Лікувальні злиття та кон’югати інсулінотропних пептидів з доменним антитілом, що зв’язує сироватковий альбумін

Реферат: Заявлений винахід стосується лікувальних композицій злиття або кон'югата, що містить або складається з (а) ексендину або PYY та (b) dAb, що зв'язує сироватковий альбумін. UA 98911 C2 (12) UA 98911 C2 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлений винахід стосується лікувальних злить та кон'югатів, що підвищують період напіввиведення у сироватці. Ці злиття та кон'югати містять імуноглобулінові (антитіло) одиничні змінні домени та GLP та/або молекули експендину. Винахід, крім того, стосується застосувань, препаратів, композицій та пристроїв, що містять такі лікувальні злиття та кон'югати. Багато ліків, що мають корисні для терапевтичних та/або діагностичних цілей властивості мають обмежену цінність, тому що вони швидко виводяться з тіла після введення. Наприклад, багато поліпептидів, що мають терапевтично корисні функції швидко виводяться з кровотоку через нирки. Відповідно, для того, щоби досягнути бажаної терапевтичної дії, повинна бути введена велика доза. Існує потреба в поліпшених терапевтичних та діагностичних засобах, що мають покращені фармакокінетичні властивості. Одним з таких видів ліків, що мають короткий період напіввиведення у тілі, або системну циркуляцію є інкретинові гормони, як - то подібний до глюкагону пептид 1, або пептид YY та також ексендин, наприклад ексендин - 4. Подібний до глюкагону пептид (GLP) - 1 є інкретиновим гормоном з сильними глюкозалежними інсулінотропічними та глюкагоностатичними діями, трофічними діями на панкреатичні β - клітини, та інгібіторними діями на шлунково-кишкову секрецію та моторику, які поєднують пониження плазми глюкози та скорочення коливань рівню глюкози. Крім того, через його здатність посилювати насичення, GLP-1 зменшує прийом їжі, тим самим обмежуючи збільшення ваги, та може навіть викликати втрату ваги. У сукупності, ці дії надають GLP-1 унікальні властивості, що вважається досить бажаним для анти - діабетичного агента, який, особливо у зв'язку з глюкозною залежністю його анти - гіперглюкемічних дій, повинен мінімізувати будь-який ризик розвитку важкої гіпоглікемії. Однак, його фармакокінетичний/фармакодинамічний профіль є таким, що нативний GLP-1 не є терапевтично корисним. Таким чином, у той час як GLP-1 є найбільш ефективним при постійному введенні, одиничні підшкірні ін'єкції мають короткочасні ефекти. GLP-1 є високочутливим до ферментативного розкладання в природних умовах, та його розщеплення дипептіділпептідазою IV (DPP-IV) є, можливо, найбільш доречним, оскільки це відбувається швидко та генерує неінсуліновий тропний метаболіт. Стратегії для освоєння GLP мають терапевтичний потенціал та базуються на розумінні факторів, що впливають на його метаболічну стабільність та фармакокінетичний/фармакодинамічний профіль, та тому знаходяться в центрі уваги інтенсивних досліджень. Велика робота була проведена зі спробою інгібування пептидази або модифікації GLP-1, таким чином, щоб його деградація сповільнювалася при одночасному збереженні біологічної активності. WO05/027978 стосується похідних GLP-1, що мають тривалий профіль дії. WO 02/46227 стосується гетерологічних білків злиття, що містять поліпептид (наприклад, альбумін), злитий з GLP-1 або аналогами (оприлюднення цих аналогів включено тут у якості посилення, як приклади аналога GLP-1, що може бути використаний у заявленому винаході). WO05/003296, WO03/060071, WO03/059934 стосуються аміно злитого білка, де GLP-1 є злитий з альбуміном у спробі підвищення періоду напіввиведення гормону. Однак, незважаючи на ці спроби, довготривалого активного GLP-1 вироблено не було. Таким чином, зокрема в області цукрового діабету і ожиріння, існує величезна необхідність в удосконаленні GLP-1 пептидів або інших агентів, таких як ексендин - 4 або PYY, що також мають інсулінотропічну дію, яка відповідна за лікування, зокрема, діабету та ожиріння. Таким чином, є необхідність модифікації GLP-1, ексендину - 4 та інших інсулінотропічних пептидів для забезпечення тривалішого терміну дії in vivo при збереженні їх низької токсичності та терапевтичних переваг. Заявлений винахід стосується композиції, яка є злиттям або кон'югатом, та яка містить або складається з (a) інсулінотропічного агента або молекули, або інкретинових ліків або молекул, які можуть, наприклад, бути ексендином - 4, PYY, наприклад, 3-26 PYY або GLP-1, наприклад, мутантом GLP-1 (7-37) A8G, що присутній у вигляді злиття або кон'югату з (b) dAb, який специфічно зв'язується з альбуміном сироватки (AlbudAb TM), вибраним від: (i) DOM 7h-14 доменного антитіла (dAb) (амінокислотна послідовність DOM 7h-14, що наведена у Фіг.1(h): SEQ ID NO 8), (ii) DOM 7h-14-10 доменного антитіла (dAb) (амінокислотна послідовність DOM 7h-1410, яка наведена у Фіг.1(o): SEQ ID NO 26) або dAb, що має до 4 амінокислотних відмінностей від послідовності DOM 7h-14-10 dAb; та (iii) DOM 7h-11-15 dAb (амінокислотна послідовність DOM 7h-11-15, яка наведена у Фіг.1(p): SEQ ID NO 27) або (iv) DOM 7h-14-10 R108C доменного антитіла (dAb) (амінокислотна послідовність DOM 7h-14-10, яка наведена у Фіг.1(r). Амінокислота або хімічний лінкер також може опціонально бути присутнім для з'єднання інсулінотропічного агента або інкретинових ліків, наприклад, ексендину - 4 та/або GLP-1, або PYY з dAb, наприклад, з DOM7h-14 dAb, DOM 7h-14-10 dAb, DOM 7h-11-15 dAb. Лінкер може 1 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бути, наприклад, спіральним лінкером, наприклад, спіральним лінкером послідовності, що наведена у Фіг. 1 (k): SEQ ID NO 11, або він може бути gly-ser лінкером, наприклад, з амінокислотною послідовністю, що наведена у Фіг. 1 (1): SEQ ID NO 12. У деяких втіленнях, злиття (або кон'югати) винаходу можуть містити, крім того, молекули, наприклад, крім того, пептиди або поліпептиди. Інсулінотропічний агент або інкретинові ліки (наприклад, ексендин та/або GLP-1) можуть бути присутніми у злитті (або кон'югаті) або з N - термінальними або C - термінальними dAb. У деяких втіленнях, винахід стосується поліпептиду, що містить, або складається з молекул злиття, що вибрані від наступного: (a) Злиття 2xGLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb (DAT 0114, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (a): SEQ ID NO 1) (b) Злиття ексендину 4 (G4S лінкер) 3 DOM7h-14 dAb (DAT 0115, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг.1(b): SEQ ID NO 2), (c) Злиття ексендину 4-DOM7h-14 dAb (DAT 0116, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (c): SEQ ID NO 3). (d) Злиття ексендину 4, спірального лінкера, DOM7h-14 dAb (DAT 0117, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг.1(d): SEQ ID NO 4). (e) Злиття GLP-1 (7-37) A8G (G4S лінкер) 3 DOM7h-14 dAb (DAT 0118, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (e): SEQ ID NO 5), (f) Злиття GLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb (DAT 0119, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (f): SEQ ID NO 6), (g) Злиття GLP-1 (7-37) A8G, спірального лінкера, DOM7h-14 dAb (DAT 0120, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (g): SEQ ID NO 7), (h) Злиття ексендину 4, (G4S)3, лінкер DOM7h-14-10 (DMS7139, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (m): SEQ ID NO 24), (i) Злиття ексендину 4, (G4S)3, лінкер DOM7h-11-15 (DMS7143, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (n): SEQ ID NO 25). Винахід також стосується кон'югатів молекул, що містять, або складаються з амінокислотних послідовностей, як ті, що описані вище, тобто таких амінокислотних послідовностей, що наведені у SEQ ID NOs-1-7 та SEQ ID NOs 24-25. У деяк втіленнях, винахід стосується поліпептиду, що містить, або складається з кон'югатних молекул, якими є: DOM 7h-14-10 (R108C) AlbudAb, кон'югована до C - термінально амідованого PYY3-36 через лізин (введений на позиції 10 у PYY) та 4 PEG лінкера, що повторюються. Амінокислотна послідовність та структура цього пептидного кон'югату наведені у Фіг. 14. Винахід також стосується поліпептиду, що містить або складається зі злиття амінокислотної послідовності ексендину 4, (G4S)3, лінкера DOM7h-14-10 (DMS7139, амінокислотної послідовності, що наведена у Фіг. 1 (m): SEQ ID NO 24), або злиття, або кон'югату молекули, що має до 4 амінокислотних замін від амінокислотної послідовності DMS7139, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (m). DOM 7h-14 є одиничним змінним доменом імуноглобуліну людини або dAb (Vk), що приєднується до альбуміну сироватки та його амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг.1(h): SEQ ID NO 8. CDR ділянки DOM 7h-14 dAb є підкресленим у амінокислотній послідовності, що наведена у Фіг.1(h): SEQ ID NO 8. DOM 7h-14-10 є одиничним змінним доменом імуноглобуліну людини або dAb, що приєднується до альбуміну сироватки та його амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг.1(o): SEQ ID NO 26. CDR ділянки DOM 7h-14-10 dAb є підкресленим у амінокислотній послідовності, що наведена у Фіг.1(o): SEQ ID NO 26. DOM 7h-11-15 є одиничним змінним доменом імуноглобуліну людини або dAb, що приєднується до альбуміну сироватки та його амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг.1(p): SEQ ID NO 27. CDR ділянки DOM 7h-11-15 dAb є підкресленим у амінокислотній послідовності, що наведена у Фіг.1(p): SEQ ID NO 27. Як тут застосовано, "злиття" має відношення до гібридного білка, що містить, по-перше, групу DOM7h-14 dAb, або DOM7h-14-10 dAb, або DOM 7h-11-15 dAb, що пов'язує сироватковий альбумін та, по-друге, інсулінотропічний агент, або інкретинові ліки. dAb, який пов'язує сироватковий альбумін та ліки, або агент, є присутнім у дискретних частинах (групах) одиничного безперервного поліпептидного ланцюга. Перша (dAb) та друга (інкретинові ліки, або інсулінотропічний агент) групи можуть бути безпосередньо зв'язані між собою пептидним зв'язком, або зв'язані відповідною амінокислотою, або пептидом, або поліпептидним лінкером. Додаткові групи, наприклад, пептиди, або поліпептиди (наприклад, третій, четвертий) та/або 2 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лінкерні послідовності можуть бути присутніми в міру необхідності. Перша група може бути у N термінальному положенні, C - термінальному положенні, або бути внутрішньою по відношенню до другої групи. У деяких втіленнях, гібридний білок містить одну, або більш ніж одну, (наприклад, від одної до біля 20) dAb групу. Як тут застосовано, "кон'югат" має відношення до композиції, що містить dAb, який пов'язує сироватковий альбумін, до якого інсулінотропічний агент, або інкретинові ліки, наприклад, GLP1, ексендин - 4, PYY, наприклад, PYY 3-36, є ковалентно, або нековалентно приєднаними. Інсулінотропічний агент або інкретинові ліки можуть бути ковалентно приєднані безпосередньо до dAb, або небезпосередньо крізь відповідну лінкерну групу, наприклад, PEG лінкерну групу. Ліки, або агент можуть бути приєднані до dAb у будь - якому відповідному положенні, такому, як аміно - термінальне, карбоксил - термінальне, або крізь відповідні амінокислотні бічні ланцюги (наприклад, аміногрупу лізину або тіолову групу цистеїну). Альтернативно, ліки, або агент можуть бути нековалентно приєднані безпосередньо до dAb (наприклад, електростатичною взаємодією, гідрофобною взаємодією), або небезпосередньо (наприклад, крізь нековалентне зв'язування партнерів комплементарного зв'язування (наприклад, біотину та авідину), де один партнер є ковалентно приєднаним до ліків, або агента та партнер комплементарного зв'язування є ковалентно приєднаним до dAb). Винахід, крім того, стосується (у значній мірі) чистого мономеру будь - якого з кон'югатів, або злиття винаходу, наприклад, DAT 0114, DAT 0115, DAT 0116, DAT 0117, DAT 0118, DAT 0119 та DAT120, DMS 7139, або DMS 7143, або DMS 7143. У одному втіленні, він є щонайменш 98, 99, 99.5 % чистим, або 100 % чистим мономером. Винахід також стосується нуклеїнових кислот, що кодують злиття, яке описано тут, наприклад, нуклеїнових кислот, що кодують DAT 0114, DAT 0115, DAT 0116, DAT 0117, DAT 0118, DAT 0119 та DAT120, DMS 7139, або DMS 7143 та, наприклад, де послідовності нуклеїнової кислоти є наведеними у Фіг. 2 (SEQ ID NOS 13-32). Крім того, передбачені клітини хазяї, які містять ці нуклеїнові кислоти. Винахід також стосується амінокислот, що кодують dAb, які зв'язуються з сироватковим альбуміном (AlbudAb TM), вибраним від: DOM7h-14 (SEQ ID NO 8), DOM7h-14-10 (SEQ ID NO 26), DOM7h-11-15 (SEQ ID NO 27) та DOM 7h-14-10R108C (SEQ ID NO 42). Винахід також стосується нуклеїнових кислот, що кодують dAb, які зв'язуються з сироватковим альбуміном, вибраним від: DOM7h-14(SEQ ID NO 23), DOM7h-14-10 (SEQ ID NO 31), DOM7h-11-15 (SEQ ID NO 32) та DOM 7h-14-10R108C (SEQ ID NO 44). Винахід, крім того, стосується способу отримання злиття заявленого винаходу, що містить зберігання клітин - хазяїв, які містять рекомбінантну нуклеїнову кислоту та/або конструкцію, що кодує злиття винаходу в умовах, відповідних для експресії вказаної рекомбінантної нуклеїнової кислоти, у якій виробляється злиття. Винахід також стосується композицій (наприклад, фармацевтичних композицій), що містять злиття, або кон'югат винаходу. Винахід також стосується способу лікування суб'єктів, що мають захворювання, або розлади, як ті, що описані тут, наприклад, метаболічні захворювання, як - то гіперглікемія, порушення толерантності до глюкози, дефіцит бета - клітин, діабет (наприклад, діабет типу 1 або типу 2, або гестаційний діабет), або ожиріння, або захворювання, що характеризуються переїданням, наприклад, він може бути застосований для пригнічення апетиту, наприклад, при синдромі Prader-Willi, та яке містить введення до вказаного суб'єкту терапевтично ефективної кількості злиття, або кон'югатів винаходу. Інші метаболічні розлади охоплюють, але без обмеження, резистентність до інсуліну, дефіцит інсуліну, гіперінсулінемію, гіперглікемію, дисліпідемію, гіперліпідемію, гіперкетонемію, гіпертензію, захворювання коронарної артерії, атеросклероз, ниркову недостатність, невропатію (наприклад, автономну невропатію, парасимпатичну невропатію, та поліневропатію), ретинопатію, катаракту, метаболічні розлади (наприклад, метаболічні розлади інсуліну та/або глюкози), ендокринні розлади, ожиріння, втрату ваги, розлади печінки (наприклад, захворювання печінки, цироз печінки, та розлади, що пов'язані з трансплантацією печінки), та стани, пов'язані з цими захворюваннями або розладами. На додаток, стани, пов'язані з діабетом, що можуть бути попереджені, або лікуються компонентами заявленого винаходу охоплюють, але без обмеження, гіперглікемію, ожиріння, діабетичну ретинопатію, мононевропатію, поліневропатію, атеросклероз, виразки, серцеві захворювання, інсульт, анемію, гангрену (наприклад, ніг та рук), імпотенцію, інфекції, катаракту, погану функцію нирок, неправильну роботу вегетативної нервової системи, порушення функції клітин білої крові, тунельний синдром зап'ястя, контрактуру Дюпюїтрена, та діабетичний кетоацидоз. 3 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід також стосується способів лікування, або запобігання захворювань, пов'язаних з підвищенням глюкози у крові, що містять введення пацієнту або суб'єкту щонайменш однієї дози кон'югатів, або злиття та/або фармацевтичних композицій заявленого винаходу. Винахід, крім того, стосується способу регуляції інсулінової чутливості у пацієнта, а також способу підвищення поглинання глюкози клітиною, та способу регуляції інсулінової чутливості клітини, з застосуванням кон'югатів, або злиття винаходу. Також запропоновано спосіб стимуляції синтезу та вивільнення інсуліну та підвищення чутливості жирової, м'язової або печінкової тканини по відношенню до поглинання інсуліну, стимулювання поглинання глюкози, сповільнення процесу травлення, або блокування секреції глюкагону у пацієнта, що містять введення до вказаного пацієнта злиття, або кон'югатів винаходу, наприклад, що містять введення щонайменш однієї дози ліків кон'югату, або злиття та/або фармацевтичних композицій заявленого винаходу. Злиття, або кон'югати та/або фармацевтичні композиції винаходу можуть бути введені окремо, або у комбінації з іншими молекулами, або групами, наприклад, з поліпептидами, терапевтичними білками та/або молекулами (наприклад, інсуліном та/або іншими білками (у тому числі антитілами), пептидами, або малими молекулами, які регулюють інсулінову чутливість, вагу, серцеві захворювання, гіпертензію, невропатію, клітинний метаболізм, та/або рівні глюкози, інсуліну, або іншого гормону у пацієнта). У особливих втіленнях, кон'югати або злиття винаходу вводять в комбінації з інсуліном (або інсуліновою похідною, аналогом, білком злиття, або засобом, що підсилює секрецію). Винахід також стосується застосування кон'югату, або злиття винаходу для виробництва ліків для лікування захворювань або розладів, як - то будь - які з вищезгаданих, наприклад, метаболічні розлади, як - то гіперглікемія, діабет (типу 1, або 2, або гестаційний діабет), або ожиріння. Винахід також стосується застосування злиття, або кон'югатів, як тут описано, для застосування у терапії, діагностиці, або профілактиці. Злиття, або кон'югати винаходу, наприклад, dAb - компонент злиття, можуть бути додатково відформатовані для того, щоби мати великий гідродинамічний розмір для подальшого подовження періоду напіввиведення, наприклад, прикріпленням PEG груп, сироваткового альбуміну, трансферину, трансферинового рецептору, або щонайменш його трансферин зв'язувальної частини, ділянки Fc антитіла, або шляхом кон'югації з антитілом домену. Наприклад, dAb, що пов'язує сироватковий альбумін може бути відформатований як великий антиген - зв'язуючий фрагмент антитіла (наприклад, відформатований як Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). У інших втіленнях винаходу, описаних тут, замість застосування dAb у злитті винаходу, також передбачається, що досвідчений фахівець може застосувати домен, який містить CDR dAb, наприклад, CDR DOM 7h-14, DOM 7h-14-10, або DOM 7h-11-15, що зв'язують сироватковий альбумін (наприклад, CDR, щеплені у відповідну білкову опорну структуру, або скелет, наприклад, Аffibody, структуру SpA, домен LDL рецептора класу А, або EGF домен). Інформацію, що повідомляється, в цілому не повинно тлумачити відповідно для запровадження таких доменів замість DAB. У деяких втіленнях, винахід стосується злиття, або кон'югату відповідно до винаходу, що містить інсулінотропічний агент, або інкретинові ліки та подвійно - специфічний ліганд, або мульти - специфічний ліганд, який містить перший dAb, відповідно до винаходу, що пов'язує сироватковий альбумін, наприклад, DOM 7h-14, DOM 7h-14-10, або DOM 7h-11-15 та другий dAb, що має таку саме, або іншу специфічність зв'язування та необов'язково, у разі мульти специфічних лігандів, додаткові dAb. Другий dAb (або додаткові dAb) необов'язково може зв'язувати іншу ціль, наприклад, FgFr Ic, або ціль CD5. Таким чином, у одному аспекті, винахід стосується злиття, або кон'югатів винаходу для доставки шляхом парентерального введення, наприклад, підшкірною, внутрішньом'язевою, або внутрішньовенною ін'єкцією, інгаляцією, доставкою через ніс, рот, трансмукозною, доставкою у шлунково - кишковий тракт пацієнта, ректальною або очною доставкою. У одному аспекті, винахід полягає у застосуванні злиття, або кон'югатів винаходу у виробництві ліків для доставки шляхом підшкірної ін'єкції, інгаляції, внутрішньовенної доставки, доставки через ніс, трансмукозної, оральної доставки, доставки у шлунково - кишковий тракт пацієнта, ректальної або очної доставки. У одному аспекті, винахід стосується способу доставки пацієнту шляхом підшкірної ін'єкції, легеневої доставки, внутрішньовенної, назальної, оральної, трансмукозної доставки, доставки у шлунково - кишковий тракт пацієнта, ректальної або очної доставки, де спосіб містить введення пацієнту фармацевтично ефективної кількості злиття, або кон'югату винаходу. 4 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У одному аспекті, винахід стосується перорального, придатного для застосування шляхом ін'єкцій, інгаляцій, придатного для застосування у небулайзері, або очного препарату, що містить злиття, або кон'югати винаходу. Препарат може бути таблеткою, пігулкою, капсулою, рідиною або сиропом. У одному аспекті, композиція може бути введена перорально, наприклад, у вигляді напою, який може продаватися як напій для втрати ваги та лікування ожиріння. У одному аспекті, винахід стосується препарату для ректальної доставки пацієнту, та препарат може бути запропоновано, наприклад, як супозиторій. Композиція для парентерального введення компонентів GLP-1 може, наприклад, бути приготована, як описано у WO 03/002136 (включено тут в якості посилання). Композиція для назального введення деяких пептидів може, наприклад, бути приготована, як описано у European Patent No. 272097 (to Novo Nordisk A/S), або у WO 93/18785 (все включено тут в якості посилання). Визначений тут термін "суб'єкт" охоплює тварин, як - то ссавців, в тому числі, але без обмеження, приматів (наприклад, людей), корів, овець, кіз, коней, собак, кішок, кролів, морських свинок, щурів, мишей, або іншу рогату худобу, овець, коней, видів собак, котів, гризунів або мишей. Винахід також надає набор для застосування у композиціях відповідно до винаходу, що вводять (наприклад, кон'югати, або злиття винаходу) суб'єкту (наприклад, пацієнту), які містять композиції (наприклад, кон'югати, або злиття винаходу), пристрій доставки ліків, та, необов'язково, інструкції по застосуванню. Композицію (наприклад, кон'югат, або злиття) може бути запропоновано у вигляді препарату, як - то ліофілізований препарат. У деяких втіленнях, пристрій доставки ліків є вибраним від групи, що охоплює шприц, інгалятор, пристрій для інтраназального або очного введення (наприклад, туманоутворювач, піпетка для носа або ока), та пристрій для безголкових ін'єкцій. Композиції (наприклад, кон'югати, або злиття) заявленого винаходу можуть бути ліофілізованими для зберігання та відновлені у відповідному носії перед застосуванням. Можуть бути застосовані будь - які відповідні способи ліофілізації (наприклад, сушка розпиленням, сушка осаду) та/або відновлення. Фахівцям зрозуміло, що ліофілізація та відновлення може приводити до втрати різною мірою активності антитіл та застосування рівнів, можливо, доведеться скоригувати для компенсації. У окремому втіленні, винахід стосується композиції, що містить ліофілізовану(сублімовану) композицію (наприклад, ліки - кон'югат, ліки злиття), як тут описано. Бажано, щоб ліофілізована (сублімована) композиція (наприклад, ліки кон'югат, ліки - злиття) втратила не більш ніж 20 %, або не більш ніж 25 %, або не більш ніж 30 %, або не більш ніж 35 %, або не більш ніж 40 %, або не більш ніж 45 %, або не більш ніж 50 % від своєї активності (наприклад, активності зв'язування сироваткового альбуміну) при регідратації. Активністю є кількість композиції (наприклад, ліки - кон'югат, ліки - злиття), що необхідна для створення дії композиції перед тим, як вона була ліофілізована. Наприклад, кількість кон'югату, або злиття, необхідне для досягнення та підтримання бажаної концентрації сироватки у бажаний період часу. Активність композиції (наприклад, ліки - кон'югат, ліки злиття) може бути визначена з застосуванням будь - якого відповідного способу перед ліофілізацією, та активність може бути визначена з застосуванням такого ж самого способу після регідратації для визначення кількості втраченої активності. Винахід також стосується препаратів зі сповільненим вивільненням, що містять злиття або кон'югати винаходу, такі препарати зі сповільненим вивільненням можуть містити злиття, або кон'югати винаходу у комбінації з, наприклад, гіалуроновою кислотою, мікросферами, або ліпосомами та іншими фармацевтично, або фармакологічно прийнятними носіями, допоміжними речовинами та/або розріджувачами. Такі препарати зі сповільненим вивільненням можуть існувати у вигляді, наприклад, супозиторіїв. У одному аспекті, винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить злиття, або кон'югат винаходу та фармацевтично, або фізіологічно прийнятний носій, наповнювач, або розріджувач. Винахід також стосується модифікованої лідерної послідовності, що має на своєму C термінальному кінці амінокислотну послідовність AMA, або AWA, де лідерна послідовність не є послідовністю дикого типу. Модифікована лідерна послідовність може бути OmpA-AMA, або AWA; або OmpT-AMA або -AWA; або GAS-AMA, або - AWA. Модифікована лідерна послідовність може бути застосована для експресії гетерологічного поліпептиду у клітині хазяї. Гетерологічний поліпептид може містити, або складатися з інсулінотропічного агента або інкретинових ліків. Гетерологічний поліпептид може містити, або складатися з доменного антитіла (dAb),наприклад, dAb, що зв'язує сироватковий альбумін. 5 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Гетерологічний поліпептид для експресії модифікованою лідерною послідовністю може бути злиттям, або кон'югатом, що містить, або складається з (a) інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків, що присутні у вигляді злиття або кон'югату з, (b) dAb, наприклад, dAb, що зв'язує сироватковий альбумін, наприклад, dAb, вибраний від: DOM 7h-14 Vk доменного антитіла (dAb), яке зв'язує сироватковий альбумін та має амінокислотну послідовність, що наведена у Фіг. 1 (h). (SEQ ID NO 8), DOM 7h-14-10 dAb, що має амінокислотну послідовність, яка наведена у Фіг.1(o) (SEQ ID NO 26), та DOM 7h-11-15 dAb, що має амінокислотну послідовність, яка наведена у Фіг.1(p) (SEQ ID NO 27). Модифікована лідерна послідовність також може бути застосованою для експресії гетерологічного поліпептиду, що містить, або складається зі злиття, вибраного від: (a) 2xGLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb злиття (DAT 0114, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (a): SEQ ID NO 1), (b) ексендин - 4 (G4S лінкер) з DOM7h-14 dAb злиття (DAT 0115, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг.1(b): SEQ ID NO 2), (c) ексендин – 4-DOM7h-14 dAb злиття (DAT 0116, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1 (c): SEQ ID NO 3), (d) ексендин - 4, спіральний лінкер, DOM7h-14 dAb злиття (DAT 0117, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг.1(d): SEQ ID NO 4), (e) GLP-1 (7-37) A8G (G4S лінкер) 3 DOM7h-14 dAb злиття (DAT 0118, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1(e): SEQ ID NO 5), (f) GLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb злиття (DAT 0119, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг.1(f): SEQ ID NO 6), (g) GLP-1 (7-37) A8G, спірального лінкера, DOM7h-14 dAb злиття (DAT 0120, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1(g): SEQ ID NO 7), (h) ексендин - 4, (G4S)3, лінкера DOM7h-14-10 злиття (DMS7139, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1(m): SEQ ID NO 24), (i) ексендин - 4, (G4S)3, лінкера DOM7h-11-15 злиття (DMS7143, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1(n): SEQ ID NO 25). Гетерологічний поліпептид для експресії модифікованим лідером може також містити, або складатися з молекул кон'югату з вищевказаними амінокислотними послідовностями, тобто тими амінокислотними послідовностями, що наведені у SEQ ID NOs-1-7 та SEQ ID NOs 24-25. Гетерологічний поліпептид для експресії модифікованим лідером може також містити, або складатися з амінокислотної послідовності ексендину 4, (G4S)3, лінкера DOM7h-14-10 злиття (DMS7139, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1(m): SEQ ID NO 24),або злиття, або молекулі кон'югату, що має до 4 амінокислотних замін від амінокислотної послідовності DMS7139, амінокислотної послідовності, наведеної у Фіг. 1(m). Клітина хазяїна для експресії може бути мікробною клітиною хазяїна, прокаріотичною клітиною хазяїна, грамм - негативною бактеріальною клітиною хазяїна, або клітиною хазяїна E. coli. Також запропоновано процес виробництва суміші (i) інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків; та (ii) інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків без двох амінокислот у N - термінальному кінці інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків; процес, що містить етап експресії (i) у клітинах хазяїна з застосуванням лідерної послідовності, що виникла внаслідок розщеплення перед першою та перед третьою позицією інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків. Інсулінотропічний агент, або інкретинові ліки можуть бути у формі злиття, або кон'югату, наприклад, з dAb, який зв'язує сироватковий альбумін, як визначено вище. Винахід також стосується отриманих сумішей, або тих, що можна отримати, з застосуванням способу, описаного вище. Лідерна послідовність може бути ompA, ompT, GAS, або будь - якою з модифікованих послідовностей, описаних вище. Процес може містити етап отримання суміші у клітинах хазяїна гетерологічною експресією. Клітина хазяїна може бути мікробною клітиною хазяїна, прокаріотичною клітиною хазяїна, грам - негативною бактеріальною клітиною хазяїна, або клітиною хазяїна E. coli. Інсулінотропічні агенти та інкретинові ліки, як - то GLP-1 мають широкий спектр терапевтичних дій, які можуть бути опосередковані крізь GLP-1R (як - то стимулювання глюкозо - залежної інсулінової секреції з підшлункової залози). Також було припущено, що існує клас дій, що можуть також бути опосередковані продуктом розщеплення DPPIV, GLP-1 9-36 аміду (або GLP-1 9-37). GLP-1 9-37 не є активним у стимулюванні глюкозо - залежної інсулінової секреції з підшлункової залози, але було припущено, що він має іншу біологічну дію, можливо крізь 6 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рухомий механізм неGLP-lR. Оскільки більшість клінічних застосувань для класу молекул GLP-1 орієнтовано на діабет, через панкреатичний GLP-1R, стабільність DPPIV була розроблена у пептидах або за допомогою використання не - людського аналогу GLP-1, як - то ексендину - 4, або мутованих амінокислот 8, або 9 у GLP-1, як - то застосовано у альбіглютиді (Syncria), або шляхом хімічних, або синтетичних модифікацій на амінокінці пептиду. Додатковим підходом може бути глобальна блокада активності DPPIV з застосуванням малих молекул інгібіторів DPPIV, як - то вілдагліптину (Galvus) та сітагліптіну (Januvia), які подовжують період напіввиведення будь - якого ендогенного секретованого GLP-1. Ці обидва підходи ефективно скорочують рівень метаболіту DPPIV GLP-1 9-36 аміду, або GLP-1 9-37. Проте, було припущено, що метаболіти DPPIV GLP - 1 9 - 36 амід, або GLP - 1 9 - 37 мають бажану біологічну дію. Декілька досліджень показали, що продукт розщеплення DPPIV GLP - 1 7 - 36 аміду, який має назву GLP - 1 9 - 36 амід, швидко утворюється після секреції GLP - 1 7 - 36, та є більш розповсюдженим у нормальному стані, ніж GLP - 1 7 - 37, може мати біологічну дію. Було припущено декілька різних шляхів дії цього механізму, як вказано нижче: Подібний до глюкагону пептид - 1 - (9 - 36) амід є головним метаболітом подібного до глюкагону пептиду - 1 (7 - 36) аміду після його введення піддослідним собакам in vivo та діє як антагоніст на рецептор підшлункової залози (Knudsen LB, Pridal L. J Biol Chem. 1997 Aug 22; 272(34): 21201 - 6) та високоефективні антагоністи рецептора подібного до глюкагону пептиду 1 підшлункової залози (Montrose - Rafizadeh C, Yang H, Rodgers BD, Beday A, Pritchette LA, Eng J. J Biol Chem. 1997 Aug 22;272(34):21201 - 6). GLP - 1(9 - 37) передає сигнал за допомогою іншого механізму до GLP - 1(7 - 37) за допомогою незалежного від інсуліну механізму: (Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002 Apr;282(4):E873 - 9.) GLP - 1 - (9 - 36) амід зменшує рівень глюкози у крові у свиней, підданих дії знеболюючих препаратів за допомогою механізму, що не викликає секрецію інсуліну (Deacon CF, Plamboeck A, Møller S, Hoist JJ.) або його дія підвищує чутливість до інсуліну у осіб, що страждають ожирінням: (Obesity (Silver Spring). 2008 Jul;16(7):1501 - 9. Epub 2008 Apr 17. GLP - 1 (9 - 36) амід, продукт розщеплення GLP - 1 (7 - 36) аміду, є глюкорегуляторним пептидом (Elahi D, Egan JM, Shannon RP, Meneilly GS, Khatri A, Habener JF, Andersen DK). Ця активність не була показана для мінус двох амінокислотних видів ексендину, оскільки це не утворюється у результаті розщеплення DPPIV, але це є можливим також для мінус двох амінокислотних видів ексендину - 4. Також було показано, що ексендин - 4 діє крізь GLP-1 R залежні та незалежні шляхи в умовах серцевих та інших дій (Circulation. 2008; 117:2340-2350: Cardioprotective and Vasodilatory Actions of Glucagon-Like Peptide 1 Receptor Are Mediated Through Both Glucagon-Like Peptide 1 Receptor-Dependent and-Independent Pathways Kiwon Ban, MSc; M. Hossein Noyan-Ashraf, PhD; Judith Hoefer, MD; Steffen-Sebastian BoIz, MD, PhD; Daniel J. Drucker, MD; Mansoor Husain, MD). У цьому зв'язку виникає можливість того, що там дійсно можуть бути аналогічна та паралельна функції як для повнорозмірної, так і для мінус двох амінокислотних форм ексендину. Щонайменш два шляхи процесу є придатними для отримання суміші інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків та мінус двох амінокислотних версій. Наприклад, може бути окреме виробництво повнорозмірного GLP-1 7-36 аміду (як - то AlbudAb у бажаному форматі пролонгації періоду напіввиведення), та GLP-1 9-36 аміду (або бажаного білка злиття). Вони можуть бути змішані для отримання продукту з бажаним співвідношенням молекул GLP-1 7-36 та GLP-1 9-36. Два паралельних процеси GMP можуть бути застосовані для отримання суміші ліків. Альтернативний спосіб полягає у виборі сигналу секреції, до якого ензим сигнальної пептидази, що відповідає за видалення сигнальної послідовності, не має одиничного сайту розщеплення, а, скоріше, складається з двох сайтів розщеплення. Ці скорочення у співвідношенні визначаються секрецію застосованого сигналу. Таким чином, залежно від вибраного сигналу секреції, вироблене співвідношення може бути: 100 % розщепленням перед позицією 1, з отриманням GLP-1 7-36 (або іншого інсулінотропічного агента, або повнорозмірної молекули інкретинових ліків); або 100 % розщепленням перед позицією 3, з отриманням GLP-1 9-36 (або іншого інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків мінус дві амінокислотні послідовності); або будь - яким відсотком від 0 до 100 для кожної з повнорозмірної, або версії з мінус двома амінокислотами. Наприклад, співвідношення може бути: 90 % повнорозмірних, 10 % - 2 амінокислоти; 80 % повнорозмірних, 20 % - 2 амінокислоти; 75 % повнорозмірних, 25 % - 2 амінокислоти; 50 % повнорозмірних, 50 % - 2 амінокислоти; 7 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 25 % повнорозмірних, 75 % - 2 амінокислоти; 20 % повнорозмірних, 80 % - 2 амінокислоти; або 10 % повнорозмірних, 90 % - 2 амінокислоти. Вибір відповідної лідерної послідовності для отримання бажаного співвідношення дозволить створити виробництво від однієї одиничної клітини - хазяїна. Це - ключова перевага з точки зору відносно GMP процесу. Це дозволяє застосування потенціальних терапевтичних дій обох видів, зберігаючи при цьому стабільність ендогенних ферментів. Весь спектр інших ендогенних пептидів та аналогів також виробляється аміно термінальними дипептидазами, з отриманням оригінальних повнорозмірних молекул та/або видів, сприйнятливих до дипептидаз. Таким чином, цей підхід може бути корисним для виробництва будь - яких пептидів та білків, де один запуск виробництва може призвести до появлення певної суміші двох видів, що розрізняються по довжині на декілька амінокислот, де амінокислоти, що відрізняються, містять частину сайту впізнавання для сигнальної пептидази. Застосування цього процесу може бути можливим у клітинах - хазяїнах ссавців, еукаріотів, або прокаріотів, наприклад у E. coli. Стислий опис малюнків: Фіг. 1: Зображення амінокислотних послідовностей (a) DAT 0114 (SEQ ID NO 1), (b) DAT 0115 (SEQ ID NO 2), (c) DAT 0116 (SEQ ID NO 3), (d) DAT 0117 (SEQ ID NO 4), (e) DAT 0118 (SEQ ID NO 5), (f) DAT 0119 (SEQ ID NO 6) (g) DAT 0120 (SEQ ID NO 7) (h) DOM 7h-14 (SEQ ID NO 8) (dAb) (CDR є підкресленими), (i) GLP-1 7-37 A(8)G (SEQ ID NO 9), (j) ексендин - 4 (SEQ ID NO 10), (k) спіральний лінкер (SEQ ID NO 11) (1) Gly-ser лінкер (SEQ ID NO 12), (m) DMS 7139 (SEQ ID NO 24, (n) DMS 7143 (SEQ ID NO 25) (o) DOM 7h-14-10 (SEQ ID NO 26) (dAb) (CDR є підкресленим), (p) DOM 7h-11-15 (SEQ ID NO 27) (dAb) (CDR є підкресленим) (q) OmpT AWA сигнальний пептид (лідер) (SEQ ID NO 28) (r) DOM7h-14-10R108C (SEQ ID NO 42) (s) PYY 3-36 (з лізином у 10 позиції) (SEQ ID NO 43). Фіг. 2: Зображення послідовності нуклеїнової кислоти: (a) DAT 0114 (констракт ссавців) (SEQ ID NO 13), (b) DAT 0115 (констракт ссавців) (SEQ ID NO 14), (c) DAT 0115 (констракт, оптимізований для E.coli) (SEQ ID NO 15), (d) DAT 0116 (констракт ссавців) (SEQ ID NO 16), (e) DAT 0116 (констракт, оптимізований для E.coli) (SEQ ID NO 17), (f) DAT 0117 (констракт ссавців) (SEQ ID NO 18), (g) DAT 0117 (констракт, оптимізований для E.coli) (SEQ ID NO 19), (h) DAT 0118 (констракт ссавців) (SEQ ID NO 20), (i) DAT 0119 (констракт ссавців) (SEQ ID NO 21), (j) DAT 0120 (констракт ссавців) (SEQ ID NO 22), (k) Dom7h-14 (SEQ ID NO 23) (1) DMS 7139 (SEQ ID NO 29, (m) DMS 7143 (SEQ ID NO 30) (n) Dom7h-14-10 (SEQ ID NO 31) (dAb), (o) DOM7h-1115 (SEQ ID NO 32) (dAb) (p) Omp AWA сигнальний пептид (SEQ ID NO 33), (q) DOM 7h-14-10 R108C (dAb) (SEQ ID NO 44), (r) кДНК яванського макака (SEQ ID NO 45) (s) олігонуклеотид 1 (SEQ ID NO 47), (t) олігонуклеотид 2 (SEQ ID NO 48) (u) послідовності нуклеїнової кислоти DMS 7139 для експресії у E.coli (SEQ ID NO 50). Фіг. 3: (a) показує залежне від дози скорочення маси тіла в мишачої моделі ожиріння шляхом введення DAT 0115 (b) показує щоденне споживання їжі в мишачої моделі ожиріння шляхом введення DAT 0115. Фіг. 4: показує DSC DAT 0115: Суцільна лінія - слід DAT 0115, пунктирна лінія відповідає не двохстанової моделі. Фіг. 5: показує DSC лізоциму: Суцільна лінія - слід лізоциму, пунктирна лінія відповідає не двохстанової моделі (сліди накладаються таким чином, що пунктирної лінії може не бути видно). Фіг. 6 показує SEC MALLS DAT0115. Фіг. 7: показує SEC MALLS DAT0117. Фіг. 8: показує SEC MALLS DAT0120. Фіг. 9: показує амінокислотну послідовність лідерів: (a) ompA (похідна E. coli) (SEQ ID NO 34), (b) ompA-AMA (штучна послідовність) (SEQ ID NO 35), (c) ompA-AWA (штучна послідовність) (SEQ ID NO 36), (d) ompT (похідна E. coli) (SEQ ID NO 37), (e) ompT-AMA (штучна послідовність) (SEQ ID NO 38), (f) GAS (похідна S. cerevisiae) (SEQ ID NO 39), (g) GAS-AMA (штучна послідовність) (SEQ ID NO 40), (h) GAS-AWA (штучна послідовність) (SEQ ID NO 41) (i) Pel B (Erwinia carotovora) (SEQ ID NO 46) (j) MaI E (штучна послідовність) (SEQ ID NO 49). Фіг. 10: показує очищений DMS7139, аналізований на мас - спектрометрі. Фіг. 11: Зображення статистичного значення зниження вмісту глюкози в крові, включаючи порівняння між DAT 0115 та контролем, DMS7139 та контролем, та між DMS7139 та DAT 0115, (a) показує план дослідження та (b) графічне представлення глюкози AUC. Довірчі інтервали, які не перекривають горизонтальну лінію, є значними. Фіг. 12: показує повторну дозу DMS7139, що вказує на залежне від дози пониження HbAIc у порівнянні з DOM7h-14 контролем. 8 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 13: показує, як DAT 0115 та DMS7139 показують залежне від дози скорочення прийому їжі та маси тіла у порівнянні з DOM7h-14 контролем у мишачої моделі ожиріння DIO, meg = мкг. Фіг. 14: показує пептидний кон'югат, який є: DOM7h-14-10 (R108C) AlbudAb, кон'югований до C - термінально амідованого PYY3-36 через лізин (введений на позиції 10 PYY) та чотирьохповторний PEG лінкер. Лінія показує лінкер, що є ковалентно приєднаним до вільного C - термінального цистеїну DOM7h-14-10 (R108C) AlbudAb та лізин у позиції 10 послідовності PYY. Амінокислотна послідовність та структура цього пептидного кон'югату є вказаною нижче. Фіг. 15: показує, що DMS7605 проявляє залежне від дози скорочення маси тіла у порівнянні з контрольним носієм. Винахід є описаним у цій заяві, з посиланням на втілення, таким чином, що дозволяє, щоб специфікації були записані чітко та коротко. Передбачено та необхідно розуміти, що варіанти можуть по - різному комбінуватися або відокремлюватися, але без відлучення від винаходу. Якщо не визначено інше, всі застосовані тут технічні та наукові терміни, мають таке ж значення, яке зазвичай є зрозумілим фахівцям (наприклад, у культурі клітин, молекулярній генетиці, хімії нуклеїнових кислот, способах гібридизації та біохімії). Були Sambrook et ah, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, що є включеним тут у якості посилання), а також хімічні способи. Термін "інсулінотропічний агент", як тут застосовано, означає компонент, який є здатним стимулювати, або викликати стимуляцію, синтез, або експресію, або активність гормону інсуліну. Відомі приклади інсулінотропічних агентів охоплюють, але без обмеження, наприклад, глюкозу, GIP, GLP, ексендин (наприклад, ексендин - 4 та ексендин - 3), PYY, та OXM. Термін "інкретин", як тут застосовано, означає тип шлунково - кишкового гормону, який викликає підвищення у кількості інсуліну, що вивільнюється, коли рівні глюкози є нормальними, або особливо, коли вони є підвищеними. Як приклад, вони охоплюють GLP-1, GIP, OXM, PYY (наприклад, PYY 3-36), VIP, та PP (панкреатичний поліпептид). Термін "аналог", як тут застосовано, має відношення до поліпептиду, та означає модифікований пептид, де один, або більше амінокислотних залишків пептиду можуть бути заміщеними іншими амінокислотними залишками та/або де один, або більше амінокислотних залишків можуть бути видаленими від пептиду та/або де один, або більше амінокислотних залишків можуть бути видаленими від пептиду та, або де один, або більше амінокислотних залишків можуть бути доданими до пептиду. Таке додавання, або видалення амінокислотних залишків може відбуватися у N - термінальному кінці пептиду та/або на C - термінальному кінці пептиду, або вони можуть бути всередині пептиду. Для опису аналогів GLP-1 була застосована проста система: наприклад GLP-1 A8G (7-37 амінокислот) позначає GLP-1 аналог, де аланін, що природно трапляється у позиції 8 був замінений на залишок гліцину. Формули пептидних аналогів та їх похідних зображені з застосуванням стандартної однолітерної абревіатури для амінокислот, застосованих відповідно до номенклатури IUPAC-IUB. Термін "фрагмент", як тут застосовано, при застосуванні по відношенню до поліпептиду, є поліпептидом, що має амінокислотну послідовність, що є така ж, як частина, але не всі амінокислотні послідовності в цілому є природними поліпептидами. Фрагменти можуть бути "вільно стоячими", або міститись всередині великого поліпептиду, де вони утворюють частину, або ділянку, як - то одиничну послідовну ділянку у одиничному великому поліпептиді. Як приклад, фрагмент природного GLP-1 буде включати в себе 7-36 амінокислот від 1-36 амінокислот, що трапляються в природі. Крім того, фрагменти поліпептидів також можуть бути варіантами природних часткових послідовностей. Наприклад, фрагмент GLP-1 що містить 7-30 амінокислот від природного GLP-1 також може бут варіантом, що має амінокислотні заміни в межах своєї часткової послідовності. Приклади відповідних інсулінотропічних агентів винаходу охоплюють GLP-1, похідні GLP-1, аналоги GLP-1, або похідні аналогів GLP-1. Додатково вони охоплюють ексендин - 4, аналоги ексендину - 4 та похідні або фрагменти ексендину - 4, та ексендин - 3, похідні ексендину - 3 та аналоги ексендину - 3. Термін "GLP-1", як тут застосовано, означає GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36), GLP-1(7-35), GLP-1 (7-38), GLP-1 (7-39), GLP-1 (7-40), GLP-1 (7-41), аналог GLP-1, пептид GLP-1, похідну GLP-1, або мутант, або фрагмент, або похідну аналога GLP-1. Такі пептиди, мутанти, аналоги та похідні є інсулінотропічними агентами. Наприклад, GLP-1 може бути GLP-1 (7-37) A8G мутантом з амінокислотною послідовністю, що наведена у Фіг. 1 (i): SEQ ID NO 9. Крім того, аналоги GLP-1 є також описаними у International Patent Application No. 90/11296 (The General Hospital Corporation), що стосується пептидних фрагментів, які містять GLP-1 (7 9 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 36), їх функціональних похідних, та мають інсулінотропічну активність, що перевищує інсулінотропічну активність GLP-1 (1-36), або GLP-1 (1-37), а також їх застосування у якості інсулінотропічних агентів (включено тут в якості посилання, особливо як приклади ліків для застосування у заявленому винаході). International Patent Application No. WO 91/11457 (Buckley et al.) стосується аналогів активних GLP-1 пептидів 7-34,7-35, 7-36, та 7-37, що можуть також бути корисними у якості GLP-1 ліків відповідно до заявленого винаходу. Застосований тут термін "пептид ексендину - 4", означає ексендин - 4 (1-39), аналог ексендину - 4, фрагмент пептиду ексендину - 4, похідну ексендину - 4, або похідну аналога ексендину - 4. Такі пептиди, фрагменти, аналоги та похідні є інсулінотропічними агентами. Амінокислотна послідовність ексендину - 4 (1-39) наведена у Фіг. 1 (j): SEQ ID NO 10. Крім того, аналоги ексендину, які корисні для заявленого винаходу описані у PCT patent publications WO 99/25728 (Beeley et al.), WO 99/25727 Beeley et al.), WO 98/05351 (Young et al.), WO 99/40788 (Young et al.), WO 99/07404 (Beeley et al.), and WO 99/43708 (Knudsen et al.) (всі включені тут в якості посилання, особливо, як приклади ліків для застосування у заявленому винаході). Застосований тут термін "пептид" має відношення до від двох до 50 амінокислот, з'єднаних разом пептидними зв'язками. Застосований тут термін "поліпептид" має відношення до щонайменш 50 амінокислот, з'єднаних разом пептидними зв'язками. Поліпептиди головним чином мають третинну структуру та складені у функціональні домени. Застосований тут термін "система індикації" має відношення до системи, у якої колекція поліпептидів, або пептидів є придатною для відбору по бажаним характеристикам, як - то фізичні, хімічні, або функціональні характеристики. Система індикації може бути відповідним набором поліпептидів, або пептидів (наприклад, у розчині, імобілізованом на відповідній підложці). Система індикації також може бути системою, що застосовує систему клітинної експресії (наприклад, експресію бібліотеки нуклеїнових кислот у, наприклад, трансформованих, інфікованих, трансфікованих, або трансдукованих клітинах та відображенню закодованих поліпептидів на поверхні клітин), або систему безклітинної експресії (наприклад, емульсіонна компартменталізація та відображення). Типові системи індикації поєднують кодуючу функцію нуклеїнової кислоти та фізичні, хімічні та/або функціональні характеристики поліпептиду, або пептиду, що кодується нуклеїновою кислотою. Коли застосована така система індикації, поліпептиди, або пептиди, що мають бажані фізичні, хімічні та/або функціональні характеристики можуть бути вибрані, та нуклеїнові кислоти, що кодують вибраний поліпептид, або пептид можуть бути легко виділені, або відновлені. Декілька систем індикації, які поєднують кодуючу функцію нуклеїнових кислот та фізичні, хімічні та/або функціональні характеристики поліпептиду, або пептиду, є відомими у цій галузі, наприклад, бактеріофаговий дисплей (фаг дисплей, наприклад, фагмідний дисплей), рибосомний дисплей, емульсіонна компартменталізація та відображення, дріжджовий дисплей, пуроміциновий дисплей, бактеріальний дисплей, плазмідний, ковалентний дисплей тощо. (Див., наприклад, EP 0436597 (Dyax), U.S. Patent No. 6,172,197 (McCafferty et ah), U.S. Patent No. 6,489,103 (Griffiths et al.)). Застосований тут термін "функціональний" описує поліпептид, або пептид, що має біологічну активність, як - то специфічна зв'язувальна активність. Наприклад, термін "функціональний поліпептид" охоплює антитіла, або їх фрагменти антиген - зв'язування, які зв'язує антиген - мішень через його антиген - зв'язуючий сайт. Застосований тут термін "ліганд - мішень" має відношення до ліганду, що специфічно, або вибірково зв'язується поліпептидом, або пептидом. Наприклад, коли поліпептид є антитілом, або його фрагментом антиген - зв'язування, ліганд - мішень може бути будь - яким бажаним антигеном, або епітопом. Зв'язування з антигеном - мішенню залежить від функціональності поліпептиду або пептиду. Як тут застосовано, "антитіло" має відношення до IgG, IgM, IgA, IgD, або IgE, або фрагментів (як - то Fab, F(ab')2, Fv, дисульфідно зв'язаний Fv, scFv, закрита конформація мультиспецифічних антитіл, дисульфі - роз'єднаний scFv, діатіло), що мають походження від будь - яких видів природного отримання антитіл, або створені по технології рекомбінантної ДНК; або виділені з сироватки, B - клітин, гібридом, трансфектом, дріжджів, або бактерій. Застосований тут термін "формат антитіла" має відношення до будь - якої відповідної поліпептидної структури, у якої один, або більше змінних доменів антитіл можуть бути включені так, що це надає антигену зв'язувальну специфічність у цій структурі. Декілька відповідних форматів відомі у цій галузі, як - то химерні антитіла, гуманізовані антитіла, антитіла людини, одноланцюгові антитіла, біспецифічні антитіла, важкі та легкі ланцюги антитіл, гомодимери та 10 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гетеродимери важких та/або легких ланцюгів антитіл, фрагменти антиген - зв'язування будь чого з вищезгаданого (наприклад, Fv фрагмент (наприклад, одиничний ланцюг Fv (scFv), дисульфідно приєднаний Fv), Fab фрагмент, Fab' фрагмент, F(ab')2 фрагмент), одиничний змінний домен антитіла (наприклад, dAb, VГОД., VHГОД., VL), та модифіковані версії будь - чого з вищезгаданого (наприклад, модифікований ковалентним приєднанням поліетиленгліколю, або іншого відповідного полімеру, або гуманізований VHH). Фраза "імуноглобуліновий одиничний змінний домен" має відношення до змінного домену антитіла (VГОД., VHГОД., VL) що специфічно зв'язується з антигеном, або епітопом незалежно від інших V ділянок, або доменів. Імуноглобуліновий одиничний змінний домен може бути присутнім у форматі (наприклад, гомо -, або гетеро - мультимер) з іншими змінними ділянками, або змінними доменами, де інші ділянки, або домени є непотрібними для зв'язування антигену одиничним імуноглобуліновим змінним доменом (тобто, де імуноглобуліновий одиничний змінний домен зв'язується з антигеном незалежно від додаткових змінних доменів). Застосований тут термін "доменне антитіло" або "dAb" – це теж само, що й "імуноглобуліновий одиничний змінний домен". Застосований тут термін "одиничний імуноглобуліновий змінний домен" – це теж само, що й "імуноглобуліновий одиничний змінний домен". Застосований тут термін "одиничний змінний домен антитіла " – це теж само, що й "імуноглобуліновий одиничний змінний домен". Імуноглобуліновий одиничний змінний домен є, у одному втіленні, змінним доменом антитіла людини, але також охоплює одиничні змінні домени антитіл інших видів, як то гризунів (наприклад, як вказано у WO 00/29004, зміст якої включено тут в якості посилання в повному обсязі), акули - няньки та VHH dAb верблюдових. VHH верблюдових є імуноглобуліновим одиничним змінним доменом, поліпептиди якого мають походження від видів, які охоплюють верблюд, ламу, альпаку, дромадера та гуанако, що виробляють важколанцюгові антитіла та природно позбавлені від легких ланцюгів. VHH може бути гуманізованим. "Домен" - це згорнута білкова структура, що має третинну структуру, незалежну від іншого білка. Взагалі, домени відповідають за дискретні функціональні властивості білків, та у багатьох випадках можуть бути доданими, видаленими, або перенесеними до інших білків без втрати функції решти білка та/або домену. "Одиничний змінний домен антитіла" є згорнутим поліпептидним доменом, що містить послідовності, характерні для змінних доменів антитіла. Тому він містить повні змінні домени антитіл та модифіковані змінні домени, наприклад, у яких одна, або більше петель можуть бути замінені послідовностями, які не є характерними для змінних доменів антитіл, або змінні домени антитіл можуть бути усічені, або можуть містити N -, або C - термінальні розширення, а також згорнуті фрагменти змінних доменів, які зберігають найменшу зв'язувальну активність та специфічність повнорозмірного домену. Термін "бібліотека" має відношення до суміші гетерогенних поліпептидів або нуклеїнових кислот. Бібліотека складається з членів, кожен з яких має одиничний поліпептид, або послідовність нуклеїнової кислоти. У цьому сенсі, бібліотека є синонімом поняття "репертуар". Відмінності у послідовностях між членами бібліотеки відповідають за різноманітність присутнього в бібліотеці. Бібліотека може приймати форму простої суміші поліпептидів або нуклеїнових кислот, або може бути у вигляді організмів, або клітин, наприклад бактерій, вірусів, тварин, або рослинних клітин та под., трансформованою з бібліотекою нуклеїнових кислот. У одному втіленні, кожен окремий організм, або клітина містить тільки одне, або обмежене число членів бібліотеки. У одному втіленні, нуклеїнові кислоти є включеними у вектори експресії, з метою забезпечення експресії поліпептидів, які кодуються нуклеїновими кислотами. Таким чином, бібліотека може бути у вигляді популяції хазяйських організмів, де кожен організм містить одну, або більше копій вектора експресії, що містить одиничний член бібліотеки у формі нуклеїнової кислоти, який може бути експресований для отримання свого відповідного поліпептидного члена. Таким чином, популяція організмів - хазяїв має потенціал для кодування великого репертуару різноманітних поліпептидів. Застосований тут термін "доза" має відношення до кількості злиття, або кон'югату, введеного суб'єкту одноразово та одночасно (одиниця дози), або у двох, або декількох введеннях протягом визначеного інтервалу часу. Наприклад, доза може мати відношення до кількості злиття, або кон'югату, введеного суб'єкту протягом одного дня (24 години) (денна доза), двох днів, одного тижня, двох тижнів, трьох тижнів, або одного, або більше місяців (наприклад, одиничним введенням, або двома, або декількома введеннями). Інтервал між дозами може бути будь - яким бажаним періодом часу. Фраза "період напіввиведення" має відношення до часу, необхідного для скорочення концентрації злиття, або кон'югату, на 50 % in vivo у сироватці, або у плазми, наприклад, через деградацію та/або очищення, або поглинання природними механізмами. Злиття, або кон'югати 11 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 винаходу стабілізуються in vivo та їх період напіввиведення збільшується шляхом зв'язування з молекулами сироваткового альбуміну. Наприклад, з сироватковим альбуміном людини (HSA), який є стійким до деградації та/або очищення, або руйнування. Ці молекули сироваткового альбуміну є природними білками, які самі мають довгий період напіввиведення in vivo. Період напіввиведення молекули зростає, якщо її функціональна активність зберігається in vivo на більш довгий період, ніж у подібній молекулі, що не має специфічності для зростання періоду напіввиведення. Наприклад, злиття, або кон'югат винаходу, що містить dAb, специфічний для сироваткового альбуміну людини (HSA) та інкретинових ліків, або інсулінотропічний агент, як то GLP-1, або ексендин в порівнянні з тим же лігандом, де немає специфічності до HSA, який не пов'язує HSA, але пов'язує іншої молекули. Наприклад, він може зв'язувати третю мішень у клітині. Типово, період напіввиведення збільшується на 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, або більше. Збільшення діапазону у 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20, 30x, 40, 50, 100, 200, 300x, або більше періоду напіввиведення є можливим. Альтернативно, або на додачу, підвищення у діапазоні до 30x, 40, 50, 60, 70, 80x, 90, 100, 150, 200, 300x, 400 періоду напіввиведення є можливим. Застосований тут термін "гідродинамічний розмір" має відношення до спостережуваного розміру молекули (наприклад, білкової молекули, ліганду), що заснований на дифузії молекул через водний розчин. Дифузія, або рух білка через розчин може бути проведена для отримання спостережуваного розміру білка, де розмір задається "радіусом Стокса" або "гідродинамічним радіусом" білкової частини. "Гідродинамічний розмір" білка залежить від маси та від форми (конформації), таким чином, що два білки з тією ж самою молекулярною масою можуть мати різні гідродинамічні розміри, засновані на загальній конформації білка. Обчислення гомології, або "ідентичності", або подібності між двома послідовностями (ці терміни тут взаємозамінні) були проведені таким чином: послідовності було вирівняно для оптимального порівняння (наприклад, можуть бути введені пробіли в однієї або в обох, першій та другій амінокислоті або нуклеїнової кислоті для оптимального вирівнювання, та негомологічними послідовностями можна бути знехтувати з метою порівняння). У одному втіленні, довжина послідовності посилання, вирівняної з метою порівняння є щонайменш 30 %, або щонайменш 40 %, або щонайменш 50 %, або щонайменш 60 %, або щонайменш 70 %, 80 %, 90 %, 100 % від довжини послідовності посилання. Далі порівняли амінокислотні залишки, або нуклеотиди у відповідних амінокислотних позиціях, або нуклеотидні позиції. Коли позиції у першої послідовності є зайняті тими ж самими амінокислотними залишками, або нуклеотидом у відповідній позиції у другій послідовності, тоді молекули є ідентичними у цій позиції (як тут застосовано, амінокислотна, або нуклеїнова "гомологія" є еквівалентною до амінокислотної "індентичності", або "індентичності" нуклеїнової кислоти). Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією числа однакових позицій, розділених послідовностями, беручи до уваги ряд пробілів, та довжиною кожного пробілу, який повинен бути введений для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Вирівнювання амінокислотних та нуклеотидних послідовностей та гомології, подібності, або ідентичності, як тут визначено, можуть бути приготовані та визначені з застосуванням алгоритму BLAST 2 Sequences, з застосуванням параметрів за замовчуванням (Tatusova, T. A. et ah, FEMS Microbiol Lett, 774: 187-188 (1999). Винахід стосується виділених та/або рекомбінантних нуклеїнових кислот, що кодують злиття винаходу, які є описані тут, наприклад, ті, що кодується SEQ ID NOS 13-23. Нуклеїнові кислоти, які позначені тут як "виділені", є нуклеїновими кислотами, що були відокремлені від іншого матеріалу (наприклад, інших нуклеїнових кислот, як - то геномна ДНК, кДНК та/або РНК у його оригінальному навколишньому середовищі (наприклад, у клітині, або у суміші нуклеїнових кислот, як - то бібліотеці). Виділена нуклеїнова кислота може бути отриманою, як частина вектора (наприклад, плазміда). Нуклеїнові кислоти, що позначені тут як "рекомбінантні", є нуклеїновими кислотами, які можуть бути приготовані з застосуванням методології отримання рекомбінантних ДНК, в тому числі способами, що спираються на штучну рекомбінацію, як - то клонування у векторі, або хромосомі з застосуванням, наприклад, ферментів рестрикції, гомологічної рекомбінації, вірусів тощо, та приготуванні нуклеїнових кислот з застосуванням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Винахід також стосується рекомбінантних клітин хазяїна, наприклад, ссавця, або мікробних, що містять (одну, або більше) рекомбінантні нуклеїнові кислоти, або констракти для експресії, які містять нуклеїнові кислоти, що кодують злиття винаходу як описано тут. Також запропоновано спосіб отримання злиття винаходу, як описано тут, що містить підтримування рекомбінантних клітин хазяїна винаходу, наприклад, ссавців, або мікробних, в умовах 12 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідних для експресії поліпептиду злиття. Спосіб може, крім того, містити етап виділення, або відновлення злиття, якщо бажано. Наприклад, молекула нуклеїнової кислоти (тобто одна, або більше молекул нуклеїнової кислоти),що кодує поліпептид злиття винаходу, або констракт експресії (тобто один, або більше констрактів) що містять таку молекулу(молекули) нуклеїнової кислоти, може бути введеною у відповідну клітину хазяїна для створення рекомбінантних клітин хазяїна з застосуванням будь якого способу відповідно до вибраних клітин хазяїна (наприклад, трансформації, трансфекції, електропорації, інфікування), такого, що ця молекула (молекули) нуклеїнової кислоти(кислот) є функціонально пов'язана до одного, або більше елементів контролю експресії (наприклад, у вектор, у констракт, створений процесами у клітині, інтегрований у геном клітини хазяїна). Отримані рекомбінантні клітини хазяїна можуть бути підтриманими в умовах, відповідних для експресії (наприклад, у присутності індуктора, у відповідній тварині, у відповідному культурному середовищі, доповненому відповідними солями, факторами росту, антибіотиками, харчовими добавками, тощо), де продукується закодований пептид, або поліпептид. Якщо це бажано, закодований пептид, або поліпептид може бути виділений, або відновлений (наприклад, від тварини, клітин хазяїна, середовища, молока). Цей процес включає в себе експресію у клітині хазяїна трансгенної тварини (Див., наприклад, WO 92/03918, GenPharm International). Описані тут поліпептиди злиття винаходу можуть також бути вироблені у відповідній системі експресії in vitro, наприклад, шляхом хімічного синтезу, або будь - яким іншим відповідним способом. Як описано та показано тут на прикладах, кон'югати винаходу зазвичай зв'язують сироватковий альбумін з високою афінністю. Наприклад, злиття, або кон'югати винаходу можуть зв'язувати сироватковий альбумін людини з афінністю (KD; KD=Koff (kd)/Kon (ka) (як визначено поверхневим плазмонним резонансом) від 5 мкМ до 100 пM, наприклад, 1 мкМ до 100 пM, наприклад, 5-50 нм, наприклад, 10-30 нм, наприклад, 20-30 нм. Злиття, або кон'югати винаходу можуть бути експресовані у E. coli, або у види Pichia (наприклад, P. pastoris), та вони також можуть бути експресовані у будь - яких дріжджах, або клітинах грибів. У одному втіленні, злиття виділяється у кількості щонайменш 0.5 мг/л, коли воно експресовано у E. coli, або у види Pichia (наприклад, P. pastoris); або у культуру клітин ссавців (наприклад, у клітини CHO, або у HEK 293). Хоча, описані тут злиття або кон'югати можуть бути секретованими при експресії у E. coli, або у видах Pichia, або у клітинах ссавців, вони також можуть бути створеними з застосуванням будь - якого відповідного способу, як - то синтетичні хімічні способи, або спосіб біологічного виробництва, що не застосовує E. coli, або види Pichia. У деяких втіленнях, злиття та кон'югати винаходу є ефективними у тваринних моделях, як то описаних у WO 2006 /059106 (наприклад, на сторінках 104-105 опублікованої WO 2006 /059106), або описаних тут у прикладах, коли введена ефективна кількість. Взагалі ефективна кількість дорівнює від 0.0001 мг/кг до 10 мг/кг (наприклад, від 0.001 мг/кг до 10 мг/кг, наприклад, від 0.001 мг/кг до 1 мг/кг, наприклад, від 0.01 мг/кг до 1 мг/кг, наприклад, від 0.01 мг/кг до 0.1 мг/кг). Моделі захворювання відомі фахівцям у цій галузі для прогнозування терапевтичної ефективності у людей. Головним чином, заявлені злиття та кон'югати винаходу будуть використані в очищеній формі разом з фармакологічно, або фізіологічно відповідними носіями. Типово, ці носії можуть охоплювати водні, або спиртово/водні розчини, емульсії або суспензії, де будь - які з них містять фізіологічний розчин та/або буферизовану середовище. Парентеральні переносники можуть охоплювати розчин хлористого натрію, декстрозу Рингера, декстрозу та хлористий натрій та лактований Рингер. Відповідні фізіологічно - прийнятні адьюванти, якщо необхідно зберегти поліпептидний комплекс у суспензії, можуть бути вибраними від загусників, як - то карбоксиметилцелюлоза, полівінілпіролідон, желатин та альгінати. Внутрішньовенні носії охоплюють рідкі та поживні наповнювачі та електролітні наповнювачі, як - то на основі декстрози Рингера. Консерванти та інші добавки, як - то антимікробні, антиоксидантні, хелатуючі агенти та інертні гази, також можуть бути присутні (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). Різні відповідні препарати можуть бути застосовані, в тому числі препарати зі сповільненим вивільненням. Шлях введення фармацевтичної композиції винаходу може бути будь - яким з тих, що зазвичай відомі фахівцям в даній області. Для терапії, ліки злиття, або кон'югати винаходу можуть бути введені до будь - якого пацієнта у відповідності з стандартними способами. Введення може бути зроблено будь - яким відповідним шляхом, в тому числі парентерально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньочеревно, перорально, через шкіру, пульмонологічно, або також, відповідно, прямою інфузією з катетером. Дозування та 13 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частота введення буде залежить від віку, статі та стану пацієнта, конкурентного введення інших ліків, протипоказань та інших параметрів, які повинні бути прийняті до уваги лікаря. Введення може бути місцевим, або системним, як зазначено. У одному втіленні, винахід стосується пульмонологічного препарату для доставки у легені, який містить (a) кон'югати, або злиття винаходу, та (b) фармацевтично прийнятний буфер, де композиції містять краплі рідини та 40 %, або більше, наприклад, 50 %, або більше, крапель рідини, присутніх у композиції, мають розмір у діапазоні, що є менш ніж 6 мікрон, наприклад, від 1 мікрон до 6 мікрон, наприклад, менш ніж 5 мікрон, наприклад, від 1 до 5 мікрон. Ці композиції є, наприклад, особливо прийнятними для прямого місцевого пульмологічного введення суб'єкту. Ці композиції можуть, наприклад, бути введені безпосередньо у легені, наприклад, інгаляцією, наприклад з застосуванням небулайзеру. Ці композиції для пульмологічної доставки можуть містити фізіологічно прийнятний буфер, що має діапазон pH між 4-8, наприклад, 7-7.5, та в'язкість, що приблизно дорівнює в'язкості розчину 2 % - 10 % PEG 1000 у 50 mM фосфатному буфері, що містить 1.2 % (м/о) цукрози. Злиття, або кон'югати заявленого винаходу можуть бути ліофілізовані для зберігання та відновлені у відповідному носії перед застосуванням. Цей спосіб, як було показано, є ефективним зі звичайними імуноглобулінами, та також можуть бути застосовані відомі фахівцям способи ліофілізації та відновлення. Фахівцям буде зрозуміло, що ліофілізація та відновлення може привести до різного ступеня втрати активності антитіл (наприклад, з звичайними імуноглобулінами, IgM антитіла, як правило, мають більшу втрату активності, ніж IgG антитіла), та що застосовані рівні, можливо, доведеться скоригувати вгору для компенсації. Для профілактичного застосування, наприклад, при введенні суб'єктам з переддіабетом, або з резистентністю до інсуліну, композиції, що містять заявлені злиття, або кон'югати також можуть бути введені у подібних, або трохи понижених дозах для запобігання, інгібування, або затримки початку захворювання (наприклад, для підтримки ремісії, або спокою, або для запобігання гострої фази). Кваліфікований лікар буде в змозі визначити відповідний інтервал дозування для лікування, супресії, або запобігання захворювання. Коли злиття, або кон'югат винаходу вводять для лікування, супресії, або запобігання захворювання, його можна ввести до чотирьох разів на день, двічі у тиждень, один раз у тиждень, один раз кожні два тижні, раз у місяць, або один раз кожні два місяці, з дозою, наприклад, від 0.0001 мг/кг до 10 мг/кг (наприклад, від 0.001 мг/кг до 10 мг/кг, наприклад, 0.001 мг/кг до 1 мг/кг, наприклад, від 0.01 мг/кг до 1 мг/кг, наприклад, від 0.01 мг/кг до 0.1 мг/кг). Лікування, або терапія, яка проводиться з застосуванням описаних тут композицій вважається "ефективною", якщо один, або більше симптомів зменшується (наприклад, щонайменш на 10 %, або щонайменш на один пункт на шкалі клінічної оцінки), в порівнянні з такими симптомами, присутніми перед лікуванням, або в порівнянні з такими симптомами у суб'єкті (людина, або модельна тварина), не обробленими такими композиціями, або іншими відповідними контролями. Симптоми, звичайно, будуть змінюватися в залежності від конкретного характеру захворювання, або розладу, але можуть бути діагностовані досвідченим лікарем або техніком. Так саме, профілактика, що проведена з застосуванням композицій, які описані тут є "ефективною", якщо початок, або тяжкість одного, або декілька симптомів є сповільненими, скороченими, або скасованими у порівнянні з такими симптомами у подібних суб'єктах (людині, або тваринній моделі), не обробленими композицією. Злиття та кон'югати заявленого винаходу можуть бути застосовані у вигляді окремо введених композицій, або вони можуть бути введені у поєднанні з іншими терапевтичними, або активними агентами, наприклад, іншими поліпептидами, або пептидами, або малими молекулами. Крім того, ці агенти можуть охоплювати різні ліки, як - то, наприклад метформін, інсулін, глітазони (наприклад, росаглітозон), імуносупресанти та імуностимулятори. Злиття та кон'югати винаходу можуть бути введені та/або приготовані разом з одним, або декількома додатковими терапевтичними, або активними агентами. Коли злиття, або кон'югат винаходу вводять з додатковим терапевтичним агентом, злиття, або кон'югат може бути введений перед, одночасно, разом, або після введення додаткового агента. Взагалі, злиття, або кон'югат винаходу та додатковий агент вводять у формі, яка забезпечує перекриття терапевтичної дії. Підвищений період напіввиведення інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків, наприклад, GLP-1, або ексендинового ліганду є корисним у застосуваннях in vivo. Винахід вирішує цю проблему шляхом забезпечення підвищення періоду напіввиведення інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків, наприклад, GLP та ексендину in vivo та як наслідок, подовженого часу дії у тілі функціональної активності цих молекул. 14 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як описано тут, композиції винаходу (тобто, що містять злиття, або кон'югати, які тут описані) можуть значно продовжити сироватковий або плазмовий період напіввиведення in vivo та/або підвищити dAUC та/або підвищити середній час перебування (MRT) у порівнянні з інсулінотропічним агентом або інкретиновими ліками окремо. На додачу, активність інсулінотропічного агента або інкретинових ліків як правило, суттєво не змінюється у композиції винаходу (наприклад, кон'югаті, або злитті). Однак, деякі зміни у активності композиції винаходу в порівнянні з інсулінотропічним агентом, або інкретиновими ліками окремо є прийнятними, та, як правило, компенсованими підвищеними фармакокінетичними властивостями кон'югатів, або злиття винаходу. Наприклад, ліки кон'югатів, або злиття винаходу можуть зв'язувати ціль з нижчою афінністю, ніж ліки окремо, але мають або еквівалентну, або більш високу ефективність у порівнянні з ліками окремо через підвищені фармакокінетичні властивості (наприклад, продовжений in vivo період напіввиведення сироватки, більший AUC) ліків композиції. На додачу, через підвищений період напіввиведення кон'югатів або злиття винаходу вони може бути введені не так часто, ніж інсулінотропічний агент, або інкретинові ліки окремо, наприклад, їх можна призначати хворим раз у місяць, або раз у тиждень, та вони також досягають більш постійного рівню інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків у крові, ніж введення інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків окремо, досягаючи тому бажаної терапевтичної, або профілактичної дії. Способи фармакокінетичного аналізу та визначення періоду напіввиведення ліганду є добре знайомі фахівцям. Деталі можна знайти у Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Reference is also made to "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982), де описано фармакокінетичні параметри, як - то періоди напіввиведення т - альфа та т - бета та площина під кривою (AUC). Періоди напіввиведення (т½ альфа та т½ бета), AUC та MRT можуть бути визначені по кривій концентрації ліганду у плазмі, або сироватці проти часу. Для моделювання кривої може бути застосовано, наприклад, набор для аналізу WinNonlin (від Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA). У першій фазі (альфа - фаза) ліганд, головним чином, розподіляється у пацієнті, з деяким усуненням. Друга фаза (бета - фаза) є термінальною фазою, коли ліганд є поширеним та сироваткова концентрація знижується, тому що ліганд виводиться від пацієнта. Т - альфа період напіввиведення є періодом напіввиведення першої фази та т - бета період напіввиведення є періодом напіввиведення другої фази. Додатково, як відомо фахівцям, для визначення періоду напіввиведення також може бути застосована прийнятна некомпартментна модель. У одному втіленні, заявлений винахід стосується злиття, або кон'югату відповідно до винаходу, що має період напіввиведення, наприклад, у людині, у діапазоні 12 годин або більше, наприклад, від 12 годин до 21 діб, наприклад, від 24 годин до 21 діб, наприклад, 2-10 діб, наприклад, 3-4 діб. Злиття, або кон'югати винаходу можуть також бути, крім того, відформатовані для того, щоб мати великий гідродинамічний розмір, наприклад, прикріпленням PEG груп, сироваткового альбуміну, трансферину, трансферинового рецептору, або щонайменш його трансферин зв'язувальної частини, Fc ділянки антитіл, або кон'югацією до домену антитіла. Гідродинамічний розмір може бути визначений з застосуванням добре відомих фахівцям способів, наприклад для визначення гідродинамічного розміру ліганда може бути застосована гель - фільтраціонна хроматографія. Відповідні матриці гель - фільтрації для визначення гідродинамічних розмірів лігандів, як - то перехрестно - зшиті агарозні матриці, є легко доступними та добре відомими. Композиції винаходу, тобто ті, що містять описані тут злиття та кон'югати, надають кілька додаткових переваг. Компонент доменного антитіла є дуже стабільним, має малий розмір у порівнянні з антитілами та іншими антиген - зв'язувальними фрагментами антитіл, може бути вироблений з високим виходом шляхом експресії у E. coli, або дріжджах (наприклад, Pichia pastoris), та антиген - зв'язувальні фрагменти антитіл, що зв'язують сироватковий альбумін можуть бути легко вибрані від бібліотек людського походження, або від будь - яких бажаних видів. Відповідно, композиції винаходу, які містять dAb, що зв'язує сироватковий альбумін, можуть бути вироблені більше легко, ніж терапевтичні, які, головним чином виробляються у клітинах ссавців (наприклад, антитіла людини, гуманізовані, або химерні антитіла) та можуть бути застосовані dAb, які не є імуногенними, (наприклад, dAb людини може бути застосований для лікування, або діагнозування захворювань людей). Імуногенність інсулінотропічного агента, або інкретинових ліків може бути скорочена, коли інсулінотропічний агент, або інкретин є частиною ліків композиції, яка містить dAb, що зв'язує 15 UA 98911 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 сироватковий альбумін. Відповідно, винахід стосується злиття, або кон'югату композиції, яка може бути менш імуногенна (ніж, наприклад, інсулінотропічний агент, або інкретин окремо), або яка може бути у значній мірі неімуногенна в контексті композиції ліків, що містить dAb, який зв'язує сироватковий альбумін. Таким чином, подібні композиції можуть бути введені суб'єкту повторно протягом тривалого часу з мінімальною втратою ефективності завдяки виробленню анти - лікових антитіл імунною системою суб'єкта. Додатково, описані тут композиції кон'югатів, або злиття можуть мати підсилений профіль безпеки та менше побічних дій, ніж інсулінотропічний агент, або інкретин окремо. Наприклад, в результаті активності зв'язування сироваткового альбуміну dAb, злиття та кон'югати винаходу мають подовжений час перебування в судинній циркуляції. Додатково, злиття та кон'югати винаходу у значній мірі нездатні перетинати гемантоенцефалічний бар'єр та накопичуватися у центральній нервовій системі протягом системного введення (наприклад, внутрішньосудинного введення). Відповідно, злиття, або кон'югати винаходу можуть бути введені з більшою безпекою та скороченими побічними проявами у порівнянні з інсулінотропічним агентом, або інкретиновими ліками окремо. Так само, злиття, або кон'югати можуть мати скорочену токсичність у окремих органах (наприклад, нирках, або печінці) ніж ліки окремо. ПРИКЛАДИ: Приклад 1 Експресія генетичного злиття GLP-1 (A8G), або ексендину - 4 та D0M7h-H AlbudAb: Eксендин - 4, або GLP-1 (7-37), з аланіном у позиції 8, що був заміщений на гліцин ([GIy8] GLP-1), був клонований, як злиття з DOM7h-14 (доменним антитілом (dAb) яке зв'язує сироватковий альбумін (AlbudAb) з амінокислотною послідовністю, що наведена нижче) у векторі pTT-5 (отриманий від CNRC, Canada). У кожному випадку, GLP-1, або ексендин - 4 розміщувався на 5' кінці констракту, та dAb на 3' кінці. Взагалі, з амінокислотної послідовності, що наведена у Фіг. 1 (A-G) було зроблено 7 констрактів (DAT 0114, DAT 0115, DAT 0116, DAT 0117, DAT 0118, DAT 0119, DAT 0120). Вони або не мають лінкера, або мають gly-ser лінкер (G4S), або спіральний лінкер (Arai, R., H. Ueda, et al. (2001). "Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein." Protein Eng 14(8): 529-32.456), або лінкер, що складається з другої GLP-1 групи між GLP-1, або ексендином - 4 та dAb. Лінкери були включені у якості спейсерів для просторового відокремлення GLP-1, або ексендину - 4 від dAb для запобігання стеричних перешкод зв'язування між GLP-1, або ексендином - 4 та GLP-1 рецептором. Послідовності констрактів наведені у Фіг. 1 (A-G). Вільна від ендотоксину ДНК була приготована у E.coli з застосуванням алкалінового лізису (з застосуванням вільного від ендотоксину плазмідного набору Giga kit, отриманого від Qiagen CA) та застосованого для трансфекції HEK293E клітин (отриманих від CNRC, Canada). Трансфекцію проводили у HEK293E клітинах (250 мл/колбу, 1.75 × 106 клітин/мл) з застосуванням 333 мкл 293fectin (Invotrogen) та 250 мкг ДНК на колбу, та проводили експресію при 300C протягом 5 діб. Супернатант зібрали шляхом центрифугування та очищення проводили шляхом афінного очищення на L - протеіні. Білок порційно зв'язували зі смолою, завантажили на колонку та промивали 10 обсягами колонки PBS. Далі білок елюірували з 50мл 0.1M гліцину, pH2 та нейтралізували з Tris pH8. Білок очікуваного розміру визначали на SDSPAGE гелі, та розміри наведені у Таблиці 1 нижче. Таблиця 1 Молекулярні маси DAT 0114, DAT 0115, DAT 0116, DAT 0117, DAT 0118, DAT 0119, DAT 0120 Білок злиття DAT 0114 DAT 0115 DAT 0116 DAT 0117 DAT 0118 DAT 0119 DAT 0120 45 Очікувана молекулярна маса 18256 16896 15950 19798 15936 15318 18895 Приклад 2 16 UA 98911 C2 5 10 15 Ілюстрація того, що злиття GLP-1 та ексендину - 4 AlbudAb зв'язують сироватковий альбумін: Злиття GLP-1 та ексендину - 4 AlbudAb аналізували способом поверхневого плазмонного резонансу (Biacore AB, отриманий від GE Healthcare) для отримання інформації про афінність. Аналіз проводили з застосуванням чипу CM5 Biacore (карбоксиметилована декстранова матриця), що був покритий сироватковим альбуміном. 1000 одиниць резонансу (RUs) кожного сироваткового альбуміну для тестування (сироватковий альбумін людини, щурів та мишей) імобілізували в ацетатному буфері, pH 5.5. Потокова кювета 1 Biocore AB була непокрита, блокований негативний контроль, потокова кювета 2 була покрита сироватковим альбуміном людини (HSA) (815 RU), потокова кювета 3 була покрита сироватковим альбуміном щурів (RSA) (826RUs), та потокова кювета 4 була покрита мишачим сироватковим альбуміном (MSA) (938 RUs). Кожну тестовану молекулу злиття експресували у культурі тканин ссавців, як описано у прикладі вище. Набор концентрацій молекул злиття приготували (у діапазоні 16 нМ – 2 мкМ) розведенням у буфері BIACORE HBS-EP (0.01M HEPES, pH7.4, 0.15M NaCl, 3мМ EDTA, 0.005 % поверхнево - активна речовина P20), та він витікав крізь чип BIACORE. Афінність (KD) обчислювали по слідам BIACORE з застосуванням прийнятних кривих швидкості утворювання та швидкості дисоціації до слідів, створених концентраціями dAb у ділянці KD. Афінність (KD) підсумована у наступній Таблиці 2: Таблиця 2 Зв'язування GLP-1 та ексендину - 4 AlbudAb з сироватковими альбумінами людини, щурів та мишей GLP-1(7-37)A8G, спіральний лінкер, 2xGLP-1(7-37) A8G, DOM7h-14 DOM7h-14 злиття злиття Сиворотковий альбумін людини Сиворотковий альбумін щурів Сиворотковий альбумін мишей 110 нМ 150 нМ 800 нМ 700 нМ 110 нМ 130 нМ 20 25 30 35 40 Результати, наведені вище демонструють, що молекули злиття зберігають здатність зв'язувати всі типи сироваткового альбуміну, та це свідчить, що вони, ймовірно, мають подовжений період напіввиведення in vivo. Приклад 3 Злиття GLP-1 та ексендину - 4 AlbudAb є активними у дослідженні GLP-1 рецептора зв'язування (GLP-1R BA). Злиття додали до обмінного буферу (100мМ NaVl, 20мМ цитрат pH 6.2.,у той час як, клітини CHO 6CRE GLPlR (CHO Kl клітини, отримані від American Type Tissue Collection, ATCC) стабільно трансфікували з чутливим елементом 6 cAMP, що несе репортерний ген люциферази та також з GLP-1 рецептором людини) посіяли (2 × 10 5 клітин/мл) у суспензійну середовище. Суспензійну культуру підтримували 24 години. Далі клітини були розведені у 15мМ HEPES буфері (отриманий від Sigma), що містив 2мМ L - глютаміну (2.5 × 105 клітин/мл), та розлиті у 384 - лункові планшети, що містили 10 мкл/лунку досліджуваного компоненту. Після додавання контролю дослідження, планшети повернули до інкубатора на три години при 37 °C та 5 % CO2. Після інкубації до лунок додали (як вказано в наборі) стійкий субстрат люциферази (отриманий від Promega) та планшети запечатали самоклеючою планшетною плівкою (Weber Marking Systems Inc. Cat. No. 607780). Далі планшети розмістили у рідері (Viewlux, Perkin Elmer) та пре - інкубували протягом 5 хвилин перед читанням флуоресценції та кресленням результатів. Компонент досліджували у діапазоні концентрацій у присутності та у відсутнoсті 10 мкМ альбуміна, що дозволило створити криву дії дози з альбуміном та без нього. EC50s був обчислений та підсумований у наступній Таблиці 3: 17 UA 98911 C2 Таблиця 3 Активність злиття GLP-1 та ексендину - 4 AlbudAb у дослідженні рецептора зв'язування GLP-1 (GLP-1R BA) Ексендин - 4 (G4S)3 DOM7h-14 злиття Ексендин – 4 DOM7h-14 злиття Ексендин - 4, спіральний лінкер, DOM7h14 злиття GLP-1 A&G, спіральний лінкер, DOM7h14 злиття GLP-1 7-36 Ексендин - 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 GLP-1R BA EC50 (пМ)n=3 8,9 12 GLP-1R BA (10мМ альбумін) EC50 (пМ)n=2 35 72 4,3 15 17 130 21 1,0 19 0,82 Результати, наведені вище, свідчать, що всі перевірені молекули злиття зберігають здатність зв'язування з GLP-1 рецептором. Результати також демонструють, що ця здатність зберігається у присутності сироваткового альбуміну. Отже, ці молекули злиття швидше за все, зберігають здатність зв'язувати GLP-1 рецептор in vivo. Приклад 4 Експресія DAT 0115, DAT 0116, DAT 0117 та DAT 0120 у культурі тканин ссавців HEK 293 з наступним очищенням шляхом захоплення афінності L - білком та іонообмінною хроматографією. Метою цього експерименту було отримання білка для визначення його характеристик in vivo та in vitro. Білок експресували у клітинах культури тканин ссавців HEK 293E з вектора pTT-5, як описано раніше. Стисло кажучи, вільна від ендотоксину ДНК була приготована, очищена, та застосована для трансфекції HEK293E клітин. Білкова експресія проходила протягом 5 діб при 30 C у інкубаторі зі струшуванням, та після цього інкубування культури зупинили та зібрали супернатант (що містить інтересуючий білок). Білок очистили від супернатанту шляхом захоплення афінності L – білковою агарозною плівковою афінною смолою (смола від GE Healthcare, L - білок власного виробництва). Далі смолу промили 10 обсягами колонки PBS та білок елюіровали з 5 обсягами колонки 0.1 M гліцину, pH2.0. Нейтралізацію проводили з 1 обсягом колонки 1МTris гліцину pH8.0. У цьому разі (на відміну від попереднього приклада), було вжито подальше очищення. Білок (у tris - гліцині) був підданий буферному обміну з 20мМ ацетатом pH 5.0 перед завантаженням з застосуванням Akta на одній (або паралельно на двох) 6 мл S - колонці (GE healthcare), попередньо врівноважених у 20мМ ацетаті pH 5.0. Після промивання з тим саме буфером, білок був елюірований 0-0.75M, або 01M NaCl градієнтом у 20мМ ацетаті pH5.0. Фракції належного розміру далі були ідентифіковані за допомогою SDS-PAGE електрофорезу та мас - спектрометрії та були об'єднані для створення кінцевої проби білка. Білок далі був підданий буферному обміну у 20мМ цитраті, pH6.2, 100мМ NaCl та концентрований до 0.5-5 мг/мл. Далі білок відфільтрували крізь 0.2 мкМ фільтр для забезпечення стерильності та застосували у прикладах, що описані нижче. Приклад 5 Порівняння стабільності DAT 0115, DAT 0116, DAT 0117 та DAT 0120 по відношенню до 1, 3 та 6 циклів заморожування - відтавання: Метою цього дослідження було порівняти стабільність DAT 0115, DAT 0116, DAT 0117 та DAT 0120 по відношенню до 1, 3, та 6 циклів заморожування - відтавання. Кожен білок експресували у HEK 293E клітинах культури тканин ссавців від pTT-5 вектора та очистили на L – білковій афінній смолі з наступною іонообмінною хроматографією, як описано вище. Білок був підданий буферному обміну у 20мМ цитраті, 100мМ NaCl та розведений до 0.5мг/мл з застосуванням того ж самого буферу. 0.5 мл аліквоти кожного білка (у тубах Еппендорфа) далі були піддані 0, 1, 3, або 6 циклам заморожування - відтавання, де кожен цикл включав 3 хвилини інкубації на сухому льоду, потім 2 хвилини при 37° С на водяній бані. (Протягом експерименту було спостережено, що 2 хвилини при 37 °C було достатньо для повного відтавання білкового розчину.) Після завершення необхідного числа циклів заморожування відтавання, проби білка зберігали при 2-8 °C до подальшого аналізу. Далі білки аналізували з застосуванням SDS PAGE електрофорезу, аналізу GLP-1R зв'язування, гель - хроматографії на колонці Superdex 75 та мас - спектрометрії. Було спостережено, що профіль SDS-PAGE, 18 UA 98911 C2 5 здатність до зв'язування GLP-1R та мас - спектрометричний профіль всіх чотирьох білків значно не змінився з вихідного показника протягом 1, 3, або 6 циклів заморожування - відтавання. Максимальна висота піку при SEC аналізі була позначена як 78 %, 86 %, 104 % та 57 % від максимальної висоти, що зберігалася після 6 циклів заморожування - відтавання для DAT 0115, DAT 0116, DAT 0117 та DAT 0120 відповідно. Був зроблений висновок, що DAT 0120 був менш стабільним до циклів заморожування - відтавання, ніж інші три білки. Таблиця 4 Результати порівняння стабільності DAT 0115, DAT 0116, DAT 0117 та DAT 0120 до 1, 3 та 6 циклів заморожування – відтавання Проба DAT 0115 DAT 0115 DAT 0115 DAT 0115 DAT 0116 DAT 0116 DAT 0116 DAT 0116 DAT 0117 DAT 0117 DAT 0117 DAT 0117 DAT0120 0 DAT0120 1 DAT0120 3 DAT0120 6 10 15 20 25 Кількість циклів заморожування – відтавання 0 1 3 6 0 1 3 6 0 1 3 6 0 1 3 6 Висота піку (mAU) % максимальної висоти піку 49 43 40 38 29 28 26 25 34 34 35 35 35 24 21 20 100 % 89 % 82 % 78 % 100 % 95 % 91 % 86 % 100 % 99 % 103 % 104 % 100 % 70 % 59 % 57 % Приклад 6 Демонстрація тривалості дії DAT 0115 у мишачій db/db моделі діабету типу II: Метою цього дослідження було визначення тривалості дії DAT 0115 на оральну толерантність глюкози у db/db мишах Тварини були розділені по зменшенню рівнів глюкози за три доби перед початком експерименту та потім розміщені по блокам Кожна тварина всередині кожного блоку була далі розподілена до кожної з 26 груп дослідження Це забезпечило схожі стартові рівні глюкози у кожній з груп дослідження DAT 0115 (вироблений у HEK293 клітинах та очищений, як описано вище) був введений підшкірно у 1мг/кг, 0.3мг/кг, або 0.1мг/кг кожні 5год., 24год., 48год., 72год., 96год., або 120 годин перед пероральним введенням глюкози (Не всі дози вводили в кожен момент часу, див., деталі у таблиці нижче.) DAT 0115 значно зменшив AUC глюкози за двохгодинний період часу орального - глюкозного тесту толерантності (OGTT) у порівнянні з db/db мишами, обробленими носієм у моменти часу від 24 год з дозами у 0,1мг/кг та 0,3мг/кг та до 72 - годинної часової відмітки для дози у 1 мг/кг Ексендин - 4, введений у якості позитивного контролю при 42мкг/кг, також значно скоротив AUC глюкози після того, як OGTT був введений за 5 год. перед пероральним прийомом таблеток. Таблиця 5 нижче показує відсоткове зниження AUC для кожної з DAT 0115 груп дослідження у порівнянні з носієм. Зірочка вказує P