Білки злиття на основі rage і способи їх використання
Номер патенту: 93356
Опубліковано: 10.02.2011
Автори: Вебстер Джеффрі К., Тянь Йє Е., Ротлейн Роберт, Мджаллі Аднан М.М.
Формула / Реферат
1. Білок злиття, який включає поліпептид RAGE, безпосередньо приєднаний до поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або частину СН2 домену імуноглобуліну, де поліпептид RAGE включає сайт зв’язування ліганду RAGE, де шарнірна ділянка Fc імуноглобуліну заміщена поліпептидом RAGE, і де сайт зв’язування ліганду RAGE включає поліпептид, що має послідовність, представлену в SEQ ID NO:9, або послідовність, яка на 90 % їй ідентична, або послідовність, представлену в SEQ ID NO:10, або послідовність, яка на 90 % їй ідентична.
2. Білок злиття за п. 1, який відрізняється тим, що:
білок злиття включає
(і) міждоменний лінкер RAGE, який розділяє домени V і С1 RAGE, або
(іі) лінкер, який розділяє домени C1 і С2 RAGE, що розміщені в шарнірній ділянці важкого ланцюга імуноглобуліну;
або
білок злиття одержаний видаленням шарнірної ділянки Fc імуноглобуліну і заміщенням її на поліпептид RAGE.
3. Білок злиття за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид RAGE включає міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, так що С-кінцева амінокислота імуноглобулінового домену RAGE приєднана до N-кінцевої амінокислоти міждоменного лінкера і С-кінцева амінокислота міждоменного лінкера RAGE приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або частину СН2 домену імуноглобуліну.
4. Білок злиття за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що білок злиття включає перший імуноглобуліновий домен RAGE і перший міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до другого імуноглобулінового домену RAGE і другого міждоменного лінкера RAGE, так що N-кінцева амінокислота першого міждоменного лінкера RAGE приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого імуноглобулінового домену RAGE, N-кінцева амінокислота другого імуноглобулінового домену RAGE приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого міждоменного лінкера RAGE, N-кінцева амінокислота другого міждоменного лінкера RAGE приєднана до С-кінцевої амінокислоти другого імуноглобулінового домену RAGE і С-кінцева амінокислота другого міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти імуноглобулінового домену Сн2 або частини Сн2 домену імуноглобуліну.
5. Білок злиття за п. 4, який відрізняється тим, що другий міждоменний лінкер RAGE, безпосередньо приєднаний до імуноглобулінового домену СН2 або частини імуноглобулінового домену СН2, включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:22, або послідовність, яка на 90 % їй ідентична, або амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:24, або послідовність, яка на 90 % їй ідентична.
6. Білок злиття за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що поліпептид RAGE являє собою один імуноглобуліновий домен RAGE, приєднаний через міждоменний лінкер RAGE до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 імуноглобуліновий домен або частину СН2 домену імуноглобуліну.
7. Білок злиття за п. 6, який відрізняється тим, що міждоменний лінкер RAGE, безпосередньо приєднаний до імуноглобулінового домену СН2 або частини СН2 домену імуноглобуліну, включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:21, або послідовність, яка на 90 % їй ідентична, або амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:23, або послідовність, яка на 90 % їй ідентична.
8. Білок злиття за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що поліпептид RAGE включає sRAGE людини, що має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 4, або його фрагмент.
9. Білок злиття за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид RAGE включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 або SEQ ID NO:20.
10. Білок злиття за п. 1, який відрізняється тим, що амінокислотна послідовність поліпептиду RAGE представлена в SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19 або SEQ ID NO:20.
11. Білок злиття з будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що поліпептид додатково включає СН3 домен імуноглобуліну або його частину.
12. Білок злиття за п. 11, який відрізняється тим, що амінокислотна послідовність поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або частину СН2 домену імуноглобуліну, являє собою або містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:38.
13. Білок злиття за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що імуноглобулін являє собою імуноглобулін, вибраний з групи, що складається з IgA, IgD, IgE, IgG і IgM.
14. Білок злиття за п. 13, який відрізняється тим, що імуноглобулін вибраний з групи, що складається з IgA1, IgА2, IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4.
15. Білок злиття за п. 14, який відрізняється тим, що імуноглобулін являє собою IgG1.
16. Білок злиття, що включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 або SEQ ID NO:37.
17. Білок злиття за п. 16, який має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:37 або SEQ ID NO:34.
18. Білок злиття, що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, представленою в SEQ ID NO:30 або SEQ ID NO:31.
19. Нуклеїнова кислота, що кодує білок злиття за будь-яким з пп. 1-18.
20. Нуклеїнова кислота за п. 19, яка відрізняється тим, що нуклеїновокислотна послідовність, що кодує поліпептид RAGE, являє собою або містить нуклеїновокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:29.
21. Нуклеїнова кислота за п. 20, що включає нуклеїновокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:30, або її фрагмент або нуклеїновокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NО:31, або її фрагмент.
22. Вектор експресії, що кодує білок злиття за будь-яким з пп. 1-18 і/або містить нуклеїнову кислоту за будь-яким з пп. 19-21.
23. Фармацевтична композиція для лікування розладів, опосередкованих RAGE, де композиція включає терапевтично ефективну кількість білка злиття за будь-яким з пп. 1-18 у фармацевтичному носії.
24. Фармацевтична композиції за п. 23, яка відрізняється тим, що вона виготовлена у вигляді розчину, який ін’єктується, або у вигляді стерильного ліофілізованого порошку.
25. Спосіб одержання білка злиття на основі RAGE, який включає стадію ковалентного приєднання поліпептиду RAGE до поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або частину СН2 домену імуноглобуліну.
26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що білок злиття кодується рекомбінантною конструкцією ДНК.
27. Спосіб за п. 25 або 26, який додатково включає стадію вбудовування конструкції ДНК у вектор експресії.
28. Спосіб за п. 27, який додатково включає трансфекцію вектора експресії в хазяйську клітину.
29. Застосування білка злиття за будь-яким з пп. 1-18 для одержання лікарського засобу для лікування RAGE-опосередкованого захворювання у суб’єкта.
30. Застосування за п. 29, де лікарський засіб призначений для внутрішньовенного, внутрішньочеревинного або підшкірного введення білка злиття на основі RAGE суб’єкту.
31. Застосування за п. 29 або 30, де лікарський засіб призначений для лікування симптому діабету або пізніх ускладнень діабету.
32. Застосування за п. 31, де симптом діабету або пізніх ускладнень діабету включає діабетичну нефропатію, діабетичну ретинопатію, діабетичне покривання виразками стопи, серцево-судинне ускладнення або діабетичну нейропатію.
33. Застосування за п. 29 або 30, де лікарський засіб призначений для застосування для лікування амілоїдозу, хвороби Альцгеймера, раку, запалення, асоційованого з аутоімунним процесом, запалення, асоційованого із запальним захворюванням кишечнику, запалення, асоційованого з ревматоїдним артритом, запалення, асоційованого з псоріазом, запалення, асоційованого з розсіяним склерозом, запалення, асоційованого з гіпоксією, запалення, асоційованого з інсультом, запалення, асоційованого з серцевим нападом, запалення, асоційованого з геморагічним шоком, запалення, асоційованого з сепсисом, запалення, асоційованого з трансплантацією органа, запалення, асоційованого з поганим загоєнням рани, або при лікуванні ниркової недостатності.
34. Клітина-хазяїн для продукування білка злиття за п. 1, де клітина трансформована вектором експресії за п. 22.
35. Клітина-хазяїн за п. 34, де клітина-хазяїн являє собою клітину яєчника китайського хом'ячка.
Текст
1. Білок злиття, який включає поліпептид RAGE, безпосередньо приєднаний до поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або частину СН2 домену імуноглобуліну, де поліпептид RAGE включає сайт зв’язування ліганду RAGE, де шарнірна ділянка Fc імуноглобуліну заміщена поліпептидом RAGE, і де сайт зв’язування ліганду RAGE включає поліпептид, що має послідовність, представлену в SEQ ID NO:9, або послідовність, яка на 90% їй ідентична, або послідовність, представлену в SEQ ID NO:10, або послідовність, яка на 90 % їй ідентична. 2. Білок злиття за п.1, який відрізняється тим, що: білок злиття включає (і) міждоменний лінкер RAGE, який розділяє домени V і С1 RAGE, або (іі) лінкер, який розділяє домени C1 і С2 RAGE, що розміщені в шарнірній ділянці важкого ланцюга імуноглобуліну; або білок злиття одержаний видаленням шарнірної ділянки Fc імуноглобуліну і заміщенням її на поліпептид RAGE. 3. Білок злиття за п.1, який відрізняється тим, що поліпептид RAGE включає міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, так що С-кінцева амінокислота імуноглобулінового домену RAGE приєднана до N-кінцевої амінокислоти міждоменного лінкера і С-кінцева амінокислота міждоменного лінкера RAGE приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або частину СН2 домену імуноглобуліну. 2 (19) 1 3 93356 4 послідовність, представлену в SEQ ID NO: 4, або його фрагмент. 9. Білок злиття за п.1, який відрізняється тим, що поліпептид RAGE включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 або SEQ ID NO:20. 10. Білок злиття за п.1, який відрізняється тим, що амінокислотна послідовність поліпептиду RAGE представлена в SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19 або SEQ ID NO:20. 11. Білок злиття за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що поліпептид додатково включає СН3 домен імуноглобуліну або його частину. 12. Білок злиття за п.11, який відрізняється тим, що амінокислотна послідовність поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або частину СН2 домену імуноглобуліну, являє собою або містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:38. 13. Білок злиття за будь-яким з пп.1-11, який відрізняється тим, що імуноглобулін являє собою імуноглобулін, вибраний з групи, що складається з IgA, IgD, IgE, IgG і IgM. 14. Білок злиття за п.13, який відрізняється тим, що імуноглобулін вибраний з групи, що складається з IgA1, IgА2, IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4. 15. Білок злиття за п.14, який відрізняється тим, що імуноглобулін являє собою IgG1. 16. Білок злиття, що включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 або SEQ ID NO:37. 17. Білок злиття за п.16, який має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:37 або SEQ ID NO:34. 18. Білок злиття, що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, представленою в SEQ ID NO:30 або SEQ ID NO:31. 19. Нуклеїнова кислота, що кодує білок злиття за будь-яким з пп.1-18. 20. Нуклеїнова кислота за п.19, яка відрізняється тим, що нуклеїновокислотна послідовність, що кодує поліпептид RAGE, являє собою або містить нуклеїновокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:29. 21. Нуклеїнова кислота за п.20, що включає нуклеїновокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:30, або її фрагмент або нуклеїновокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NО:31, або її фрагмент. 22. Вектор експресії, що кодує білок злиття за будь-яким з пп.1-18 і/або містить нуклеїнову кислоту за будь-яким з пп.19-21. 23. Фармацевтична композиція для лікування розладів, опосередкованих RAGE, де композиція включає терапевтично ефективну кількість білка злиття за будь-яким з пп.1-18 у фармацевтичному носії. 24. Фармацевтична композиції за п.23, яка відрізняється тим, що вона виготовлена у вигляді розчину, який ін’єктується, або у вигляді стерильного ліофілізованого порошку. 25. Спосіб одержання білка злиття на основі RAGE, який включає стадію ковалентного приєднання поліпептиду RAGE до поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або частину СН2 домену імуноглобуліну. 26. Спосіб за п.25, який відрізняється тим, що білок злиття кодується рекомбінантною конструкцією ДНК. 27. Спосіб за п.25 або 26, який додатково включає стадію вбудовування конструкції ДНК у вектор експресії. 28. Спосіб за п.27, який додатково включає трансфекцію вектора експресії в хазяйську клітину. 29. Застосування білка злиття за будь-яким з пп.1-18 для одержання лікарського засобу для лікування RAGE-опосередкованого захворювання у суб’єкта. 30. Застосування за п.29, де лікарський засіб призначений для внутрішньовенного, внутрішньочеревинного або підшкірного введення білка злиття на основі RAGE суб’єкту. 31. Застосування за п.29 або 30, де лікарський засіб призначений для лікування симптому діабету або пізніх ускладнень діабету. 32. Застосування за п.31, де симптом діабету або пізніх ускладнень діабету включає діабетичну нефропатію, діабетичну ретинопатію, діабетичне покривання виразками стопи, серцево-судинне ускладнення або діабетичну нейропатію. 33. Застосування за п.29 або 30, де лікарський засіб призначений для застосування для лікування амілоїдозу, хвороби Альцгеймера, раку, запалення, асоційованого з аутоімунним процесом, запалення, асоційованого із запальним захворюванням кишечнику, запалення, асоційованого з ревматоїдним артритом, запалення, асоційованого з псоріазом, запалення, асоційованого з розсіяним склерозом, запалення, асоційованого з гіпоксією, запалення, асоційованого з інсультом, запалення, асоційованого з серцевим нападом, запалення, асоційованого з геморагічним шоком, запалення, асоційованого з сепсисом, запалення, асоційованого з трансплантацією органа, запалення, асоційованого з поганим загоєнням рани, або при лікуванні ниркової недостатності. 34. Клітина-хазяїн для продукування білка злиття за п.1, де клітина трансформована вектором експресії за п.22. 35. Клітина-хазяїн за п.34, де клітина-хазяїн являє собою клітину яєчника китайського хом'ячка. Перехресні посилання на споріднені заявки. Дана заявка встановлює пріоритет, відповідно до положення 35 USC 119(е), відносно поперед ньої заявки на патент США №60/598555, зареєстрованої 3 серпня 2004 року. Опис попередньої 5 заявки на патент США 60/598555 включений повністю в дану заявку у вигляді посилання. Даний винахід стосується регуляції рецептора високоглікозилованих кінцевих продуктів (RAGE). Більш конкретно, даний винахід стосується білків злиття, що включають поліпептид RAGE, способів одержання таких білків злиття і використання таких білків для лікування розладів, пов'язаних з RAGE. Інкубація білків або ліпідів з альдозними цукрами приводить до неензиматичного глікозилування і окислення аміногруп на білках з утворенням аддуктів Амадорі. З плином часу вказані аддукти зазнають додаткового перегрупування, дегідратації і зшиття з іншими білками з утворенням комплексів, відомих як високоглікозиловані кінцеві продукти (AGE). Фактори, які сприяють утворенню AGE, включають затримку білкового метаболізму (як, наприклад, у випадку амілоїдозів), накопичення макромолекул, що характеризуються високим вмістом лізину, і високі рівні глюкози в крові (як, наприклад, при діабеті) (Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761 (1995)). AGE залучаються до великого числа розладів, які включають ускладнення, асоційовані діабетом, а також нормальний процес старіння організму. AGE демонструють специфічне і насичувань зв'язування з рецепторами клітинної поверхні на моноцитах, макрофагах, ендотеліальних клітинах мікросудинної сітки, гладком'язових клітинах, мезангіальних клітинах і нейронах. Рецептор для високоглікозилованих кінцевих продуктів (RAGE) стосується сімейства молекул імуноглобулінового супергена. Позаклітинний (N-кінцевий) домен RAGE включає три ділянки імуноглобулінового типу: один домен V типу (варіабельний), за яким ідуть два домени С-типу (константні) (Neeper, et al., J. Biol. Chem, 267: 14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (Suppl). 96#194 (1997)). 3a позаклітинним доменом іде один трансмембранний домен і короткий високозаряджений цитозольний фрагмент. N-кінцевий позаклітинний домен може бути виділений шляхом протеолізу RAGE або з використанням стратегій молекулярної біології з одержанням розчинного RAGE (sRAGE), що включає V і С домени. RAGE експресується на клітинах різних типів, що включають лейкоцити, нейрони, клітини мікроглії і судинного ендотелію (Ногі et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761 (1995). Підвищені рівні RAGE також виявлені у старіючих тканинах (Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)) і в сітківці, судинній сітці і нирці у хворих діабетом (Schmidt et al., Nature Med., 1: 1002-1004 (1995)). Крім AGE, інші сполуки також можуть зв'язуватися і модулювати активність RAGE. RAGE зв'язується з лігандами, які характеризуються поліфункціональністю і наявністю структурних відмінностей, і включають амілоїд-бета (Αβ), сироватковий амілоїд A (SAA), кінцеві продукти з підвищеним рівнем глікозилування (AGE), S100, (прозапальний представник сімейства калгрануліну), карбоксиметиллізин (CML), афотерин і CD11b/CD 18 (Bucciarelli et al., Cell Моl. Life Sci., 59: 1117-128 (2002); Chavakis et al., Microbes Infect, 6: 1219-1225 93356 6 (2004); Kokkola et al., Scand. J. Immunol., 61, 1-9 (2005); Schmidt et al., J. Clin. Invest., 108: 949-955 (2001); Rocken et al. Am. J. Pathol., 162: 1213-1220 (2003)). Було показано, що зв'язування лігандів, таких як AGE, S100/калгранулін, β-амілоїд, CML (N-εкарбоксиметиллізин) і амфотерин, з RAGE модифікує експресію великого числа генів. Вказані види взаємодії можуть потім ініціювати механізми сигнальної трансдукції, включаючи активацію р38, p21ras, МАР-кіназ, фосфорилування Erk1-2 і активацію медіатора транскрипції запальних сигнальних молекул, NF-κΒ (Yeh et al., Diabetes, 50: 14951504 (2001)). Наприклад, у клітинах великого числа типів взаємодія між RAGE і його лігандами може викликати окислювальний стрес, який приводить до активації фактора транскрипції NF-kB, чутливого до вільних радикалів, і до активації генів, регульованих NF-κΒ, таких як цитокіни IL-1β і TNF-α. Крім того, експресія RAGE піддається позитивній регуляції через NF-κΒ, так що виявляється підвищений рівень експресії в сайтах запалення або при окислювальному стресі (Tanaka et al., J. Biol. Chem. 275: 25781-25790 (2000)). Таким чином, зв'язування ліганду ініціює петлю регуляції по типу позитивного зворотного зв'язку, яка може підтримувати наростаючу і часто несприятливу спіраль. Активація RAGE в різних тканинах і органах може приводити до великого числа патофізіологічних наслідків. RAGE залучається у множину станів, що включають гостре хронічне запалення (Hofmann et al., Cell. 97: 889-901 (1999)), розвиток пізніх ускладнень діабету, таких як підвищена проникність судин (Wautier et al., J. Clin. Invest., 97: 238-243 (1995)), нефропатія (Teillet et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11: 1488-1497 (2000)), атеросклероз (Vlassara et al., The Finish Medical Society DUODECIM, Ann. Med., 28: 419-426 (1996)) і ретинопатія (Hammes et al., Diabetologia, 42: 603-607 (1999)). RAGE також залучається в патогенез хвороби Альцгеймера (Yan et al., Nature, 382: 685-691 (1996)) і в інвазію і метастазування пухлини (Taguchi et al., Nature, 405: 354-357 (2000)). Незважаючи на масштабну експресію RAGE і його явну плейотропну роль, продемонстровану на багатьох різних моделях захворювань, видно, RAGE не є обов'язковим фактором у випадку нормального розвитку. Наприклад, миші з виключеним функціонуванням RAGE не демонструють аномального фенотипу, вказуючи на те, що хоча RAGE може грати певну роль в патології захворювання при хронічній стимуляції, інгібування RAGE, швидше усього, не позначається на якому-небудь небажаному гострому фенотипі (Liliensiek et al., J. Clin. Invest., 113: 1641-50(2004)). Антагоністичне зв'язування фізіологічних лігандів з RAGE може здійснювати негативну регуляцію патофізіологічних змін, що створюються надмірними концентраціями AGE та інших лігандів RAGE. За рахунок зниження рівня зв'язування ендогенних лігандів з RAGE можуть бути знижені симптоми, асоційовані з розладами, опосередкованими RAGE. Розчинний RAGE (sRAGE) здатний здійснювати ефективний антагоністичний вплив на зв'язування лігандів RAGE з RAGE. Однак, sRAGE 7 може, у випадку його введення in vivo, мати такий період напіввиведення, який буде дуже малий для терапевтичного застосування у випадку одного або декількох розладів. Таким чином, є потреба в розробці сполук, які б здійснювали антагоністичний ефект на зв'язування AGE та інших фізіологічних лігандів з рецептором RAGE, так щоб такі сполуки мали бажаний фармакокінетичний профіль. Варіанти здійснення даного винаходу включають білки злиття на основі RAGE і способи використання таких білків. Даний винахід може бути здійснений в рамках множини способів. Варіанти здійснення даного винаходу можуть включати білок злиття, що містить поліпептид RAGE, приєднаний до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE. В одному варіанті білок злиття включає сайт зв'язування ліганду RAGE. Білок злиття може також включати поліпептид RAGE, безпосередньо приєднаний до поліпептиду, що включає домен СН2 імуноглобуліну або частину домену СH2. Даний винахід також стосується способу одержання білка злиття на основі RAGE. В одному варіанті даний спосіб включає приєднання поліпептиду RAGE до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE. В одному варіанті поліпептид RAGE включає сайт зв'язування ліганду RAGE. Даний спосіб може також включати приєднання поліпептиду RAGE безпосередньо до поліпептиду, що включає домен СН2 імуноглобуліну або частину домену СН2. В іншому варіанті даний винахід може включати способи і композиції для лікування у суб'єкта розладу, опосередкованого RAGE. Даний спосіб може включати введення білка злиття за даним винаходом суб'єкту. Композиція може включати білок злиття на основі RAGE за даним винаходом у фармацевтично прийнятному носії. Можна відмітити різні переваги, асоційовані з конкретними варіантами здійснення даного винаходу. В одному варіанті білки злиття за даним винаходом можуть бути метаболічно стабільними при їх введенні суб'єкту. Крім того, білки злиття за даним винаходом можуть демонструвати високу афінність зі зв'язування з лігандами RAGE. У деяких варіантах білки злиття за даним винаходом зв'язуються з лігандами RAGE зі значеннями афінності, що укладаються в діапазон від високих наномолярних до низьких мікромолярних кількостей. У ситуації зв'язування з високою афінністю з фізіологічними лігандами RAGE білки злиття за даним винаходом можуть використовуватися для інгібування зв'язування ендогенних лігандів з RAGE, що може розглядатися як спосіб полегшення захворювань, опосередкованих RAGE. Крім того, білки злиття за даним винаходом можуть бути представлені у вигляді білка або нуклеїнової кислоти. В одному репрезентативному варіанті білок злиття може вводитися системно і залишатися в судинній сітці для ефективного лікування судинних захворювань, які частково опосередковані RAGE. В іншому репрезентативному варіанті білок злиття може вводитися місцево для лікування захворювань, патологія яких включає ліганди RAGE. Альтернативно, конструкція нуклеїнової кислоти, що кодує білок злиття, може бути 93356 8 доставлена у потрібний сайт шляхом використання відповідного носія, такого як вірус або «оголена» ДНК, де тимчасова місцева експресія може локально інгібувати взаємодію між лігандами RAGE і рецепторами. Таким чином, введення може бути тимчасовим (як, наприклад, у випадку введення білка злиття) або більш постійним за своєю природою (наприклад, у тому випадку, коли білок злиття вводять у вигляді рекомбінантної ДНК). Нижче описуються додаткові особливості здійснення даного винаходу. Потрібно розуміти, що даний винахід не обмежується деталями, наведеними в заявці, формулі винаходу і кресленнях. Даний винахід може бути здійснений у вигляді інших варіантів і може бути реалізований або виконаний різними способами. Різні особливості, аспекти і переваги даного винаходу будуть більш зрозумілими при розгляді їх в поєднанні з наведеними кресленнями. На Фіг.1 показані різні RAGE послідовності, що стосуються різних варіантів даного винаходу: Панель A: SEQ ID NO: 1, амінокислотна послідовність людського RAGE; і SEQ ID NO: 2, амінокислотна послідовність людського RAGE без сигнальної послідовності на ділянці амінокислот 1-22; Панель В: SEQ ID NO: 3, амінокислотна послідовність людського RAGE без сигнальної послідовності на ділянці амінокислот 1-23; Панель С: SEQ ID NO: 4, амінокислотна послідовність людського sRAGE; SEQ ID NO: 5, амінокислотна послідовність людського sRAGE без сигнальної послідовності на ділянці амінокислот 1-22 і SEQ ID NO: 6, амінокислотна послідовність людського sRAGE без сигнальної послідовності на ділянках амінокислот 1-23; Панель D: SEQ ID NO: 7, амінокислотна послідовність, що включає V-домен людського RAGE; SEQ ID NO: 8, альтернативна амінокислотна послідовність, що включає V-домен людського RAGE; SEQ ID NO: 9, N-кінцевий фрагмент V-домену людського RAGE; SEQ ID NO: 10, альтернативний Nкінцевий фрагмент V-домену людського RAGE; SEQ ID NO: 11, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 124-221 людського RAGE; SEQ ID NO: 12, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 227-317 людського RAGE; SEQ ID NO: 13, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 23-123 людського RAGE; Панель Е, SEQ ID NO: 14, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 24-123 людського RAGE; SEQ ID NO: 15, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 23-136 людського RAGE; SEQ ID NO: 16, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 24-136 людського RAGE; SEQ ID NO: 17, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 23-226 людського RAGE; SEQ ID NO: 18, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 24-226 людського RAGE; Панель F, SEQ ID NO: 19, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 23-251 людського RAGE; SEQ ID NO: 20, амінокислотна послідовність на ділянці амінокислот 24-251 людського RAGE; SEQ ID NO: 21, міждоменний лінкер RAGE; SEQ ID NO: 22, другий міждоменний лінкер RAGE; SEQ ID NO: 23, третій міждоменний лінкер 9 RAGE; SEQ ID NO: 24, четвертий міждоменний лінкер RAGE; Панель G, SEQ ID NO: 25, ДНК, що кодує амінокислотну послідовність на ділянці амінокислот 1-118 людського RAGE; SEQ ID NO: 26, ДНК, що кодує амінокислотну послідовність на ділянці амінокислот 1-123 людського RAGE; і SEQ ID NO: 27, ДНК, що кодує амінокислотну послідовність на ділянці амінокислот 1-136 людського RAGE; Панель Н, SEQ ID NO: 28, ДНК, що кодує амінокислотну послідовність на ділянці амінокислот 1-230 людського RAGE; і SEQ ID NO: 29, ДНК, що кодує амінокислотну послідовність на ділянці амінокислот 1-251 людського RAGE; Панель І, SEQ ID NO: 38, часткова амінокислотна послідовність СН2 і СН3 доменів людського IgG; SEQ ID NO: 39, ДНК, що кодує частину людських доменів СН2 і СН3 людського IgG; SEQ ID NO: 40, амінокислотна послідовність СН2 і СН3 доменів людського IgG; Панель J, SEQ ID NO: 41, ДНК, що кодує людські домени СН2 і СН3 людського IgG; SEQ ID NO: 42, амінокислотна послідовність СН2 домену людського IgG; SEQ ID NO: 43, амінокислотна послідовність СН3 домену людського IgG; і SEQ ID NO: 44, п'ятий міждоменний лінкер RAGE. На Фіг.2 показана послідовність ДНК (SEQ ID NO: 39) кодуючої ділянки білка злиття на основі RAGE (TTP-4000), відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. Кодуюча послідовність 1753, виділена жирним шрифтом, кодує N-кінцеву білкову послідовність RAGE, тоді як послідовність на ділянці 754-1386 кодує білкову послідовність людського IgG Fc (1). На Фіг.3 показана послідовність ДНК (SEQ ID NO: 31) кодуючої ділянки альтернативного білка злиття на основі RAGE (TTP-3000), відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. Кодуюча послідовність 1-408, виділена жирним шрифтом, кодує N-кінцеву білкову послідовність RAGE, тоді як послідовність 409-1041 кодує білкову послідовність людського IgG Fc (1). На Фіг.4 показані амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 32 (ТТР-4000), SEQ ID NO: 33 і SEQ ID NO: 34, кожна з яких кодує чотиридоменний білок злиття на основі RAGE, відповідно до альтернативних варіантів здійснення даного винаходу. Послідовність RAGE виділена жирним шрифтом. На Фіг.5 показані амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 35 (TTP-3000), SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 37, кожна з яких кодує тридоменний білок злиття на основі RAGE, відповідно до альтернативних варіантів здійснення даного винаходу. Послідовність RAGE виділена жирним шрифтом. На Фіг.6, панель А, наведене порівняння білкових доменів людського RAGE і людський IgG гамма-1 Fc білка, і точки розщеплення, що використовуються для одержання ТТР-3000 (в положенні 136) і ТТР-4000 (в положенні 251), відповідно до альтернативних варіантів здійснення даного винаходу; і на панелі В показана доменна структура ТТР-3000 і ТТР-4000, відповідно до альтернативних варіантів здійснення даного винаходу. На Фіг.7 показані результати тесту на зв'язування in vitro для sRAGE і білків злиття на основі RAGE, ТТР-4000 (ТТ4) і ТТР-3000 (ТТ3), з лігандами RAGE амілоїд-бета (Α-бета), S100b (S100), і 93356 10 амфотерином (Ampho), відповідно до альтернативних варіантів здійснення даного винаходу. На Фіг.8 показані результати тесту на зв'язування in vitro для білка злиття на основі RAGE ТТР-4000 (ТТ4) («білок») з амілоїдом-бета у порівнянні з негативним контролем, що включає тільки реагенти для імунологічного виявлення («тільки комплекс») і продемонстрований антагонізм такого приєднання під дією антагоніста RAGE («ліганд RAGE»), відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. На Фіг.9 показані результати тесту на зв'язування in vitro для білка злиття на основі RAGE ТТР-3000 (ТТ3) («білок») з амілоїдом-бета у порівнянні з негативним контролем, що включає тільки реагенти для імунологічного виявлення («тільки комплекс») і продемонстрований антагонізм такого приєднання під дією антагоніста RAGE («ліганд RAGE»), відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. На Фіг.10 показані результати клітинного тесту, що виконується для визначення рівня інгібування індукованої S100b-RAGE продукції TNF-α під дією білків злиття на основі RAGE ТТР-3000 (ТТ3) і ТТР-4000 (ТТ4), і sRAGE, відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. На Фіг.11 показаний фармакокінетичний профіль для білка злиття на основі RAGE ТТР-4000, відповідно до варіанта здійснення даного винаходу, де кожна з кривих стосується різних тварин в одних і тих же експериментальних умовах. На Фіг.12 показані відносні рівні вивільнення TNF-α з клітин ТНР-1 внаслідок стимуляції білком злиття на основі RAGE ТТР-4000 і стимуляції людським IgG, як заходу запальної відповіді, відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. Фіг.13 ілюструє використання білка злиття на основі RAGE ТТР-4000 для зниженні рестенозу у тварин з діабетом, відповідно до альтернативних варіантів здійснення даного винаходу, де на панелі А показано, що білок злиття на основі RAGE ТТР-4000 знижує співвідношення внутрішньої оболонки/середовища, у порівнянні з негативним контролем (IgG), і на панелі В показано, що білок злиття на основі RAGE ТТР-4000 знижує проліферацію гладком'язових клітин судин залежним від дози способом. Фіг.14 ілюструє використання білка злиття на основі RAGE ТТР-4000 для зниження утворення амілоїду і дисфункції пізнавального процесу у тварин з хворобою Альцгеймера (ХА), відповідно до альтернативних варіантів здійснення даного винаходу, де на панелі А показано, що білок злиття на основі RAGE ТТР-4000 знижує амілоїдне навантаження мозку, а на панелі В показано, що білок злиття на основі RAGE ТТР-4000 поліпшує пізнавальну функцію. На Фіг.15 наведені криві, що описують насичення зв'язування для ТТР-4000 з різними іммобілізованими відомими лігандами RAGE, відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. У контексті даного опису, якщо особливо не вказане інше, всі цифри, що належать до кількостей інгредієнтів, умов реакції і т.п.в тексті опису, потрібно розуміти як такі, що вказуються в поєд 11 нанні з терміном «приблизно». Відповідно, якщо з контексту не випливає протилежне, числові параметри, наведені далі в описі, є приблизними значеннями, які можуть варіювати, в залежності від бажаних властивостей, потрібних при здійсненні даного винаходу. У крайньому випадку, але не з метою обмеження застосування принципу еквівалентів застосовно до даного винаходу, кожний числовий параметр можна розглядати як число, відповідне значущим цифрам із застосуванням звичайної методики округлення. Незважаючи на те, що числові діапазони і параметри, наведені в загальному описі винаходу, дані в деякому наближенні, числові значення, наведені у конкретних прикладах, дані настільки точно, наскільки це можливо. Однак, кожне числове значення може містити в собі деяку помилку, виникаючу як результат стандартного відхилення, властивого відповідним методикам вимірювання. Більше того, всі вказані діапазони потрібно розуміти, як такі, що охоплюють будь-які і всі піддіапазони, що входять в них. Наприклад, діапазон, вказаний як «від 1 до 10», потрібно розглядати як такий, що включає будь-які і всі піддіапазони між наведеними значеннями (і включаючи їх) від мінімального значення, яке дорівнює 1, до максимального значення, яке дорівнює 10, що означає, що всі піддіапазони, які починаються від мінімального значення 1 або більше, наприклад від 1 до 6,1 і які закінчуються максимальним значенням 10 або менше, наприклад 5,5-10, входять в нього. Додатково, будь-які посилання, які позначаються як «включені в даний контекст» потрібно розуміти як включені повністю. Потрібно також зазначити, що в контексті даного опису єдині форми визначень включають їх множинне значення, якщо явно не випливає іншого. Термін «або» використовується взаємозамінно з терміном «і/або», якщо з контексту явно не випливає інше. Крім того, терміни «частина» і «фрагмент», що використовуються взаємозамінно, належать до частин поліпептиду, нуклеїнової кислоти та інших молекулярних конструкцій. У контексті даного опису термін «проти напряму зчитування» стосується залишку, який є Nкінцевим відносно другого залишку, в тому випадку, якщо молекула є білком, або знаходиться в 5' положенні відносно другого залишку, якщо молекула являє собою нуклеїнову кислоту. Крім того, в контексті даного опису термін «в напрямі зчитування» стосується залишку, який є С-кінцевим відносно другого залишку, якщо молекула є білком, або знаходиться в 3' положенні відносно другого залишку, якщо молекула являє собою нуклеїнову кислоту. Якщо не вказане інше, всі технічні і наукові терміни, використані в описі, мають значення, загальноприйняті в даній галузі. Практикуючим фахівцям може бути рекомендоване відоме керівництво (Current Protocols in Molecular Biology (Ansubel)), в якому описані визначення і терміни, що використовуються в даній галузі. Абревіатури амінокислотних залишків представлені стандартними трибуквеними і/або однобуквеними кодами, що 93356 12 використовуються в даній галузі для позначення однієї з 20 звичайних L-амінокислот. Термін «нуклеїнова кислота» являє собою полінуклеотид, такий як дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) або рибонуклеїнова кислота (РНК). Термін використовується для позначення одноланцюгових нуклеїнових кислот, дволанцюгових нуклеїнових кислот, і РНК і ДНК, одержаних з нуклеотидних або нуклеозидних аналогів. Термін «вектор» стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка може використовуватися для транспортування другої молекули нуклеїнової кислоти в клітину. В одному варіанті здійснення даного винаходу такий вектор дозволяє здійснювати реплікацію послідовностей ДНК, введених у вектор. Вектор може включати промотор для підвищення експресії молекули нуклеїнової кислоти щонайменше в деяких хазяйських клітинах. Вектори можуть реплікуватися автономно (позахромосомно) або можуть бути інтегровані в хромосому хазяйської клітини. В одному варіанті здійснення даного винаходу вектор може включати вектор експресії, здатний продукувати білок, одержаний щонайменше з частини послідовності нуклеїнової кислоти, вбудованої у вектор. Як відомо в даній галузі, умови гібридизації послідовностей нуклеїнових кислот одна з одною можуть бути описані в термінах, що варіюють від низької до високої суворості. В основному, високо суворі умові гібридизації стосуються промивання гібридів в низькосольовому буфері при високих температурах. Гібридизація може включати фільтрування зв'язаної ДНК з використанням розчинів для гібридизації, стандартних для даної галузі, таких як розчини, що включають 0,5Μ NaHPO4, 7% додецилсульфат натрію (ДСН), при температурі 65°С, промивання в 0,25Μ NaHPO4, що містить 3,5% ДСН, з подальшим промиванням в 0,1×SSC/0,1 ДСН при температурі, що варіює від кімнатної температури до 68°С, в залежності від довжини зондів (див., наприклад, Ausubel, F. Μ. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed., Chapter 2, John Wiley&Sons, N.Y.). Наприклад, умови високої суворості промивання включають промивання в 6×SSC/0,05% пірофосфату натрію при температурі 37°С у випадку олігонуклеотидного зонда з 14 основами або при температурі 48°С у випадку олігонуклеотидного зонда з 17 основами, або при температурі 55°С у випадку олігонуклеотидного зонда з 20 основами, або при температурі 60°С у випадку олігонуклеотидного зонда з 25 основами, або при температурі 65°С у випадку олігонуклеотидного зонда, що включає приблизно 250 нуклеотидів в довжину. Зонди нуклеїнової кислоти можуть бути мічені радіонуклідами, що складають кінцеву мітку, наприклад, [-32Ρ]ΑΤΡ, або за рахунок включення радіоактивно мічених нуклеотидів, таких як [α-32P]dCTP, введених шляхом випадкового мічення з використанням праймерів. Альтернативно, зонди можуть бути мічені шляхом включення біотинільованих або мічених флуоресцеїном нуклеотидів, де виявлення зондів проводять з використанням стрептавідину або антитіл проти флуоресцеїну. 13 В контексті даного опису термін «малі органічні молекули» стосується молекул з молекулярною вагою менше, ніж 2000 дальтон, які містять щонайменше один атом вуглецю. Терміни «поліпептид» і «білок» використовуються взаємозамінно в тексті даного опису для позначення молекул білка, які можуть включати або часткові білки, або білки повної довжини. Термін «білок злиття» стосується білка або поліпептиду, який має амінокислотну послідовність, одержану з двох або більше білків. Білок злиття може також включати сполучні ділянки амінокислот між амінокислотними частинами, одержаними з окремих білків. В контексті даного опису термін «поліпептид, який відрізняється від RAGE» являє собою будьякий поліпептид, який був одержаний не з RAGE або його фрагмента. Такі поліпептиди, які відрізняються від RAGE, включають імуноглобулінові пептиди, димеризовані поліпептиди, пептиди, які стабілізуються, амфіфільні пептиди або поліпептиди, які включають амінокислотні послідовності, які забезпечують наявність відповідних «міток» для цільової доставки білка або його очищення. В контексті даного опису термін «імуноглобулінові пептиди» може включати важкий ланцюг імуноглобуліну або його частину. В одному варіанті здійснення даного винаходу частина важкого ланцюга може являти собою Fc фрагмент або його частину. В контексті даного опису Fc фрагмент включає шарнірну ділянку важкого ланцюга поліпептиду, а також СН2 і СН3 домени важкого ланцюга імуноглобуліну, в мономерній або димерній формі. В іншому випадку СH1 і Fc фрагмент можуть використовуватися у вигляді імуноглобулінового поліпептиду. Важкий ланцюг (або його частина) може бути одержаний з важкого ланцюга будьякого відомого ізотипу: IgG (), IgM (μ), IgD (), IgE (ε) або IgA (α). Додатково, важкий ланцюг (або його частина) може бути одержаний з важкого ланцюга будь-якого відомого підтипу: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4), IgAl (α1), IgA2 (α2) або на основі мутантів даних ізотипів або підтипів, які містять мутації, що змінюють їх біологічну активність. Прикладом такої біологічної активності, яка може бути змінена, є зниження здатності ізотипу зв'язуватися з деякими рецепторами Fc, наприклад, за рахунок модифікації шарнірної ділянки. Терміни «ідентичність» або «процент ідентичності» стосуються ідентичності на рівні послідовності, що є між двома амінокислотними послідовностями або між двома послідовностями нуклеїнової кислоти. Процент ідентичності може бути визначений шляхом вирівнювання послідовностей і стосується числа ідентичних залишків (наприклад, амінокислот або нуклеотидів) в положеннях, спільних для послідовностей, що порівнюються. Вирівнювання послідовностей і їх порівняння може бути проведене за допомогою відомих для цього алгоритмів (див., наприклад, Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482: Needleman and Wunsch, 1970, J. Моl. Biol. 48: 443; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444) або при використанні комп'ютерних версій вказаних алгоритмів (пакеті прикладних програм 93356 14 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), які широко доступні у вигляді програм BLAST і FASTA. Крім того, для порівняння послідовностей може використовуватися програма ENTREZ, доступна від National Institutes of Health, Bethesda MD. В одному варіанті здійснення даного винаходу процент ідентичності двох послідовностей може бути визначений при використанні GCC з ваговим значенням гепу (пропуску), що дорівнює 1, так що кожному амінокислотному гепу надається вагове значення, відповідне помилці в одній амінокислоті між двома послідовностями. В контексті даного опису термін «консервативні залишки» стосується амінокислот, які є однаковими серед множини білків, що мають одну і ту ж структуру і/або функцію. Ділянка консервативних залишків, можливо, має значення для опису структури або функції білка. Так, консервативні залишки, які стикаються, що ідентифікуються в тримірному білку, можуть бути важливі для опису структури або функції білка. Для виявлення консервативних залишків або консервативних ділянок тримірної структури можна провести порівняння послідовностей однакових або схожих білків з різних видів або у індивідуумів одного і того ж виду. В контексті даного опису термін «гомолог» означає поліпептид, що має певну міру гомології з амінокислотною послідовністю дикого типу. Порівняння гомології може бути проведене приблизно або частіше за все за допомогою легко доступних програм порівняння послідовностей. Такі комерційно доступні комп'ютерні програми дозволяють обчислити процент гомології між двома або більше послідовностями (див., наприклад, Wilbur, W. J. and Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 726-730). Наприклад, можуть бути взяті гомологічні послідовності, що включають такі амінокислотні послідовності, які в альтернативних варіантах щонайменше на 75% ідентичні, на 85% ідентичні, на 90% ідентичні, на 95% ідентичні або на 98% ідентичні одна одній. В контексті даного опису поліпептидний або білковий «домен» включають ділянку поліпептиду або білка, яка включає незалежну одиницю. Домен може бути визначений з точки зору структури послідовності і/або біологічної активності. В одному варіанті здійснення даного винаходу поліпептидний домен може включати ділянку білка, яка складається в просторову структуру таким чином, що по суті не залежить від іншої частини білка. Домени можуть бути ідентифіковані з використанням баз даних доменів, таких як, без обмеження, PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT і PROCLASS. В контексті даного опису термін «імуноглобуліновий домен» означає амінокислотну послідовність, яка характеризується структурною гомологією або ідентичністю до домену імуноглобуліну. Довжина послідовності амінокислот в імуноглобуліновому домені може бути будь-якого розміру. В одному варіанті здійснення даного винаходу імуноглобуліновий домен може включати менше, ніж 250 амінокислот в довжину. В одному репрезентативному варіанті здійснення даного винаходу іму 15 ноглобуліновий домен може складати приблизно 80-150 амінокислот в довжину. Наприклад, варіабельний домен і ділянки СН1, СН2 і СН3 в IgG, кожний, являє собою імуноглобуліновий домен. В іншому варіанті здійснення даного винаходу варіабельні ділянки СН1, СН2, СН3 і СН4 в IgM, кожна, являє собою імуноглобуліновий домен. В контексті даного опису «імуноглобуліновий домен RAGE» являє собою послідовність амінокислот білка в RAGE, яка характеризується структурною гомологією або ідентичністю до домену імуноглобуліну. Наприклад, домен імуноглобуліну RAGE може включати V-домен RAGE, домен RAGE Ig-подібного С2 типу 1 («С1 домен») або домен RAGE Ig-подібного С2 типу 2 («С2 домен»). В контексті даного опису термін «міждоменний лінкер» означає поліпептид, який з'єднує разом два домени. Fc шарнірна ділянка являє собою приклад міждоменного лінкера в IgG. В контексті даного опису термін «безпосередньо з'єднаний» ідентифікує ковалентний зв'язок між двома різними групами (наприклад, між послідовностями нуклеїнових кислот, поліпептидів, поліпептидними доменами), які не містять якихнебудь вбудованих атомів між двома групами, що з'єднуються. В контексті даного опису термін «лігандзв'язувальний домен» стосується домену білка, відповідального за зв'язування ліганду. Вказаний термін «лігандзв'язувальний домен» включає гомологи зв'язувального домену ліганду або його частини. У цьому контексті можуть бути зроблені обережні заміщення амінокислот в зв'язувальному сайті ліганду з урахуванням схожості по полярності, заряду, розчинності, гідрофобності або гідрофільності залишків з тим, щоб зберегти специфічність зі зв'язування домену, відповідального за зв'язування ліганду. В контексті даного опису термін «сайт зв'язування ліганду» включає залишки в білку, які безпосередньо взаємодіють з лігандом, або залишки, що залучаються до здійснення такої локалізації ліганду, щоб він залишався в тісній близькості до тих залишків, які безпосередньо взаємодіють з лігандом. Взаємодія залишків в сайті зв'язування ліганду може бути визначена по просторовій близькості залишків до ліганду на прикладі моделі або в самій структурі. Термін «сайт зв'язування ліганду» включає гомологи сайта зв'язування ліганду або його частини. У зв'язку з цим, можуть бути зроблені обережні заміщення амінокислот в сайті зв'язування ліганду з урахуванням схожості по полярності, заряду, розчинності, гідрофобності або гідрофільності залишків з тим, щоб зберегти специфічність сайта зі зв'язування з лігандом. Сайт зв'язування ліганду може знаходитися в одному або декількох зв'язувальних доменах білка або поліпептиду. В контексті даного опису термін «взаємодіє» стосується станів, що передбачають безпосередню близькість між лігандом або сполукою, або їх частинами або фрагментами, і частиною другої цікавлячої молекули. Взаємодія може бути нековалентною, що наприклад здійснюється внаслідок дії водневих зв'язків, взаємодією під дією сил Ван 93356 16 дер Вальса або може являти собою електростатичну або гідрофобну взаємодію, або вона може бути ковалентною. В контексті даного опису термін «ліганд» стосується молекули або сполуки або іншої структури, яка взаємодіє з сайтом зв'язування ліганду, включаючи субстрати або аналоги, або їх частини. В контексті даного опису термін «ліганд» може стосуватися сполук, які зв'язуються з цікавлячим білком. Ліганд може являти собою агоніст, антагоніст або модулятор. Або вказаний ліганд може давати біологічний ефект. Або вказаний ліганд може блокувати зв'язування інших лігандів і тим самим інгібувати біологічний ефект. Ліганди можуть включати, без обмеження, малі молекули інгібіторів. Вказані малі молекули можуть включати пептиди, пептидоміметики, органічні сполуки і т.п.Ліганди можуть також включати поліпептиди і/або білки. В контексті даного опису термін «сполукамодулятор» стосується молекули, яка змінює або модифікує біологічну активність цікавлячої молекули. Сполука-модулятор може підвищувати або знижувати активність або змінювати фізичні або хімічні характеристики, а також функціональні або імунологічний властивості цікавлячої молекули. У випадку RAGE сполука-модулятор може підвищувати або знижувати активність або змінювати характеристики або функціональні або імунологічні властивості RAGE або його частини. Сполукамодулятор може включати природні і/або хімічно синтезовані або штучні пептиди, модифіковані пептиди (наприклад, фосфопептиди), антитіла, вуглеводи, моносахариди, олігосахариди, полісахариди, гліколіпіди, гетероциклічні сполуки, нуклеозиди або нуклеотиди або їх частини, а також малі органічні або неорганічні молекули. Сполукамодулятор може являти собою ендогенну фізіологічну сполуку або може бути природною синтетичною сполукою. Або сполука-модулятор може являти собою малу органічну молекулу. Термін «сполука-модулятор» також включає хімічно модифікований ліганд або хімічно модифіковану сполуку, і включає їх ізомерні і рацемічні форми. Термін «агоніст» включає сполуку, яка зв'язується з рецептором з утворенням комплексу, який демонструє фармакологічну відповідь, специфічну для рецептора, що залучається. Термін «антагоніст» включає сполуку, яка зв'язується з агоністом або з рецептором з утворенням комплексу, який не демонструє істотної фармакологічної відповіді і може інгібувати біологічну відповідь, індуковану агоністом. Відповідно, агоністи RAGE можуть зв'язуватися з RAGE і стимулювати RAGE-опосередковані клітинні процеси, а антагоністи RAGE можуть інгібувати опосередковані RAGE процеси, що стимулюються агоністом RAGE. Наприклад, в одному варіанті здійснення винаходу клітинний процес, що стимулюється агоністами RAGE, включає активацію транскрипції гена TNF-α. Термін «пептидні міметики» стосується структур, які служать як замісники пептидів в процесах взаємодії між молекулами (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24: 243-252). Пептидні міметики можуть включати синтетичні структури, 17 які можуть містити амінокислотні і/або пептидні зв'язки і можуть їх не містити, але які зберігають структурні і функціональні особливості пептиду, агоніста або антагоніста. Пептидні міметики також включать пептоїди, олігопептоїди (Simon et al., 1972, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 89: 9367) і пептидні бібліотеки, що містять пептиди заданої довжини, які відображають всі можливі послідовності амінокислот, відповідні пептиду, агоніста або антагоніста згідно з даним винаходом. Термін «лікування» стосується ослаблення симптому захворювання або розладу і може включати виліковування розладу, по суті запобігання настанню розвитку розладу або поліпшення стану суб'єкта. Термін «терапія» в контексті даного опису стосується повного спектра терапевтичних методів, що застосовуються у випадку того розладу, на який страждає пацієнт, включаючи полегшення одного симптому або більшої частини симптомів, що визначаються даним розладом, вилікування конкретного розладу або запобігання розвитку розладу. В контексті даного опису термін «ЕС50» визначається як концентрація агента, яка відповідає 50% від рівня біологічного ефекту, що вимірюється. Наприклад, ЕС50 терапевтичного агента, що надає помітний біологічний ефект, може включати величину, при якій даний агент демонструє 50% рівень вказаного біологічного ефекту. В контексті даного опису термін «ІС50» визначається як концентрація агента, яка приводить до 50% інгібування ефекту, що вимірюються. Наприклад, ІС50 антагоніста зв'язування RAGE може включати значення, при якому антагоніст знижує зв'язування ліганду з сайтом зв'язування ліганду RAGE на 50%. В контексті даного опису термін «ефективна кількість» означає кількість агента, яка є ефективною для вияву бажаного ефекту у суб'єкта. Термін «терапевтично ефективна кількість» означає кількість лікарського засобу або фармацевтичного агента, яка демонструє терапевтичну відповідь у тварини або людини, для якої бажана така відповідь. Фактична доза, яка включає ефективну кількість, може залежати від способу введення, розміру суб'єкта і стану його здоров'я, від природи розладу, що підлягає лікуванню, і т.п. Термін «фармацевтично прийнятний носій» в контексті даного винаходу може стосуватися сполук і композицій, які прийнятні для використання у людини або тварини, наприклад, може стосуватися терапевтичних композицій, що вводяться з метою лікування розладу або захворювання, опосередкованого RAGE. Термін «фармацевтична композиція» в контексті даного опису означає композицію, яка може вводитися в організм хазяїна-ссавця, наприклад, перорально, парентерально, місцево, шляхом інгаляції, інтраназально, ректально, у стандартних дозованих формах, включаючи звичайні нетоксичні носії, розріджувачі, ад'юванти, наповнювачі і т.п. Термін «парентеральний» в контексті даного опису включає підшкірні ін'єкції, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньогруднинну ін'єкцію або методику інфузії. 93356 18 Білки злиття на основі RAGE Варіанти здійснення даного винаходу включають білки злиття на основі RAGE, способи одержання таких білків злиття і способи використання таких білків злиття. Даний винахід може здійснюватись множиною способів. Так, наприклад, варіанти даного винаходу стосуються білків злиття, що включають поліпептид RAGE, приєднаний до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE. В одному варіанті білки злиття можуть включати сайт зв'язування ліганду RAGE. У цьому варіанті здійснення винаходу сайт зв'язування ліганду включає більшу частину Nкінцевого домену білка злиття. Сайт зв'язування ліганду RAGE може включати V домен RAGE або його частину. У цьому варіанті сайт зв'язування ліганду RAGE включає SEQ ID NO: 9 або послідовність, на 90% їй ідентичну, або SEQ ID NO: 10 або послідовність, на 90% їй ідентичну. В одному варіанті поліпептид RAGE може бути приєднаний до поліпептиду, що включає імуноглобуліновий домен або частину (наприклад, фрагмент) імуноглобулінового домену. В одному варіанті поліпептид, що включає імуноглобуліновий домен, включає щонайменше частину одного з СН2 або СН3 доменів людського IgG. Білок або поліпептид RAGE може включати людський білок RAGE повної довжини (наприклад, SEQ ID NO: 1) або фрагмент людського RAGE. В контексті даного опису фрагмент поліпептиду RAGE складає щонайменше 5 амінокислот в довжину, може включати більше 30 амінокислот в довжину, але має довжину менше, ніж повна амінокислотна послідовність. В альтернативних варіантах поліпептид RAGE може включати послідовність, яка на 70% або на 80%, або на 85%, або на 90% ідентична людському RAGE або його фрагменту. Наприклад, в одному варіанті поліпептид RAGE може включати людський RAGE або його фрагмент, при цьому, швидше, першим залишком буде гліцин, а не метіонін (див., наприклад, Neeper et al., (1992)). Або в іншому варіанті людський RAGE може включати RAGE повної довжини з видаленою сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 3) (Фіг.1Α і 1В) або частину вказаної амінокислотної послідовності. Білки злиття згідно з даним винаходом можуть також включати sRAGE (наприклад, SEQ ID NO: 4), поліпептид, який на 90% ідентичний sRAGE, або фрагмент sRAGE. В контексті даного опису sRAGE або білок RAGE не включає трансмембранну ділянку або цитоплазматичний «хвостовий» фрагмент (Park et al., Nature Med., 4: 1025-1031 (1998)). Так, наприклад, поліпептид RAGE може включати людський sRAGE або його фрагмент, при цьому в першому положенні буде знаходитися, швидше, гліцин, а не метіонін (див., наприклад, Neeper et al., (1992)). Або поліпептид RAGE може включати людський sRAGE з видаленою сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO: 5 або SEQ ID NO: 6) (Фіг.1С) або частину вказаної амінокислотної послідовності. В інших варіантах білок RAGE може включати V домен RAGE (наприклад, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8, Фіг.1D) (Neeper et al., (1992); Schmidt et 19 al., (1997)). Або може бути використана послідовність, яка на 90% ідентична V домену RAGE або його фрагменту. Або, в іншому варіанті, білок RAGE може включати V домен RAGE (наприклад, SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10, Фіг.1D). В одному варіанті білок RAGE може включати сайт зв'язування ліганду. У цьому варіанті сайт зв'язування ліганду може включати SEQ ID NO: 9 або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або SEQ ID NO: 10 або послідовність, яка на 90% ідентична їй. У ще одному варіанті фрагмент RAGE являє собою синтетичний пептид. Таким чином, поліпептид RAGE, що використовується в білках злиття згідно з даним винаходом, може включати фрагмент RAGE повної довжини. Як відомо в даній галузі, RAGE включає тридоменний поліпептид імуноглобулінового типу, в який входять V домен і С1 і С2 домени, кожний з яких з'єднаний з іншим за допомогою міждоменного лінкера. RAGE повної довжини також включає трансмембранний поліпептид і цитоплазматичний хвостовий фрагмент в напрямі зчитування інформації (С-кінцевий) С2 домену і приєднаний до С2 домену. В одному варіанті поліпептид RAGE не включає які-небудь залишки сигнальної послідовності. Сигнальна послідовність RAGE може включати або залишки 1-22, або залишки 1-23 з RAGE повної довжини. Наприклад, поліпептид RAGE може включати амінокислоти 23-116 з людського RAGE (SEQ ID NO: 7) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, амінокислоти 24-116 з людського RAGE (SEQ ID NO: 8) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідній V домену RAGE. Або, в іншому варіанті, поліпептид RAGE може включати амінокислоти 124-221 з людського RAGE (SEQ ID NO: 11) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну С1 домену RAGE. В іншому варіанті поліпептид RAGE може включати амінокислоти 227-317 з людського RAGE (SEQ ID NO: 12) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, відповідну С2 домену RAGE. Або, в іншому варіанті, поліпептид RAGE може включати амінокислоти 23-123 з людського RAGE (SEQ ID NO: 13) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, або амінокислоти 24-123 з людського RAGE (SEQ ID NO: 14) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену RAGE і міждоменному лінкеру в напрямі зчитування інформації. Або, в іншому варіанті, поліпептид RAGE може включати амінокислоти 23226 з людського RAGE (SEQ ID NO: 17) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, або амінокислоти 24-226 з людського RAGE (SEQ ID NO: 18) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену, С1 домену і міждоменному лінкеру, що з'єднує вказані два домени. Або, в іншому варіанті, поліпептид RAGE може включати амінокислоти 23339 з людського RAGE (SEQ ID NO: 5) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, або залишки 24339 з людського RAGE (SEQ ID NO: 6) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, відповідну sRAGE (тобто, яка кодує V, С1 і С2 домени і міждоменні лінкери). Або, в іншому варіанті, можуть 93356 20 використовуватися фрагменти кожної з вказаних послідовностей. Білок злиття може включати декілька типів пептидів, які не були одержані з RAGE або його фрагмента. Другий поліпептид з білка злиття може включати поліпептид, одержаний з імуноглобуліну. В одному варіанті імуноглобуліновий поліпептид може включати важкий ланцюг імуноглобуліну або його частину (тобто, фрагмент). Наприклад, фрагмент важкого ланцюга може включати поліпептид, одержаний з Fc фрагмента імуноглобуліну, де фрагмент Fc включає шарнірну ділянку важкого ланцюга поліпептиду і СН2 і СН3 домени важкого ланцюга імуноглобуліну як мономер. Важкий ланцюг (або його частина) може бути одержаний з важкого ланцюга будь-якого відомого ізотипу: IgG (), IgM (μ), IgD (), IgE (ε) або IgA (α). Додатково, важкий ланцюг (або його частина) може бути одержаний з будь-якого відомого підтипу важкого ланцюга: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4), IgA1 (α1), IgA2 (α2) або на основі мутантів даних ізотипів або підтипів, які містять мутації, що змінюють їх біологічну активність. Другий поліпептид може включати домени СH2 і СН3 людського IgG1 або будь-яку частину, або обидва вказані домени. Як репрезентативні варіанти можна вказати поліпептид, що включає домени СН2 і СН3 з людського IgG1 або його частину, який можуть включати SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 40. Fc частина ланцюга імуноглобуліну може мати прозапальну дією in vivo. Так, в одному варіанті білок злиття на основі RAGE згідно з даним винаходом включає міждоменний лінкер, одержаний з RAGE, але не з шарнірної ділянки міждоменного поліпептиду, одержаного з імуноглобуліну. Таким чином, в одному варіанті білок злиття на основі RAGE може також включати поліпептид RAGE, безпосередньо приєднаний до поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або фрагмент або частину СН2 домену імуноглобуліну. В одному варіанті СН2 домен або його фрагмент може включати SEQ ID NO: 42. В одному варіанті поліпептид RAGE може включати сайт зв'язування ліганду. Сайт зв'язування ліганду RAGE може включати V домен RAGE або його частину. В одному варіанті сайт зв'язування ліганду RAGE включає SEQ ID NO: 9 або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або SEQ ID NO: 10 або послідовність, яка на 90 % ній ідентична. Поліпептид RAGE, що використовується в білках злиття згідно з даним винаходом, може включати імуноглобуліновий домен RAGE. Додатково або альтернативно, фрагмент RAGE може включати міждоменний лінкер. Або в іншому варіанті поліпептид RAGE може включати імуноглобуліновий домен RAGE, приєднаний проти напряму зчитування інформації (тобто, ближче до N-кінця) або в напрямі зчитування інформації (тобто, ближче до С-кінця) міждоменного лінкера. У ще одному варіанті поліпептид RAGE може включати два (або більше) імуноглобулінових домени RAGE, які з'єднуються один з одним за допомогою міждоменного лінкера. Поліпептид RAGE може також включати RAGE з множиною імуноглобулінових доменів, які з'єднані один з одним за допомогою одного або 21 декількох міждоменних лінкерів і містять кінцевий міждоменний лінкер, приєднаний до N-кінцевого імуноглобулінового домену RAGE і/або до Скінцевого домену імуноглобуліну. Додаткові поєднання імуноглобулінових доменів RAGE і міждоменних лінкерів також входять в галузь даного винаходу. В одному варіанті поліпептид RAGE включає міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, так що С-кінцева амінокислота імуноглобулінового домену RAGE приєднана до N-кінцевої амінокислоти міждоменного лінкера і С-кінцева амінокислота міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до Nкінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або його фрагмент. Поліпептид, який включає СН2 домен імуноглобуліну може включати СН2 і СН3 домени людського IgG1 або будь-яку їх частину, або обидва вказані домени. Як зразковий варіант можна указати поліпептид, що включає СН2 і СН3 домени або їх частину з людського IgG1, який може включати SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 40. Як було указано вище, білок злиття згідно з даним винаходом, може включати один або множину доменів з RAGE. Крім того, поліпептид RAGE, що включає міждоменний лінкер, приєднаний до поліпептидному домену RAGE, може включати фрагмент білка RAGE повної довжини. Наприклад, поліпептид RAGE може включати амінокислоти 23-136 з людського RAGE (SEQ ID NO: 15) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, або амінокислоти 24-136 з людського RAGE (SEQ ID NO: 16) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, відповідну V домену RAGE і міждоменному лінкеру у напрямі зчитування інформації. Або, в іншому варіанті, поліпептид RAGE може включати амінокислоти 23-251 з людського RAGE (SEQ ID NO: 19) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, або амінокислоти 24-251 з людського RAGE (SEQ ID NO: 20) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, відповідну V домену, С1 домену, міждоменному лінкеру, що з'єднує два домени, і другому міждоменному лінкеру у напрямі зчитування С1. Наприклад, в одному варіанті білок злиття може включати два імуноглобулінових домени, одержаних з білка RAGE, і два імуноглобулінових домени, одержаних з Fc поліпептиду людини. Білок злиття може включати перший імуноглобуліновий домен RAGE і перший міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до другого імуноглобулінового домену RAGE і другого міждоменного лінкера RAGE, так що N-кінцева амінокислота першого міждоменного лінкера приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого імуноглобуліновового домену RAGE, Nкінцева амінокислота другого імуноглобулінового домену RAGE приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого міждоменного лінкера, Nамінокислота другого міждоменного лінкера приєднана до С-кінцевої амінокислоти другого імуноглобулінового домену RAGE і С-кінцева амінокислота другого міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти СH2 домену імуноглобуліну. В одному варіан 93356 22 ті чотиридоменний білок злиття на основі RAGE може включати SEQ ID NO:32. В альтернативних варіантах чотири домени білка злиття на основі RAGE включають SEQ ID NO:33 або SEQ ID NO:34. Альтернативно, тридоменний білок злиття може включати один імуноглобуліновий домен, одержаний з RAGE і два імуноглобулінових домени, одержаних з Fc поліпептиду людини. Наприклад, білок злиття може включати один імуноглобуліновий домен RAGE, приєднаний через міждоменний лінкер RAGE до N-кінцевої амінокислоти СН2 домену імуноглобуліну або частини СН2 домену імуноглобуліну. В одному варіанті тридоменний білок злиття на основі RAGE може включати SEQ ID NO:35. В альтернативних варіантах тридоменний білок злиття на основі RAGE може включати SEQ ID NO:36 або SEQ ID NO:37. Фрагмент міждоменного лінкера RAGE може включати пептидну послідовність, яка відповідає зчитуванню в напрямі транскрипції в природному стані, і таким чином, приєднується до імуноглобулінового домену RAGE. Наприклад, у випадку V домену RAGE міждоменний лінкер може включати амінокислотні послідовності, які зчитуються у природному стані у напрямі транскрипції V домену. В одному варіанті лінкер може включати SEQ ID NO:21, відповідну ділянці амінокислот 117-123 RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, лінкер може включати пептид, що містить додаткові частини природної послідовності RAGE. Наприклад, може використовуватися міждоменний лінкер, що включає декілька амінокислот (наприклад, 1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот) проти напряму або в напрямі зчитування інформації з SEQ ID NO:32. Таким чином, в одному варіанті міждоменний лінкер включає SEQ ID NO: 23, який включає амінокислоти на ділянці 117-136 з RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, можуть використовуватися фрагменти SEQ ID NO: 21, які містять делецію, наприклад, з 1, 2 або 3 амінокислот з будь-якого кінця лінкера. В альтернативних варіантах лінкер може включати послідовність, яка на 70% ідентична або на 80% ідентична, або на 90% ідентична SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO:23. У випадку С1 домену RAGE лінкер може включати пептидну послідовність, яка зчитується у природному варіанті у напрямі транскрипції С1 домену. У цьому варіанті лінкер може включати SEQ ID NO: 22, відповідну амінокислотам на ділянці 222251 RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, лінкер може включати пептид, який містить додаткові частини природної послідовності RAGE. Наприклад, може використовуватися лінкер, що включає декілька амінокислот (1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот) проти напряму зчитування або в напрями зчитування інформації з SEQ ID NO: 22. Або в іншому варіанті можуть використовуватися фрагменти SEQ ID NO: 22, які містять делецію, наприклад, з 1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот з будь-якого кінця лінкера. Наприклад, в одному варіанті міждоменний лінкер RAGE може включати SEQ ID NO: 24, відповідну амінокислотам на ділянці 222-226. Або, в іншому варіанті, міждоменний лінкер може включати SEQ ID NO: 23 44, відповідний амінокислотам на ділянці 318-342 з RAGE. Способи одержання білків злиття на основі RAGE Даний винахід також стосується способу одержання білка злиття на основі RAGE. Так, в одному варіанті даний винахід стосується способу одержання білка злиття на основі RAGE, що включає стадію ковалентного приєднання поліпептиду RAGE, приєднаного до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE, де поліпептид RAGE включає сайт зв'язування ліганду RAGE. Наприклад, приєднаний поліпептид RAGE і другий поліпептид, який відрізняється від RAGE, можуть кодуватися рекомбінантною конструкцією ДНК. Даний спосіб також стосується стадії включення конструкції ДНК у вектор експресії. Крім того, вказаний спосіб може включати стадію введення вектора експресії в хазяйську клітину. Наприклад, варіанти здійснення даного винаходу стосуються білків злиття, які включають поліпептид RAGE, приєднаний до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE. В одному варіанті білок RAGE може включати сайт зв'язування ліганду RAGE. В одному варіанті сайт зв'язування ліганду включає велику частину N-кінцевого домену білка злиття. Сайт зв'язування ліганду RAGE може включати V домен RAGE або його частину. В одному варіанті сайт зв'язування ліганду RAGE включає SEQ ID NO: 9 або послідовність, яка на 90% їй ідентична, або SEQ ID NO: 10 або послідовність, яка на 90% їй ідентична. В одному варіанті поліпептид RAGE може бути приєднаний до поліпептиду, що включає імуноглобуліновий домен або частину (тобто його фрагмент) імуноглобулінового домену. В одному варіанті поліпептид, що включає імуноглобуліновий домен, включає щонайменше частину щонайменше одного з доменів СН2 або СН3 доменів людського IgG. Білок злиття може бути також одержаний генно-інженерними способами з використанням методик рекомбінантної ДНК. Наприклад, в одному варіанті даний винахід може включати виділену послідовність нуклеїнової кислоти, кодуючої поліпептид RAGE, приєднаного до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE. В одному варіанті поліпептид RAGE може включати сайт зв'язування ліганду RAGE. Білок або поліпептид RAGE може включати людський RAGE повної довжини (наприклад, SEQ ID NO: 1) або фрагмент людського RAGE. В одному варіанті поліпептид RAGE не включає якінебудь залишки з сигнальної послідовності. Сигнальна послідовність RAGE може включати залишки 1-22 або залишки 1-23 з RAGE повної довжини (SEQ ID NO: 1). В альтернативних варіантах поліпептид RAGE може включати послідовність, яка на 70% або на 80%, або на 90% ідентична людському RAGE або його фрагменту. Наприклад, в одному варіанті поліпептид RAGE може включати людський RAGE або його фрагмент, в якому міститься як перший залишок, швидше, гліцин, а не метіонін (див., наприклад, Neeper et al., (1992)). Або, в іншому варіанті, людський RAGE може 93356 24 включати RAGE повної довжини з видаленою сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 3) (Фіг.1А і ЇВ) або частину вказаної амінокислотної послідовності. Білки злиття згідно з даним винаходом можуть також включати sRAGE (наприклад, SEQ ID NO: 4) або поліпептид, який на 90% ідентичний sRAGE або фрагменту sRAGE. Наприклад, поліпептид RAGE може включати людський sRAGE або його фрагмент, при цьому як перший залишок міститься, швидше, гліцин, а не метіонін (див., наприклад, Neeper et al., (1992)). Або, в іншому, варіанті людський RAGE може включати sRAGE з видаленою сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO: 5 або SEQ ID NO: 6) (Фіг.1С) або частину такої амінокислотної послідовності. В інших варіантах білок RAGE може включати V домен (наприклад, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8; Фіг.1D). Або, в іншому варіанті, може використовуватися послідовність, яка на 90% ідентична V домену RAGE або його фрагменту. Або, в іншому варіанті, білок RAGE може включати фрагмент RAGE, що включає частину V домену (наприклад, SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10, Фіг.1D). В одному варіанті сайт зв'язування ліганду може включати SEQ ID NO: 9 або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або SEQ ID NO: 10 або послідовність, яка на 90% ідентична їй. У ще одному варіанті фрагмент RAGE являє собою синтетичний пептид. В одному варіанті послідовність нуклеїнової кислоти включає SEQ ID NO: 25, який кодує амінокислоти на ділянці 1-118 з людського RAGE або його фрагмента. Наприклад, може використовуватися послідовність, що включає нуклеотиди 1-348 з SEQ ID NO: 25, яка кодує амінокислоти на ділянці 1-116 з людського RAGE. Або, в іншому варіанті, нуклеїнова кислота може включати послідовність SEQ ID NO: 6, яка кодує амінокислоти на ділянці 1123 з людського RAGE. Або, в іншому варіанті, нуклеїнова кислота може включати послідовність SEQ ID NO: 27, яка кодує амінокислоти 1-136 з людського RAGE. Або, в іншому варіанті, нуклеїнова кислота може включати послідовність SEQ ID NO: 28, яка кодує амінокислоти 1-120 з людського RAGE. Або, в іншому варіанті, нуклеїнова кислота може включати послідовність SEQ ID NO: 29, яка кодує амінокислоти на ділянці 1-251 з людського RAGE. Або, в іншому варіанті, можуть використовуватися фрагменти вказаних послідовностей нуклеїнової кислоти, які кодують фрагменти поліпептиду RAGE. Білок злиття може включати декілька типів пептидів, які не були одержані з RAGE або його фрагмента. Другий поліпептид з білка злиття може включати поліпептид, одержаний з імуноглобуліну. Важкий ланцюг імуноглобуліну (або його частина) може бути одержаний з будь-якого відомого ізотипу важкого ланцюга: IgG (), IgM (μ), IgD (), IgE (ε) або IgA (α). Крім того, важкий ланцюг (або його частина) може бути одержаний з будь-якого відомого підтипу важких ланцюгів: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4), IgA1 (α1), IgA2 (α2) або на основі мутантів даних ізотипів або підтипів, що містять мутації, які міняють біологічну активність. Другий поліпептид може включати СН2 і СН3 доме 25 ни людського IgG1 або будь-якого з них, або обидва вказані домени. Як зразкові варіанти можна указати поліпептид, що включає домени СН2 і СН3 людського IgG або їх частину, який може включати SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 40. Імуноглобуліновий пептид може кодуватися послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 39 або SEQ ID NO: 41. Fc частина ланцюга імуноглобуліну може мати прозапальну дію in vivo. Так, білок злиття на основі RAGE згідно з даним винаходом може включати міждоменний лінкер, одержаний з RAGE, але не з шарніра міждоменної ділянки поліпептиду, одержаного з імуноглобуліну. Наприклад, в одному варіанті здійснення даного винаходу білок злиття може кодуватися рекомбінантною конструкцією ДНК. Крім того, даний спосіб може включати стадію введення конструкції ДНК у вектор експресії. А також даний спосіб може включати трансфекцію вектора експресії в хазяйську клітину. Таким чином, в одному варіанті даний винахід включає спосіб одержання білка злиття на основі RAGE, який включає стадію ковалентного приєднання поліпептиду RAGE до поліпептиду, що включає домен СH2 імуноглобуліну або частину домену СH2 імуноглобуліну. В даному варіанті білок злиття може включати сайт зв'язування ліганду RAGE. Сайт зв'язування ліганду RAGE може також включати V домен RAGE або його частину. В одному варіанті сайт зв'язування ліганду RAGE включає SEQ ID NO: 9 або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або SEQ ID NO: 10 або послідовність, яка на 90% їй ідентична. Наприклад, в одному варіанті даний винахід включає нуклеїнову кислоту, що кодує пептид RAGE, безпосередньо приєднаний до поліпептиду, який включає СH2 домен імуноглобуліну або його фрагмент. В одному варіанті здійснення винаходу СH2 домен або його фрагмент включає SEQ ID NO: 42. Другий поліпептид може включати СН2 і СН3 домени з людського IgG1. Як зразковий варіант здійснення винаходу можна указати поліпептид, що включає домени СН2 і СН3 людського IgG1, який може включати SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 40. Імуноглобуліновий поліпептид може кодуватися послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 39 або SEQ ID NO: 41. В одному варіанті здійснення даного винаходу поліпептид RAGE може включати міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, так що С-кінцева амінокислота імуноглобулінового домену RAGE приєднана до Nкінцевої амінокислоти міждоменного лінкера, і Скінцева амінокислота міждоменного лінкера безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або його фрагмент. Поліпептид, що включає СН2 домен імуноглобуліну, може включати поліпептид, який включає СН2 і СН3 домени з людського IgG1 або частину одного або обох вказаних доменів. Як зразковий варіант здійснення винаходу потрібно указати поліпептид, що включає СН2 і СН3 домени з людського IgG1 і їх частину, який може включати SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 40. 93356 26 Білок злиття згідно з даним винаходом може включати один або множину доменів RAGE. Крім того, поліпептид RAGE, що включає міждоменний лінкер, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, може включати фрагмент білка RAGE повної довжини. Наприклад, в одному варіанті білок злиття за даним винаходом може включати два імуноглобулінових домени, одержаних з білка RAGE, і два імуноглобулінових домени, одержаних з людського поліпептиду Fc. Білок злиття може включати перший імуноглобуліновий домен RAGE і перший міждоменний лінкер, приєднаний до другого імуноглобулінового домену RAGE і другого міждоменного лінкера RAGE, так що N-кінцева амінокислота першого міждоменного лінкера приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого імуноглобулінового домену RAGE, N-кінцева амінокислота другого імуноглобулінового домену RAGE приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого міждоменного лінкера, N-кінцева амінокислота другого міждоменного лінкера приєднана до Скінцевої амінокислоти другого імуноглобулінового домену RAGE і С-кінцева амінокислота другого міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СH2 домен імуноглобуліну або його фрагмент. Наприклад, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23-251 людського RAGE (SEQ ID NO: 19) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або амінокислоти на ділянці 24251 людського RAGE (SEQ ID NO: 20) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену, С1 домену, міждоменному лінкеру, який зв'язує два вказаних домени, і другому міждоменному лінкеру в напрямі зчитування інформації С1. В одному варіанті здійснення винаходу конструкція нуклеїнової кислоти, яка включає SEQ ID NO: 30 або його фрагмент, може кодувати чотиридоменний білок злиття на основі RAGE. Альтернативно, тридоменний білок злиття може включати один імуноглобуліновий домен, одержаний з RAGE, і два імуноглобулінових домени, одержаних з людського поліпептиду Fc. Наприклад, білок злиття може включати один імуноглобуліновий домен RAGE, приєднаний через міждоменний лінкер RAGE до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає імуноглобуліновий домен Сн2 або його фрагмент. Наприклад, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23136 людського RAGE (SEQ ID NO: 15) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або амінокислоти на ділянці 24-136 людського RAGE (SEQ ID NO: 16) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену RAGE і міждоменному лінкеру в напрямі зчитування інформації. В одному варіанті здійснення даного винаходу конструкція нуклеїнової кислоти, яка включає SEQ ID NO: 31 або її фрагмент, може кодувати тридоменний білок злиття на основі RAGE. Фрагмент міждоменного лінкера RAGE може включати пептидну послідовність, відповідну напряму зчитування інформації в природному стані і яка, таким чином, приєднана до імуноглобулінового домену RAGE. Наприклад, у випадку V домену RAGE, міждоменний лінкер може включати аміно 27 кислотні послідовності, які відповідають напряму зчитування інформації з V домену. В даному варіанті лінкер може включати SEQ ID NO: 21, відповідну амінокислотам на ділянці 117-123 RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, лінкер може включати пептид, який містить додаткові частини з природної послідовності RAGE. Наприклад, може використовуватися міждоменний лінкер, що включає декілька амінокислот (наприклад, 1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот) проти напряму або в напрямі зчитування інформації з SEQ ID NO:21. Таким чином, в одному варіанті здійснення винаходу міждоменний лінкер включає SEQ ID NO: 23, що включає амінокислоти на ділянці 117-136 з RAGE повної довжини. Або можуть використовуватися фрагменти SEQ ID NO: 21, які містять делецію з 1, 2, або 3 амінокислот з будь-якого кінця лінкера. В альтернативних варіантах лінкер може включати послідовність, яка на 70% ідентична або на 80% ідентична, або на 90% ідентична SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO: 23. У випадку С1 домену RAGE, лінкер може включати пептидну послідовність, яка відповідає напряму зчитування інформації в природному стані з С1 домену. В даному варіанті лінкер може включати SEQ ID NO: 22, відповідну амінокислотам на ділянці 222-251 RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, лінкер може включати пептид, що містить додаткові частини з природної послідовності RAGE. Наприклад, може використовуватися лінкер, який включає декілька амінокислот (1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот) проти напряму і в напрямі зчитування інформації (відповідно в положеннях «апстрім» і «даунстрім») з SEQ ID NO: 22. Або можуть використовуватися фрагменти SEQ ID NO: 22, які містять делецію, наприклад, з 1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот з будьякого кінця лінкера. Наприклад, в одному варіанті міждоменний лінкер RAGE може включати SEQ ID NO: 24, відповідну амінокислотам на ділянці 222226. Або міждоменний лінкер може включати SEQ ID NO: 44, відповідну амінокислотам на ділянці 318-342 з RAGE. Спосіб, що описується, може також включати стадію введення конструкції ДНК у вектор експресії. Так, в цьому варіанті даний винахід включає вектор експресії, який кодує білок злиття, що включає поліпептид RAGE, безпосередньо приєднаний до поліпептиду, який включає домен СН2 імуноглобуліну або частину домену СН2 імуноглобуліну. В даному варіанті поліпептид RAGE включає конструкції, такі як наведені в даному описі, що містять міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, так що Скінцева амінокислота імуноглобулінового домену RAGE приєднана до N-кінцевої амінокислоти міждоменного лінкера і С-кінцева амінокислота міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або його частину. Наприклад, вектор експресії, що використовується для трансфекції клітин, може включати послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 30 або її фрагмент, або SEQ ID NO: 31 або її фрагмент. 93356 28 Даний спосіб може також включати стадію трансфекції клітини вектором експресії згідно з даним винаходом. Так, в одному варіанті, даний винахід включає клітину, трансфіковану вектором експресії, який експресує білок злиття на основі RAGE згідно з даним винаходом, так що клітина експресує білок злиття, який включає поліпептид RAGE, безпосередньо приєднаний до поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або частину СН2 домену імуноглобуліну. В даному варіанті поліпептид RAGE включає конструкції, такі як наведені в даному описі конструкції, що містять міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, так що Скінцева амінокислота імуноглобулінового домену RAGE приєднана до N-кінцевої амінокислоти міждоменного лінкера і С-кінцева амінокислота міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або його частину. Наприклад, вектор експресії може включати послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 30 або її фрагмент, або SEQ ID NO: 31 або її фрагмент. Наприклад, плазміди можуть бути сконструйовані таким чином, що вони будуть експресувати білки злиття RAGE-IgG Fc, що одержуються шляхом об'єднання 5 і послідовностей кДНК різної довжини для людського RAGE з 3' кДНК послідовністю людського IgG1 Fc (1). Послідовності касет експресії можуть бути вставлені у вектор експресії, такий як вектор експресії pcDNA3.1 (Invitrogen, СА) з використанням стандартних рекомбінантних методик. Крім того, спосіб, що описується, може включати трансфекцію вектора експресії в хазяйську клітину. В одному варіанті рекомбінант може бути трансфікований в клітини яєчника китайського хом'яка, після чого проводиться оптимізація експресії. В альтернативних варіантах клітини можуть продукувати від 0,1 до 20 грам/літр або від 0,5 до 10 грам/літр, або приблизно 1-2 грам/літр. Як відомо в даній галузі техніки, такі конструкції нуклеїнової кислоти можуть бути модифіковані за рахунок мутацій, наприклад, шляхом ампліфікації в рамках ПЛР матриці нуклеїнової кислоти з використанням праймерів, що включають цікавлячу мутацію. При використанні даного способу можуть бути створені поліпептиди, що включають ліганди RAGE з варіюючою афінністю. В одному варіанті мутовані послідовності можуть бути на 90% або більше ідентичні вихідній ДНК. Як такі варіанти можуть включати нуклеотидні послідовності, які гібридизуються в суворих умовах (тобто в умовах, еквівалентних приблизно температурі 2027°С нижче температури плавлення (Тпл) дуплекса ДНК в 1 молярному розчині солі). Кодуюча послідовність може бути експресована при трансфекції вектора експресії у відповідну хазяйську клітину. Наприклад, рекомбінантні вектори можуть бути стабільно трансфіковані в клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), після чого можуть бути відібрані і клоновані клітини, які експресують білок злиття. В одному варіанті клітини, які експресують рекомбінантну конструкцію, виби 29 рають за резистентністю до неоміцину, що кодується плазмідою, при внесенні антибіотика G418. Індивідуальні клони можуть бути відібрані і клони, які експресують високі рівні рекомбінантного білка, виявлені за методом вестерн-блотингу клітинного супернатанту, можуть бути розмножені і генний продукт далі очищений афінною хроматографією з використанням колонок з білком А. Зразкові рекомбінантні амінокислоти, які кодують білки злиття згідно з даним винаходом, показані на Фіг.2-5. Наприклад, відповідно до вказаного вище, білок злиття, який продукується конструкцією рекомбінантної ДНК, може включати поліпептид RAGE, приєднаний до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE. Білок злиття може включати два домени, одержаних з білка RAGE, і два домени, одержаних з імуноглобуліну. Зразкова конструкція нуклеїнової кислоти, яка кодує білок злиття, ТТР-4000 (ТТ4), що має вказаний тип конструкції, показана на Фіг.2 (SEQ ID NO: 30). Як видно з Фіг.2, кодуюча послідовність на ділянці 1-753 (виділена жирним шрифтом) кодує N-кінцеву білкову послідовність RAGE, тоді як послідовність на ділянці 754-1386 кодує білкову послідовність IgG Fc. У випадку одержання з SEQ ID NO: 30 або послідовності, яка на 90% ідентична їй, білок злиття може включати чотиридоменну амінокислотну послідовністю SEQ ID NO: 32 або поліпептид з видаленою сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO: 33 або SEQ ID NO: 34) (Фіг.4). На Фіг.4 амінокислотна послідовність RAGE виділена жирним шрифтом. Імуноглобулінова послідовність являє собою імуноглобулінові домени СН2 і СН3 з IgG. Як видно з Фіг.6В, перші 251 амінокислота білка злиття ТТР-4000 RAGE повної довжини містить як поліпептидну послідовність RAGE сигнальну послідовність, яка включає амінокислоти на ділянці 122/23, V домен імуноглобуліну (включаючи сайт зв'язування ліганду), який включає амінокислоти на ділянці 23/24-116, міждоменний лінкер, який включає амінокислоти 117-123, другий імуноглобуліновий домен (С1), який включає амінокислоти на ділянці 124-221 і міждоменний лінкер в напрямі зчитування інформації, який включає амінокислоти на ділянці 222-251. В одному варіанті білок злиття може необов'язково включати другий імуноглобуліновий домен RAGE. Наприклад, білок злиття може включати один імуноглобуліновий домен, одержаний з RAGE, і два імуноглобулінових домени, одержаних з людського поліпептиду Fc. Приклад конструкції нуклеїнової кислоти, що кодує даний тип білка злиття, показаний на Фіг.3 (SEQ ID NO: 31). Як видно з Фіг.3, кодуюча послідовність на ділянці нуклеотидів 1-408 (виділена жирним шрифтом) кодує N-кінцеву білкову послідовність RAGE, а послідовність на ділянці 409-1041 кодує білкову послідовність IgG1 Fc (1). У випадку одержання з SEQ ID NO: 31 або послідовності, яка на 90% їй ідентична, білок злиття може включати тридоменну амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 35 або поліпептид з видаленою сигнальною послідовністю (SEQ ID NO: 36 або SEQ ID NO: 37) (Фіг.5). На Фіг.5 амінокислотна по 93356 30 слідовність RAGE виділена жирним шрифтом. Як видно з Фіг.6В, перші 136 амінокислот з білка злиття ТТР-3000 RAGE повної довжини містять як поліпептид RAGE сигнальну послідовність, яка включає амінокислоти на ділянці 1-22/23, V домен імуноглобуліну (включаючи сайт зв'язування ліганду), який включає амінокислоти на ділянці 23/24116, і міждоменний лінкер, який включає амінокислоти на ділянці 117-136. Послідовність на ділянці 137-346 включає імуноглобулінові домени СН2 і СН3 з IgG. Білки злиття згідно з даним винаходом можуть демонструвати підвищену стабільність in vivo відносно поліпептидів RAGE, які не містять другий поліпептид. Білок злиття може бути далі модифікований для підвищення стабільності, ефективності, активності і біологічної доступності. Так, білки злиття за даним винаходом можуть бути модифіковані за рахунок пост-трансляційного процесингу або шляхом хімічної модифікації. Наприклад, білок злиття може бути приготований методом синтезу, так щоб він включав L-, D- або неприродні амінокислоти, альфа-двозаміщені амінокислоти або Nалкіл-амінокислоти. Додатково, білки можуть бути модифіковані шляхом ацетилування, ацилування, АДФ-рибозилування, амідування, приєднання ліпідів, таких як фосфатидилінозит, за рахунок утворення дисульфідних зв'язків і т.п.Крім того, може бути доданий поліетиленгліколь для підвищення біологічної стабільності білка злиття. Зв'язування антагоністів RAGE з білками злиття на основі RAGE Білки злиття згідно з даним винаходом можуть мати множину різних застосувань. Наприклад, білок злиття згідно з даним винаходом може використовуватися в тесті на зв'язування для ідентифікації лігандів RAGE, таких як агоністи, антагоністи або модулятори RAGE. Наприклад, в одному варіанті даний винахід стосується способу виявлення модуляторів RAGE, який включає: (а) одержання білка злиття, що включає поліпептид RAGE, приєднаний до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE, де поліпептид RAGE включає сайт зв'язування ліганду; (b) змішування цікавлячої сполуки і ліганду, що має відому зв'язувальну афінність для RAGE, з білком злиття; і (с) вимірювання рівня зв'язування відомого ліганду RAGE з білком злиття на основі у присутності цікавлячої сполуки. В даному варіанті сайт зв'язування ліганду включає більшу частину N-кінцевого домену білка злиття. Білки злиття на основі RAGE можуть також включати набори для виявлення модуляторів RAGE. Наприклад, в одному варіанті набір згідно з даним винаходом може включати: (а) сполуку, яка має відому зв'язувальну афінність з RAGE, як позитивний контроль; (b) білок злиття на основі RAGE, що включає поліпептид RAGE, приєднаний до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE, де поліпептид RAGE включає сайт зв'язування ліганду RAGE; і (с) інструкції з використання. В одному варіанті сайт зв'язування ліганду RAGE включає більшу частину N-кінцевого домену білка злиття. 31 Білок або поліпептид RAGE може включати людський RAGE повної довжини (наприклад, SEQ ID NO: 1) або фрагмент людського RAGE. В одному варіанті поліпептид RAGE не включає якихнебудь залишків з сигнальної послідовності. Сигнальна послідовність RAGE може включати залишки на ділянці 1-22 або на ділянці 1-23 з RAGE повної довжини (SEQ ID NO: 1). В альтернативних варіантах поліпептид RAGE може включати послідовність, яка на 70%, на 80% або на 90% ідентична людському RAGE або його фрагменту. Наприклад, в одному варіанті поліпептид RAGE може включати людський RAGE або його фрагмент, де як перший залишок присутній, швидше, гліцин, а не метіонін (див., наприклад, Neeper et al., (1992)). Або, в іншому варіанті, людський RAGE може включати RAGE повної довжини з видаленою сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 3) (Фіг.1А і 1В) або частину такої амінокислотної послідовності. Білки злиття згідно з даним винаходом можуть також включати sRAGE (наприклад, SEQ ID NO: 4), поліпептид, який на 90% ідентичний sRAGE, або фрагмент sRAGE. Наприклад, поліпептид RAGE може включати людський sRAGE або його фрагмент, де як перший залишок присутній, швидше, гліцин, а не метіонін (див., наприклад, Neeper et al., (1992)). Або, в іншому варіанті, людський RAGE може включати sRAGE з видаленою сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO: 5 або SEQ ID NO: 6) (Фіг.1С) або частину такої амінокислотної послідовності. В інших варіантах білок RAGE може включати V домен (наприклад, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8, Фіг.1D). Або може бути використана послідовність, яка на 90% ідентична V домену або його фрагменту. Або в іншому варіанті, білок RAGE може включати фрагмент RAGE, що включає частину V домену (наприклад, SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10, Фіг.1D). В даному варіанті сайт зв'язування ліганду може включати SEQ ID NO: 9 або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або SEQ ID NO: 10 або послідовність, яка на 90% ідентична їй. У ще одному варіанті фрагмент RAGE являє собою синтетичний пептид. Білок злиття може включати декілька типів пептидів, які не були одержані з RAGE або його фрагмента. Другий поліпептид з білка злиття може включати поліпептид, одержаний з імуноглобуліну. Важкий ланцюг (або його частина) може бути одержаний з важкого ланцюга будь-якого відомого ізотипу: IgIgG (), IgM (μ), IgD (), IgE (ε) або IgA (α). Додатково, важкий ланцюг (або його частина) може бути одержаний з важкого ланцюга будь-якого відомого підтипу: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4), IgA1 (α1), IgA2 (α2) або на основі мутантів даних ізотипів або підтипів, які містять мутації, що змінюють їх біологічну активність. Другий поліпептид може включати домени СН2 і СH3 з людського IgG1 або частину кожного з них, або обидва вказаних домени. Як репрезентативні варіанти можна указати поліпептид, що включає домени СН2 і СН3 з людського IgG або їх частину, який може включати SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 40. Імуноглобуліновий пептид може кодуватися послі 93356 32 довністю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 39 або SEQ ID NO:41. Fc частина ланцюга імуноглобуліну може мати прозапальну дію in vivo. Так, в одному варіанті білок злиття на основі RAGE згідно з даним винаходом включає послідовність Fc, одержану з RAGE, а не з імуноглобулінового ланцюга. В даному варіанті білок злиття може включати імуноглобуліновий домен RAGE, приєднаний до поліпептиду, що включає імуноглобуліновий домен СH2 або його фрагмент. В одному варіанті поліпептид RAGE може включати міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, так що С-кінцева амінокислота імуноглобулінового домену RAGE приєднана до N-кінцевої амінокислоти міждоменного лінкера і С-кінцева амінокислота міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або його фрагмент. Поліпептид, що включає СН2 домен імуноглобуліну, може включати поліпептид, що включає домени СН2 і СН3 з людського IgG1 або частину обох або будь-якого з цих доменів. Як репрезентативний варіант можна указати поліпептид, який включає домени СН2 і СН3 людського IgG1 або їх частину, який може включати SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 40. Білок злиття згідно з даним винаходом може включати один або множину доменів з RAGE. Крім того, поліпептид RAGE, що включає міждоменний лінкер, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, може включати фрагмент білка RAGE повної довжини. Наприклад, в одному варіанті білок злиття за даним винаходом може включати два імуноглобулінових домени, одержаних з білка RAGE, і два імуноглобулінових домени, одержаних з людського поліпептиду Fc. Білок злиття може включати перший імуноглобуліновий домен RAGE і перший міждоменний лінкер, приєднаний до другого імуноглобулінового домену RAGE, і другий міждоменний лінкер RAGE, так що N-кінцева амінокислота першого міждоменного лінкера приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого імуноглобулінового домену RAGE, N-кінцева амінокислота другого імуноглобулінового домену RAGE приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого міждоменного лінкера, N-кінцева амінокислота другого міждоменного лінкера приєднана до Скінцевої амінокислоти другого імуноглобулінового домену RAGE і С-кінцева амінокислота другого міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає імуноглобуліновий домен Сн2 або його фрагмент. Наприклад, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23-251 з людського RAGE (SEQ ID NO: 19) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або амінокислоти на ділянці 24-251 з людського RAGE (SEQ ID NO: 20) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену, С1 домену, міждоменному лінкеру, який зв'язує два вказаних домени, і другий міждоменний лінкер в напрямі зчитування інформації з С1. В одному варіанті здійснення винаходу конструкція нуклеїнової кислоти, яка включає SEQ ID NO: 30 33 або його фрагмент, може кодувати чотиридоменний білок злиття на основі RAGE. Альтернативно, тридоменний білок злиття може включати один імуноглобуліновий домен, одержаний з RAGE, і два імуноглобулінових домени, одержаних з людського поліпептиду Fc. Наприклад, білок злиття може включати один імуноглобуліновий домен RAGE, приєднаний через міждоменний лінкер RAGE до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає імуноглобуліновий домен СH2 або його фрагмент. Наприклад, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23136 з людського RAGE (SEQ ID NO: 15) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або амінокислоти на ділянці 24-136 людського RAGE (SEQ ID NO: 16) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену RAGE і міждоменному лінкеру в напрямі зчитування інформації. В одному варіанті здійснення винаходу конструкція нуклеїнової кислоти, яка включає SEQ ID NO: 31 або його фрагмент, може кодувати тридоменний білок злиття на основі RAGE. Як вказувалося вище, фрагмент міждоменного лінкера RAGE може включати пептидну послідовність, яка відповідає в природному стані напряму зчитуванню інформації, і таким чином приєднана до імуноглобулінового домену RAGE. Наприклад, у випадку V- домену RAGE, міждоменний лінкер може включати амінокислотні послідовності, які в природному стані відповідають напряму зчитування інформації з V домену. В даному варіанті лінкер може включати SEQ ID NO: 21, відповідну амінокислотам на ділянці 117-123 RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, лінкер може включати пептид, що містить додаткові частини з природної послідовності RAGE. Наприклад, може використовуватися міждоменний лінкер, що включає декілька амінокислот (наприклад, 1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот) проти напряму або в напрямі зчитування інформації SEQ ID NO: 21. Так, в одному варіанті здійснення винаходу міждоменний лінкер включає SEQ ID NO: 23, що включає амінокислоти на ділянці 117-136 з RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, можуть використовуватися фрагменти SEQ ID NO: 21, які містять делецію, наприклад, з 1, 2 або 3 амінокислот з будь-якого кінця лінкера. В альтернативних варіантах лінкер може включати послідовність, яка на 70% ідентична або на 80% ідентична, або на 90% ідентична SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO: 23. У випадку С1 домену RAGE, лінкер може включати пептидну послідовність, яка відповідає в природному стані напряму зчитування інформації з С1 домену. В даному варіанті лінкер може включати SEQ ID NO: 22, відповідну амінокислотам на ділянці 222-251 RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, лінкер може включати пептид, що містить додаткові частини з природної послідовності RAGE. Наприклад, може використовуватися лінкер, що включає декілька (наприклад, 1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот) амінокислот проти напряму або в напрямі зчитування інформації з SEQ ID NO: 22. Або, в іншому варіанті, можуть використовуватися фрагменти SEQ ID NO: 22, які містять делецію, наприклад, з 1-3, 1-5 або 1-10, 93356 34 або 1-15 амінокислот з будь-якого кінця лінкера. Наприклад, в одному варіанті міждоменний лінкер RAGE може включати SEQ ID NO: 24, відповідну амінокислотам на ділянці 222-226. Або, в іншому варіанті, міждоменний лінкер може включати SEQ ID NO: 44, відповідну амінокислотам на ділянці 318-342 з RAGE. Наприклад, білок злиття на основі RAGE може використовуватися в тесті на зв'язування для ідентифікації потенційних лігандів RAGE. В одному зразковому варіанті такого тесту на зв'язування відомий ліганд RAGE може бути нанесений на твердий субстрат (наприклад, на планшети Максісорб (Maxisorb)) в концентрації приблизно 5 мікрограм на ямку, де кожна ямка містить загальний об'єм приблизно 100 мікролітрів (мкл). Планшети інкубують при температурі 4°С протягом ночі для абсорбції ліганду. Альтернативно, можуть використовуватися більш короткі періоди інкубації при більш високих температурах (наприклад, при кімнатній температурі). Після закінчення періоду часу, необхідного для того, щоб ліганд зв'язався з субстратом, вміст ямок відсмоктують і додають блокуючий буфер (наприклад, 1% БСА в 50мМ імідазольному буфері, рН7,2) для блокування неспецифічного зв'язування. Наприклад, блокуючий буфер може бути доданий до планшетів на 1 годину при кімнатній температурі. Далі вміст ямок в планшетах відсмоктують і/або промивають промивальним буфером. У такому варіанті може бути використаний буфер, що включає 20мМ імідазолу, 150мМ NaCl, 0,05% Твін-20, 5мМ СаСI2 і 5мМ MgCl2, рН7,2, як промивальний буфер. Далі, до експериментальних ямок може бути доданий білок злиття у зростаючому розведенні. Далі білок злиття на основі RAGE інкубують з іммобілізованим лігандом в експериментальних ямках, так щоб була досягнута рівновага зі зв'язування. В одному варіанті білок злиття RAGE інкубують з іммобілізованим лігандом приблизно протягом однієї години при температурі 37°С. В альтернативних варіантах використовують більш тривалі періоди інкубації при більш низьких температурах. По закінченні інкубації білка злиття та іммобілізованого ліганду планшет промивають для видалення незв'язаного білка злиття. Білок злиття, зв'язаний з іммобілізованим лігандом, може бути виявлений різними способами. В одному варіанті для виявлення використовують методику ELISA. Так, в одному варіанті комплекс для імунологічного виявлення, який містить моноклональний мишачий IgG1 проти людського компонента, біотинільований козячий антимишачий IgG і авідин з приєднаною лужною фосфатазою, може бути доданий до білка злиття, іммобілізованого в експериментальній ямці. Комплекс для імунологічного виявлення може бути підданий зв'язуванню з іммобілізованим білком злиття, так щоб зв'язування між білком злиття і комплексом для імунологічного виявлення досягло рівноваги. Наприклад, комплекс може бути підданий зв'язуванню з білком злиття протягом однієї години при кімнатній температурі. У цій точці незв'язаний комплекс може бути видалений промиванням експериментальних ямок промивальним буфером. Зв'язаний комплекс може бути виявле 35 ний при додаванні субстрату лужної фосфатази, пара-нітрофенілфосфату (ПНФФ (PNPP)) з подальшим вимірюванням рівня перетворення ПНФФ в пара-нітрофенол (ПНФ (PNP)), що визначається як підвищення поглинання при довжині хвилі 405нм. В одному варіанті ліганд RAGE зв'язується з білком злиття на основі RAGE з наномолярною (нМ) або мікромолярною (мкМ) афінністю. На Фіг.7 проілюстрований експеримент, що демонструє зв'язування лігандів RAGE з білками злиття на основі RAGE згідно з даним винаходом. Готують розчини ТТР-3000 (ТТ3) і ТТР-4000 (ТТ4) з вихідними концентраціями 1,082мг/мл і 370мкг/мл, відповідно. Як видно з Фіг.7, при різному розведенні білки злиття ТТР-3000 і ТТР-4000 здатні зв'язуватися з іммобілізованими лігандами RAGE амілоїдбета (Абета) (Amyloid Beta (1-40) від Biosource), S100b (S100), і амфотерином (Ampho), що приводить до підвищення рівня поглинання. За відсутності ліганду (наприклад, при нанесенні покриття тільки з БСА), не відмічається підвищення поглинання. Тест на зв'язування згідно з даним винаходом може використовуватися для кількісного визначення рівня зв'язування ліганду з RAGE. В альтернативних варіантах ліганди RAGE можуть зв'язуватися з білком злиття згідно з даним винаходом з афінностями зі зв'язування, що варіюють від 0,1 до 1000 наномолів (нМ) або від 1 до 500нМ, або від 10 до 80нМ. Білок злиття за даним винаходом може також використовуватися для ідентифікації сполук, що мають здатність зв'язуватися з RAGE. Як показано на Фіг.8 і 9, відповідно, ліганд RAGE може бути досліджений на його здатність конкурувати з іммобілізованим амілоїд-бета за зв'язування з білками злиття ТТР-4000 (ТТ4) і ТТР-3000 (ТТ3). Так, можна бачити, що ліганд RAGE в кінцевій концентрації в тесті (FAC), яка дорівнює 10мкМ, може витісняти в реакції зв'язування білка злиття RAGE з амілоїдбета в концентраціях 1:3, 1:10, 1:30 і 1:100 вихідного розчину ТТР-4000 (Фіг.8) і ТТР-3000 (Фіг.9). Модуляція клітинних ефекторів Варіанти білків злиття згідно з даним винаходом можуть використовуватися для модуляції біологічної відповіді, опосередкованої RAGE. Наприклад, можуть бути створені білки злиття з метою модуляції RAGE-індукованого підвищення їх генної експресії. Так, в одному варіанті білки злиття згідно з даним винаходом можуть використовуватися для модуляції функцій біологічних ферментів. Наприклад, взаємодія між RAGE і лігандами може викликати окислювальний стрес і активацію NF-κΒ і генів, регульованих NF-κΒ, таких як цитокіни IL-Ιβ, TNF-α і т.п.Додатково було показано, що деякі інші регуляторні шляхи, такі як шляхи, що залучають p21ras, МАР-кінази, ERK1 і ERK2, активуються при зв'язуванні AGE та інших лігандів з RAGE. Використання білків злиття згідно з даним винаходом для модуляції експресії клітинного еффектора TNF-α показане на Фіг.10. Мієлоїдні клітини ТНР-1 культивують в середовищі RPMI 1640 з домішкою 10% ФСТ та індукують секрецію TNF-α шляхом стимуляції RAGE з використанням S100b. У випадку такої стимуляції у присутності білка 93356 36 злиття RAGE індукція TNF-α за рахунок зв'язування S100b з RAGE може бути інгібована. Так, на Фіг.10 показано, що додавання 10мкг білка злиття на основі RAGE ТТР-3000 (ТТ3) або ТТР-4000 (ТТ4) знижує індукцію TNF-α під дією S100b приблизно на 50%-75%. Білок злиття ТТР-4000 може бути щонайменше так само ефективний з блокування індукції TNF-α під дією S100b, як і sRAGE (Фіг.10). Специфічність інгібування послідовностей RAGE для ТТР-4000 і ТТР-3000 показана в експерименті, в рамках якого додають один IgG до S100b-стимульованих клітин. Додавання IgG і S100b до тесту приводить до тих же рівнів TNF-α, що і додавання одного S100b. Фізіологічні характеристики білків злиття на основі RAGE Хоча sRAGE може давати терапевтичний ефект при модуляції RAGE-опосередкованих захворювань, людський sRAGE може мати обмеження, при використанні його в рамках єдиного терапевтичного підходу, що визначаються відносно коротким періодом напіввиведення sRAGE з плазми. Наприклад, тоді як sRAGE гризунів має період напіввиведення у нормальних і діабетичних щурів, що дорівнює приблизно 20 годин, людський sRAGE має період напіввиведення менше, ніж 2 години, при оцінці зі збереження імунореактивності sRAGE (Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290: 1458-1466 (1999)). Для досягнення терапевтичного ефекту RAGE, який має близькі до sRAGE характеристики зі зв'язування, але більш стабільний фармакокінетичний профіль, може бути використаний білок злиття на основі RAGE, що включає сайт зв'язування ліганду RAGE, приєднаний до одного або декількох імуноглобулінових доменів людини. Як відомо в даній галузі, імуноглобулінові домени можуть включати Fc частину важкого ланцюга імуноглобуліну. Fc частина імуноглобуліну може додавати деяких властивостей білкам злиття. Наприклад, білок злиття Fc може підвищувати період напіввиведення таких білків злиття з сироватки і часто від декількох годин до декількох днів. Підвищення фармакокінетичної стабільності в основному являє собою результат взаємодії лінкера, що знаходиться між ділянками СН2 і СН3 фрагмента Fc, з рецептором FcRn (Wines et al., J. Immunol, 164: 53135318 (2000)). Хоча білки злиття, які включають поліпептид Fc імуноглобуліну, можуть давати перевагу, що визначається підвищеною стабільністю, імуноглобулінові білки злиття можуть викликати запальну відповідь при введенні в організм хазяїна. Запальна відповідь може визначатися в основному Fc частиною імуноглобуліну в білку злиття. Прозапальна відповідь може бути бажаною, якщо цільова сполука експресується в таких клітинах, уражених таким захворюванням, які потрібно усунути (наприклад, в раковій клітині або в популяції лімфоцитів, що спричиняють автоімунне захворювання). Прозапальна відповідь може бути нейтральною особливістю, якщо цільова сполука являє собою розчинний білок, оскільки велика частина розчинних білків не активує імуноглобуліни. Однак, прозапальна відповідь може бути негативною харак 37 теристикою, якщо цільова сполука експресується на клітинах такого типу, руйнування яких може призвести до небажаних побічних ефектів. Крім того, прозапальна відповідь також може бути негативною характеристикою, якщо запальний каскад встановлюється в сайті зв'язування білка злиття з тканиною-мішенню, оскільки багато які медіатори запалення можуть бути шкідливі для оточуючої тканини і/або можуть викликати системні ефекти. Первинний прозапальний сайт на імуноглобулінових Fc фрагментах знаходиться на шарнірній ділянці між СН2 і СН3. Дана шарнірна ділянка взаємодіє з FcR1-3, що знаходяться на різних лейкоцитах, і примушує ці клітини впливати на мішень (Wines et al., J. Immunol, 164: 5313-5318 (2000)). Білки злиття на основі RAGE при їх використанні як терапевтичних препаратів для лікування RAGE-опосередкованих захворювань, можуть не викликати запальну відповідь. Так, деякі варіанти білків злиття RAGE за даним винаходом можуть включати білок злиття, що включає поліпептид RAGE, приєднаний до імуноглобулінового(их) домену(ів), де Fc шарнірна ділянка в імуноглобуліні видалена і заміщена поліпептидом RAGE. У цьому випадку взаємодія між білком злиття на основі RAGE і Fc рецепторами на запальних клітинах може бути мінімізована. Однак, може бути важливо підтримувати відповідні липкі властивості та інші форми взаємодії, що визначаються тримірною структурою, між різними імуноглобуліновими доменами білка злиття. Так, варіанти білків злиття згідно з даним винаходом можуть заміняти біологічно інертний, але структурно близький міждоменний лінкер RAGE, який розділяє V і С1 домени RAGE, або лінкер, який розділяє С1 і С2 домени RAGE в нормальній шарнірній ділянці важкого ланцюга імуноглобуліну. Так, поліпептид RAGE в білку злиття може включати послідовність міждоменного лінкера, яка в природному стані відповідає напряму зчитування інформації з імуноглобулінового домену RAGE, з утворенням імуноглобулінового домену RAGE/лінкерного фрагмента. При здійсненні даного способу вдається зберігати тримірні взаємодії між імуноглобуліновими доменами, що визначаються RAGE або імуноглобуліном. В одному варіанті білок злиття на основі RAGE згідно з даним винаходом може спричиняти істотне підвищення фармакокінетичної стабільності у порівнянні з sRAGE. Наприклад, як видно з Фіг.11, при насиченні ТТР-4000, білка злиття на основі RAGE, його лігандами може зберігатися період напіввиведення більше 300 годин. Це різко відрізняється від значення періоду напіввиведення sRAGE, який нараховує лише декілька годин в плазмі людини. Таким чином, білки злиття на основі RAGE згідно з даним винаходом можуть використовуватися для антагонізації в процесі зв'язування фізіологічних лігандів з RAGE і являти собою засіб лікування RAGE-опосередкованих захворювань, не викликаючи неприйнятного рівня запалення. Білки злиття згідно з даним винаходом можуть демонструвати істотне зниження запальної відповіді у порівнянні з IgG. Наприклад, як видно з Фіг.12, 93356 38 ТТР-4000, білок злиття на основі RAGE, не стимулює вивільнення TNF-α з клітин в умовах, при яких виявляється вивільнення TNF-α, стимульоване людським IgG. Лікування захворювання білками злиття на основі RAGE Даний винахід може також включати способи лікування RAGE-опосередкованого розладу у людини. В одному варіанті даний спосіб може включати введення суб'єкту білка злиття, що включає поліпептид RAGE, який включає сайт зв'язування ліганду RAGE, приєднаний до другого поліпептиду, який відрізняється від RAGE. В одному варіанті білок злиття може включати сайт зв'язування ліганду RAGE. В одному варіанті сайт зв'язування ліганду включає велику частину N-кінцевого домену білка злиття. Сайт зв'язування ліганду RAGE може включати V домен RAGE або його частину. В даному варіанті сайт зв'язування ліганду RAGE включає SEQ ID NO: 9 або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або SEQ ID NO: 10 або послідовність, яка на 90% ідентична їй. В одному варіанті поліпептид RAGE може бути приєднаний до поліпептиду, що включає імуноглобуліновий домен або частину (тобто, фрагмент) імуноглобулінового домену. В даному варіанті поліпептид, що включає імуноглобуліновий домен, включає щонайменше частину щонайменше одного з СН2 або СН3 доменів людського IgG. Білок або поліпептид RAGE може включати людський RAGE повної довжини (наприклад, SEQ ID NO: 1) або фрагмент людського RAGE. В даному варіанті поліпептид RAGE не включає якінебудь залишки з сигнальної послідовності. Сигнальна послідовність RAGE може включати залишки на ділянці 1-22 або на ділянці 1-23 з RAGE повної довжини (SEQ ID NO: 1). В альтернативних варіантах поліпептид RAGE може включати послідовність, яка на 70%, на 80% або на 90% ідентична людському RAGE або його фрагменту. Наприклад, в одному варіанті поліпептид RAGE може включати людський RAGE або його фрагмент, де як перший залишок присутній, швидше, гліцин, а не метіонін (див., наприклад, Neeper et al., (1992)). Або, в іншому варіанті, людський RAGE може включати RAGE повної довжини з видаленою сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 3) (Фіг.1А і 1В) або частину вказаної амінокислотної послідовності. Білки злиття згідно з даним винаходом можуть також включати sRAGE (наприклад, SEQ ID NO: 4), поліпептид, який на 90% ідентичний sRAGE, або фрагмент sRAGE. Наприклад, поліпептид RAGE може включати людський sRAGE або його фрагмент, де як перший залишок присутній, швидше, гліцин, а не метіонін (див., наприклад, Neeper et al., (1992)). Або, в іншому варіанті, людський RAGE може включати sRAGE з видаленою сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO: 5 або SEQ ID NO: 6) (Фіг.1С) або частину вказаної амінокислотної послідовності. В інших варіантах білок RAGE може включати V домен (наприклад, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8, Фіг.1D). Або, в іншому варіанті, може бути використана послідовність, яка на 90% ідентична V домену або його фрагменту. Або, в 39 іншому варіанті, білок RAGE може включати фрагмент RAGE, що включає частину V домену (наприклад, SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10, Фіг.1D). В одному варіанті сайт зв'язування ліганду може включати SEQ ID NO: 9 або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або SEQ ID NO: 10 або послідовність, яка на 90% ідентична їй. У ще одному варіанті фрагмент RAGE являє собою синтетичний пептид. Білок злиття може включати декілька типів пептидів, які не були одержані з RAGE або його фрагмента. Другий поліпептид в білку злиття може включати поліпептид, одержаний з імуноглобуліну. Важкий ланцюг (або його частина) може бути одержаний з важкого ланцюга будь-якого відомого ізотипу: IgG (), IgM (μ), IgD (), IgE (ε) або IgA (α). Додатково, важкий ланцюг (або його частина) може бути одержаний з важкого ланцюга будь-якого відомого підтипу: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4), IgA1 (α1), IgA2 (α2) або на основі мутантів даних ізотипів або підтипів, які містять мутації, що змінюють їх біологічну активність. Другий поліпептид може включати СН2 і СН3 домени з людського IgG1 або будь-яку їх частину, або обидва вказаних домени. Як репрезентативні варіанти можна указати поліпептид, що включає СН2 і СН3 домени людського IgG1 або їх частину, який може включати SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 40. Імуноглобуліновий пептид може кодуватися послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO:41. Наприклад, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23-116 з людського RAGE (SEQ ID NO: 7) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або амінокислоти на ділянці 24-116 з людського RAGE (SEQ ID NO: 8) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену RAGE. Або, в іншому варіанті, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 124-221 з людського RAGE (SEQ ID NO: 11) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну С1 домену RAGE. В іншому варіанті поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 227-317 з людського RAGE (SEQ ID NO: 12) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, відповідну С2 домену RAGE. Або, в іншому варіанті, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23-123 з людського RAGE (SEQ ID NO: 13) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або амінокислоти на ділянці 24-123 з людського RAGE (SEQ ID NO: 14) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, відповідну V домену RAGE і міждоменному лінкеру в напрямі зчитування інформації. Або, в іншому варіанті, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23-226 з людського RAGE (SEQ ID NO: 17) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, або амінокислоти на ділянці 24-226 з людського RAGE (SEQ ID NO: 18) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену, С1 домену і міждоменному лінкеру, що з'єднує обидва вказані домени. Або, в іншому варіанті, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23-339 з людського RAGE (SEQ ID NO: 5) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, або залишки на ділянці 24-339 з людського RAGE 93356 40 (SEQ ID NO: 6) або послідовність, яка на 90% їй ідентична, відповідну sRAGE (тобто, яка кодує V, С1 і С2 домени і міждоменні лінкери). Або, в іншому варіанті, можуть використовуватися фрагменти кожної з вказаних послідовностей. Fc частина ланцюга імуноглобуліну може мати прозапальну активність in vivo. Так, в одному варіанті білок злиття на основі RAGE згідно з даним винаходом включає міждоменний лінкер, одержаний з RAGE, але не з шарніра міждоменної ділянки поліпептиду, одержаного з імуноглобуліну. Таким чином, в одному варіанті білок злиття на основі RAGE може також включати поліпептид RAGE, безпосередньо приєднаний до поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або фрагмент. В одному варіанті СН2 домен або його фрагмент може включати SEQ ID NO: 42. В одному варіанті поліпептид RAGE може включати міждоменний лінкер RAGE, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, так що Скінцева амінокислота імуноглобулінового домену RAGE приєднана до N-кінцевої амінокислоти міждоменного лінкера і С-кінцева амінокислота міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або його фрагмент. Поліпептид, що включає СН2 домен імуноглобуліну, може включати СН2 і СН3 домени з людського IgG1. Як репрезентативний варіант можна указати поліпептид, що включає СН2 і СН3 домени людського IgG1, який може включати SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 40. Білок злиття згідно з даним винаходом може включати один або множину доменів з RAGE. Крім того, поліпептид RAGE, що включає міждоменний лінкер, приєднаний до імуноглобулінового домену RAGE, може включати фрагмент білка RAGE повної довжини. Наприклад, в одному варіанті білок злиття згідно з даним винаходом може включати два імуноглобулінових домени, одержаних з білка RAGE, і два імуноглобулінових домени, одержаних з людського поліпептиду Fc. Білок злиття може включати перший імуноглобуліновий домен RAGE і перший міждоменний лінкер, приєднаний до другого імуноглобулінового домену RAGE і другого міждоменного лінкера RAGE, так що N-кінцева амінокислота першого міждоменного лінкера приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого імуноглобулінового домену RAGE, N-кінцева амінокислота другого імуноглобулінового домену RAGE приєднана до С-кінцевої амінокислоти першого міждоменного лінкера, N-кінцева амінокислота другого міждоменного лінкера приєднана до Скінцевої амінокислоти другого імуноглобулінового домену RAGE і С-кінцева амінокислота другого міждоменного лінкера RAGE безпосередньо приєднана до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає імуноглобуліновий домен СН2 або його фрагмент. Наприклад, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23-251 з людського RAGE (SEQ ID NO: 19) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або амінокислоти на ділянці 24-251 з людського RAGE (SEQ ID NO: 20) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену, С1 домену, міждоменному лінкеру, що 41 з'єднує два вказаних домени, і другому міждоменному лінкеру в напрямі зчитування інформації з С1. В одному варіанті здійснення винаходу конструкція нуклеїнової кислоти, яка включає SEQ ID NO: 30 або її фрагмент, може кодувати чотиридоменний білок злиття на основі RAGE. Альтернативно, тридоменний білок злиття може включати один імуноглобуліновий домен, одержаний з RAGE, і два імуноглобулінових домени, одержаних з людського поліпептиду Fc. Наприклад, білок злиття може включати один імуноглобуліновий домен RAGE, приєднаний через міждоменний лінкер RAGE до N-кінцевої амінокислоти поліпептиду, що включає СН2 домен імуноглобуліну або його фрагмент. Наприклад, поліпептид RAGE може включати амінокислоти на ділянці 23136 з людського RAGE (SEQ ID NO: 15) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, або амінокислоти на ділянці 24-136 з людського RAGE (SEQ ID NO: 16) або послідовність, яка на 90% ідентична їй, відповідну V домену RAGE і міждоменному лінкеру в напрямі зчитування інформації. В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти, яка кодує SEQ ID NO: 31 або його фрагмент, може кодувати тридоменний білок злиття RAGE. Фрагмент міждоменного лінкера RAGE може включати пептидну послідовність, яка відповідає напряму зчитування інформації в природному стані і таким чином приєднану до імуноглобулінового домену RAGE. Наприклад, у випадку V домену RAGE, міждоменний лінкер може включати амінокислотну послідовність, яка відповідає напряму зчитування інформації з V домену, у природному стані. В даному варіанті лінкер може включати SEQ ID NO: 21, відповідну амінокислотам на ділянці 117-123 RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, лінкер може включати пептид, що містить додаткові частини з природної послідовності RAGE. Наприклад, може використовуватися міждоменний лінкер, що включає декілька амінокислот (наприклад, 1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот) проти напряму або в напрямі зчитування інформації з SEQ ID NO: 21. Таким чином, в одному варіанті здійснення винаходу міждоменний лінкер включає SEQ ID NO: 23, що включає амінокислоти на ділянці 117-136 з RAGE повної довжини. Або, в іншому варіанті, можуть використовуватися фрагменти SEQ ID NO: 21, які містять делецію, наприклад, з 1, 2, або 3 амінокислот з будь-якого кінця лінкера. В альтернативних варіантах лінкер може включати послідовність, яка на 70% ідентична або на 80% ідентична, або на 90% ідентична SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO: 23. У випадку С1 домену RAGE, лінкер може включати пептидну послідовність, яка відповідає напряму зчитування інформації з С1 домену, у природному стані. В одному варіанті лінкер може включати SEQ ID NO: 22, відповідний амінокислотам на ділянці 222-251 RAGE повної довжини. Лінкер може включати пептид, що містить додаткові частини з природної послідовності RAGE. Наприклад, може використовуватися лінкер, що включає декілька (наприклад, 1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот) амінокислот проти напряму або в напрямі зчитування інформації з SEQ ID NO: 22. 93356 42 Або можуть використовуватися фрагменти SEQ ID NO: 22, які містять делецію, наприклад, з 1-3, 1-5 або 1-10, або 1-15 амінокислот з будь-якого кінця лінкера. Наприклад, в одному варіанті міждоменний лінкер RAGE може включати SEQ ID NO: 24, відповідну амінокислотам на ділянці 222-226. Або міждоменний лінкер може включати SEQ ID NO: 44, відповідну амінокислотам на ділянці 318-342 з RAGE. В одному варіанті білок злиття згідно з даним винаходом може вводитися різними способами. Введення білка RAGE згідно з даним винаходом може включати внутрішньочеревинну ін'єкцію (в/ч). Альтернативно, білок злиття на основі RAGE може вводитися перорально, інтраназально або в аерозольній формі. В іншому варіанті введення являє собою внутрішньовенне введення (в/в). Білок злиття на основі RAGE може також ін'єктуватись підшкірно. В іншому варіанті здійснюють внутрішньоартеріальне введення білка злиття. В іншому варіанті введення здійснюється сублінгвально. Крім того, для введення можуть використовуватися капсули з пролонгованим вивільненням. У ще одному варіанті введення може бути трансректальним, наприклад, з використанням супозиторіїв і т.п.Наприклад, може використовуватися підшкірне введення, яке корисне для лікування хронічних захворювань в тих випадках, коли бажане самолікування. Для підтвердження корисності використання сполук, що модулюють RAGE, як лікарських засобів оцінювались результати їх застосування у різних тварин, взятих як відповідні моделі. Приклади таких моделей включають: a) інгібування під дією sRAGE утворення неоінтими на моделі щурів з рестенозом після пошкодження артерій, як у діабетичних, так і нормальних щурів, шляхом інгібування активації ендотелію, гладких м'язів і макрофагів за допомогою RAGE (Zhou et al., Circulation 107: 2238-2243 (2003)); b) інгібування взаємодії RAGE/ліганду з використанням sRAGE або антитіл проти RAGE, зниження утворення амілоїдних бляшок на моделі мишей з системним амілоїдозом (Yan et al., Nat. Med., 6: 643-651 (2000)). Зниження амілоїдних бляшок супроводжується зниженням рівня запальних цитокінів, інтерлейкіну-6 (IL-6) і макрофагального колонієстимулюючого фактора (М-КСФ), а також зниженою активацією NF-kB у оброблених тварин; c) RAGE-трансгенні миші (які здійснюють суперекспресію RAGE і негативну експресію домінантного RAGE) демонструють утворення бляшок і розлад розпізнавальної здатності, в рамках моделі мишей з ХА (Arancio et al., ЕМВО J., 23: 4096-4105 (2004)); d) використання sRAGE при лікуванні мишей з діабетом знижує проникність судин (Bonnardel-Phu et al., Diabetes, 48: 2052-2058 (1998)); е) лікування з використанням sRAGE знижує рівень атеросклеротичних пошкоджень у діабетичних мишей з аполіпопротеїном E-null і запобігає появі функціональних і морфологічних ознак діабетичної нефропатії у db/db мишей (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419: 80-88 (2003); і 43 93356 ι) sRAGE ослабляє тяжкість запалення на моделі мишей з артритом, індукованим колагеном (Hofmann et al., Genes Immunol., 3: 123-135 (2002)), на моделі мишей з експериментальним алергічним енцефаломієлітом (Yan et al., Nat. Med., 9: 28-293 (2003)) і на моделі мишей із запальним захворюванням кишечнику (Hofmann et al. Cell, 97: 889-901 (1999)). Таким чином, в одному варіанті здійснення білки злиття згідно з даним винаходом можуть використовуватися для лікування симптомів діабету і/або ускладнень діабету, опосередкованих RAGE. В альтернативних варіантах симптоми діабету або пізні ускладнення діабету можуть включати діабетичну нефропатію, діабетичну ретинопатію, діабетичну виразку стопи, серцево-судинні ускладнення діабету або діабетичну невропатію. Спочатку ідентифікований як рецептор молекул, експресія яких асоційована з патологією діабету, сам по собі RAGE є обов'язковим компонентом в патофізіології діабетичних ускладнень. Було показано, що інгібування взаємодії RAGE з його лігандом(ами) in vivo дає терапевтичний ефект на багатьох моделях діабетичних ускладнень і запалення (Hudson et al. Arch. Biochem. Biophys, 419: 80-88 (2003)). Наприклад, лікування протягом двох місяців з використанням антитіл проти RAGE нормалізувало ниркову функцію і знизило аномальну гістопатологію нирки у мишей з діабетом (Flyvbjerg et al. Diabetes, 53: 166-172 (2004)). Крім того, лікування з використанням розчинної форми RAGE (sRAGE), який зв'язується з лігандами RAGE та інгібує взаємодії RAGE/ліганду, знижує вираженість атеросклеротичних пошкоджень у діабетичних мишей з аполіпопротеїном E-null і знижує функціональну і морфологічну патологію діабетичної нефропатії у мишей db/db (Bucciarelli et al., Circulation., 106: 2827-2835 (2002)). Крім того, було показано, що неензиматичне глікоксилування макромолекул, що приводить в результаті до утворення кінцевих продуктів з підвищеним глікозилуванням (AGE), посилюється в сайтах запалення при нирковій недостатності, у випадку гіперглікемії та інших станів, асоційованих з системним або локальним окислювальним стресом (Dyer et al., J. Clin. Invest., 91: 2463-2469 (1993); Reddy et al., Biochem., 34: 10872-10878 44 (1995); Dyer et al., J. Biol. Chem., 266: 11654-11660 (1991); Degenhardt et al., Cell. Моl. Biol., 44: 11391145 (1998)). Накопичення AGE в судинній сітці може здійснюватись в осередках, наприклад, в суглобовому амілоїді, що складається з АGЕ-β2мікроглобуліну, виявленого у пацієнтів з амілоїдозом, пов'язаним з діабетом (Miyata et al., J. Clin. Invest., 92: 1243-1252 (1993); Miyata et al., J. Clin. Invest, 99: 1088-1094 (1996)), або в основному зустрічається в судинній сітці і тканині пацієнтів з діабетом (Schmidt et al., Nature. Med., 1: 1002-1004 (1995)). Прогресуюче накопичення AGE з плином часу у пацієнтів з діабетом говорить про те, що механізм ендогенного кліренсу не здатний ефективно функціонувати в сайтах осадження AGE. Такі акумульовані AGE мають здатність змінювати клітинні властивості за допомогою множини механізмів. Хоча AGE експресується на низькому рівні в нормальних тканинах і в судинній клітині, було показано, що в середовищі, де накопичуються ліганди рецептора, RAGE зазнає позитивної регуляції (Li et al., J. Biol. Chem., 272: 16498-16506 (1997); Li et al., J. Biol. Chem., 273: 30870-30878 (1998); Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275: 25781-25790 (2000)). Експресія RAGE підвищується в ендотелії, гладком'язових клітинах та інфільтруючих моноядерних фагоцитах судинної сітки при діабеті. Крім того, дослідження з використанням клітинної культури показали, що взаємодія AGE-RAGE викликає зміни клітинних властивостей, важливих для судинного гомеостазу. Використання білків злиття на основі RAGE при лікуванні патологій, пов'язаних з діабетом, проілюстроване на Фіг.13. Білок злиття на основі RAGE, ТТР-4000, оцінюють на моделі рестенозу у щурів з діабетом при проведенні вимірювання проліферації гладких м'язів і розмноження клітин інтими після ураження судинної сітки. Як показано на Фіг.13, лікування з використанням ТТР-4000 істотно знижує співвідношення інтима/середовище (І/С) (Фіг.13А, таблиця 1) на моделі асоційованого з діабетом рестенозу залежним від дози способом. Крім того, лікування з використанням ТТР-4000 істотно знижує асоційовану з рестенозом проліферацію гладком'язових клітин судинної сітки, залежним від дози способом. Таблиця 1 Ефект ТТР-4000 на моделі щурів з рестенозом IgG (n=9) Площа просвіту (мм2) Медіальна площа (мм2) Співвідношення І/С 0,2±0,03 0,12±0,01 1,71±0,27 ТТР-4000 (n=9) низька доза** (0,3мг/тварина через день ×4) 0,18±0,04 0,11±0,02 1,61±0,26 ТТР-4000 (n=9) висока доза** (1,0мг/тварина через день ×4) 0,16±0,02 0,11±0,01 1,44*±0,15 * Р
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюRage fusion proteins and methods of use
Автори англійськоюMjalli Adnan M.M., Tian Ye E., Webster Jeffrey C., Rothlein Robert
Назва патенту російськоюБелки слияния ha ochobe rage и способы их использования
Автори російськоюМджалли Аднан M.M., Тянь Йе E., Вебстер Джеффри K., Ротлейн Роберт
МПК / Мітки
МПК: C07K 19/00, C07K 14/705
Мітки: злиття, способи, використання, білки, основі
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/88-93356-bilki-zlittya-na-osnovi-rage-i-sposobi-kh-vikoristannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Білки злиття на основі rage і способи їх використання</a>
Rage-злиті білки і способи їх застосування
Номер патенту: 92154
Опубліковано: 11.10.2010
Автори: Стерн Девід М., Тянь Йє Е., Янь Ши Ду, Ротлейн Роберт, Вебстер Джеффрі К., Мджаллі Аднан М.М., Шмідт Анн Марі
МПК: C12N 15/62, C07K 14/705, A61K 38/17
Мітки: rage-злиті, білки, способи, застосування
Формула / Реферат:
1. Злитий білок, що містить фрагмент sRAGE людини, безпосередньо з'єднаний на своєму карбоксильному кінці з аміно-кінцем частини фрагмента важкого ланцюга фрагмента Fc імуноглобуліну, де (а) послідовність sRAGE людини наведена в SEQ ID NO: 5 або 6; (b) аміно-кінцева послідовність фрагмента sRAGE людини являє собою SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10 або послідовність, щонайменше на 90 % ідентичну SEQ ID NO: 9 або 10; (с)...
Дезінфікуючий засіб на основі полігуанідинів, способи його одержання та використання
Номер патенту: 84593
Опубліковано: 10.11.2008
Автори: Баранова Ганна Іванівна, Нижник Юрій Васильович, Марієвський Віктор Федорович
МПК: A01N 25/10, C08G 69/26, C08G 12/00, A61L 2/18, A61P 31/10, A61P 31/04
Мітки: дезінфікуючий, використання, одержання, полігуанідинів, основі, засіб, способи
Формула / Реферат:
1. Дезінфікуючий агент, що є водорозчинним похідним гуанідину загальної формули (1): {[-(CH2)m–HN–C–NH-]n[-R1-O–R2–O–R3-HN–C–NH-]y}z, (1) || || NH · НХ NH · НХ ,де: m = 6-12; n = 0–9; y = 0–9, причому, n і y...
Композиції, що диспергуються, на основі макромолекулярних сполук і способи їх одержання та використання
Номер патенту: 65538
Опубліковано: 15.04.2004
Автори: Платц Роберт М., Бордмен Теренс Д., Бревер Томас К.
МПК: A61K 38/00, A61K 9/12, A61K 38/28, A61K 9/14, A61K 9/48
Мітки: способи, основі, одержання, композиції, сполук, макромолекулярних, диспергуються, використання
Формула / Реферат:
1. Способ получения диспергируемых сухих порошков биологических макромолекулярных соединений, включающийполучение способной испаряться жидкой среды с заданной концентрацией биологического макромолекулярного соединения, имеющего молекулярный вес выше 2 kD,распыление жидкой среды, и сушку капель в потоке горячего газа для получения частиц со складчатостью по крайней мере 2, измеряемой с помощью воздухопроницаемости,...
Способи використання розчинного рецептора br43x2
Номер патенту: 74330
Опубліковано: 15.12.2005
Автори: Ксу Венфанг, Медден Карен, Ї Девід П., Гросс Джейн А.
МПК: A61P 43/00, C12N 1/15, A61P 37/00, C12P 21/02, A61P 13/12, A61P 35/00, C07K 16/28, A61P 11/00, C12N 15/09, A61P 7/06, C07K 14/705, A61P 25/28, A61P 37/06, A61K 38/00, A61K 38/17, C07K 19/00, A61K 39/395, A61P 9/12, A61P 31/18, A61P 7/02, C07K 14/715, A61P 37/02, C12N 5/10, C12P 21/08, A61P 35/02, C12N 1/21, A61P 29/00, A61P 31/04, A61P 19/02, A61P 21/04, A61P 3/10, A61P 11/06, C12N 1/19
Мітки: способи, рецептора, розчинного, br43x2, використання
Формула / Реферат:
1. Спосіб інгібування активності ztnf4 у ссавця, що включає призначення вказаному ссавцю ефективної кількості сполуки, яка вибрана з групи, що складається з:a) поліпептиду, що включає екстрацелюлярний домен BR43x2 (SEQ ID NO:2),b) розчинного поліпептиду, що включає екстрацелюлярний домен ТАСІ,c) поліпептиду, що включає екстрацелюлярний домен ВСМА,d) поліпептиду, що включає послідовність SEQ ID NO:10,e)...
Концентрат суспензії на масляній основі і способи одержання та використання вказаного концентрату
Номер патенту: 66747
Опубліковано: 15.06.2004
Автори: Зюссманн Райнер, ФРІШ Герхард
МПК: A01N 25/30, A01N 47/20, A01N 43/707, A01N 43/64
Мітки: вказаного, способи, основі, концентрат, концентрату, використання, суспензії, масляній, одержання
Формула / Реферат:
1. Концентрат суспензии на масляной основе, отличающийся тем, что он содержит:а) по меньшей мере одно биологически активное вещество, выбранное из группы гербицидов, таких как бискарбамат, бензофуран, сульфонилмочевина, триазинон, пиридазинон и пиридинкарбоновая кислота;б) по меньшей мере один тензид, выбранный из группы алкилэтоксилатов и алкиларилэтоксилатов, которые фосфатированы и при известных условиях нейтрализованы...