Пептид для імунотерапії пухлин, включаючи нейрональні пухлини та пухлини мозку

Реферат: UA 110599 C2 (12) UA 110599 C2 Цей винахід належить до пептидів, нуклеїнових кислот та клітин для використання в імунотерапевтичних методах. Зокрема, цей винахід стосується пептиду, який містить послідовність амінокислот SEQ ID NO: 4, що викликає перехресне реагування Т-клітин із зазначеним пептидом; де зазначена послідовність амінокислот включає безперервну ділянку амінокислот відповідно до SEQ ID NO: 4, причому вказаний пептид має загальну довжину від 8 до 16 амінокислот. UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Цей винахід відноситься до пептидів, нуклеїнових кислот та клітин для використання в імунотерапевтичних методах. Зокрема, цей винахід стосується імунотерапії раку. Крім того, цей винахід відноситься до епітопів пухлино-асоційованих пептидів цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL), разом або в поєднанні з іншими пухлино-асоційованими пептидами, котрі служать активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, стимулюючих протипухлинні імунні реакції. Цей винахід відноситься до 30 пептидних послідовностей та їхніх варіантів, одержаних з молекул HLA класу I і II пухлинних клітин людини, котрі можуть використовуватись в композиціях вакцин для викликання протипухлинних імунних реакцій. Рівень техніки Гліоми - це пухлини головного мозку, які мають походження з гліальних клітин у нервовій системі. Гліальні клітини, які зазвичай називаються нейроглія чи просто глія, є ненервовими клітинами, котрі забезпечують підтримку та харчування клітин, утримують гомеостаз, утворюють мієлін та беруть участь в передачі сигналів в нервовій системі. Дві найбільш важливі підгрупи гліом – це астроцитоми та олігодендроцитоми, названі відповідно до типу нормальних гліальних клітин, з яких вони походять (астроцити або олігодендроцити, відповідно). Мультиформна гліобластома (далі іменується "гліобластома"), що належить до підгрупи астроцитом, є найбільш типовою злоякісною пухлиною мозку у дорослих людей, що становить приблизно 40 % усіх злоякісних пухлин мозку та близько 50 % гліом. Вона агресивно втручається у центральну нервову систему та відзначається найвищим рівнем злоякісності (клас IV) серед усіх гліом. Хоча є стабільний прогрес в лікуванні цього захворювання, завдяки досягненням в нейровізуалізації, мікрохірургії, різноманітним варіантам лікування і препаратам, таким як темозоломід та опромінювання, гліобластоми залишаються невиліковними. Смертність від цієї пухлини мозку дуже висока: середня тривалість життя дорівнює від 9 до 12 місяців після першого діагнозу. 5річна виживаність в період спостерігання з 1986 по 1990 рік становила 8.0 %. На даний час, п'ятирічна виживаність після інвазивного лікування, включаючи повне видалення пухлини, все ж таки менше 10 %. Відповідно, існує велика медична потреба в альтернативному і ефективному терапевтичному методі. Пухлинні клітини гліобластом є найбільш недиференційованими серед пухлин мозку, отже клітини пухлини мають великий потенціал міграції та проліферації і є високо-інвазивними, що пояснює дуже несприятливий прогноз. Гліобластоми призводять до смерті внаслідок швидкого, агресивного та інфільтративного росту в мозку. Тип інфільтративного росту відповідає за нерезектабельний характер цих пухлин. Гліобластоми також відносно резистентні до опромінювання та хіміотерапії, і тому випадки рецидивів після курсу лікування є частими. Крім того, імунна реакція на неопластичні клітини є достатньо неефективною, з точки зору повного знищення усіх неопластичних клітин після хірургічного видалення та променевої терапії. Гліобластоми розділяються на первинні гліобластоми (de novo) та вторинні гліобластоми, в залежності від різниці в генному механізмі протягом злоякісної трансформації недиференційованих астроцитів або гліальних прекурсорних клітин. Вторинна гліобластома зустрічається у людей віком до 45 років. Протягом, в середньому, 4-5 років вторинна гліобластома розвивається з астроцитоми більш низької злоякісності в недиференційовану астроцитому. І навпаки, первинна гліобластома, переважно, зустрічається у старших людей, з середнім віком 55 років. В цілому, первинна гліобластома є швидкоплинною гліобластомою, яка характеризується прогресуванням пухлини протягом 3 місяців з того стану, коли не виявлено ніяких клінічних або патологічних аномалій (Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 2939 (IARC Press, Lyon, France, 2000)). Гліобластома мігрує по мієлінованих нервах та широко розповсюджується в центральній нервовій системі. В більшості випадків хірургічне втручання має лише обмежений тривалий терапевтичний ефект. Клітини злоякісної гліоми уникають детекції імунною системою хазяїна, оскільки вони генерують імуно-супресивні речовини, що погіршують проліферацію T-клітин та виробництво імуно-стимулюючого цитокіну IL-2. Внутрішньочерепні неоплазми можуть виникати з будь-яких конструкцій чи типів клітин, присутніх в ЦНС, включаючи мозок, м'які мозкові оболонки, гіпофіз, череп і навіть залишкові ембріональні тканини. Загальна щорічна захворюваність на первинні пухлини мозку в Сполучених Штатах становить 14 випадків на 100 000 людей. Найбільш типовими первинними пухлинами мозку є менінгіоми, які представляють 27 % від усіх первинних пухлин мозку, та гліобластоми - 23 % від усіх первинних пухлин мозку (в той час як гліобластоми нараховують 40 % злоякісних пухлин мозку у дорослих). Більшість з цих пухлин мають агресивну дію та високу злоякісність. Первинні пухлини мозку - найбільш розповсюджені солідні пухлини у дітей, і вони є второю найчастішою причиною смерті від раку у дітей, після лейкемії. 1 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пошук ефективних методів лікування гліобластом у пацієнтів все ще триває. Ведуться дослідження в галузі імунотерапії, або лікування із залученням імунної системи, у боротьбі з цими неопластичними клітинами. Перші багатообіцяючі результати були отримані компанією Northwest Biotherapeutics в імунотерапевтичних дослідженнях у людей, хворих на гліобластому, при використанні препарату "DCVax Brain", вакцини на клітинній основі, в якій застосовувалися дендритні клітини пацієнта, завантажені лізатами аутологічних пухлинних клітин, та препарату Celldex, в якому застосовувався пептид з EGFRvIII, для індукування антиген-специфічних реакцій CTL, що, в свою чергу, співвідносилося з тривалою середньою виживаністю, в порівнянні з середньою виживаністю, одержаною при використанні стандартних методів лікування (Heimberger et al., 2006). Колоректальна карцинома Згідно із даними Американського Товариства по Боротьбі з Раком, колоректальний рак (CRC) є третім з найбільш розповсюджених видів раку в США, на який захворюють більш ніж 175 000 нових пацієнтів кожного року. В США, Японії, Франції, Німеччині, Італії, Іспанії та Великобританії він уражає більш ніж 480 000 людей. Колоректальний рак є однією з найчастіших причин смертності від раку в розвинених країнах. Відносна виживаність протягом 1 року та 5 років для осіб з колоректальним раком становить 84 % та 64 %, відповідно. По закінченні 5 років виживаність продовжує знижуватись – до 57 % через 10 років після постановки діагнозу. Коли захворювання на колоректальний рак визначаються на ранній, локалізованій стадії, 5-річна виживаність дорівнює 90 %; однак, лише 39 % випадків колоректального раку діагностується на цьому етапі, переважно, внаслідок недостатнього скринінгу. Після регіонального розповсюдження раку, коли він уражає сусідні органи чи лімфовузли, виживаність протягом п'яти років падає до 68 %. У осіб з віддаленими метастазами 5-річна виживаність становить 10 %. Дослідження показують ймовірність виникнення колоректального раку як результату взаємодії між успадкованими факторами та впливом зовнішнього середовища. В більшості випадків, попередниками колоректальних пухлин вважаються аденоматозні поліпи; однак, переродження може тривати багато років. Основним фактором ризику колоректального раку є вік, оскільки 90 % випадків захворювання діагностуються у людей старше 50 років. Інші фактори ризику колоректального раку, за даними Американського Товариства по Боротьбі з Раком, включають вживання алкоголю, раціон харчування з великим вмістом жирів та/або червоного м'яса і недостатнім вживанням фруктів та овочів. Захворюваність продовжує зростати, зокрема, в таких регіонах, як Японія, де це може бути обумовлено переходом на західний стиль харчування, з надмірною кількістю жирів та м'яса в раціоні та зменшенням вживання харчових волокон. Однак, частота захворювань зростає не настільки швидко, як раніше, і це може бути обумовлено більш активним скринінгом та видаленням поліпів, що запобігає переродженню поліпів на рак. Як і у відношенні більшості солідних пухлин, терапією першого ряду є хірургічне втручання, однак, його переваги обмежуються ранніми стадіями захворювання, в той час як у значної частини пацієнтів діагностується запущена стадія. Стандартом лікування прогресуючого колоректального раку є режими хіміотерапії, які базуються на схемах з використанням фторурацила. Більшість таких режимів – це так звані схеми FOLFOX (інфузійне введення 5фторурацилу/лейковоріну плюс оксаліплатін) та FOLFIRI (ірінотекан, лейковорін, бюлюсне і тривале інфузійне введення 5-FU). Введення цитотоксичних препаратів третього покоління, таких як ірінотекан та оксаліплатін, збільшило надію на значне підвищення ефективності лікування, але прогноз все ще відносно несприятливий, і виживаність, в цілому, залишається на рівні приблизно 20 місяців при наявності метастазів, отже, незадоволені потреби стосовно лікування цієї хвороби поки що є високими. Останнім часом з'явилося нове покоління медикаментів, що діють цілеспрямовано на молекулярному рівні, таких як Avastin® (бевакізумаб) та Erbitux® (цетуксімаб), і близько 40 сполук знаходяться на завершальному етапі клінічної розробки для різних стадій колоректального раку. Комбінації декількох з цих сполук збільшують кількість потенційних варіантів терапії, які очікуються в майбутньому. Переважна більшість речовин є у фазі 2, причому на EGFR (рецептори епідермального фактора росту) ці сполуки діють частіше, ніж будь-які інші ліки, розроблені для колоректального раку, і це обумовлено фактом, що приблизно у 80 % хворих на колоректальний рак експресія EGFR підвищується. Зараз проводяться клінічні дослідження пацієнтів з II стадією захворювання, з поєднанням хіміотерапії та недавно ухвалених моноклональних антитіл (mAb) (цетуксімаб + ірінотекан або FOLFOX4; бевакізумаб як одиночний препарат або разом з FOLFOX4). Очікується, що період 2 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спостережень для одержання статистично значимих результатів цих досліджень становитиме від трьох до чотирьох років. Моноклональні антитіла (mAb), які на даний час використовуються в онкології, в цілому мають прекрасні шанси щодо їхнього використання без втручання в активну імунотерапію. Фактично, були одержані доклінічні дані (GABRILOVICH 1999) та клінічні докази, які свідчать про те, що зниження експресії VEGF (фактору росту ендотелія судин) (за допомогою бевакізумабу) позитивно впливає на активацію T-клітин, опосередковану DC (дендритними клітинами) (Osada T, Chong G, Tansik R, Hong T, Spector N, Kumar R, Hurwitz HI, Dev I, Nixon AB, Lyerly HK, Clay T, Morse MA. The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 2008 Jan 10.). Рак простати та інші пухлини Рак простати (рак передміхурової залози) є основною причиною смерті від раку у чоловіків: за наявними оцінками, в 2007 році було зареєстровано 27 050 смертельних випадків від цієї хвороби. Хоча з початку 1990-х років смертність серед білих чоловіків та афроамериканців знижувалася, показники смертності у афроамериканців залишаються більш ніж в два рази вищими, ніж у білих чоловіків. Рак простати – це найчастіше діагностований вид раку у чоловіків. За невиясненими до цього часу причинами, захворюваність у афроамериканців значно більша, ніж у білих. Показники захворюваності на рак простати значно змінилися за останні 20 років: із швидким збільшенням за період 1988-1992 років, різким спадом в 1992-1995 роках, та помірним ростом з 1995 року. Ці тенденції, значною мірою, відображають покращення скринінгу раку простати з аналізом крові для визначення рівня простато-специфічного антигену (PSA). Помірний зріст випадків захворювання за останнє десятиріччя, скоріше за все, пояснюється широко поширеним PSA-скринінгом серед чоловіків, молодших 65 років. Показники частоти захворювання на рак простати вирівнялися у чоловіків віком 65 років і більше. Захворюваність досягла піку у білих чоловіків в 1992 році (237.6 на 100 000 осіб) та афроамериканців у 1993 році (342.8 на 100 000 осіб). Лікування раку простати може включати пильне спостереження, хірургічне втручання, променеву терапію, терапію Високо-інтенсивним Фокусованим Ультразвуком (HIFU), хіміотерапію, кріохірургію, гормональну терапію або комбінацію деяких з цих методів. Вибір варіанту лікування залежить від стадії захворювання, індексу Глісона та рівня PSA. Іншими важливими факторами є вік чоловіка, загальний стан його здоров'я та відношення до потенційного лікування і можливих побічних ефектів. Оскільки будь-яке лікування може мати серйозні побічні ефекти, такі як еректильна дисфункція та недержання сечі, обговорення методу лікування часто зосереджується на досягненні балансу між задачами терапії та ризиками змін у стилі життя. Якщо рак поширюється за межі передміхурової залози, варіанти лікування значно змінюються, оскільки більшість лікарів, котрі займаються терапією раку передміхурової залози, використовують різні номограми для прогнозування ймовірності поширення. Лікування пильним спостереженням, HIFU, променевою терапією, кріохірургією та хірургічним втручанням взагалі пропонуються чоловікам, у яких рак залишається в межах передміхурової залози. Гормональна терапія та хіміотерапія часто призначаються у випадку захворювання, котре поширюється за межі передміхурової залози. Однак, є й винятки: променева терапія може використовуватись для деяких запущених пухлин, а гормональна терапія – для певних випадків пухлин на ранній стадії. Кріотерапія, гормональна терапія та хіміотерапія також можуть пропонуватись, якщо первісний варіант лікування не дає результату, і рак прогресує. У значної кількості пацієнтів, хворих на рак простати, які перенесли радикальну простатектомію внаслідок клінічно очікуваного росту, обмеженого ураженим органом, заключний гістологічний аналіз хірургічної проби показує локальне екстенсивне поширення пухлини за межі органу. У цих пацієнтів відзначається високий ризик ранніх місцевих рецидивів, що, як правило, можуть бути виявлені як підвищений рівень PSA, тобто, біохімічний рецидив. Можливі методи лікування в цьому випадку включають дистанційну променеву терапію та гормон- пригнічувальну терапію; однак, цінність таких терапевтичних підходів, зокрема, для подовження тривалого виживання пацієнта, не може вважатися доказаним. Крім того, треба враховувати можливі ускладнення, пов'язані з лікуванням, такі як розвиток звуження уретри (променева терапія), втрата лібідо та імпотенція, ризик зменшення солей кальцію в кістках скелету, що проявляється як остеопороз, та помітно збільшений ризик патологічних переломів кісток (при гормон-пригнічувальній терапії). Більш ніж 90 % усіх випадків раку простати виявляються на локальній та реґіонарній стадії; відносний показник 5-річної виживаності для пацієнтів, у яких пухлини діагностувалися на цих стадіях, досягає 100 %. Протягом останніх 25 років, 5-річна виживаність для усіх стадій в 3 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сукупності збільшилася з 69 % приблизно до 90 %. Відповідно до останніх даних, відносна 10річна виживаність становить 93 %, а 15-річна виживаність - 77 %. Значне покращення в показниках виживаності, зокрема, на рівні 5 років, можна частково віднести на рахунок раннього діагностування та удосконалення лікування. Проте, виживаність значно знижується після того, як пухлина поширюється на інші тканини та органи. Рак легенів За попередніми оцінками, в 2007 році в США очікується 210 000 нових випадків захворювання на рак легенів, що нараховує приблизно 15 % діагнозів раку. Захворюваність значно знижувалася у чоловіків, з 102 випадків на 100 000 осіб в 1984 році до 78.5 в 2003 році. У жінок зараз захворюваність залишається на одному й тому ж рівні після тривалого періоду зростання. Рак легенів клінічно класифікується як мілкоклітинний (13 %) або немілкоклітинний (87 %) рак, для цілей лікування. Рак легенів є причиною більшості смертей від ракових захворювань і у чоловіків, і у жінок. За прогнозами в 2007 році очікується 160 390 смертельних випадків від цього захворювання, що становить близько 29 % усіх смертей від раку. Щорічно, починаючи з 1987 року, від раку легенів вмирало більше жінок, ніж від раку молочної залози. Протягом періоду 1991-2003 років, показники смертності у чоловіків продовжували істотно знижуватися, приблизно на 1.9 % на рік. Зріст смертності від раку легенів у жінок припинився після постійного підвищення протягом кількох десятиліть. Ці тенденції в смертності від раку легенів відображають зменшення в кількості курців за останні 30 років. Методи лікування визначаються типом (мілкоклітинний чи немілкоклітинний) та стадією раку і включають хірургічне втручання, променеву терапію, хіміотерапію та спрямовану біологічну терапію, з використанням, наприклад, бевакізумабу (Avastin®) та ерлотінібу (Tarceva®). Для локалізованого раку, хірургічне втручання є зазвичай переважним методом лікування. Недавні дослідження вказують на те, що виживаність у випадку немілкоклітинного раку легенів на ранній стадії покращується завдяки хіміотерапії після проведення операції. Оскільки захворювання, як правило, вже є поширеним на момент його виявлення, часто використовуються променева терапія та хіміотерапія, іноді в поєднанні з хірургічною операцією. Хіміотерапія, окремо чи разом з променевою терапією, є взагалі переважним методом лікування мілкоклітинного раку легенів; при такій схемі лікування у великої кількості пацієнтів спостерігається ремісія, яка є в деяких випадках довготривалою. 1-річна відносна виживаність для раку легенів трохи підвищилася з 37 % в 1975-1979 роках до 42 % в 2002 році, значною мірою завдяки удосконаленням в хірургічній техніці та комбінованій терапії. Однак, 5-річний рівень виживаності для усіх стадій разом – лише 16 %. Виживаність становить 49 % для випадків, визначених, коли захворювання ще локалізоване; однак, лише 16 % діагнозів раку легенів ставиться на такій ранній стадії. Отже, існує необхідність в новому ефективному та безпечному методі лікування гліобластоми, пухлини передміхурової залози, раку молочної залози, раку стравоходу, колоректального раку, світло-клітинного раку нирки, раку легенів, ЦНС, раку яєчників, меланоми, раку підшлункової залози, плоско-клітинного раку, лейкемії, медулобластоми та інших пухлин, в яких спостерігається надмірна експресія сурвівіну та/або інших білків цього винаходу, для покращення стану пацієнтів без використання хіміотерапевтичних речовин або інших засобів, які можуть призвести до серйозних побічних ефектів. Стислий опис винаходу В першому аспекті цей винахід відноситься до пептиду, що включає послідовність, обрану з групи послідовностей від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 30 або її варіант, котрий є принаймні на 85 % гомологічним послідовності SEQ ID No. 1 – SEQ ID No. 30, або її варіанту, що викликає перехресне реагування T-клітин із зазначеним варіантом пептиду; де зазначений пептид не є повномірним поліпептидом сурвівіну людини. Переважно, вказаний пептид обирається з пептиду, який має специфічний HLA-підтип, такий як HLA-A*02 або HLA-DR. У другому аспекті, цей винахід відноситься до нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, відповідно до цього винаходу, або вектор експресії, здатний експресувати таку нуклеїнову кислоту. В третьому аспекті цей винахід відноситься до клітини хазяїна, яка вміщує нуклеїнову кислоту або вектор експресії, відповідно до цього винаходу, в якому зазначена клітина хазяїна, переважно, є антиген-презентуючою клітиною, зокрема, дендритною клітиною або антигенпрезентуючою клітиною. В четвертому аспекті цей винахід відноситься до методу in vitro для виробництва активованих цитотоксичних T-лімфоцитів (CTL), який включає контакт CTL in vitro з молекулами MHC людини класу І з завантаженим антигеном, що експресуються на поверхні належної 4 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антиген-презентуючої клітини або штучної імітації антиген-презентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації даного CTL антиген-специфічним способом, коли цей антиген є пептидом, відповідно до цього винаходу. В п'ятому аспекті цей винахід відноситься до використання пептиду, відповідно до цього винаходу, нуклеїнової кислоти або вектору експресії, відповідно до цього винаходу, клітини, відповідно до цього винаходу, чи активованого цитотоксичного Т-лімфоциту, виробленого за цим винаходом, для лікування раку чи для виробництва медикаменту проти раку, причому зазначений медикамент переважно є вакциною. Переважно, зазначене ракове захворювання обирається з наведених нижче: астроцитома, пілоцитна астроцитома, дізембріопластична нейроепітеліальна пухлина, олігодендрогліоми, епендімома, мультиформна гліобластома, змішані гліоми, олігоастроцитоми, медулобластома, ретінобластома, нейробластома, гермінома, тератома, гангліогліоми, гангліоцитома, центральна гангліоцитома, примітивні нейроектодермальні пухлини (PNET, наприклад, медулобластома, медулоепітеліома, нейробластома, ретінобластома, епендімобластома), пухлини пінеальної паренхіми (наприклад, пінеоцитома, пінеобластома), епендімальні клітинні пухлини, пухлини хороїдного сплетіння, нейроепітеліальні пухлини неясного походження (гліоматоз головного мозку, астробластома), гліобластома, рак простати, рак молочної залози, рак стравоходу, рак товстої кишки, колоректальний рак, гіпернефрома, світло-клітинний рак нирки, рак легенів, ЦНС, рак яєчників, меланома, рак підшлункової залози, плоско-клітинний рак, лейкемія та медулобластома, а також інші пухлини або види раку, що характеризуються підвищеною експресію сурвівіну та/бо інших білків цього винаходу. В шостому аспекті цей винахід відноситься до комплекту у такому складі: (a) контейнер, який вміщує фармацевтичну композицію, що включає пептид, відповідно до цього винаходу, нуклеїнову кислоту чи вектор експресії, відповідно до цього винаходу, клітину, відповідно до цього винаходу, або активований цитотоксичний T-лімфоцит, відповідно до цього винаходу, в розчині або в ліофілізованій формі; (b) додатково, другий контейнер, який вміщує розріджувач або відновлюючий розчин для ліофілізованої формуляції; (c) додатково, принаймні, один пептид, обраний з групи, яка складається з пептидів, відповідно до послідовності SEQ ID NOs 130, та (d) додатково, інструкції по використанню розчину та/або відновленню та/або використанню ліофілізованої формуляції. В переважному втіленні, пептид обирається з групи від SEQ ID NOs 1 до SEQ ID 24. В сьомому аспекті цей винахід відноситься до методу виробництва рекомбінантного антитіла, що специфічно зв'язується з класом I чи II головного комплексу гістосумісності людини (MHC), в комплексі з HLA-обмеженим антигеном, який включає: імунізацію клітин нелюдиноподібних ссавців, що розроблені шляхом генної інженерії та експресують зазначений головний комплекс гістосумісності людини (MHC) класу I чи II з розчинною формою молекули MHC класу I чи II, в комплексі з зазначеним HLA-обмеженим антигеном; виділення молекул мРНК з клітин, продукуючих антитіло, зазначеного нелюдиноподібного ссавця; створення бібліотеки фагового дисплея, що демонструє кодування молекул білку зазначеними молекулами мРНК; та виділення принаймні одного фагу з наведеної вище бібліотеки фагового дисплея, причому принаймні один такий фаг буде показувати специфічний зв'язок зазначеного антитіла з вказаним класом I чи II головного комплексу гістосумісності людини (MHC), в комплексі з зазначеним HLA-обмеженим антигеном. У восьмому аспекті цей винахід відноситься до антитіла, що специфічно зв'язується з класом I чи II головного комплексу гістосумісності людини (MHC), в комплексі з HLA-обмеженим антигеном, причому антитіло є поліклональним антитілом, моноклональним антитілом та/або химерним антитілом. Стислий опис винаходу Стислий опис малюнків Малюнок 1 показує мас-спектри рідинної хроматографії з ESI (іонізацією електророзпиленням), які ідентифікують пухлино-асоційовані пептиди (TUMAP) IGF2BP3-001 зі зразку гліобластоми GB6010, що представлені за способом, обмеженим MHC класу I. Малюнок 2 відображає профіль експресії мРНК генів-мішеней винаходу, які експресуються в зразках гліобластоми в дуже значній мірі. Експресія цих генів відсутня чи дуже низька в нормальних тканинах і значно підвищена в зразках гліобластоми. Відносні значення експресії мРНК показані для кількох нормальних тканин і окремих зразків мультиформної гліобластоми (GBM), які були визначені шляхом використання генних чипів. Значення співвідносяться з рівнями експресії в нормальній нирці (значення завжди довільно встановлюється на 1.0). Значення для нормальних тканин були генеровані з використанням комерційно доступних пулів мРНК. Букви в лапках означають "детекційний сигнал", який видає аналітична програма. 5 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "Детекційний сигнал" вказує, чи був транскріпт специфічно визначений у зразку взагалі, або чи могла спостерігатися якась значна детекція. Він може мати такі значення: "P" (присутній), "A" (відсутній) або "M" (виявлений в незначній мірі). Малюнок 3 показує тетрамерний аналіз проліферації CSP-001 та NLGN4X-001- специфічних CD8 позитивних лімфоцитів з периферичної крові здорового донора з використанням 6 мікросфер. 1 × 10 збагачених CD8-позитивними PBMC (мононуклеарів периферичної крові) на лунку стимулювалися кожного тижня мікросферами в поєднанні з анти-CD28 плюс пухлинний антиген високої щільності A*0201/CSP-001 (ліва панель) або анти-CD28 плюс пухлинний антиген високої щільності A*0201/NLGN4X-001 (права панель). Після трьох стимуляцій in vitro, усі клітини були викрашені антитілом CD8 FITC, тетрамерами з флуоресцентним маркуванням A*0201/ CSP-001 та A*0201/ NLGN4X-001. Клітини обмежуються популяцією CD8-позитивних лімфоцитів; цифри представляють процент клітин в зазначеному квадранті в межах CD8позитивних лімфоцитів. Малюнок 4 показує афінність пептидів HLA класу I цього винаходу до молекули MHC, кодованої алеллю HLA-A*0201. Константи дисоціації (KD) HLA-пептидів TUMAP класу І з винаходу та контрольного пептиду HBV-001 (елемент, який потужно зв'язує A*02) були виміряні за допомогою аналізу рефолдінгу MHC методом ELISA. Детальний опис винаходу Усі терміни, що використовуються в цьому винаході, мають визначення, наведені нижче, якщо не вказано інше. Термін "пептид" використовується тут для визначення ряду амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та та карбонільною групами суміжних амінокислот. Зазвичай пептиди мають довжину 9 амінокислот, але можуть мати довжину лише 8 амінокислот чи досягати довжини 16, або 10, 11, 12, 13, 14 чи 15 амінокислот. Термін "олігопептид" використовується тут для визначення ряду амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та карбонільною групами суміжних амінокислот. Довжина олігопептиду не є критичною для винаходу, якщо в ньому вміщені належний епітоп чи епітопи. Олігопептиди, як правило, за довжиною є меншими, ніж приблизно 30 амінокислот, та більшими, ніж приблизно 14 амінокислот. Термін "поліпептид" означає ряд амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та карбонільною групами суміжних амінокислот. Довжина поліпептиду не є критичною для винаходу, якщо він вміщує належні епітопи. На відміну від термінів "пептид" чи "олігопептид", термін "поліпептид" вживається для визначення молекул, які вміщують більш ніж приблизно 30 амінокислотних залишків. Пептид, олігопептид, білок чи полінуклеотид, що кодує таку молекулу, є "імуногенним" (тобто, "імуногеном" в рамках цього винаходу), якщо він здатний індукувати імунну реакцію. У випадку цього винаходу, імуногенність більш специфічно визначена як здатність індукувати Тклітинну реакцію. Отже, "імуноген" буде молекулою, здатною індукувати імунну реакцію, та у випадку цього винаходу, - молекулою, здатною індукувати Т-клітинну реакцію. T-клітинний "епітоп" є молекулою короткого пептиду, яка зв'язується з рецептором MHC класу I чи II, формуючи потрійний комплекс (альфа-ланцюг MHC класу I, бета-2-мікроглобулін та пептид), здатний розпізнаватися T-клітиною, яка має відповідний T-клітинний рецептор, що зв'язується з MHC/пептидним комплексом з належною афінністю. Пептиди, що зв'язуються з MHC-молекулами класу I, як правило, мають довжину 8-14 амінокислот, і найбільш типовою є довжина 9 амінокислот. Епітопи T-клітин, що зв'язуються з MHC-молекулами класу II, як правило, мають довжину 12-30 амінокислот. У випадку пептидів, котрі зв'язуються з молекулами MHC класу II, один і той самий пептид та відповідний T-клітинний епітоп можуть займати спільний коровий сегмент, але мати різну загальну довжину, внаслідок того, що бокові послідовності відрізняються за довжиною вище аміно-кінця ключової послідовності та нижче її карбоксильного кінця, відповідно. Рецептори MHC класу II мають більш відкриту конформацію, пептиди, зв'язані з рецепторами MHC класу II, відповідно, не повністю заглиблені в структуру пептидно-зв'язуючої "кишені" МНС-молекули класу II, як в пептидно-зв'язуючій "кишені" MHCмолекули класу І. Дивно, але це не відноситься до пептиду послідовності SEQ ID NO: 1, оскільки невеликі варіації в довжині пептиду ведуть до значного зниження активності (див. нижче). У людей існують три різні генетичні локуси, які кодують МНС-молекули класу I (MHCмолекули людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (HLA)): HLA-A, HLA-B та HLA-C. HLA-A*0l, HLA-A*02, і HLA-A*11 є прикладами різних алелей MHC класу І, що можуть експресуватися з цих локусів. 6 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В геномі людини є три різні локуси для генів MHC класу II: HLA-DR, HLA-DQ та HLA-DP. Рецептори MHC класу II є гетеродімерами, що складаються з альфа- та бета-ланцюгу, обидва з яких закріплюються в клітинній мембрані через трансмембранну ділянку. HLA-DRB1*04 та HLADRB1*07 – два приклади різних бета-алелей MHC класу II, котрі, як відомо, кодуються в цих локусах. Алелі класу II дуже поліморфні, наприклад, описано кілька сот різних HLA-DRB1алелей. Отже, для терапевтичних та діагностичних цілей в значній мірі доцільним є пептид, що зв'язується з належною афінністю з кількома різними рецепторами HLA класу II. Пептид, який зв'язується з кількома різними молекулами HLA класу II, називається гетерогенним лігандом. Посилання на ДНК-послідовність в цьому винаході включає однониткові та двониткові ДНК. Отже, конкретна послідовність, якщо контекст не передбачає іншого, відноситься до однониткової ДНК такої послідовності, дуплексу такої послідовності з її комплементом (двониткова ДНК) та комплементу такої послідовності. Термін "кодуюча ділянка" відноситься до тієї частини гену, яка природним чи нормальним способом кодує продукт експресії того гену в його природному геномному середовищі, тобто, до ділянки, що кодує in vivo природний продукт експресії гену. Кодуюча ділянка може бути з нормального гену, або гену, що мутував чи був змінений, або навіть бути з послідовності ДНК чи гену, повністю синтезованого в лабораторії з використанням методів, добре відомих досвідченим фахівцям в галузі синтезу ДНК. Термін "нуклеотидна послідовність" відноситься до гетерополімеру дезоксирібонуклеотидів. Нуклеотидна послідовність, що кодує конкретний пептид, олігопептид чи поліпептид, може мати природне походження чи створюватися синтетичним шляхом. В цілому, сегменти ДНК, що кодують пептиди, поліпептиди та білки цього винаходу, збираються з фрагментів кДНК та коротких олігонуклеотидних лінкерів, або з серії олігонуклеотидів, для одержання синтетичного гену, здатного експресуватися в рекомбінантній транскрипційній одиниці, яка вміщує регуляторні елементи, одержані з мікробного чи вірусного оперону. Термін "продукт експресії" означає поліпептид або білок, котрий є природним трансляційним продуктом гену та будь-якої нуклеїново-кислотної послідовності, що кодує еквіваленти, які є результатом деградації генетичного коду, і також кодує ті ж амінокислоти. Термін "фрагмент", стосовно кодуючої послідовності, означає частину ДНК, яка вміщує менш ніж повну кодуючу ділянку, і продукт експресії якої зберігає по суті ту ж біологічну функцію чи діяльність, що й продукт експресії повної кодуючої ділянки. Термін "сегмент ДНК" відноситься до полімеру ДНК, у формі окремого фрагменту чи як компонент більшої структури ДНК, що одержаний з ДНК, виділеної принаймні один раз по суті в чистій формі, тобто, без забруднюючих ендогенних матеріалів та в кількості чи концентрації, яка дає змогу ідентифікувати, виконувати маніпуляції та відновлювати сегмент і його складові нуклеотидні послідовності за допомогою стандартних біохімічних методів, наприклад, з використанням вектору клонування. Такі сегменти надаються у формі відкритої рамки зчитування, без порушень внутрішніми нетрансльованими послідовностями, чи інтронами, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетрансльованих ДНК можуть бути присутні по низхідній від відкритої рамки зчитування, де вони не заважають маніпуляціям або експресії кодуючих ділянок. Термін "праймер" означає коротку нуклеїново-кислотну послідовність, котра може бути спарена з однією ниткою ДНК та надає вільний 3'OH-кінець, на якому ДНК-полімераза розпочинає синтез дезоксирібонуклеотидного ланцюгу. Термін "промотор" означає ділянку ДНК, включену у зв'язування РНК-полімерази для ініціації транскрипції. Термін "відкрита рамка зчитування (ORF)" означає серію тріплетів, що кодують амінокислоти без будь-яких термінаційних кодонів, та є послідовністю, яка може (потенційно) транслюватися в білок. Термін "виділений" означає, що матеріал видаляється зі свого первісного середовища (наприклад, природного середовища, якщо він має природне походження). Наприклад, природно існуючий полінуклеотид чи поліпептид, присутній у живих тварин, не є виділеним, але той самий полінуклеотид чи поліпептид, відокремлений від якихось чи всіх співіснуючих матеріалів в природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути часткою вектору, та/або такі полінуклеотиди чи поліпептиди можуть становити частину композиції і продовжувати бути виділеними, якщо такий вектор чи композиція не є частиною свого природного середовища. Полінуклеотиди та рекомбінантні чи імуногенні поліпептиди, розкриті відповідно до цього винаходу, також можуть бути в "очищеній" формі. Термін "очищений" не вимагає абсолютної чистоти; він має на увазі відносне визначення та може включати препарати високого ступеню 7 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 очищення або препарати, які тільки частково очищені, в тому сенсі, як спеціалісти в цій галузі розуміють такі терміни. Наприклад, окремі клони, виділені з бібліотеки кДНК, були умовно очищені до електрофорезної однорідності. Очищення вихідного матеріалу чи природного матеріалу принаймні на порядок величини, переважно на два-три порядки, та більш переважно, на чотири- п'ять порядків величини, чітко передбачається в цьому винаході. Крім того, заявлений поліпептид, котрий має чистоту переважно в 99.999 %, або принаймні в 99.99 % чи 99.9 %; і навіть бажано 99 % за вагою, чи більше, також чітко пропонується. Нуклеїнові кислоти та продукти експресії поліпептидів, що розкриваються відповідно до цього винаходу, а також вектори експресії, які вміщують такі нуклеїнові кислоти та/або такі поліпептиди, можуть бути в "збагаченій формі". Термін "збагачений" в тому виді, в якому він використовується тут, означає, що концентрація матеріалу принаймні в 2, 5, 10, 100 або 1000 разів перевищує його природну концентрацію (наприклад), переважно 0.01 %, за вагою, принаймні переважно приблизно 0.1 % за вагою. Також передбачаються збагачені препарати приблизно в 0.5 %, 1 %, 5 %, 10 % та 20 % за вагою. Послідовності, структури, вектори, клони та інші матеріали, які складають цей винахід, можуть переважно бути у збагаченій чи виділений формі. Термін "активний фрагмент" означає фрагмент, що генерує імунну реакцію, тобто, має імуногенну функцію, при введенні (разом чи як додатково з прийнятним ад'ювантом) тварині, наприклад, ссавцю, такому як кролик чи миша, і також включаючи людину. Така імунна реакція має вид стимуляції Т-клітинної реакції у тварини-реципієнта, такої як людина. Альтернативно, "активний фрагмент" також може використовуватись для індукування Т-клітинної реакції in vitro. В цьому винаході терміни "частка", "сегмент" і "фрагмент", якщо вони використовуються по відношенню до поліпептидів, означають безперервну послідовність залишків, таких як амінокислотні залишки, причому ця послідовність утворює підгрупу більшої послідовності. Наприклад, якщо поліпептид був підданий обробці будь-якою з типових ендопептідаз, таких як трипсин або химотрипсин, олігопептиди, одержані в результаті такої обробки, будуть представляти частки, сегменти чи фрагменти початкового поліпептиду. Це означає, що будьякий такий фрагмент буде обов'язково вміщувати, як частину своєї амінокислотної послідовності, сегмент, фрагмент або частину, яка є по суті ідентичною, якщо не повністю ідентичною, послідовності від SEQ ID NO: 1 до 30, котра відповідає природним або "вихідним" білкам послідовностей від SEQ ID NO: 1 до 30. Якщо такі терміни використовуються стосовно полінуклеотидів, вони означають продукти, одержані після обробки зазначених полінуклеотидів будь-якою з типових ендонуклеаз. Відповідно до цього винаходу, термін "процентна ідентичність" або "процент ідентичності", відносно послідовності, означає, що послідовність порівнюється із заявленою або описаною послідовністю після вивірки послідовності, яка порівнюється ("Порівняна Послідовність"), з описаною або заявленою послідовністю ("Контрольна Послідовність"). Процентна ідентичність визначається відповідно до наведеної нижче формули: Процентна ідентичність = 100 [I -(C/R)] де C - кількість різниць між Контрольною Послідовністю та Порівняною Послідовністю на довжині вивірки в інтервалі порівняння між Контрольною Послідовністю та Порівняною Послідовністю, де (i) кожна основа чи амінокислота в Контрольній Послідовності, котра не має відповідної вивіреної основи чи амінокислоти у Порівняній Послідовності, і (ii) кожній розрив у Контрольній Послідовності та (iii) кожна вивірена основа чи амінокислота у Контрольній Послідовності, яка відрізняється від вивіреної основи чи амінокислоти у Порівняній Послідовності, становить різницю; та R – це кількість основ чи амінокислот в Контрольній Послідовності на довжині вивірки з Порівняною Послідовністю з будь-яким розривом, утвореним в Контрольній Послідовності, також зарахованим як основа чи амінокислота. Якщо існує вивірка між Порівняною Послідовністю та Контрольною Послідовністю, для якої процентна ідентичність, розрахована вище, є приблизно рівною чи більшою, ніж зазначена мінімальна Процентна Ідентичність, то Порівняна Послідовність має зазначену мінімальну процентну ідентичність до Контрольної Послідовності, навіть якщо можуть існувати вивірки, в яких розрахована, як описано вище, Процентна Ідентичність менша, ніж зазначена Процентна Ідентичність. Первісні пептиди, що розкриваються в цьому винаході, можуть модифікуватися заміщенням одного чи кількох залишків на різних, можливо, селективних, ділянках пептидного ланцюгу, якщо не зазначається інше. Такі заміщення можуть бути консервативного характеру, наприклад, коли одна амінокислота замінюється амінокислотою подібної структури та характеристик, тобто, коли 8 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гідрофобна амінокислота замінюється іншою гідрофобною амінокислотою. Навіть більш консервативною буде заміна амінокислот такого ж чи подібного розміру та хімічного характеру, наприклад, коли лейцин замінюється ізолейцином. В дослідженнях варіацій послідовностей в сімействах природних гомологічних білків, певні амінокислотні заміщення частіше допускаються, ніж інші, і вони часто демонструють кореляцію зі схожістю в розмірі, заряді, полярності та гідрофобності між первісною амінокислотою та її заміною, і це є основою для визначення "консервативних заміщень". Консервативні заміщення визначаються тут як заміни в межах однієї з наведених нижче п'яти груп: Група 1 – малі аліфатичні, неполярні чи слабо полярні залишки (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Група 2 – полярні, негативно заряджені залишки та їхні аміди (Asp, Asn, Glu, Gln); Група 3 – полярні, позитивно заряджені залишки (His, Arg, Lys); Група 4 – великі аліфатичні неполярні залишки (Met, Leu, Ile, Val, Cys); та Група 5 - великі ароматичні залишки (Phe, Tyr, Trp). Менш консервативні заміщення можуть включати заміну однієї амінокислоти іншою, котра має подібні характеристики, але трохи відрізняється за розміром, наприклад, заміна аланіну ізолейциновим залишком. Високо-неконсервативні заміни можуть включати заміщення кислотної амінокислоти полярною, або навіть такою, що є основною за своїм характером. Такі "радикальні" заміщення не можуть, однак, відхилятись як потенційно неефективні, оскільки їхні хімічні наслідки не є повністю прогнозованими, та радикальні заміщення також можуть несподівано призвести до сприятливих ефектів, які неможливо передбачити за простими хімічними принципами. Безумовно, такі заміщення можуть включати структури, інші ніж звичайні L-амінокислоти. Отже, D-амінокислоти можуть заміщуватися L-амінокислотами, котрі зазвичай виявляються в антигенних пептидах винаходу та охоплюються розкриттям в ньому. Крім того, амінокислоти, які мають нестандартні R-групи (тобто, R-групи, інші ніж можна знайти в типових 20 амінокислотах природних білків) також можуть використовуватись для заміщення, з метою виробництва імуногенів та імуногенних поліпептидів, відповідно до цього винаходу. Якщо виявляється, що заміщення в більш ніж одній позиції призводять до утворення пептиду по суті з еквівалентною чи більшою антигенною активністю, як визначено нижче, тоді комбінації цих заміщень будуть досліджуватись з метою визначення, чи мають комбіновані заміщення додатковий чи синергічний вплив на антигенність пептиду. Більшою частиною, не більш ніж 4 позиції в пептиді замінюються одночасно. Термін "Т-клітинна реакція" означає специфічну проліферацію та активацію ефекторних функцій, індукованих пептидом in vitro чи in vivo. Для CTL, обмежених MHC класу I, ефекторними функціями можуть бути лізис клітин-мішеней з імпульсно введеним пептидом, пептидним прекурсором чи клітин-мішеней, природно презентуючих пептид, секреція цитокінів, переважно гамма-інтерферону, TNF-альфа, або IL-2, індукована пептидом, секреція ефекторних молекул, переважно, гранзимів чи перфорінів, індукована пептидом, або дегрануляція. Для Т-клітин- хелперів, обмежених MHC класу II, ефекторні функції – це, ймовірно, індукована пептидом секреція цитокінів, переважно, IFN-гамма, TNF-альфа, IL-4, IL5, IL-10 або IL-2, чи індукована пептидом дегрануляція. Можливі ефекторні функції для CTL і Тклітин- хелперів не обмежуються цим переліком. Переважно, коли CTL, специфічні для пептиду послідовностей від SEQ ID NO: l до 30, перевіряються в порівнянні з заміщеними пептидами, пептидна концентрація, при якій заміщені пептиди досягають половини від максимального зростання в лізисі, відносно вихідних даних, становить не більше, ніж приблизно 1 мМ, переважно не більше, ніж приблизно 1 мкM, ще більш переважно не більше близько 1 нМ, і ще більш переважно не більше 100 пM, та найбільш переважно – не більше, ніж приблизно 10 пМ. Також є переважним, щоб заміщений пептид розпізнавався CTL від більш, ніж однієї людини, принаймні, від двох та, більш переважно, від трьох людей. Отже, епітопи цього винаходу можуть бути ідентичними природно існуючим пухлиноасоційованим чи пухлино-специфічним епітопам та можуть включати епітопи, що відрізняються не більш, ніж на 4 залишки від контрольного пептиду, за умови, що вони мають по суті ідентичну антигенну активність. Стимуляція імунної реакції залежить від наявності антигенів, які визнаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Виявлення існування пухлино-асоційованих антигенів дало можливість використовувати імунну систему хазяїна для сприяння імунній реакції, котра є специфічною для цільових антигенів, експресованих на поверхні клітин пухлин, що завдяки такому механізму дії здатна призводити до ремісії, затримки чи сповільнення росту пухлини. Зараз досліджуються різні механізми використання як гуморальних, так і клітинних важелів імунної системи для імунотерапії раку. 9 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Окремі елементи клітинної імунної реакції здатні специфічно розпізнавати та знищувати клітини пухлин. Виділення цитотоксичних T-лімфоцитів (CTL) з пухлино-інфільтруючих клітинних популяцій чи з периферичної крові наводить на думку, що такі клітини грають важливу роль в природному імунному захисті проти раку (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). На основі аналізу 415 зразків, взятих у пацієнтів з колоректальним раком, автори Galon et al. змогли продемонструвати, що тип, щільність та локалізація імунних клітин в пухлинній тканині, фактично, є кращим прогностичним фактором виживаності пацієнтів, ніж широко використовувана TNM-класифікація пухлин (Galon et al., 2006). MHC класу I презентують пептиди, які є результатом протеолітичного розщеплення, в основному, ендогенних протеїнів, DRIPS (дефектних продуктів рибосом) та більших за розміром пептидів. MHC-молекули класу II, переважно, знаходяться на професійних антигенпрезентуючих клітинах (APC); вони, в першу чергу, презентують пептиди екзогенних чи трансмембранних білків, що поглинаються АPC в ході ендоцитозу, та проходять подальшу обробку (Cresswell, 1994). Комплекси пептиду та MHC-молекули класу I розпізнаються CD8позитивними цитотоксичними T-лімфоцитами, які презентують відповідні TCR (рецептори Тклітин), а комплекси пептиду і MHC-молекули класу II розпізнаються CD4-позитивними Тклітинами- хелперами, що презентують відповідні TCR. Добре відомим є той факт, що TCR, пептид і MHC присутні в стехіометричному співвідношенні 1:1:1. CD4-позитивні T-клітини- хелпери відіграють важливу роль в індукуванні та підтриманні ефекторних реакцій CD8-позитивними цитотоксичними T-клітинами (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). Спочатку примування та розповсюдження CTL в лімфовузлах підтримується CD4- позитивними T-клітинами (Schoenberger et al., 1998). Відповідно, одним з механізмів може бути спрямування непідготовлених CD8-позитивних клітин до місця функціональної взаємодії CD4+T-клітина – APC (Castellino et al., 2006). Нарешті, утворення функціональних CD8-позитивних клітин пам'яті в більшості випадків залежить від допомоги CD4-позитивних T-клітин (Sun and Bevan, 2003; Janssen et al., 2003). З цієї причини, ідентифікація епітопів CD4-позитивних T-клітин, одержаних з пухлино-асоційованих антигенів (TAA), може мати велике значення для розробки фармацевтичних продуктів для викликання протипухлинних імунних (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). В місці локалізації пухлини, T-клітини- хелпери підтримують CTL- сприяюче цитокінне оточення (Qin and Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006) та притягують ефекторні клітини, наприклад, CTLS, NK-клітини, макрофаги, гранулоцити (Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007). За відсутністю запалення, експресія молекул MHC класу II, переважно, зводиться до клітин імунної системи, зокрема, до професійних антиген-презентуючих клітин (APC), наприклад, моноцитів, клітин, що походять з моноцитів, макрофагів, дендритних клітин. При дослідженні пацієнтів з пухлинами було несподівано виявлено, що клітини пухлини експресують MHCмолекули класу II (Dengjel et al., 2006). На моделях ссавців, наприклад, мишей, було продемонстровано, що навіть за відсутністю ефекторних клітин CTL (тобто, CD8-позитивних T-лімфоцитів), CD4-позитивні T-клітини є достатніми для візуалізації інгібування пухлин шляхом інгібування ангіогенезу завдяки секреції гамма-інтерферону (IFNγ) (Qin and Blankenstein, 2000). Крім того, було запропоноване пряме знищення клітин пухлин цитотоксичними CD4-позитивними T-клітинами за допомогою лімфотоксинів та гранзиму B (Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992). Крім того, було показано, що CD4-позитивні T-клітини, які розпізнають пептиди з пухлиноасоційованих антигенів, представлених молекулами HLA класу II, можуть протидіяти розвитку пухлин за допомогою індукування реакцій антитіл (Ab) (Kennedy et al., 2003). На відміну від пухлино-асоційованих пептидів, які зв'язуються з молекулами HLA класу I, лише невелика кількість лігандів класу II пухлино-асоційованих антигенів (TAA) була описана на даний час. Оскільки визначальна експресія молекул HLA класу II зазвичай обмежується клітинами імунної системи (Mach et al., 1996), можливість виділення пептидів класу II безпосередньо з первинних пухлин не вважалася ймовірною. Однак, автори Dengjel et al. за останній час досягли успіху в ідентифікації ряду епітопів MHC класу II безпосередньо з пухлин (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006). Антигени, котрі розпізнаються пухлино-специфічними цитотоксичними T-лімфоцитами, тобто, їхні епітопи, можуть бути молекулами, одержаними з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, транскрипційні фактори та ін., котрі експресуються та, в порівнянні з незміненими клітинами того ж самого походження, мають підвищену концентрацію в клітинах відповідної пухлини. 10 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Діюча класифікація пухлино-асоційованих антигенів (ТАА) включає наведені нижче основні групи (Novellino et al., 2005): 1. Антигени Cancer-testis: Перші TAA, що були ідентифіковані, котрі можуть розпізнаватися T-клітинами (van der Bruggen et al., 1991) належать до цього класу, і вони спочатку були названі антигени cancer-testis (CT), внаслідок експресії членів цього класу в гістологічно різних пухлинах людини та, серед нормальних тканин, тільки в сперматоцитах/сперматогонії сем'яників та, час від часу, в плаценті. Оскільки клітини сім'яників не експресують молекули HLA класу I і II, ці антигени не можуть розпізнаватися T-клітинами в нормальних тканинах і тому можуть вважатися імунологічно пухлино-специфічними. Добре відомі приклади CT-антигенів – це члени сімейства MAGE або NY-ESO-1. 2. Диференційовані антигени: Ці TAA зустрічаються і в пухлинах, і в нормальній тканини, з якої виникає пухлина; більшість з них знаходиться в меланомах та нормальних меланоцитах. Багато з цих меланоцитних білків, що відносяться до лінії диференціювання, беруть участь в біосинтезі меланіну і тому не є пухлино-специфічними, але незважаючи на це широко використовуються для імунотерапії раку. Приклади включають, без обмежень, тирозиназу та Melan-A/MART-1 для меланоми або PSA для раку простати. 3. Надмірно експресовані TAA: Гени, що кодують широко експресовані TAA, були визначені в гістологічно різних типах пухлин, а також в багатьох нормальних тканинах, в цілому, з більш низькими рівнями експресії. Можливо, багато епітопів, що процесуються та потенційно презентуються нормальними тканинами, нижче порогового рівня для розпізнавання Тклітинами, в той час як їхня надмірна експресія в клітинах пухлин може запускати протиракову реакцію за допомогою порушення раніше встановленої толерантності. Яскравими прикладами цього класу TAA є Her-2/neu, Сурвівін, Теломераза або WT1. 4. Пухлино-специфічні антигени: Ці унікальні TAA виникають з мутацій нормальних генів (таких як β-катенін, CDK4, та ін.). Деякі з цих молекулярних змін асоціюються з неопластичною трансформацією та/або прогресуванням. Пухлино-специфічні антигени, в цілому, здатні індукувати сильні імунні реакції без ризику аутоімунних реакцій проти нормальних тканин. З іншого боку, ці TAA в більшості випадків є релевантними тільки до конкретної пухлини, на якій вони були ідентифіковані, і зазвичай не зустрічаються на великій кількості інших пухлин. 5. TAA, що виникають з аномальних пост-трансляційних модифікацій: Такі TAA можуть виникати з білків, котрі не є пухлино-специфічними і не експресуються надмірно в пухлинах, але незважаючи на це стають пухлино-асоційованими внаслідок пост-трансляційних процесів, активних, перш за все, в пухлинах. Приклади цього класу виникають зі змінених моделей глікозилювання, котрі ведуть до нових епітопів в пухлинах, як у випадку MUC1 чи сплайсингу білків в ході деструкції, що може чи не може бути пухлино-специфічною (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004). 6. Онковірусні білки: Ці TAA є вірусними білками, котрі можуть відігравати вирішальну роль в онкогенному процесі, та внаслідок того, що ці білки є чужорідними (не людського походження), вони можуть викликати Т-клітинну реакцію. Прикладами таких білків є вірусні білки папіломи типу 16 у людини, E6 та E7, котрі експресуються в цервікальній карциномі. Для того, щоб білки розпізнавалися цитотоксичними T-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлино-асоційовані антигени, та з метою використання в лікуванні, мають бути дотримані деякі попередні умови. Антиген повинен експресуватися, головним чином, клітинами пухлин, а не нормальними здоровими тканинами, чи бути присутнім в здорових клітинах в порівняно невеликих кількостях. Крім того, бажано, щоб відповідний антиген був не тільки присутнім в будь-якому виді пухлин, але також знаходився у високих концентраціях (наприклад, кількість копій відповідного пептиду на клітину). Пухлино-специфічні та пухлино-асоційовані антигени часто походять з білків, що беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину внаслідок їхньої функції, наприклад, в контролі клітинного циклу чи в супресії апоптозу. До того ж, наступні мішені цих білків, які є основною причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, відповідно, бути непрямим чином асоційованими з пухлинами. Такі непрямо пухлино-асоційовані антигени також можуть бути мішенями у вакцинаційному підході (Singh-Jasuja et al., 2004). Істотно важливою в обох випадках є присутність епітопів в амінокислотній послідовності антигену, оскільки такий пептид ("імуногенний пептид"), одержаний з пухлино-асоційованого антигену, повинен призводити до Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo. По суті, будь-який пептид, здатний зв'язувати молекулу MHC, може функціонувати як Tклітинний епітоп. Передумовою для індукування Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo є наявність T-клітини з відповідним рецептором TCR та відсутність імунологічної толерантності до цього конкретного епітопу. 11 UA 110599 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Отже, TAA є відправною точкою для розробки протипухлинної вакцини. Методи ідентифікації та характеризації TAA основані на використанні CTL, котрі можуть бути виділені у пацієнтів або здорових людей, або вони базуються на генерації різних профілів транскрипції або різних моделей експресії пептидів пухлин і нормальних тканин (Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al., 2002). Однак, ідентифікація генів, надмірно експресованих в тканинах пухлин чи клітинних лініях пухлин людини, або селективно експресованих в таких тканинах чи клітинних лініях, не дає точної інформації щодо використання антигенів, транскрибованих з цих генів, в імунній терапії. Це можна пояснити тим, що тільки індивідуальна субпопуляція епітопів з цих антигенів є прийнятною для такого застосування, оскільки T-клітина з відповідним TCR повинна бути присутньою, а імунологічна толерантність до цього конкретного епітопа має бути відсутньою чи мінімальною. Отже, важливо обирати тільки ті пептиди з надмірно експресованих чи селективно експресованих білків, котрі презентуються в зв'язку із молекулами MHC, проти яких можна знайти функціональну T-клітину. Така функціональна T-клітина визначається як Т-клітина, що після стимуляції специфічним антигеном може клонально розмножуватись і здатна виконувати ефекторні функції ("ефекторна T-клітина"). T-клітини – хелпери відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції CTL в протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, які запускають реакцію Т-клітин- хелперів типу TH1, підтримують ефекторні функції CD8-позитивних T-клітин- кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлин, що експресують комплекси пухлиноасоційованого пептиду/MHC на своїх клітинних поверхнях.