New-SEC (% мономерів) рН 4. Висновки: Дослідження зберігання показали, що лікарська форма або композиція, яка містить лізин, метіонін і Pluronic F68, залишається дуже стабільною як при температурі 2-8°С, так і при температурі 25°С до 8 тижнів. Вони залишаються стабільними при температурі 40°С до 3 тижнів з точки зору відсоткового рівня мономерів (відсоток мономерів є завжди вищим за 98%). Ці результати були підтверджені двома різними методами (AUC та NEW-SEHPLC). Таким чином, композиція відповідно до цього винаходу, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, містить комбінацію амінокислоти та антиоксиданта. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, до згаданої композиції додатково додають поверхнево-активну речовину. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, амінокислотою є лізин, антиоксидантом є метіонін. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, поверхнево-активна речовина вибрана з групи, яка включає твій (наприклад, твін 20), Pluronic F77, Pluronic F87, Pluronic F88 та Pluronic F68. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, поверхнево-активною речовиною є Pluronic F68. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, діапазон рН композиції становить від 3,5 до 5,5. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, рН композиції дорівнює 4,7. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація лізину становить від приблизно 1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, концентрація лізину становить приблизно 27,3 мг/мл. Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 1w 37,8 1,9 99,6 100,0 4,7 3w 34,9 3,4 100,0 4,6 Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація поверхнево-активної речовини становить від приблизно 0,01 мг/мл до приблизно 10 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, концентрація поверхневоактивної речовини становить приблизно 0,5 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація антиоксиданта становить від приблизно 0,01 мг/мл до приблизно 5,0 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, концентрація антиоксиданта становить приблизно 0,12 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація інтерферону становить від приблизно 10 мкг/мл до приблизно 800 мкг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, концентрація інтерферону становить приблизно 88 мкг/мл. Посилання 1. Derynk R. et al., Nature 1980; 285, 542-547. 2. Familletti P.C., Rubinstein S. and Pestka S. 1981 "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon", in Methods in Enzymology, Vol. 78 (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York, 387394. 3. Mark D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (18) 5662-5666 (1984). 4. Pestka S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations, in Methods in Enzymology (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York 119, 14-23. 5. Rubinstein S., Familletti P.C. and Pestka S. Convenient Assay for Interferons. J. Virol 1981; 37, 755-758. 6. Shepard H.M. et al., Nature 1981; 294, 563-565. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601