Штам brucella abortus 7-26 для виготовлення бруцельозного rs-антигену

Реферат: Штам Brucella abortus 7-26 виділений і селекційований для виготовлення бруцельозного RSантигену. UA 98886 U (54) ШТАМ BRUCELLA ABORTUS 7-26 ДЛЯ ВИГОТОВЛЕННЯ БРУЦЕЛЬОЗНОГО RS-АНТИГЕНУ UA 98886 U UA 98886 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, зокрема до виготовлення виробничих штамів Brucella abortus, які використовують для виготовлення бруцельозного RS-антигену при дослідженні зразків клінічного матеріалу, щодо наявності антитіл до дисоційованих RS-форм бруцел у сироватці крові тварин. Відомий штам Brucella abortus 82 в RS-формі (колекція Саратовської науково-дослідної ветеринарної станції, Російська Федерація), який використовують для виготовлення антигену зі штаму В. abortus 82 при диференційній діагностиці хворих на бруцельоз тварин від вакцинованих (Патент РФ № 2036473 G01N33/53, А61К38/10. - Опубл. 27.05.1995 р. - 2 с.). Також відомий комплексний діагностикум із суміші S- і R-антигенів бруцел в різних співвідношеннях, який використовують при постановці діагностичної реакції на бруцельоз (Патент РФ № 2203499 G01N33/569, А61К39/10. - Опубл. 27.04.2003 p. - 7 c.). Використання цих штамів в біологічній промисловості України неможливе за їх відсутністю. Для розробки препаратів для диференційної діагностики бруцельозу тварин необхідно мати вітчизняні виробничі штами. В основу корисної моделі поставлено задачу винайти штам Brucella abortus в RS-формі для виготовлення антигену шляхом дослідження музейного вакцинного штаму Brucella abortus 7-26 з колекції культур бруцел. Штам В. abortus 7-26 був виділений і селекційований в УНДІЕВ у 1963 p., як інаглютинабельний мутант вірулентної культури В. abortus, ізольованої з аборт-плоду великої рогатої худоби. Відноситься до порядку Proteobacteria, класу Alphaproteobacteria, відділу Rhizobiales, родини Brucellaceae, роду Brucella, виду Brucella abortus і має стабільну RS-форму. Зареєстрований за № 57 штамів мікроорганізмів та зберігається в лабораторії вивчення бруцельозу Національного наукового центру «Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини» НААН, м. Харків, Україна. Штам В. abortus 7-26, який знаходиться в RS-формі, має такі культурально-морфологічні, аглютинабельні та біохімічні властивості: - росте на бруцельозних середовищах: м'ясо-печінковому пептонно-глюкозо-гліцериновому агарі (МППГГА) рН (7,2-7,4) та бульйоні (МППГГБ) в умовах термостату за температури (37,5±0,5) °С; - у посівах на МППГГА росте у вигляді напівпрозорого нальоту; на агарі в бактеріологічних чашках на 3-4 добу формує круглі (від 0,5 до 2,0 мм в діаметрі), випуклі, зернисті колонії, сіроблакитні з оранжево-жовтим центром, а після фарбування за Уайт-Вільсоном - фіолетові з червоним відтінком в центрі; - на бульйоні - формує слабке помутніння й осад на дні пробірки; - продукує сірководень; - дає позитивну реакцію аглютинації з R- і S-бруцельозними сироватками, позитивні термофлокуляцію (через 72 год.) й трипафлавінову пробу; - дає ріст у напіврідкому агарі з фуксином (1:50000) і не рости на середовищі з тіоніном (1:25000); - в мазках, що пофарбовані за Грамом, Козловським або Стемпом, штам має вид дрібних паличкоподібних (1,0-1,2 × 0,5-0,7) мкм бактерій рожевого та червоного кольору. Штам вільний від контамінації іншої бактеріальної мікрофлори та грибами. Підтримання штаму проводять шляхом пересіву з інтервалом 2-3 місяці на середовищі МППГГА рН (7,2-7,4) за температури (37,5±0,5) °С. Перевіряють культуру на культурально-морфологічні, аглютинабельні та біохімічні властивості не рідше одного разу за 6 місяців. Зберігають штам в пробірках на МППГГА під гумовими пробками або у ліофілізованому стані в ампулах в холодильнику за температури (4±2)° С. Корисну модель ілюструють наступні приклади. Приклад 1. Проведено вивчення антигенних властивостей експериментальної серії бруцельозного RS-антигену, виготовленого зі штаму В. abortus 7-26, який знаходиться в RSформі. Здійснили клонування штаму та вивчення властивостей отриманих 3-х клонів. Встановлено, що усі 3 клони культури росли на МППГГА у вигляді напівпрозорого нальоту і на бульйоні мали опалесценцію з аглютинатом на дні, утворювали H2S, росли на МПНРА з фуксином (1:50000) і не росли на середовищі з тіоніном (1:25000), давали аглютинацію з Sбруцельозною і R-родовою бруцелаовісною сироватками, з трипафлавіном і в пробі термофлокуляції (через 72 год). При мікроскопії мазків, пофарбованих за Грамом, Козловським та Стемпом, спостерігали дрібні паличкоподібні 1,0-1,2 × 0,5-0,7 мкм бактерії червоного та рожевого кольору. У посівах на МППГГА в чашці Петрі культури росли у вигляді круглих (від 0,5 до 2,0 мм в діаметрі), випуклих, зернистих колоній, які при бічному освітленні були сіро-блакитні з оранжево-жовтим центром, а після фарбування за Уайт-Вільсоном - мали фіолетовий колір з червоним відтінком в центрі. Однорідною вважали культуру, що мала не більше 5 % дисоційованих форм. Із відібраної культури з найбільш типовими властивостями виробляли RSантиген. Далі культуру бруцел вирощували на матрацах з МППГГА протягом двох діб, 1 UA 98886 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контролювали на типовість росту, відсутність контамінації, аглютинабельні властивості, а потім культуру змивали стерильним фізіологічним розчином натрію хлориду з додаванням 0,5 % 9 3 фенолу рН (7,0-7,2), визначали концентрацію суспензії 100×10 КУО/см за стандартом каламутності та інактивували її у водяній бані за температури (80±1) °С протягом 60 хв., охолоджували за температури (18-20) °С й додатково витримували у холодильнику за температури (4±2) °С протягом 10 діб. Після інактивації бактерійної суспензії проводили контролювання повноти інактивації шляхом висіву на пробірки з МППГГА і МППГГБ, витримували їх у термостаті за температури (37,5±0,5) °С впродовж 7-10 діб. За відсутності специфічного росту суспензію вважали інактивованою. Потім інактивовану суспензію 9 стандартизували стерильним фенолізованим фізіологічним розчином до концентрації 20×10 3 КУО/см (за бруцельозним стандартом каламутності), перевіряли на відсутність контамінації бактеріальною та грибною мікрофлорою шляхом висіву на середовища МПА, МПБ, КіттаТароцці, Сабуро і тіогліколеве середовище з резазурином згідно ДСТУ 4483. Суспензія була не контамінована бактеріальною та грибною мікрофлорою. Далі виготовлений бруцельозний RS3 антиген фасували в стерильні флакони по 10,0 см й етикували їх. Активність RS-антигену визначали у пробірочній реакції аглютинації відносно титрації робочих стандартів ННЦ «ІЕКВМ» (2012 р.) позитивної бруцельозної сироватки (S-сироватка), 3 що містить 1000 МО в 1,0 см , та позитивної IE сироватки (R-бруцелаовісна сироватка). Визначення граничного титру антитіл проводили за стандартною методикою (згідно Настанови по діагностиці бруцельозу тварин, Київ, 1998 p.). Встановлено, що граничні титри бруцельозної сироватки становили 1:800 і R-бруцелаовісної сироватки - 1:50 на два хрести з бруцельозним RS-антигеном в робочому розведенні 1:10. В контролі застосовували антиген бруцельозний єдиний для РА, РЗК з шт. В. abortus 19 в S-формі (виробництво Херсонського державного підприємства - біологічної фабрики) у розведенні 1:10, титр якого з бруцельозною сироваткою становив 1:1000 і R-бруцелаовісною сироваткою реакція була негативною (табл. 1). На специфічність RS-антиген перевіряли з контрольними негативними сироватками крові великої рогатої худоби або овець з комерційних наборів (виробництва ТОВ «НДП «Ветеринарна медицина») титрі 1:25 і вище. Реакція була негативною. При контролюванні в РА самоаглютинуючих властивостей RS- антигену з фенолізованим фізіологічним розчином в рівному співвідношенні спостерігали негативну реакцію (рідина мутна, на дні пробірки осад бактерій у вигляді «пункту»). Таким чином, бруцельозний RS-антиген, виготовлений з штаму В. abortus 7-26, є активним та специфічним і дозволяє виявити антитіла до дисоційованих RS-форм бруцел у сироватці крові тварин. Приклад 2. Чутливість бруцельозного RS-антигену, який виготовлений за вищевказаною технологією, досліджували шляхом визначення граничного титру сироваток крові 36 морських свинок, інфікованих культурою вакцинного штаму В. abortus 7-26 після аплікації на слизову 7 8 оболонку очей по 5,0×10 КУО і 4,0×10 КУО культури (по 18 голів на кожну дозу). Термін елімінації культури з організму тварин визначали через 16, 25, 49, 63, 87 і 102 діб після діагностичного забою 3-х морських свинок на дозу шляхом бактеріологічного дослідження патологічного матеріалу. Динаміку появи й згасання специфічних антитіл виявляли в РА з гомологічним бруцельозним RS-антигеном із штаму 7-26 та антигеном бруцельозним єдиним (S-форма) в розведенні 1:10. Результати досліду свідчать (табл. 2), що при серологічному дослідженні всі морські свинки незалежно від дози зараження реагували як на 16 добу в РА з гомологічним бруцельозним RS-антигеном із штаму В. abortus 7-26 в титрі - 1:40-1:80, на 63 добу - 1:160-1:320 і зниженням на 87 добу - 1:10-1:40. В ці ж строки тільки у 33,3-66,7 % тварин в РА з комерційним S-антигеном бруцельозним єдиним відзначали низький рівень антитіл 1:101:20. Слід відмітити, що у всіх морських свинок спостерігали на 63-87 добу позитивну реакцію з гомологічним бруцельозним RS-антигеном в порівнянні з негативною реакцією з бруцельозним S-антигеном. Згасання антитіл до RS-антигену спостерігали на 102 добу спостереження. Повну елімінацію культури з організму тварин спостерігали через 49 діб після вакцинації в обох групах. Таким чином доведено, що у контактно заражених культурою В. abortus 7-26 морських свинок при відсутності негативної реакції в РА з бруцельозним S-антигеном спостерігали позитивну реакцію з гомологічним бруцельозним RS-антигеном. Встановлено, що бруцельозний RS-антиген, виготовлений зі штаму В. abortus 7-26, виявляє високу чутливість при серологічному дослідженні щодо наявності антитіл до дисоційованих RSформ бруцел у сироватці крові лабораторних тварин. Приклад 3. В досліді на 18 морських свинках (2 дослідні та одна контрольна групи, по 6 голів у групі) вивчали імунологічну активність живої вакцини з штаму В. abortus 7-26 після разового введення. Дві групи морських свинок вакцинували живою культурою В. abortus 7-26 шляхом 2 UA 98886 U 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 7 аплікації на кон'юнктиву в дозі 5,0×10 КУО і підшкірно 25,0×10 КУО відповідно. Морським свинкам контрольної групи препарат не вводили. Гуморальну імунну відповідь у тварин вивчали через місяць при дослідженні в РА з бруцельозним RS-антигеном з штаму 7-26 та антигеном бруцельозним єдиним. За результатами досліджень встановлено, що через місяць після 7 підшкірного введення живої вакцини зі штаму 7-26 в дозі 25,0×10 КУО у всіх морських свинок виявили більш виражену імунну реакцію в РА з гомологічним RS-антигеном 7 середньогеометричний титр (1,75±0,05) lg, ніж на кон'юнктивальне її введення в дозі 5,0×10 КУО - титр (1,55±0,05) lg, р < 0,1 (табл. 3). В той же час, у 100 % морських свинок після щеплення спостерігали позитивну реакцію з RS-антигеном в більш високому титрі ніж при дослідженні з бруцельозним S-антигеном - 33,3-66,7 % тварин. При дослідженні в РА як з RSантигеном, так і з антигеном бруцельозним єдиним сироватки морських свинок контрольної групи в титрі 1:10-1:20 були негативними. Ці дані підтверджують, що бруцельозний RS-антиген, виготовлений зі штаму В. abortus 7-26, виявив високу специфічність та чутливість при серологічному дослідженні щодо наявності антитіл до RS-форм бруцел у сироватці крові тварин, які були заражені живою культурою В. abortus 7-26. Приклад 4. В досліді на 10 баранах вивчали імунну відповідь на введення живої вакцини з шт. В. abortus 7-26. Баранам першої групи (5 голів) вводили підшкірно живу вакцину в дозі 9 5,0×10 КУО, контрольній групі (5 гол.) нічого не вводили. На 10, 45, 100, 135, 168, 190 добу після вакцинації проводили дослідження сироватки крові на бруцельоз в РБП з антигеном бруцельозним для роз-бенгал проби, РА та РЗК з антигеном бруцельозним єдиним (Херсонське державне підприємство - біологічна фабрика) і в РА з бруцельозним RS-антигеном (ННЦ «ІЕКВМ»). Визначення граничного титру антитіл проводили за стандартною методикою (Настанова по діагностиці бруцельозу тварин, К. 1998 p.). При вивченні динаміки серологічних реакцій з бруцельозними антигенами встановлено, що у всіх баранів вакцинованих живою культурою зі штаму 7-26 виявили специфічні антитіла в РА, РБП і у 40 % тварин в РЗК на 10 добу після щеплення (табл. 4). Рівень антитіл у 80 % баранів на 45 добу в РА з гомологічним бруцельозним RS-антигеном був вище - титр (1,08±0,07) lg, ніж з антигеном бруцельозним єдиним - 0,56 lg (p < 0,05), який відмічали тільки у 40 % тварин даної групи. Аглютинуючі антитіла на 100 добу зберігалися у 60 % вакцинованих баранів в РА з RSантигеном ніж при дослідженні в РА, РБП з S-антигеном - 40 % тварин, при цьому комплементзв'язуючі антитіла зникали. В подальшому на 135 добу РА з RS-антигеном була позитивною у 40 % тварин при негативних реакціях в РБП, РА і РЗК з бруцельозними Sантигенами. На 168, 190 добу після щеплення у баранів дослідної та повний термін дослідження у тварин контрольної груп сироватки в титрі 1:25-1:50 в РА з RS-антигеном, так і в PA, P3K (титр 1:5-1:10) і РБП з бруцельозними S-антигенами були негативними. Таким чином доведено, що бруцельозний RS-антиген, виготовлений з штаму В. abortus 7-26, можна застосовувати при дослідженні зразків клінічного матеріалу щодо наявності антитіл до дисоційованих RS-форм бруцел у сироватці крові тварин. Приклад 5. Проведено вивчення чутливості та активності експериментальної серії бруцельозного RS-антигену в РА з польовими сироватками тварин з господарств. Застосовували сироватки тварин з сумнівними, хибнопозитивними та негативними результатами після серологічного дослідження на бруцельоз. Реакцію аглютинації проводили за стандартним способом з різними чотирма розведеннями сироватки (згідно «Настанови по діагностиці бруцельозу», К. 1998 р.). Діагностичним титром сироватки в РА з бруцельозним RSантигеном вважали титр 1:100 для великої рогатої худоби і 1:50 для овець з оцінкою не менше як на 2 хрести. Вякості контролю застосовували контрольні негативні сироватки, робочі стандарти позитивної бруцельозної сироватки та R-бруцелаовісної сироватки. В процесі проведення дослідження на бруцельоз в РБП 3293 тварин (3181 великої рогатої худоби, 112 овець різних вікових груп) з 7 областей України встановлено, що в 17,7 % випадках здійснювали уточнюючі серологічні дослідження. При повторних досліджень із використанням комерційного бруцельозного S-антигену виявили 1,54 % тварин із позитивними реакціями на бруцельоз. При проведенні уточнюючих досліджень із використанням експериментального бруцельозного RSантигену та виробничого Yersinia enterocolitica 09 антигену встановлено, що 0,68 % хибнопозитивних реакцій на бруцельоз зумовлені серопозитивністю до ієрсиній. Реакцій зумовлених RS- та S-формами бруцел не виявлено. Встановлено також, що граничні титри бруцельозної сироватки становили 1:800 і Rбруцелаовісної сироватки - 1:50 на два хрести з RS-антигеном в розведенні 1:10. Реакція RSантигену в РА з контрольними негативними сироватками титрі 1:25 і вище була негативною. При 3 UA 98886 U контролюванні в РА самоаглютинуючих властивостей RS-антигену з фенолізованим фізіологічним розчином в рівному співвідношенні спостерігали негативну реакцію. Таким чином, штам В. abortus 7-26 в RS-формі може бути застосований для створення діагностикуму при проведенні скринінгових досліджень на бруцельоз. 5 Таблиця 1 Штам В. abortus 7-26 для виготовлення бруцельозного RS антигену Сироватки Робочий стандарт ННЦ «ІЕКВМ» бруцельозної сироватки Робочий стандарт ННЦ «ІЕКВМ» Rбруцелаовісної сироватки Контроль 1 Негативна контрольна сироватка ВРХ Негативна контрольна сироватка овець 0,85 % розчин натрію хлориду 5 % розчин натрію хлориду Контроль 2: Робочий стандарт ННЦ «ІЕКВМ» бруцельозної сироватки Робочий стандарт ННЦ «ІЕКВМ» Rбруцелаовісної сироватки Негативна контрольна сироватка ВРХ Негативна контрольна сироватка овець 0,85 % розчин натрію хлориду 5 % розчин натрію хлориду Титр 1:200 1:400 1:600 1:800 Бруцельозний RS-антиген (1:10) 1:25 1:50 1:100 1:1000 1:1200 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ ++++ ++ + Антиген бруцельозний єдиний (1:10) ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ 4 UA 98886 U Таблиця 2 Штам В. abortus 7-26 для виготовлення бруцельозного RS антиген Доза і спосіб введення культури Термін забою (діб) 16 25 7 5,0×10 КУО, кон'юнктивально 49 63 87 102 16 25 8 4,0×10 КУО, кон'юнктивально 49 63 87 102 Примітки: Серологічні дослідження на бруцельоз РА (RS-антиген)* РА (S-антиген)** n/титр*** n/титр 3 1 1 : 20  1 : 40 1 : 10 3 1 1 : 40 1 : 10 3 1 1 : 320 1 : 10 3 1 1 : 160  1 : 320 1 : 10 3 1: 10  1: 20 3 2 1: 40  1 : 80 1 : 10 3 2 1 : 80 1 : 10 3 1 1 : 320 1 : 20 3 1 : 160  1 : 320 3 1: 10  1: 20 Кількість тварин / із них заразилися 3/3 3/3 3/3/3/3/3/3 3/3 3/3/3/3/ * - РА з бруцельозним RS-антигеном (шт. В. abortus 7-26); ** - PA з антигеном бруцельозним єдиним; *** - n - кількість реагуючих (чисельник), титр (знаменник). Таблиця 3 Штам В. abortus 7-26 для виготовлення бруцельозного RS антигену Група Вакцина і спосіб введення Імунна відповідь після вакцинації PA (RS-антиген)* PA (S-антиген)** Доза вакцини (КУО) 1 жива, кон'юнктивально жива, підшкірно 25,0×10 3 контроль 7 титр lg кількість тварин,% 1,55  0,05 100,0 5,0×10 2 титр lg *** кількість тварин,% 0,33 33,3 1,07  0,07 66,7 1,75  0,05 100,0 7 Примітки : * - РА з бруцельозним RS- з антигеном (шт. В. abortus 7-26); ** - РА з антигеном бруцельозним єдиним; 5 UA 98886 U *** - середньогеометрічний титр М ± m lg. Таблиця 4 Група, вакцина Термін (діб) 10 45 1, жива 100 135 2, контроль 168 190 10 45 100 135 168 190 Бруцельозна серопозитивність після вакцинації RS-антиген S-антиген РА HF РЗК РБП n, % * титр lg n, % титр lg n, % титр lg 100,0 1,83  0,16 80,0 1,08  0,07 100,0 1,72  0,11 40,0 0,56 40,0 0,56 40,0 0,34 40,0 0,28 40,0 60,0 0,62  0,07 40,0 0,56 n, % 100,0 100,0 Примітка: *- n - кількість реагуючих, % (чисельник), середньогеометричний титр М ± m lg (знаменник). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Штам Brucella abortus 7-26 виділений і селекційований для виготовлення бруцельозного RSантигену. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6