Антиміостатинове моноклональне антитіло

1. Антиміостатинове моноклональне антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR) та варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR), причому LCVR містить: a) пептид CDRL1 з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 27, 28 або 29, b) пептид CDRL2 з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 30 i c) пептид CDRL3 з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 58; a HCVR містить: a) пептид CDRH1 з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 59, b) пептид CDRH2 з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 60, c) пептид CDRH3 з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 61. 2 (19) 1 3 95457 4 с) LCVR з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 7 та HCVR з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 21, 22, 23, 24, 25 або 56; d) LCVR з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 8, 9, 10, 11 або 12 та HCVR з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 55; е) LCVR з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 10 та HCVR з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 26. 5. Моноклональне антитіло за п. 4, яке містить LCVR з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 10 та HCVR з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № 26. 6. Моноклональне антитіло за будь-яким із пп. 1-5, яке являє собою непроцесоване антитіло, по суті інтактне антитіло, Fab-фрагмент, F(аb')2-фрагмент або одноланцюговий Fv-фрагмент. 7. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким із пп. 1-6 та фармацевтично прийнятний носій. 8. Моноклональне антитіло за будь-яким із пп. 1-6 для застосування як лікарський засіб. 9. Застосування ефективної кількості моноклонального антитіла за будь-яким із пп. 1-6 при виготовленні лікарського засобу для підвищення м'язової маси або підвищення густини кісток у суб'єкта, який цього потребує. 10. Застосування ефективної кількості моноклонального антитіла за будь-яким із пп. 1-6 при виготовленні лікарського засобу для лікування або запобігання одного або декількох станів, вибраних з групи, яку складають: слабкість, кахексія, виснаження м'язів, слабкість м'язів, міопатія, м'язова дистрофія, остеопороз, COPD, ниркова недостатність або хвороба, печінкова недостатність або хвороба, серцева недостатність, діабет типу II або порушення обміну речовин. Галузь, до якої належить винахід Цей винахід належить до галузі медицини, зокрема, до галузі моноклональних антитіл проти міостатину. Конкретніше, цей винахід має відношення до високоафінних химерних, гуманізованих або людських антиміостатинових антитіл, які з більшою перевагою, порівняно із зв'язуванням з GDF-11, зв'язуються з міостатином, та застосування цих антитіл для лікування, профілактики або діагностування різних розладів та станів у ссавців та птахів різних видів. Передумови створення винаходу Члени надродини білків трансформуючого фактора росту бета (TGF-) залучені до розвитку зародка і тканинного гомеостазу статевозрілих організмів. Спільною структурною особливістю членів надродини TGF- є пептидна сигнальна послідовність, необхідна для секреції білка, та амінокінцевий фрагмент, який протеолітичним шляхом відщеплюється на відстані приблизно 105-140 амінокислот від карбоксильного кінця великого білка-попередника з одержанням зрілого білка. Зрілий білок відрізняється висококонсервативними залишками цистеїну, у той час як активна форма зрілого білка являє собою сполучений дисульфідними зв'язками гомодимер протеолітично розщепленого пропротеїну [Грей A. (Gray А.), Мастон A. (Maston A.), Science, 247:1328, 1990]. Міостатин, який називають також фактором росту і диференціювання клітин-8 (GDF-8), є членом надродини білків TGF-. Міостатин має спільні структурні особливості з іншими членами родини TGF-. Він має у своєму складі гідрофобний амінокінець, який відіграє роль секреторного сигналу, і консервативний домен RSRR, важливий для протеолітичного процесингу. Наслідком розщеплення білка є одержання амінокінцевого, пов'язаного з латентністю пептиду та карбоксикінцевого зрілого сигнального пептиду, який утворює біологічно активний гомодимер. Міостатин головним чином експресується у скелетних м'язах, що розвиваються, та у розвинутих скелетних м'язах і функціонує як негативний регулятор скелетних м'язів. Наслідком системної надекспресії міостатину у статевоз рілих мишей є виснаження м'язів [Ціммерс (Zimmers) та інші, Science, 296:1486-1488, 2002], у той час як, навпаки, миші з блокованим міостатином відрізняються гіпертрофією та гіперплазією скелетних м'язів, наслідком чого є вдвічі або втричі більша м'язова маса порівняно з одноприплідними тваринами дикого типу, та зменшення накопичення жирового компонента тіла (Макферрон [McPherron) та інші, Nature, 387:83-90, 1997]. Як повідомлялось, мутація з блокуванням міостатину у людей пов'язується з макроскопічною гіпертрофією м'язів [Шульке (Scheulke) та інші, New Eng. J. Med. 350:2682, 2004]. На сучасному етапі існує обмежена кількість доступних способів лікування виснаження м'язів або розладів чи станів, корисним для яких було б збільшення м'язової маси та/або сили м'язів, у тому числі, наприклад, м'язової дистрофії, слабості, атрофії від бездіяльності та кахексії, а також розладів, які пов'язуються з виснаженням м'язів, наприклад, захворювання нирок, недостатності або хвороби серця і захворювання печінки. Завдяки своїй ролі негативного регулятора росту скелетних м'язів, міостатин є бажаною мішенню для терапевтичного або профілактичного втручання у разі таких розладів чи станів або контролювання розвитку таких розладів чи станів. Окрім його безпосередньої ролі у регуляції скелетних м'язів, міостатин може також бути залученим до інших фізіологічних процесів, у тому числі диференціації преадіпоцитів у адіпоцити (Кім (Кіт) та інші, BBRC, 281:902-906, 2001) і, опосередковано, до глюкозного гомеостазу [Макферрон А. (McPherron А.), Лі С-Дж. (Lee S-J.), JCI 109:595, 2002] та пригнічення утворення кісткової тканини [Хемрік М. (Hamrick M.), Мої. Cell Evol. Biol 272 388-391, 2003; Хемрік (Hamrick) та інші, Calcif Tissue Int., 71:63, 2002]. Таким чином, міостатинспецифічні антагоністи, наприклад, міостатинспецифічні антитіла, можуть також виявитись корисними для лікування, профілактики або контролювання розладів або станів, наприклад, таких, благотворним для яких було б підвищення густини кісткової тканини (наприклад, 5 остеопороз), діабету типу II, порушення обміну речовин, ожиріння та остеоартриту. Міостатин є висококонсервативним у різних видів; амінокислотна послідовність зрілої форми міостатину у людини, миші, пацюка, курки, індика і корови є 100 % ідентичною (дивись Фіг. 2 і Фіг. 3). У великої рогатої худоби спостерігаються природні мутації міостатину, які пов'язують із подвійном'язовим фенотипом (Макферрон [McPherron) та інші, PNAS, 94:12457-12461, 1997]. Оскільки міостатин є висококонсервативним як за послідовністю, так і за функцією у різних видів, тому антиміостатинове антитіло являє собою перспективний засіб підвищення м'язової маси або лікування чи профілактики розладів та станів, які були згадані вище, не тільки у людей, але також і у інших ссавців, у тому числі, наприклад, хатніх тварин (наприклад, собак та кішок), спортивних тварин (наприклад, коней), тварин, які задовольняють харчові потреби (наприклад, великої рогатої худоби, свиней, овець) та птахів різних видів (наприклад, курок, індиків, качок та інших мисливських і свійських птахів). Фактор росту і диференціювання клітин-11, який називають також GDF-11 або BMP-11, є членом надродини білків TGF-p, найбільш гомологічним по відношенню до міостатину. Амінокислотна послідовність зрілих форм людського міостатину і GDF-11 є ідентичною приблизно на 90 %, однак GDF-11 експресується у ширшому діапазоні тканин, аніж GDF-8, у тому числі у пульпі зубу, тканині головного мозку, серцевій, нирковій і легеневій тканині, а також у м'язовій і жировій тканині [Накашіма (Nakashima) та інші, Mech. of Development, 80:185, 1999]. Миші з блокованим GDF-11 гинуть у межах 24 год. після народження із численними відхиленнями від норми. Зокрема, такі миші демонструють зайві пари ребер, у них бракує нирок і у них виявляють пороки розвитку шлунка, селезінки і підшлункової залози [Макферрон (McPherron) та інші, Nature Genetics, 22:260, 1999; Ескела (Esquela) та Лі (Lee), Dev. Biol, 257:356, 2003; Хармон (Harmon) та інші, Devpt, 131:6163, 2004]. Нещодавно було встановлено, що людський GDF-11 регулює часові вікна, у межах яких поліпотентні попередники зберігають компетентність із продукування різних нащадків нервів [Кім Дж. (Kim J.) та інші, Science, 308:1927-1930, 2005]. Існує терапевтична потреба у специфічному пригніченні активності міостатину без пригнічення або з мінімальним пригніченням активності інших білків надродини TGF-, зокрема, GDF-11, для зведення до мінімального рівня можливості небажаних побічних ефектів, що є наслідком зв'язування антагоніста міостатину з іншим білком надродини TGF-. Окрім того, існує діагностична потреба у антиміостатиновому антитілі, яке не вступає до перехресної реакції або є мінімально перехреснореактивним з іншим білком надродини TGF-, зокрема, GDF-11, для точнішого контролювання або визначення рівнів міостатину у зразку. На додаток до цього, існує потреба у міостатинспецифічних антитілах, які специфічно і переважно зв'язують міостатин із високою афінністю і, тим самим, уможливлюють зведення до мінімального рівня дози, яку одержують хворі, наслідком чого, 95457 6 тим самим, може бути рідше введення дози такого антитіла, порівняно з антитілом, яке зв'язує міостатин із меншою афінністю (тобто більшою KD). Високоафінне антитіло є також бажаним тому, що воно може уможливити більшу гнучкість у виборі шляхів введення антитіла хворому, оскільки внутрішньовенний шлях введення лікарського засобу є менш бажаним, аніж, наприклад, підшкірний. Існує також потреба у міостатинспецифічних антитілах із низьким або сприятливим у інших відношеннях значенням ІС50 У аналізах біологічної активності міостатину для одержання терапевтичного антиміостатинового антитіла з мінімальною ефективною терапевтичною дозою. Бажано також надати антитіла, специфічні по відношенню до міостатину, де будь-яка імунна реакція на антитіло, яка виникає у хворого, що одержує згадане антитіло, є зведеною до мінімального рівня. Цей винахід задовольняє ці потреби і забезпечує відповідні переваги. Суть винаходу Антитілами за цим винаходом є химерні, гуманізовані або повністю людські антиміостатинові моноклональні антитіла та їхні антигензв'язувальні фрагменти, що антагонізують або нейтралізують щонайменше одну in vitro або in vivo біологічну активність або властивість, що пов'язується з міостатином або його частиною. За одним із варіантів здійснення антитіла за цим винаходом, що специфічно та/або переважно зв'язують міостатин, є значно менш реактивними з GDF-11, аніж із міостатином, тобто моноклональне антитіло за цим винаходом зв'язує міостатин щонайменше приблизно у 2 рази, 3 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 22 рази, 24 рази або 25 разів більше, аніж воно зв'язує GDF-11, за результатами визначення за методами, прийнятими у цій галузі, наприклад, за допомогою конкурентного ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз) або аналізу BIACORE чи KINEXA, для демонстрації більшої спорідненості (тобто нижчої KD) згаданого антитіла до GDF-8, аніж GDF-11. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, рівні зв'язування GDF-11 антитілами за цим винаходом, у разі експресії у вигляді Fab-фрагментів, за результатами будь-якого аналізу зв'язування, доступного у цій галузі, не перевищують фонових рівнів. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом специфічно зв'язують міостатин у межах домену, що стягує амінокислоти 40-64 [ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA для людини], 43-57 [CSGECEFVFLQKYPH або CSGESEFVFLQKYPH для людини] та/або 45-59 [GECEFVFLQKYPHTH для людини] зрілого міостатину або вони специфічно зв'язують поліпептид, що містить амінокислоти 40-64, 43-57 та/або амінокислоти 45-59 зрілого міостатину. За одним із варіантів здійснення антитіла за цим винаходом мають ІС50 меншу за або таку, що дорівнює приблизно 25 нМ, 20 нМ, 16 нМ, 14 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 6 нМ або 5,2 нМ у in vitro аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи (дивись Приклад 6). За варіантом, якому віддається перевага, такі антитіла за цим винаходом додатково відрізняються тим, що вони є значно менш реактивними з GDF-11 порівняно з GDF-8, тобто зв'язують міос 7 татин щонайменше приблизно у 2 рази, 3 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 22 рази, 24 рази або 25 разів більше, аніж вони зв'язують GDF-11, за результатами визначення за методами, прийнятими у цій галузі, наприклад, за допомогою конкурентного ELISA або аналізу BIACORE чи KINEXA, для демонстрації більшої спорідненості (тобто нижчої KD) згаданого антитіла до GDF-8, аніж GDF-11, і за варіантом, якому віддається ще більша перевага, вони зв'язують міостатин у межах домену, що стягує амінокислоти 40-64, 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину або вони зв'язують поліпептид, що містить амінокислоти 40-64, 43-57 та/або 45/59 зрілого міостатину. За одним із варіантів здійснення антитіла за цим винаходом відрізняються сильною зв'язувальною спорідненістю (KD) до міостатину, тобто мен-8 -8 -9 шою за приблизно 3х10 М, 1х10 М або 1х10 М, за варіантом, якому віддається перевага, меншою -10 -10 за приблизно 9×10 М, 8,7×10 М або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, мен-11 шою за приблизно 8×10 М. За альтернативним варіантом антитіла за цим винаходом відрізняються КD відносно міостатину не більшою за приблиз-8 -8 -9 -10 но 3х10 М, 1х10 М, 1х10 М, або 9х10 М за варіантом, якому віддається більша перевага, не -10 більшою за приблизно 8,7х10 М і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, не більшою -11 за приблизно 8×10 М. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом, які відрізняються сильною зв'язувальною спорідненістю, як описано вище, також мають ІС50 меншу за 25 нМ, 20 нМ, 16 нМ, 14 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 6 нМ або 5,2 нМ у in vitro аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи та/або вони є значно менш реактивними з GDF-11, порівняно з GDF-8. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, вони зв'язують міостатин у межах домену, що стягує амінокислоти 40-64, 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину, та/або вони зв'язують поліпептид, що містить амінокислоти 40-64, 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину. За іншим варіантом здійснення антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом містить поліпептид варіабельної ділянки легкого ланцюга ("LCVR") з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, до складу якої входять ПОСЛІДОВНОСТІ № 5-12. За іншим варіантом здійснення антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом містить поліпептид варіабельної ділянки важкого ланцюга ("HCVR") з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, до складу якої входять ПОСЛІДОВНОСТІ № 13-26, № 55 та № 56. Послідовності, що пов'язуються з ПОСЛІДОВНОСТЯМИ кожного номера, представлені на наведених у цьому описі Фіг. 5-9. За іншим варіантом здійснення моноклональним антитілом за цим винаходом є антитіло, яке може конкурувати за зв'язування з людським міостатином із конкуруючим антитілом, як демонструється доступним аналізом у цій галузі (наприклад, конкурентний ELISA), де згадане конкуруюче антитіло містить два поліпептиди з послідовностями, вибраними з групи, до складу якої входять: (і) ПОСЛІДОВНОСТІ № 5 та № 15, (іі) ПОСЛІДОВНОСТІ 95457 8 № 5 та № 16, та (ііі) ПОСЛІДОВНОСТІ № 10 та № 26. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, що конкурує з конкуруючим антитілом, визначення якого наведено вище, додатково відрізняється переважним зв'язуванням GDF-8 порівняно з GDF-11, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, вони зв'язують міостатин у межах домену, що стягує амінокислоти 40-64, 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину та/або вони зв'язують поліпептид, що містить амінокислоти 40-64, 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, що конкурує з конкуруючим антитілом, визначення якого наведено вище, додатково відрізняється КD відносно міостатину не біль-8 -8 -9 шою за приблизно 3х10 М, 1х10 М, 1х10 М, -10 -10 -11 9х10 М, 8,7×10 М або 8x10 M. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, що конкурує з конкуруючим антитілом, визначення якого наведено вище, додатково відрізняється ІС50 меншою за 25 нМ, 20 нМ, 16 нМ, 14 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 6 нМ або 5,2 нМ у in vitro аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи. За одним із варіантів здійснення антиміостатинове антитіло за цим винаходом має варіабельну ділянку важкого і легкого ланцюга, де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки (CDR) з наведеними нижче амінокислотними послідовностями: CDRH1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 59), CDRH2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 60) та CDRH3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 61); та/або де варіабельна ділянка легкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки (CDR) з наведеними нижче амінокислотними послідовностями: CDRL1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 57), CDRL2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 30) та CDRL3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 58). Антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом може додатково містити константну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, до складу якої входить людський (або по суті людського походження) IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM та IgD, за варіантом, якому віддається перевага, IgG1 або IgG4. Антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом може додатково містити людську константну ділянку легкого ланцюга типу каппа або лямбда. У разі, коли антитіло призначене для застосування як терапевтичний засіб для людей, константна ділянка за варіантом, якому віддається перевага, має по суті людське походження. У разі, коли антитіло призначене для застосування як терапевтичний засіб для тварини окрім людини, або яйця тварини окрім людини, константна ділянка за варіантом, якому віддається перевага, походить по суті від тварини, для якої згадане антитіло призначене як терапевтичний засіб [дивись, наприклад, Кларксон К. (Clarkson С.) та інші, Мої. Ітт., 30:1195-1204, 1993; заявка на патент США № 2002/01651350; та номери Genbank X69797, U03778, Х16701, Х07174, АВ016711]. Цим винаходом передбачаються антитіла різних форм. Наприклад, антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом може містити або являти собою інтактне антитіло (тобто непро 9 цесоване антитіло, що має інтактний Fcфрагмент), по суті інтактне антитіло або його антигензв'язувальний домен (наприклад, Fab, Fab', F(ab')2) або одноланцюговий Fv-фрагмент. Зрозуміло, що антитіла усіх таких форм позначаються у цьому описі терміном "антитіло". На додаток до цього, антитіло за цим винаходом може мітитись виявною міткою, іммобілізуватись на твердій фазі та/або кон'югуватись із гетерологічною сполукою, наприклад, ферментом або молекулою поліетиленгліколю. Окрім того, антитіла за цим винаходом вважаються "моноклональними", незважаючи навіть на те, що вони можуть різнитись за характером глікозилування. У цьому описі передбачаються діагностичні, терапевтичні та профілактичні варіанти застосування моноклональних антитіл за цим винаходом. За одним із діагностичних варіантів застосування цей винахід пропонує спосіб визначення присутності та/або кількості білка міостатину, що включає піддання експериментального зразка, підозрюваного на вміст білка міостатину, впливу антиміостатинового антитіла за цим винаходом та визначення специфічного зв'язування антитіла із зразком. Антиміостатинове антитіло за цим винаходом може застосовуватись для визначення рівнів міостатину у експериментальних зразках шляхом порівняння значень експериментального зразка зі стандартною кривою, яку одержали шляхом зв'язування згаданого антитіла зі зразками з відомими кількостями міостатину за допомогою будь-якого способу, доступного у цій галузі, наприклад, ELISA. Цей винахід додатково пропонує набір, до складу якого входить антитіло за цим винаходом, і за варіантом, якому віддається перевага, інструкції із застосування антитіла для виявлення білка міостатину у, наприклад, експериментальному зразку. За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка містить антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом. Фармацевтична композиція за цим винаходом може додатково містити фармацевтично прийнятний носій. У згаданій фармацевтичній композиції антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом являє собою активний інгредієнт. За варіантом, якому віддається перевага, фармацевтична композиція містить гомогенну або по суті гомогенну популяцію антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом. Композиція для терапевтичного застосування є стерильною і може ліофілізуватись та за варіантом, якому віддається перевага, поставлятись із відповідним розріджувачем. Цей винахід пропонує спосіб пригнічення щонайменше однієї біологічної активності міостатину у тварини, за варіантом, якому віддається перевага, у ссавця або птаха, за варіантом, якому віддається перевага, у людини, яка цього потребує, який включає введення терапевтично ефективної кількості або профілактично ефективної кількості чи кількості антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом, яка нейтралізує або пригнічує міостатин, згаданому ссавцю або птаху. Цей винахід додатково пропонує спосіб підвищення м'язової маси або лікування чи профілактики 95457 10 захворювання чи розладу або стану, симптоми якого поліпшуються завдяки нейтралізації або антагонізування біологічної активності міостатину, що включає введення хворому (наприклад, людині), який потребує такого лікування або профілактики, терапевтично або профілактично ефективної кількості моноклонального антитіла за цим винаходом. Цей винахід пропонує антиміостатинове моноклональне антитіло для застосування при виготовленні лікарського засобу для введення ссавцю, за варіантом, якому віддається перевага, людині, для лікування, наприклад, слабкості, кахексії, вікової саркопенії, виснаження або слабкості м'язів, міопатії, м'язової дистрофії, остеопорозу, ожиріння, COPD (хронічне обструктивне захворювання легень), ниркової недостатності або хвороби, печінкової недостатності або хвороби, серцевої недостатності або хвороби, порушення обміну речовин та діабету типу II у ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, у людини, яка цього потребує, шляхом введення згаданому ссавцю терапевтично ефективної або профілактично ефективної кількості антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом. Цей винахід пропонує готовий виріб, до складу якого входить пакувальний матеріал і антитіло за цим винаходом, яке знаходиться у згаданому пакувальному матеріалі, причому згаданий пакувальний матеріал включає пакувальну вкладку, на якій за варіантом, якому віддається перевага, вказується, що антитіло специфічно нейтралізує або антагонізує активність міостатину або знижує рівень міостатину. Факультативно на пакувальній вкладці додатково вказується, що антитіло переважно нейтралізує або антагонізує активність міостатину порівняно з активністю GDF-11, або переважно зменшує рівень міостатину порівняно зі зниженням рівня GDF-11 шляхом переважного зв'язування міостатину порівняно зі зв'язуванням GDF-11. Цей винахід додатково пропонує виділену нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло за цим винаходом; вектор (або вектори), що містить(-ять) згадану нуклеїнову кислоту, за факультативним варіантом функціонально зв'язаний(-і) з контрольними послідовностями, які розпізнаються клітиною-хазяїном, трансформованою згаданим вектором; клітину-хазяїна, яка містить згаданий вектор; спосіб продукування антитіла за цим винаходом, який включає культивування згаданої клітинихазяїна таким чином, що згадана нуклеїнова кислота експресується, і за факультативним варіантом виділення згаданого антитіла із середовища клітини-хазяїна. Стислий опис фігур На Фіг. 1 представлена амінокислотна послідовність людського проміостатину з підкресленою сигнальною послідовністю і виділеною жирним шрифтом частиною білка на карбоксильному кінці, яка утворює мономер міостатину зрілої форми. На Фіг. 2 представлена амінокислотна послідовність мономерного людського зрілого міостатину. Активний людський міостатин являє собою гомодимер цього поліпептиду, зв'язаний дисуль 11 фідними зв'язками. Антигенна детермінанта за цим винаходом підкреслена. Ця послідовність ідентична послідовності зрілого міостатину у миші, пацюка, курки, індика, собаки, коня і свині. На Фіг. З представлено впорядковане розміщення амінокислотної послідовності зрілого міостатину ссавців та птахів різних видів. На Фіг. 4 представлено впорядковане розміщення амінокислотної послідовності зрілої форми людського міостатину і людського GDF-11 із підкресленою антигенною детермінантою за цим винаходом і виділеними жирним шрифтом залишками у межах згаданої антигенної детермінанти, якими відрізняються міостатин і GDF-11. На Фіг. 5 представлено впорядковане розміщення амінокислотної послідовності варіабельних ділянок важкого ланцюга (HCVR) із каркасом VH270. Гіперваріабельні ділянки (CDR) виділені жирним шрифтом. На Фіг. 6 представлено впорядковане розміщення амінокислотної послідовності варіабельних ділянок важкого ланцюга (HCVR) із каркасом VH439. Гіперваріабельні ділянки (CDR) виділені жирним шрифтом. На Фіг. 7 і Фіг. 8 представлено впорядковане розміщення амінокислотної послідовності варіабельних ділянок легкого ланцюга (LCVR) із каркасом 02. Гіперваріабельні ділянки (CDR) виділені жирним шрифтом. На Фіг. 9 представлена амінокислотна послідовність гіперваріабельних ділянок LCVR та HCVR різних антитіл за цим винаходом. На Фіг. 10 представлена амінокислотна послідовність LCVR різних мишачих антиміостатинових антитіл, де будь-яке з них може бути зразковою вихідною молекулою для антитіл за цим винаходом. Дивись включені до цього опису заявки на патенти США № 60/559,621 та № 60/555,456. На Фіг. 11 представлена амінокислотна послідовність HCVR різних мишачих антиміостатинових антитіл, де будь-яке з них може бути зразковою вихідною молекулою для антитіл за цим винаходом. Дивись включені до цього опису заявки на патенти США № 60/559,621 та № 60/555,456. Докладний опис винаходу Цей винахід пропонує антиміостатинові моноклональні антитіла, здатні до специфічного зв'язування з міостатином ссавців або птахів (пропротеїном або зрілим білком чи його частиною, мономерною або гомодимерною), де згадані антитіла додатково відрізняються тим, що вони є химерними, гуманізованими або повністю людськими антитілами або їхніми антигензв'язувальними доменами, здатними нейтралізувати або антагонізувати щонайменше одну активність міостатину in vitro та/або in vivo: за варіантом, якому віддається перевага, демонструють ІС50 меншу за приблизно 25 нМ, 20 нМ, 16 нМ, 14 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 6 нМ або 5,2 нМ у аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи, та/або за варіантом, якому віддається перевага, демонструють високу зв'язувальну спорідненість до міостатину. Антитіла за цим винаходом додатково відрізняються тим, що вони зв'язують міостатин у межах домену, що стягує амінокислоти на залишках 40-64 зрілої форми міостатину (на 95457 12 приклад, ПОСЛІДОВНІСТЬ № 53), і є значно менш реактивними з найближчим гомологом міостатину, GDF-11. Визначення У разі вживання у цьому описі, термін "зрілий міостатин" (дивись ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2 для людини, миші, пацюка, курки, індика, собаки, коня та свині) означає мономерну або гомодимерну форму білка, який одержали шляхом протеолітичного розщеплення на Arg 266 пропротеїнової форми міостатину довжиною 375 амінокислот. У разі вживання у цьому описі, термін "міостатин" означає зрілий міостатин. У разі вживання у цьому описі, термін "проміостатин" або "пропротеїнова форма міостатину", у разі вживання відносно людського білка, означає білок, що містить послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 1, у вигляді мономера або гомодимера. Непроцесоване антитіло у тому вигляді, у якому воно існує за природних умов, являє собою молекулу імуноглобуліну, що складається із чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (Н) ланцюгів (приблизно 50-70 кДа у непроцесованому вигляді) та двох легких (L) ланцюгів (приблизно 25 кДа у непроцесованому вигляді), взаємно зв'язаних дисульфідними зв'язками. Амінокінцева частина кожного ланцюга містить варіабельну ділянку довжиною приблизно 100-110 амінокислот або більше, яка відповідає, головним чином, за розпізнавання антигену. На карбоксильному кінці кожного ланцюга знаходиться константна ділянка, яка відповідає головним чином за ефекторну функцію. Легкі ланцюги підрозділяються на ланцюги типу каппа або типу лямбда і відрізняються конкретною константною ділянкою, як відомо у цій галузі. Важкі ланцюги підрозділяються на ланцюги типу гамма, мю, альфа, дельта або іпсилон і визначають ізотип антитіла як IgG, IgM, IgA, IgD та IgE відповідно, і декілька з них можуть додатково підрозділятись на субкласи (ізотипи), наприклад, IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 та IgA2. Важкий ланцюг кожного типу відрізняється конкретною константною ділянкою, відомою у цій галузі. Субодиничні структури і об'ємні конфігурації антитіл різних класів є добре відомими у цій галузі. Кожен важкий ланцюг містить N-кінцеву варіабельну ділянку важкого ланцюга (у цьому описі "HCVR") і константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів (СНІ, СН2 та СНЗ) у разі IgG, IgD та IgA; і 4 доменів (СНІ, СН2, СНЗ та СН4) у разі IgM та IgE. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (у цьому описі "LCVR") і константну ділянку легкого ланцюга, CL. HCVR та LCVR можуть додатково підрозділятись на гіперваріабельні ділянки, які називають ділянками, що обумовлюють комплементарність ("CDR"), що чергуються з більш консервативними ділянками, які називаються каркасними ділянками ("FR"). Кожна HCVR та LCVR складається з трьох CDR та чотирьох FR, які розміщуються у напрямку від аміно-кінця до карбоксильного кінця таким чином: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. У цьому описі 3 CDR важкого ланцюга позначають як "CDRH1, CDRH2 і CDRH3", а З CDR легкого ланцюга позначають як 13 "CDRL1, CDRL2 і CDRL3". Гіперваріабельні ділянки (CDR) містять більшість залишків, які вступають до специфічних взаємодій з антигеном. Місцезнаходження амінокислот у кожному домені відповідає добре відомим умовним позначенням [наприклад, Кебот (Kabat), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) або номенклатурна схема Чотья (Chothia), описана у Аль-Лазікані (AlLazikani) та інші, /. Мої. Віоі, 273:927-948, 1997, дивись також інтернет-сайт http:www.rubic.rdg.ac.uk/~andrew/bioinf.org/abs]. Функціональна здатність антитіла до зв'язування конкретного антигену значною мірою обумовлюється шістьма гіперваріабельними ділянками. Термін "антитіло" у відношенні до антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом (або просто "моноклональне антитіло за цим винаходом"), у значенні, вживаному у цьому описі, означає моноклональне антитіло. Термін "моноклональне антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, означає химерне антитіло, гуманізоване антитіло або непроцесоване антитіло, якщо у цьому описі не вказано інше. За варіантом, якому віддається перевага, моноклональне антитіло за цим винаходом існує у гомогенній або по суті гомогенній популяції. Моноклональні антитіла за цим винаходом можна одержати за допомогою, наприклад, методу гібридом, добре відомого у цій галузі, а також рекомбінантними методами, методами проявлення у фагах, синтетичними методами або комбінаціями таких методів чи іншими методами, добре відомими у цій галузі. "Моноклональне антитіло" означає антитіло, яке одержують з унікальної копії або клону, у тому числі, наприклад, з будь-якого еукаріотного, прокаріотного або фагового клону, а не спосіб, за допомогою якого його продукують. "Моноклональним антитілом" може бути інтактне антитіло (що містить повну або непроцесовану Fc-ділянку), по суті інтактне антитіло або частина чи фрагмент антитіла, що містить антигензв'язувальну ділянку, наприклад, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент або Р(аЬ')2-фрагмент химерного, гуманізованого чи людського антитіла. Варіабельні ділянки кожної пари легкий/важкий ланцюг утворюють антигензв'язувальні домени антитіла. Так, інтактне антитіло IgG має два зв'язувальні домени. За виключенням біфункціональних або біспецифічних антитіл, два зв'язувальні домени є однаковими. У значенні, вживаному у цьому описі, термін "антигензв'язувальний домен" або "антигензв'язувальна ділянка" чи "антигензв'язувальний фрагмент" у цьому описі взаємозамінно означає ту частину молекули антитіла у межах варіабельної ділянки, яка містить амінокислотні залишки, які взаємодіють з антигеном і наділяють антитіло його специфічністю та спорідненістю до згаданого антигену. Антигензв'язувальний домен антитіла містить каркасні амінокислотні залишки, необхідні для підтримання відповідної конформації антигензв'язувальних залишків. За варіантом, якому віддається перевага, гіперваріабельні ділянки антигензв'язувального домену або у цілому антигензв'язувальний домен антитіл за 95457 14 цим винаходом буде мати мишаче походження або по суті мишаче походження, з певними амінокислотними залишками, які замінюють із метою поліпшення конкретної активності (дивись, наприклад, Фіг. 9). За варіантом, якому віддається перевага, каркасні ділянки антитіл за цим винаходом мають людське походження або по суті людське походження (людське походження щонайменше на 85 %, 90 %, 95 %, 97 % або 99 %). За іншими варіантами здійснення антигензв'язувальний домен або гіперваріабельні ділянки антигензв'язувального домену можуть бути одержані від інших видів окрім людини, у тому числі (але без обмеження) від кроля, пацюка або хом'ячка. За іншими варіантами здійснення антигензв'язувальний домен може мати повністю людське походження або по суті людське походження з певними зміненими амінокислотними залишками для поліпшення конкретної активності, наприклад, спорідненості або специфічності (дивись, наприклад, амінокислотні положення Фіг. 9, які виділені жирним шрифтом і підкреслені). Окрім того, термін "моноклональне антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, може означати одноланцюговий Fv-фрагмент, який можна одержати шляхом об'єднання ДНК, що кодує LCVR та HCVR, з лінкерною послідовністю (дивись Плактан (Pluckthun), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, том 113, Розенбург (Rosenburg) та Мур (Мооге) (редактори), Springer-Verlag, New York, crop. 269-315, 1994). Слід розуміти, що, незалежно від того, чи вказуються конкретно фрагменти або домени, термін "антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, включає такі фрагменти або домени, а також одноланцюгові форми. Доти, доки білок зберігає здатність до специфічного або переважного зв'язування своєї гаданої мішені (тобто антигенної детермінанти або антигену), він входить до обсягу терміна "антитіло". Словосполучення "популяція моноклональних антитіл" означає гомогенну або значною мірою гомогенну популяцію антитіл (тобто щонайменше приблизно 85 %, 87 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно 97 % чи 98 % або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, щонайменше 99 % антитіл у згаданій популяції могли б конкурувати при проведенні твердофазного імуноферментного аналізу за той самий антиген або антигенну детермінанту). Антитіла можуть бути або можуть не бути глікозилованими і, незважаючи на це, все ще знаходитись у межах цього винаходу. Моноклональні антитіла можуть бути гомогенними, якщо вони мають ідентичну амінокислотну послідовність, хоча вони можуть різнитись за посттрансляційною модифікацією, наприклад, схемою глікозилування. "Варіантне" антиміостатинове антитіло означає у цьому описі молекулу, амінокислотна послідовність якої відрізняється від амінокислотної послідовності "вихідного" антиміостатинового антитіла унаслідок додання, делеції та/або заміни одного або декількох амінокислотних залишків послідовності вихідного антитіла. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, варіантне антитіло 15 містить одну або декілька амінокислотних замін на одній або декількох гіперваріабельних ділянках вихідного антитіла. Наприклад, варіантне антитіло може містити щонайменше одну (наприклад, від приблизно однієї до приблизно десяти, а за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно двох до приблизно п'яти) заміну на одній або декількох гіперваріабельних ділянках вихідного антитіла. Ідентичність або гомологія відносно послідовності варіантного антитіла визначається у цьому описі як відсоток амінокислотних залишків у послідовності варіантного антитіла, що є ідентичними із залишками вихідного антитіла після впорядкованого розміщення послідовностей і введення розривів, у разі необхідності, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей. Жодне з N-кінцевих, С-кінцевих або внутрішніх подовжень, делецій або інсерцій у послідовності антитіла не повинно розглядатись як таке, що впливає на ідентичність або гомологію послідовності. Варіантне антитіло зберігає здатність до зв'язування міостатину і за варіантом, якому віддається перевага, має властивості, які перевищують властивості вихідного антитіла. Наприклад, варіантне антитіло може мати більшу зв'язувальну спорідненість, меншу ІС50 У аналізі SBE/''репортерної" групи або підвищену здатність до пригнічення біоактивності міостатину. Варіантним антитілом, яке викликає особливий інтерес у цьому описі, є антитіло, що демонструє щонайменше приблизно двократне, п'ятикратне, за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше приблизно десятикратне, а за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно двадцятикратне, тридцятикратне або п'ятдесятикратне посилення біоактивності, у разі порівняння з вихідним антитілом. "Вихідним" антитілом у цьому описі є антитіло, що кодується амінокислотною послідовністю, яку застосовують для одержання варіантного антитіла. Вихідне антитіло може мати мишачий каркас, але за варіантом, якому віддається перевага, має людську каркасну ділянку. Згадане вихідне антитіло може бути мишачим (дивись, наприклад, наведені у цьому описі Фіг. 10 і Фіг. 11), химерним, гуманізованим або людським антитілом. Термін "специфічно зв'язується", у значенні, вживаному у цьому описі, означає ситуацію, за якої один член специфічної зв'язувальної пари значною мірою зв'язується лише з молекулами, які є його специфічним зв'язувальним партнером(ами) (тобто рівень перехресної реактивності становить менше ніж приблизно 35 %, 33 %, 30 %, 20 % або 10 %), як визначається методами у цій галузі, наприклад, конкурентним ELISA або шляхом визначення Ко за допомогою аналізу BIACORE або KJNEXA. Згаданий термін вживається також у тому разі, наприклад, коли антигензв'язувальний домен антитіла за цим винаходом є специфічним для конкретної антигенної детермінанти, яку несе ряд антигенів. У цьому разі специфічне антитіло, що несе антигензв'язувальний домен, буде здатним до специфічного зв'язування різних антигенів, які несуть згадану антигенну детермінанту. Відповідним чином, моноклональне антитіло за цим 95457 16 винаходом специфічно зв'язується з антигенною детермінантою, локалізованою у межах амінокислот 40-64, 43-57 та/або 45-59 зрілої форми міостатину. Термін "переважно зв'язується", у значенні, вживаному у цьому описі, означає ситуацію, за якої антитіло зв'язує специфічний антиген щонайменше приблизно у 2 рази, 3 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 22 рази, 24 рази або 25 разів більше, аніж воно зв'язує інший антиген, як визначається методами у цій галузі, наприклад, конкурентним ELISA або шляхом визначення Kq за допомогою аналізу BIACORE або KINEXA. Відповідним чином, моноклональне антитіло за цим винаходом переважно зв'язує GDF-8, порівняно з GDF-11. Подібним же чином, антитіло може переважно зв'язувати одну антигенну детермінанту у межах антигену, порівняно з іншою антигенною детермінантою у межах того самого антигену. Термін "антигенна детермінанта" означає частину молекули, яка може розпізнаватись і зв'язуватись антитілом на одному або декількох антигензв'язувальних центрах антитіла. Антигенні детермінанти часто складаються з хімічно активного поверхневого угруповання молекул, наприклад, амінокислот або бічних ланцюгів цукрів, і мають специфічні об'ємні структурні характеристики, а також специфічні зарядові характеристики. Словосполучення "пригнічення антигенної детермінанти" та/або "нейтралізація антигенної детермінанти" має відношення до антигенної детермінанти, наслідком зв'язування якої, у разі знаходження її у контексті інтактної молекули (у цьому разі, міостатину), антитілом, специфічним щодо згаданої антигенної детермінанти, є втрата або зниження біологічної активності молекули або організму, який містить згадану молекулу in vivo або in vitro. Термін "антигенна детермінанта", у значенні, вживаному у цьому описі, додатково означає частину поліпептиду, що має антигенну та/або імуногенну активність у тварини, за варіантом, якому віддається перевага, у ссавця, наприклад, миші або людини. Термін "антигенна детермінанта", у значенні, вживаному у цьому описі, визначається як частина поліпептиду, з якою може специфічно зв'язуватись антитіло, що визначається будь-яким методом, добре відомим у цій галузі, наприклад, традиційними імуноаналізами. Антигенні детермінанти не обов'язково повинні бути імуногенними, однак можуть бути імуногенними. Термін "імуногенна антигенна детермінанта", у значенні, вживаному у цьому описі, визначається як частина поліпептиду, яка викликає гуморальну імунну відповідь у тварини, що визначається будь-яким методом, відомим у цій галузі. [Дивись, наприклад, Гейсен (Geysen) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1983)]. Словосполучення "біологічна властивість" або "біоактивність", "активність" або "біологічна активність" по відношенню до антитіла за цим винаходом вживаються у цьому описі взаємозамінно і означають (але без обмеження) афінність і специфічність антигенної детермінанти/антигену, здатність нейтралізувати або антагонізувати актив 17 ність міостатину in vivo або in vitro, IC50 У аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи та інших аналізах активності in vitro, in vivo стабільність антитіла та імуногенні властивості антитіла. Іншими біологічними властивостями антитіла, що піддаються встановленню, є наприклад, перехресна реактивність (тобто з нелюдськими гомологами пептидумішені або, взагалі, з іншими білками чи тканинами) і здатність до збереження високих рівнів експресії білка у клітинах ссавців. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або визначатись чи оцінюватись за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі (але без обмеження) ELISA, конкурентного ELISA, аналізу поверхневого плазмонного резонансу, аналізів нейтралізації in vitro та in vivo без обмеження, зв'язування рецептора, продукування та/або секреції цитокіну або фактора росту, розвитку кепів шпоркової жаби Xenopus, трансдукції сигналів та імуногістохімії зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людини, примата або будь-якого іншого джерела за потребою. Термін "активність міостатину", у значенні, вживаному у цьому описі, означає одну або декілька фізіологічних росторегулювальних або морфогенетичних активностей, пов'язаних з активним білком міостатином. Наприклад, активний міостатин є негативним регулятором маси скелетних м'язів. Активний міостатин може також модулювати продукування м'язоспецифічних ферментів (наприклад, креатинкінази), стимулювати проліферацію міобластів та модулювати диференціацію преадіпоцитів у адіпоцити. Термін "пригнічувати" або "нейтралізувати", у значенні, вживаному у цьому описі відносно активності антитіла за цим винаходом, означає здатність значною мірою антагонізувати, пригнічувати, запобігати, стримувати, уповільнювати, переривати, ліквідувати, припиняти, зменшувати або обертати, наприклад, розвиток або тяжкість того, що пригнічується, у тому числі (але без обмеження) біологічної активності або властивості, захворювання або стану. Ступінь пригнічення або нейтралізації за варіантом, якому віддається перевага, становить щонайменше приблизно 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або більше. Термін "виділена(-ий)", у разі вживання по відношенню до нуклеїнової кислоти або білка (наприклад, антитіла), означає нуклеїновокислотну послідовність або білок, яку(який) ідентифікують і відокремлюють від щонайменше однієї домішки, з якою вона(він) є, зазвичай, зв'язана(зв'язаний) у її(його) природному джерелі. За варіантом, якому віддається перевага, "виділеним антитілом" є антитіло, яке є по суті вільним від інших антитіл, що мають інші антигенні специфічності (наприклад, фармацевтичні композиції за цим винаходом містять виділене антитіло, яке специфічно зв'язує міостатин і є по суті вільним від антитіл, які специфічно зв'язують інші антигени окрім міостатину). Терміни "позначення за Кеботом" та "номенклатура за Кеботом" вживаються у цьому описі взаємозамінно. Ці терміни, визнані у цій галузі, означають систему позначення амінокислотних 95457 18 залишків, які є більш змінними (тобто гіперваріабельними), аніж інші амінокислотні залишки у варіабельних ділянках важких і легких ланцюгів антитіла [Кебот (Kabat) та інші, Ann. NYAcad. Set, 190:382-393 (1971); Кебот (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'яте видання, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication № 91-3242 (1991)]. Полінуклеотид є "функціонально зв'язаним" у разі його знаходження у функціональному взаємозв'язку з іншим полінуклеотидом. Наприклад, промотор або енхансер є функціонально зв'язаним із кодувальною послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності. Пептид є "функціонально зв'язаним" з іншим пептидом, коли функціонально зв'язаними є полінуклеотиди, які їх кодують, за варіантом, якому віддається перевага, вони знаходяться у тій самій відкритій рамці зчитування. Терміни "індивід", "суб'єкт" і "хворий", які вживаються у цьому описі взаємозамінно, означають тварину, за варіантом, якому віддається перевага, ссавців (у тому числі непримата і примата) або птахів, у тому числі (але без обмеження) мишей, мавп, людей, сільськогосподарських тваринссавців (наприклад, велику рогату худобу, свиней, овець), спортивних тварин-ссавців (наприклад, коней) і хатніх тварин-ссавців (наприклад, собак і кішок); за варіантом, якому віддається перевага, цей термін означає людей. Згаданий термін означає також різні види птахів, у тому числі (але без обмеження) курок та індиків. За певним варіантом здійснення суб'єкт, за варіантом, якому віддається перевага, людина, додатково характеризується захворюванням або розладом чи станом, для якого благотворним був би знижений рівень або зменшена біологічна активність міостатину. За іншим варіантом здійснення суб'єкт, за варіантом, якому віддається перевага, ссавець, за варіантом, якому віддається перевага, людина, додатково характеризується тим, що знаходиться під загрозою розвитку розладу, захворювання або стану, для якого благотворним був би знижений рівень міостатину або зменшена біологічна активність міостатину. Термін "вектор" означає нуклеїновокислотну молекулу, здатну до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв'язана, у тому числі (але без обмеження) плазміди і вектори на основі вірусного геному. Певні вектори здатні до автономної реплікації у клітині-хазяїні, до якої їх вводять, у той час як інші вектори можуть інтегруватись до геному клітини-хазяїна після введення до неї і, завдяки цьому, їх реплікація відбувається разом із геномом згаданої клітини. Більш того, певні вектори здатні до спрямування експресії генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори у цьому описі називаються "рекомбінантними експресійними векторами" (або просто "експресійними векторами"), і зразкові вектори добре відомі у цій галузі. Словосполучення "клітина", "клітина-хазяїн", "клітинна лінія" та "культура клітин" вживаються у цьому описі взаємозамінно і означають окрему клітину або культуру клітин, яка є реципієнтом будь-якого виділеного полінуклеотиду за цим винаходом або будь-якого рекомбінантного(-их) век 19 тора(-ів), що містить(-ять) послідовність, яка кодує HCVR, LCVR або моноклональне антитіло за цим винаходом. Клітини-хазяї являють собою нащадків однієї клітини-хазяїна, і нащадки не обов'язково можуть бути повністю ідентичними (за морфологією або за загальним комплементом ДНК) вихідній клітині-хазяїну унаслідок природної, випадкової або навмисної мутації та/або зміни. Клітина-хазяїн включає клітини трансформовані, трансдуковані або інфіковані in vivo або in vitro одним або декількома рекомбінантними векторами або полінуклеотидом, що експресує моноклональне антитіло за цим винаходом або його легкий чи важкий ланцюг. Клітина-хазяїн, що містить рекомбінантний вектор за цим винаходом (стабільно або нестабільно включений до хромосоми хазяїна), може також називатись "рекомбінантною клітиною-хазяїном". Переважними клітинами-хазяями для застосування за цим винаходом є клітини СНО (культура клітин яєчника китайського хом'ячка) (наприклад, АТСС (американська колекція типових культур) CRL-9096), клітини NS0, клітини SP2/0 та клітини COS (культура клітин яєчника мавпи) (наприклад, АТСС CRL-1650, CRL-1651), HeLa (АТСС CCL-2). Додатковими клітинами-хазяями для застосування за цим винаходом є рослинні клітини, дріжджові клітини, клітини інших ссавців і прокаріотні клітини. Визначення характеристик антитіла Цей винахід має відношення до виділених моноклональних антитіл, які специфічно зв'язують міостатин із високою афінністю. Антитіла за цим винаходом за варіантом, якому віддається перевага, є химерними, гуманізованими або людськими антитілами або їх антигензв'язувальними доменами, і за варіантом, якому віддається перевага, зв'язуються з міостатином у межах ділянки зрілої форми міостатину, що стягує амінокислоти 40-64, або за варіантом, якому віддається більша перевага, у межах ділянки зрілої форми міостатину, що стягує амінокислоти 43-57 та/або 45-59. На додаток до цього, антитіла за цим винаходом нейтралізують біологічну активність міостатину in vivo або in vitro. Специфічне зв'язування антиміостатинових моноклональних антитіл за цим винаходом із міостатином дозволяє застосовувати антитіла за цим винаходом як терапевтичні засоби або профілактичні засоби для пов'язаних із міостатином станів, захворювань або розладів, тобто станів, захворювань або розладів, благотворним для яких було б зниження рівнів міостатину або антагонізування чи пригнічення біологічної активності міостатину. Окрім того, антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись для діагностування або контролювання станів, захворювань або розладів, корисним для яких є змінений рівень або біологічна активність міостатину, чи для визначення рівня міостатину у зразку. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, цей винахід пропонує антиміостатинове моноклональне антитіло, яке зв'язує міостатин або його частину зі зв'язувальною спорідненістю (KD) до міостатину меншою за або такою, що дорівнює -8 -8 -9 приблизно 3х10 М, 1х10 М або 1х10 М, за варіантом, якому віддається перевага, меншою за -10 -10 -11 приблизно 9×10 М, 8,7×10 М або 8×10 М. За 95457 20 варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом відрізняються KD до міостатину не -8 -8 -9 більшою за приблизно 3х10 М, 1х10 М, 1х10 -10 або 9х10 М і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, KD до міостатину не більшою -10 -11 за приблизно 8,7×10 М або 8×10 M. Спорідненість антитіл може визначатись, як описано у прикладах, наведених нижче у цьому описі, або за допомогою будь-якого прийнятного способу, доступного у цій галузі. За іншим варіантом, якому віддається перевага, цей винахід пропонує антиміостатинове моноклональне антитіло, яке має ІС50 меншу за або таку, що дорівнює приблизно 25 нМ, 20 нМ, 16 нМ, 14 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 6 нМ, 5,2 нМ або менше у in vitro аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи, як описано у прикладах, наведених нижче. Такі антитіла можуть додатково відрізнятись КD до міо-8 -8 статину не більшою за приблизно 3х10 М, 1х10 -9 -10 М, 1х10 M або 9х10 М і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, KD до міостатину -10 -11 не більшою за приблизно 8,7х10 M або 8х10 М. Такі антитіла можуть додатково відрізнятись переважним зв'язуванням міостатину, у разі порівняння з їх здатністю до зв'язування GDF-11 за допомогою будь-якого доступного у цій галузі способу, наприклад, ELISA або конкурентногоELISA чи визначення значення KD за допомогою, наприклад, аналізу BIACORE або KINEXA. За одним із варіантів здійснення моноклональне антитіло за цим винаходом має меншу за приблизно 35 %, 33 %, 30 %, 28 %, 25 %, 23 % або 20 % перехресну реактивність (за варіантом, якому віддається більша перевага, меншу за приблизно 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 % або 6 %, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, меншу за приблизно 5 % або 4 % перехресну реактивність) з неміостатиновим білком (таким, наприклад, як GDF-11) або з неміостатиновим пептидом, що містить щонайменше 15, 14, 13, 12, 11, 10 або 9 суміжних амінокислот, як визначається за допомогою стандартного методу у цій галузі, наприклад, ELISA, конкурентного ELISA або значень Kq, які визначаються, наприклад, за допомогою аналізу BIACORE або KINEXA. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом зв'язує міостатин щонайменше у 2 рази, З рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 22 рази, 24 рази або 25 разів сильніше порівняно зі ступенем зв'язування GDF-11, як визначається, наприклад, конкурентним ELISA або аналізом BIACORE чи KINEXA. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, рівні зв'язування GDF-11 антитілами за цим винаходом не перевищують фонових рівнів у разі застосування будь-якого аналізу зв'язування, доступного пересічному фахівцю у цій галузі. Моноклональне антитіло за цим винаходом зв'язує мономерну або димерну форму міостатину або його частину, що містить амінокислоти, які стягують залишки 40-64, 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину. За варіантом, якому віддається перевага, обидва поліпептиди, міостатин і GDF-11, у разі перевірки на переважне зв'язування антитілом за цим 21 винаходом, являють собою гомодимерні форми зрілого білка, за варіантом, якому віддається перевага, ссавцевого або пташиного походження, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, людського походження. Однак поліпептиди міостатин і GDF-11, у разі перевірки на переважне зв'язування антитілом за цим винаходом, можуть являти собою мономерну форму зрілого білка або пропротеїнову форму чи поліпептид, що містить частину зрілого білка, що стягує амінокислоти 4064, 43-57 та/або 45-59 зрілої форми білка. Антиміостатинові моноклональні антитіла за цим винаходом зв'язують антигенну детермінанту, яка, як було встановлено, локалізується у межах амінокислот 40-64 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 53 для людини) зрілого міостатину, за варіантом, якому віддається перевага, у межах амінокислот 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину. На додаток до цього, імуногенна антигенна детермінанта міостатину за цим винаходом локалізується у межах амінокислот 40-64 зрілого міостатину (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 53 для людини), за варіантом, якому віддається перевага, у межах амінокислот 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину будь-якого виду ссавців або птахів. Передбачається також, що імуногенна антигенна детермінанта за цим винаходом є також антигенною детермінантою. Антигенна детермінанта може мати додаткові залишки міостатину за межами амінокислот 40-64 зрілого міостатину, однак моноклональні антитіла за цим винаходом не потребують цих додаткових залишків для специфічного зв'язування міостатину. На додаток до цього, залишки міостатину за межами амінокислот 40-64 можуть впливати на конформаційну структуру антигенного домену і, тим самим, змінювати зв'язування антитіла за цим винаходом з антигенною детермінантою. За варіантом, якому віддається перевага, моноклональні антитіла за цим винаходом суттєво не реагують (тобто зв'язуються) з GDF-11 порівняно із ступенем їх зв'язування з GDF-8. За варіантом, якому віддається більша перевага, моноклональні антитіла за цим винаходом зв'язують міостатин щонайменше у 2 рази, 3 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 22 рази, 24 рази або 25 разів сильніше (наприклад, із більшою афінністю або більшою специфічністю) порівняно із ступенем зв'язування GDF-11, як визначається, наприклад, ELISA, конкурентним ELISA або значеннями KD, що визначаються аналізом BIACORE чи KINEXA. Пептид, що містить амінокислоти 40-64 (включно), 43-57 або 45-59 зрілого міостатину або будьякий пептид, що містить імуногенну антигенну детермінанту, як описано у цьому описі, може застосовуватись як імуногенний пептид, за варіантом, якому віддається перевага, кон'югованим із білком-носієм, наприклад, KLH (гемоціанін лімфи равлика), для одержання моноклональних антитіл за цим винаходом із застосуванням методів, доступних пересічному фахівцю у цій галузі. Передбачається, що залишки цистеїну у межах цих пептидів можуть бути замінені на залишки серину і все ще функціонувати як імуногенна антигенна детермінанта. Імуногенний пептид може застосовуватись для імунізації тварини окрім людини, за варіантом, 95457 22 якому віддається перевага, ссавця, за варіантом, якому віддається більша перевага, миші. У разі повністю людського антитіла, імуногенний пептид може застосовуватись для імунізації трансгенної лінії мишей, де експресія мишачого гена антитіл є супресована і ефективно замінена на експресію людського гена антитіл. Після цього антиміостатинові антитіла виділяють з імунізованої тварини і перевіряють методами, добре відомими у цій галузі, для виділення тих антитіл, які специфічно зв'язуються у межах домену, що стягує амінокислоти 40-64 зрілого міостатину, за варіантом, якому віддається перевага, у межах домену, що стягує амінокислоти 43-57 та/або 45-59, за варіантом, якому віддається перевага, перевіряють на зв'язувальну -8 -8 спорідненість меншу за приблизно 3х10 М, 1х10 -9 М або 1х10 М, за варіантом, якому віддається -10 -10 перевага, меншу за приблизно 9х10 М, 8,7х10 -11 М або 8х10 М та/або перевіряють на ІС50 меншу за або таку, що дорівнює приблизно 25 нМ, 20 нМ, 16 нМ, 14 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 6 нМ, 5,2 нМ або менше у in vitro аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи (дивись аналіз, опис якого наведено у представленому у цьому описі Прикладі 6). Моноклональні антитіла можна одержати за допомогою методу гібридом, широко відомого у цій галузі [дивись, наприклад, Колер (Kohler) та інші, Nature, 256:495, 1975] або їх можна одержати методами рекомбінантних ДНК (наприклад, за патентом США № 4,816,567) чи іншими методами, доступними у цій галузі. Взагалі, гібридому можна одержати шляхом злиття відповідної лінії імморталізованих клітин (наприклад, лінії клітин мієломи, наприклад, SP2/0) з клітинами імунізованих тварин, що продукують антитіла. Клітини, що продукують антитіла, за варіантом, якому віддається перевага, клітини селезінки або лімфовузлів, одержують від тварин, імунізованих антигеном, що становить інтерес. Гібридні клітини (гібридоми) можна виділити шляхом селективного культивування і клонувати методом серійних розведень. Культуральне середовище, у якому вирощують клітини гібридом, аналізують на продукування моноклональних антитіл, спрямованих проти згаданого антигену. За варіантом, якому віддається перевага, зв'язувальну специфічність моноклональних антитіл, що продукуються клітинами гібридом, визначають імунопреципітацією або аналізом зв'язування in vitro. наприклад, радіоімуноаналізом (RIA) або ELISA. Клітини, що продукують антитіла з бажаними зв'язувальними властивостями, можуть відбиратись за допомогою відповідного відбіркового аналізу. Методи такого виділення і відбирання добре відомі у цій галузі. Можуть застосовуватись інші придатні методи одержання або виділення антитіл, що зв'язуються у межах домену, що стягує амінокислоти 40-64, 4357 та/або 45-59 зрілого міостатину, у тому числі людські або штучні антитіла, з включенням методів, за допомогою яких відбираються рекомбінантні антитіла (наприклад, одноланцюгові Fv або Fab) з бібліотеки, або які покладаються на імунізацію трансгенних тварин (наприклад, мишей), здатних до продукування репертуару людських антитіл [дивись, наприклад, Джакобовіц (Jakobovits) та 23 інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993; Джакобовіц (Jakobovits) та інші, Nature, 362:255258, 1993; Лонберг (Lonberg) та інші., патент США № 5,545,806; Сурані (Surani) та інші, патент США № 5,545,807]. Цим винаходом і терміном "антитіло" передбачаються також одноланцюгові антитіла та химерні, гуманізовані або приматизовані (CDRтрансплантовані) антитіла, а також химерні або CDR-трансплантовані одноланцюгові антитіла тощо, що містять частини, одержані від різних видів. Різні частини цих антитіл можуть об'єднуватись хімічним шляхом за допомогою традиційних методів, синтетичним шляхом або одержуватись у вигляді безперервного білка за допомогою генноінженерних методів. Наприклад, для продукування безперервного білка можуть експресуватись нуклеїнові кислоти, що кодують химерний або гуманізований ланцюг. Дивись, наприклад, патент США № 4,816,567; Європатент № 0,125,023 В1; Патент США № 4,816,397; Європатент № 0,120,694 Bl; WO 86/01533; Європатент № 0,194,276 В1; Патент США № 5,225,539; Європатент № 0,239,400 В1 та патенти США № 5,585,089 та № 5,698,762. Дивись також Ньюмен P. (Newman R.) та інші, BioTechnology, 10:1455-1460, 1993, відносно приматизованого антитіла та Леднер (Ladner) та інші, патент США № 4,946,778 та Берд Р.Е. (Bird R.E.) та інші, Science, 242:423-426, 1988, відносно одноланцюгових антитіл. На додаток до цього, продукуватись можуть також функціональні частини антитіл, у тому числі антигензв'язувальні частини химерних, гуманізованих, людських або одноланцюгових антитіл. Функціональні частини згаданих антитіл зберігають щонайменше одну антигензв'язувальну функцію та/або біологічну функцію чи біологічну активність непроцесованого антитіла, похідними якого вони є. Функціональні частини, яким віддається перевага, зберігають антигензв'язувальну функцію відповідного непроцесованого антитіла (наприклад, здатність до зв'язування зрілої форми міостатину ссавців). Функціональні частини, яким віддається особлива перевага, зберігають здатність до пригнічення однієї або декількох функцій або біоактивностей, характерних для зрілого міостатину ссавців, наприклад, зв'язувальної активності, сигнальної активності та/або стимулювання клітинної відповіді. Наприклад, за одним із варіантів здійснення функціональна частина або фрагмент може пригнічувати взаємодію зрілого міостатину з одним або декількома з його лігандів та/або може пригнічувати одну або декілька функцій, опосередкованих рецептором. Частини або фрагменти антитіл, здатні до зв'язування зрілого міостатину або його частини (за варіантом, якому віддається перевага, у межах амінокислот 40-64, 43-57 та/або 45-59 зрілого міостатину) включають (але без обмеження) Fv, Fab, Fab' та Р(аb')2-фрагменти і передбачаються цим винаходом. Такі фрагменти можуть продукуватись шляхом ферментативного розщеплення або методами рекомбінантних ДНК. Наприклад, шляхом розщеплення папаїном або пепсином можна одержати Fab- або F(аb')2-фрагменти, відповідно. 95457 24 Найменшим антигензв'язувальним фрагментом є Fv, що містить HCVR та LCVR. Fab-фрагмент містить HCVR-CH1 та LCVR-CL ділянки, ковалентно зв'язані дисульфід ним зв'язком між константними ділянками. Для подолання схильності нековалентно зв'язаних HCVR та LCVR ділянок у Fv до дисоціації у разі коекспресії у клітині-хазяїні може бути сконструйований так званий одноланцюговий (sc) Fv-фрагмент (scFv), у якого гнучкий поліпептид відповідної довжини зв'язує С-кінець HCVR з Nкінцем LCVR або С-кінець LCVR із N-кінцем HCVR. Найпоширенішим лінкером є пептид довжиною у 15 залишків (Gly4Ser)3, однак у цій галузі відомі також інші лінкери. Антитіла можуть також продукуватись у вигляді різноманітних скорочених форм за допомогою генів антитіл, до яких у 3'-5'напрямку відносно природного стоп-сайта був введений один або декілька стоп-кодонів. Наприклад, химерний ген, що кодує частину важкого ланцюга F(ab')2, може конструюватись таким чином, щоб включати послідовності ДНК, що кодують СН1 ділянку і шарнірну ділянку важкого ланцюга. Вибір фрагментів антитіл із бібліотек за допомогою методів збагачення, наприклад, проявлення у фагах [Меттьюз Д.Дж. (Matthews D.J.), Уеллс Дж.А. (Wells J.A.), Science, 260:1113-7, 1993], проявлення у рибосомах [Хейнс (Hanes) та інші, Ргос. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:14130-5, 1998], проявлення у бактеріях [Семюелсон П. (Samuelson P.) та інші, Journal of Biotechnology, 96:129-154, 2002] або проявлення у дріжджах [Кік М.К. (Kieke M.C.) та інші, Protein Engineering, 10:1303-1310, 1997], виявився успішною альтернативою класичній гібридомній технології (нещодавня оглядова стаття: Літл М. [Little M.) та інші, Immunology Today, 21:364-370, 2000]. Варіантні антитіла Вихідним антитілом є мишаче моноклональне антитіло або людське антитіло (яке одержали, наприклад, у трансгенній миші), яке одержали проти імуногенної антигенної детермінанти (амінокислоти 40-64, 43-57 або 45-59 зрілого міостатину) за цим винаходом або проти білка, що містить імуногенну антигенну детермінанту за цим винаходом. Мишаче вихідне антитіло може додатково змінюватись для одержання химерної або гуманізованої форми антитіла за допомогою методів, добре відомих у цій галузі. Такі химерні або гуманізовані антитіла можуть правити за вихідні антитіла для додаткової варіації або мутагенезу. Вихідні антитіла за цим винаходом можуть бути додатково піддані мутагенезу, наприклад, у межах гіперваріабельної ділянки(-ок) (дивись, наприклад, Фіг. 9) для одержання варіантного антитіла з оптимізованою властивістю, яка становить інтерес, наприклад, зв'язувальною спорідненістю, ІС50, специфічністю тощо. Перевага віддається варіантному антитілу із амінокислотною заміною, у якого щонайменше один амінокислотний залишок молекули вихідного антитіла був видалений і на його місце вставлений інший залишок. Сайтами найбільшого інтересу для замісного мутагенезу є гіперваріабельні ділянки, однак передбачаються також зміни каркасної ділянки. Перевага віддається замінам консервативних амінокислот. Якщо наслід 25 ком таких замін є зміна біологічної активності антитіла, у такому разі можуть здійснюватись більш суттєві зміни, тобто зміни неконсервативних амінокислот із перевіркою одержаних продуктів. Зручним способом одержання замісних варіантів є "визрівання афінності" із застосуванням проявлення у фагах. Стисло, декілька сайтів гіперваріабельної ділянки піддають мутації із здійсненням усіх можливих амінокислотних замін на кожному сайті. Варіанти антитіл, які одержують таким чином, проявляються моновалентним чином із нитчастих фагових частинок як гібриди з продуктом гена III M13, що заповнюють кожну частинку. Після цього варіанти з проявленням у фагах перевіряють на їхню біологічну активність (наприклад, зв'язувальну спорідненість, специфічність, ІС50), як розкривається у цьому описі. Для ідентифікування сайтів-кандидатів гіперваріабельної ділянки для модифікації може здійснюватись мутагенез методом ідентифікування аланіну для ідентифікування залишків гіперваріабельної ділянки, які значною мірою сприяють зв'язуванню антигену. Альтернативно або на додаток до цього корисним може бути проведення аналізу кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікування ділянок контактування між антитілом і міостатином. Такі контактні залишки і сусідні залишки є кандидатами на заміну за методами, розробленими за цим винаходом або відомими у цій галузі. Альтернативно або на додаток до цього неспецифічний мутагенез може здійснюватись на одній або декількох послідовностях гіперваріабельної ділянки на одному або декількох положеннях залишків, у той час як CDR є функціонально зв'язаною з варіабельною ділянкою або у той час як CDR є незалежною від іншої послідовності варіабельної ділянки з подальшим повертанням зміненої CDR до варіабельної ділянки за допомогою методу рекомбінантних ДНК. Після одержання і експресії таких варіантних антитіл, панель варіантів піддають перевірці. Як описано у цьому описі, антитіла з найкращими властивостями у одному або декількох відповідних аналізах можуть відбиратись для додаткової розробки. Будь-який залишок цистеїну, не залучений до підтримання відповідної конформації антиміостатинового антитіла за цим винаходом, може замінюватись, як правило, на серин, для поліпшення стійкості згаданої молекули до окиснення та запобігання хибного перехресного зв'язування. І, навпаки, цистеїновий(-і) зв'язок(-ки) може(-уть) додаватись до згаданого антитіла для поліпшення його стійкості (зокрема, коли згадане антитіло являє собою фрагмент антитіла, наприклад, Fvфрагмент). Амінокислотний варіант згаданого антитіла іншого типу змінює вихідну схему глікозилування згаданого антитіла. Термін "змінює" означає видалення однієї або декількох вуглеводних складових, присутніх у складі антитіла, та/або додання одного або декількох сайтів глікозилування, не присутніх у вихідному антитілі. Глікозилування антитіл є, як правило, Nзв'язаним або О-зв'язаним. N-зв'язане означає приєднання вуглеводної складової до бічного лан 95457 26 цюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин та аспарагін-Х-треонін, де X являє собою будь-яку амінокислоту окрім проліну, є визнаними послідовностями для ферментативного приєднання вуглеводної складової до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, присутність будь-якої із цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилування. О-зв'язане глікозилування означає приєднання одного із цукрів, N-ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози, до оксіамінокислоти, найчастіше, серину або треоніну, хоча застосовуватись може також 5-гідроксипролін або 5гідроксилізин. Додання сайтів глікозилування до антитіла, як правило, супроводжується зміною амінокислотної послідовності таким чином, що вона містить одну або декілька з вищеописаних трипептидних послідовностей (для N-зв'язаних сайтів глікозилування). Зміна може також здійснюватись шляхом додання або заміни одного або декількох залишків серину або треоніну на послідовність вихідного антитіла (для О-зв'язаних сайтів глікозилування). Послідовність Моноклональне антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, має LCVR, що містить пептид із послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 5-12 та/або HCVR, що містить пептид із послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 13-26, № 55 та № 56 (дивись наведені у цьому описі Фіг. 59). На додаток до цього, моноклональне антитіло за цим винаходом являє собою антитіло, зв'язування якого зі зрілим людським міостатином (або його частиною) конкурентно пригнічується моноклональним антитілом, що містить два поліпептиди з послідовностями, представленими групою, яка включає (і) ПОСЛІДОВНОСТІ № 5 та № 15; (И) ПОСЛІДОВНОСТІ № 5 та № 16; і (ііі) ПОСЛІДОВНОСТІ № 10 та № 26. Таке конкурентне пригнічення між антитілами може визначатись за допомогою аналізів, добре відомих фахівцю у цій галузі, наприклад, за допомогою конкурентного ELISA. За іншим варіантом здійснення антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом містить (і) поліпептид LCVR з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 5-12 та (іі) поліпептид HCVR з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 13-26, № 55 та № 56. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло, що містить поліпептид LCVR з амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ № 5, додатково містить поліпептид HCVR з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що містить ПОСЛІДОВНОСТІ № 13-20. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло, що містить поліпептид LCVR з амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ № 6, додатково містить поліпептид HCVR з амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ № 14. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло, що містить поліпептид LCVR з амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ № 7, додатково містить поліпептид HCVR з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що містить ПОСЛІДОВНОСТІ № 21-25 та № 56. За варіантом, 27 якому віддається перевага, антитіло, що містить поліпептид LCVR з амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ № 10, додатково містить поліпептид HCVR з амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ № 26 або № 55. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло, що містить поліпептид HCVR з амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ № 55, додатково містить поліпептид LCVR з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що містить ПОСЛІДОВНОСТІ № 8-12. Досвідченому фахівцю буде зрозуміло, що антитіла за цим винаходом не обмежуються конкретними послідовностями HCVR та LCVR, які наведені на поданих у цьому описі Фіг. 5-9, але також включають варіанти цих послідовностей, які зберігають антигензв'язувальну здатність. Такі варіанти можна одержати з наведених послідовностей за допомогою методів, відомих у цій галузі, як описано вище. За іншим варіантом здійснення антиміостатинове антитіло за цим винаходом має варіабельну ділянку важкого і легкого ланцюгів, де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки з наведеними нижче амінокислотними послідовностями: CDRH1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 59), CDRH2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 60) та CDRH3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 61); та/або де варіабельна ділянка легкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки з наведеними нижче амінокислотними послідовностями: CDRL1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 57), CDRL2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 30 або № 52) та CDRL3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 58). За варіантом, якому віддається перевага, гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга антитіла за цим винаходом зображені на Фіг. 5, Фіг. 6 або Фіг. 9, а гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга антитіла за цим винаходом зображені на Фіг. 7, Фіг. 8 або Фіг. 9, і згадані гіперваріабельні ділянки знаходяться у згаданому антитілі у положенні, визначеному на фігурах. Наприклад, одне антитіло за цим винаходом має CDRL1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 27, CDRL2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № ЗО, CDRL3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 31, CDRH1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 36, CDRH2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 43 і CDRH3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 47 (як, наприклад, антитіло ІС7.1 на Фіг. 9). Додатково передбачається, що антиміостатинове антитіло за цим винаходом містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить CDRH1 ділянку з послідовністю, яку вибирають із групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 36-42, та/або CDRH2 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 43-46, та/або CDRH3 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 47-51. За іншим варіантом здійснення антиміостатинове антитіло за цим винаходом містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить CDRL1 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 27-29, та/або CDRL2 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № ЗО або № 52, та/або CDRL3 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 31-35. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, антиміос 95457 28 татинове антитіло за цим винаходом містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить CDRH1 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 36-42, та/або CDRH2 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 43-46, та/або CDRH3 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 47-51 і додатково містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDRL1 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 2729, та/або CDRL2 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № ЗО або № 52, та/або CDRL3 ділянку з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ № 31-35. Структурою для розміщення CDR за цим винаходом буде, як правило, послідовність важкого або легкого ланцюга антитіла або значна їхня частина, у якій CDR займає положення, що відповідає положенню CDR природної HCVR та LCVR (Кебот (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept of HHS, 1991). За варіантом, якому віддається перевага, три гіперваріабельні ділянки (CDR) кожного ланцюга, легкого і важкого, надаються у межах людської каркасної ділянки, наприклад, як прилегла безперервна послідовність, представлена наведеною нижче формулою: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Ділянки FR1, FR2, FR3 та FR4 важкого ланцюга і легкого ланцюга об'єднуються з утворенням повного каркаса у разі розміщення у вигляді прилеглої безперервної послідовності з гіперваріабельними ділянками у зазначеному порядку. На додаток до послідовностей гіперваріабельних ділянок, LCVR та HCVR додатково містять каркасну послідовність. У гуманізованого антитіла, призначеного для терапевтичного застосування на людях, каркасна послідовність за варіантом, якому віддається перевага, має повністю або значною мірою людське походження (тобто щонайменше 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % людського походження). За варіантом, якому віддається перевага, каркасною ділянкою легкого ланцюга гуманізованого, людського або химерного антитіла за цим винаходом є 02, як показано на Фіг. 7, що складається з FR1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 65, FR2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 66, FR3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 67 і FR4 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 68. За варіантом, якому віддається перевага, каркасною ділянкою важкого ланцюга гуманізованого, людського або химерного антитіла за цим винаходом є VH2-70 або VH4-39, як показано на Фіг. 5 і Фіг. 6 відповідно. Каркас VH2-70 складається з FR1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 69, FR2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 70, FR3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 71 і FR4 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 72. VH4-39 складається з FR1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 73, FR2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 74, FR3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 75 і FR4 з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 76. Послідовність каркасної ділянки антитіла для застосування на тваринах окрім людини може по суті походити з людського геному (за варіантом, якому віддається перевага, застосовується на тварині окрім людини, коли вона є зародком або новона 29 родженою) або з геному тварини, на якій воно буде застосовуватись із терапевтичною метою. За одним із варіантів здійснення антиміостатинове антитіло за цим винаходом, де уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю, яка представлена наведеною у цьому описі ПОСЛІДОВНІСТЮ, додатково відрізняється тим, що воно являє собою химерне, гуманізоване або повністю людське антитіло або його антигензв'язувальний домен, що антагонізує або нейтралізує щонайменше одну активність міостатину in vivo або in vitro. Антиміостатинове антитіло за цим винаходом, де уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю, яка представлена наведеною у цьому описі ПОСЛІДОВНІСТЮ, за варіантом, якому віддається перевага, додатково відрізняється тим, що воно переважно зв'язує GDF-8 порівняно з GDF-11. За варіантом, якому віддається більша перевага, такі антитіла зв'язують міостатин щонайменше у приблизно 2 рази, 3 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 22 рази, 24 рази або 25 разів сильніше, аніж вони зв'язують GDF-11. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, ступінь зв'язування GDF-11 такими антитілами, у разі їх експресії у вигляді Fabs, не перевищує фонових рівнів. Антиміостатинове антитіло за цим винаходом, де уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю, яка відповідає наведеній у цьому описі ПОСЛІДОВНОСТІ, за варіантом, якому віддається перевага, додатково відрізняється тим, що воно (і) зв'язує пептид, що містить амінокислотну послідовність, зображену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 53, за варіантом, якому віддається перевага, пептид, який містить амінокислотну послідовність, зображену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 62; та/або (іі) має ІС50, меншу або таку, що дорівнює приблизно 25 нМ, 20 нМ, 16 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 6 нМ, 5,7 нМ у in vitro аналізі міостатину/SBE "репортерної" групи, та/або (ііі) має зв'язувальну спорідненість (KD) до міостатину меншу за приб-8 -8 -9 лизно 3х10 М, 1x10 M або 1х10 M, за варіантом, якому віддається перевага, меншу за прибли-10 -10 -11 зно 9х10 М або 8,7х10 М чи 8х10 М; за альтернативним варіантом відрізняється KD відно-8 сно міостатину, що не перевищує приблизно 3х10 -8 -9 -10 М, 1x10 М, 1х10 М або 9х10 М; за варіантом, якому віддається більша перевага, КD, що не пе-10 ревищує приблизно 8,7х10 М, і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, КD, що не -11 перевищує приблизно 8х10 М. Експресія антитіл Цей винахід спрямовано також на лінії клітин, що експресують антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом або його частину. Одержання і виділення ліній клітин, що продукують моноклональне антитіло за цим винаходом, може здійснюватись за допомогою стандартних методів, відомих у цій галузі. Лініями клітин, яким віддається перевага, є COS (культура клітин яєчника мавпи), СНО (культура клітин яєчника китайського хом'ячка), SP2/0, NS0 та дріжджові клітини (доступні із загальнодоступних сховищ, наприклад, 95457 30 АТСС (Американська колекція типових культур), Manassas, штат Вірджинія). Для експресії антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись найрізноманітніші експресійні системи-хазяї, у тому числі прокаріотні (бактеріальні) та еукаріотні експресійні системи (наприклад, дріжджі, бакуловірус, рослинні клітини, клітини ссавців та інших тварин, трансгенні тварини та клітини гібридом), а також експресійні системи проявлення у фагах. Прикладом відповідного бактеріального експресійного вектора є pUC119, і відповідним еукаріотним експресійним вектором є модифікований вектор pcDNA3.1 з ослабленою системою вибору DHFR (дигідрофолатредуктаза). У цій галузі відомі також інші системи експресії антитіла і вони охоплюються цим винаходом. Антитіло за цим винаходом можна одержати шляхом рекомбінантної експресії імуноглобулінових генів легкого і важкого ланцюгів у клітиніхазяїні. Для експресії антитіла рекомбінантним шляхом, клітина-хазяїн трансформується, трансдукується, інфікується тощо одним або декількома векторами рекомбінантної експресії, що несуть фрагменти ДНК, які кодують імуноглобулінові легкі та/або важкі ланцюги антитіла таким чином, що згадані легкі та/або важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні. Важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно з різних промоторів, з якими вони функціонально зв'язані, у одному векторі, або за альтернативним варіантом важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно з різних промоторів, з якими вони функціонально зв'язані, у двох векторах - один із них експресує важкий ланцюг і один із них експресує легкий ланцюг. Факультативно важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись у різних клітинах-хазяях. За варіантом, якому віддається перевага, рекомбінантні антитіла секретуються до середовища, у якому культивують клітини-хазяї, з якого антитіла можуть бути виділені або очищені. Стандартні методи рекомбінантних ДНК застосовуються для одержання генів важкого і легкого ланцюгів антитіла, включення цих генів до рекомбінантних експресійних векторів і введення цих векторів до клітин-хазяїв. Опис таких стандартних методів рекомбінантних ДНК наведено, наприклад, у Сембрук (Sambrook), Фріч (Fritsch), Маніатіс (Maniatis) (редактори), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, друге видання, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Осбел (Ausubel) та інші (редактори) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989. Виділена ДНК, що кодує HCVR, може бути перетворена на непроцесований ген важкого ланцюга шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує HCVR, з іншою молекулою ДНК, що кодує константні ділянки важкого ланцюга (СН1, СН2 та СНЗ). Послідовності людських генів константної ділянки важкого ланцюга відомі у цій галузі. Дивись, наприклад, Кебот (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'яте видання, U.S. Department of Health and Human Services, публікація NIH № 91-3242 (1991). Фрагменти ДНК для цих ділянок можуть бути одержані, наприклад, 31 шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. Константна ділянка важкого ланцюга може бути константною ділянкою будь-якого типу (наприклад, IgG, IgA, IgE, IgM або IgD), класу (наприклад, IgG1 IgG2, IgG3 та IgG4) або підкласу і будь-яким алотиповим варіантом, як описано у Кебот (supra). За альтернативним варіантом антигензв'язувальним фрагментом може бути Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, Р(аb')2фрагмент, Fd-фрагмент або одноланцюговий Fvфрагмент (scFv). Для гена Fab-фрагмента важкого ланцюга, ДНК, що кодує HCVR, може функціонально зв'язуватись з іншою молекулою ДНК, що кодує лише константну ділянку СН1 важкого ланцюга. Виділена ДНК, що кодує LCVR, може бути перетворена на непроцесований ген легкого ланцюга (а також ген Fab-фрагмента легкого ланцюга) шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує LCVR, з іншою молекулою ДНК, що кодує константну ділянку легкого ланцюга, CL. Послідовності людських генів константної ділянки легкого ланцюга відомі у цій галузі. Дивись, наприклад, Кебот (Kabat), supra. Фрагменти ДНК для цих ділянок можуть бути одержані, наприклад, шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. Константна ділянка легкого ланцюга може бути константною ділянкою легкого ланцюга типу каппа або лямбда. Для одержання scFv гена фрагменти ДНК, що кодують HCVR і LCVR, функціонально зв'язують з іншим фрагментом, який кодує гнучкий лінкер, наприклад, який кодує амінокислотну послідовність (Gly4-Ser)3, завдяки чому HCVR та LCVR послідовності можуть експресуватись як суміжний безперервний одноланцюговий білок із LCVR та HCVR ділянками, які з'єднуються гнучким лінкером. Дивись, наприклад, Берд (Bird) та інші, Science, 242:423-426, 1988; Хастон (Huston) та інші, Proc. Natl. Acad. Set USA, 85:5879-5883, 1988; Маккафферті (McCafferty) та інші, Nature, 348:552-554, 1990. Для експресії антитіла за цим винаходом ДНК, що кодує частковий або повномірний легкий та/або важкий ланцюг, одержану, як було описано вище, вводять до експресійного вектора таким чином, що ген функціонально зв'язується з контрольними послідовностями транскрипції та трансляції. Експресійний вектор та контрольні послідовності експресії вибирають таким чином, щоб вони були сумісними із застосовуваними експресійними клітинами-хазяями. Ген легкого ланцюга антитіла і ген важкого ланцюга антитіла можуть вводитись до окремих факторів, або, за більш типовим варіантом, обидва гени вводять до одного й того самого експресійного вектора. Гени антитіла вводять до експресійного вектора за допомогою стандартних методів. На додаток до цього, рекомбінантний експресійний вектор може кодувати сигнальний пептид, що полегшує секрецію легкого та/або важкого ланцюга антиміостатинового моноклонального антитіла з клітини-хазяїна. Ген легкого та/або важкого ланцюга антиміостатинового моноклонального антитіла може клонуватись до вектора таким чином, що сигнальний пептид виявляється функціонально зв'язаним у межах рамки зчитування з амінокінцем гена ланцюга антитіла. Згаданий 95457 32 сигнальний пептид може бути імуноглобуліновим сигнальним пептидом або гетерологічним сигнальним пептидом. Окрім гена(-ів) важкого та/або легкого ланцюга антитіла, рекомбінантний експресійний вектор за цим винаходом несе регуляторні послідовності, що контролюють експресію гена(-ів) ланцюга антитіла у клітині-хазяїні. Термін "регуляторна послідовність" означає промотори, енхансери та інші контрольні елементи експресії (наприклад, сигнали поліаденілування) за потребою, що контролюють транскрипцію або трансляцію гена(-ів) ланцюга антитіла. Конструкція експресійного вектора, з включенням вибору регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна, яка зазнає трансформування, рівня експресії бажаного білка. Переважними регуляторними послідовностями для експресії клітинамихазяями ссавців є вірусні елементи, які забезпечують високі рівні експресії білка у клітинах ссавців, наприклад, промотори та/або енхансери, які одержують із цитомегаловірусу (CMV), мавпячого вірусу 40 (SV40), аденовірусу (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)) та вірусу поліоми. На додаток до генів важкого та/або легкого ланцюга антитіла і регуляторних послідовностей, рекомбінантні експресійні вектори за цим винаходом можуть нести додаткові послідовності, наприклад, послідовності, які регулюють реплікацію вектора у клітинах-хазяях (наприклад, точки початку реплікації) та один або декілька маркерних селектовних генів. Маркерні селектовні гени полегшують селекцію клітин-хазяїв, до яких було введено вектор. Наприклад, за типовим варіантом, маркерний селектовний ген наділяє стійкістю до лікарського засобу, наприклад, G418, гігроміцину або метотрексату, клітину-хазяїна, до якої було введено згаданий вектор. Маркерними селектовними генами, яким віддається перевага, є ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для застосування у клітинаххазяях без DHFR із селекцією/ампліфікацією метотрексатом), пео ген (для G418 селекції) та глютамат-аміак-лігази (GS) у лінії клітин, яким бракує GS (наприклад, NS0) для селекції/ампліфікації. Для експресії легких та/або важких ланцюгів експресійний(-ні) вектор (-и), що кодує(-ють) важкі та/або легкі ланцюги, вводять до клітини-хазяїна за допомогою стандартних методів, наприклад, шляхом електропорації, осадження фосфатом кальцію, трансфікування DEAE (діетиламіноетилцелюлоза)декстрану, трансдукування, інфікування тощо. Незважаючи на теоретичну можливість експресії антитіл за цим винаходом у прокаріотних або еукаріотних клітинах-хазяях, перевага відцається еукаріотним клітинам і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, клітинам-хазяям ссавців, оскільки такі клітини з більшою ймовірністю складають і секретують відповідно укладене і імунологічно активне антитіло. Клітинами-хазяями ссавців для експресії рекомбінантних антитіл за цим винаходом, яким віддається перевага, є клітини яєчника китайського хом'ячка (клітини СНО) (у тому числі DHFR-CHO клітини, опис яких наведено у роботі Урлауб (Urlaub) і Чейсін (Chasin), Proc. 33 Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220, 1980), що застосовуються з DHFR селектовним маркером, наприклад, як описано у Кауфман (Kaufman) і Шарп (Sharp), /. Мої. Віоі, 159:601-621, 1982, клітини мієломи лінії NS0, клітини COS та клітини SP2/0. У разі, коли рекомбінантні експресійні вектори, які кодують гени антитіла, вводять до клітин-хазяїв ссавців, антитіла продукуються шляхом культивування клітин-хазяїв впродовж періоду часу, достатнього для забезпечення експресії згаданого антитіла у клітинах-хазяях, або за варіантом, якому віддається більша перевага, секреції антитіла до культурального середовища, у якому вирощують клітини-хазяї. Антитіла можуть виділятись із клітини-хазяїна та/або культурального середовища за допомогою стандартних методів очищення. Клітини-хазяї можуть також застосовуватись для продукування частин або фрагментів інтактних антитіл, наприклад, Fab-фрагментів або scFv молекул, за традиційними методами. Досвідченому фахівцю буде зрозуміло, що варіанти вищезгаданих методів входять до обсягу цього винаходу. Наприклад, може виникнути необхідність трансфікування клітини-хазяїна ДНК, яка кодує легкий ланцюг або важкий ланцюг антитіла за цим винаходом. Метод рекомбінантних ДНК може також застосовуватись для видалення певної частини або усієї ДНК, яка кодує будь-який або обидва (легкий і важкий) ланцюги, які не є необхідними для зв'язування з міостатином. Молекули, що експресуються такими скороченими молекулами ДНК, також належать до антитіл за цим винаходом. У системі для рекомбінантної експресії антитіла за цим винаходом, якій віддається перевага, рекомбінантний експресійний вектор, що кодує як важкий ланцюг антитіла, так і легкий ланцюг антитіла, вводять до DHFR-CHO клітин шляхом, наприклад, трансфікування, опосередкованого фосфатом кальцію. У межах рекомбінантного експресійного вектора кожен із генів важкого і легкого ланцюгів антитіла функціонально зв'язаний із енхансером/промоторним регуляторним елементом (який, наприклад, одержують з SV40, CMV (цитомегаловірус), аденовірусу тощо, наприклад, CMV енхансер/AdMLP промоторний регуляторний елемент або SV40 енхансер/AdMLP промоторній регуляторний елемент) для стимулювання високих рівнів транскрипції генів. Рекомбінантний експресійний вектор несе також DHFR ген, який забезпечує селекцію клітин СНО, які були трансфіковані згаданим вектором шляхом селекції/ампліфікації метотрексатом. Селектовані клітини-хазяїтрансформанти культивують для забезпечення експресії важких і легких ланцюгів антитіла, і інтактне антитіло виділяють із культурального середовища. Стандартні методи молекулярної біології застосовують для одержання рекомбінантного експресійного вектора, трансфікування клітинхазяїв, селекції трансформантів, культивування клітин-хазяїв та виділення антитіла з культурального середовища. Антитіла або їх антигензв'язувальні частини за цим винаходом можуть експресуватись у тварині (наприклад, миші), що є трансгенною за людськими імуноглобуліновими 95457 34 генами [дивись, наприклад, Тейлор (Taylor) та інші, Nucleic Adds Res., 20:6287-6295, 1992]. Після завершення експресії, інтактні антитіла, їхні димери, окремі легкі і важкі ланцюги або інші форми імуноглобулінів за цим винаходом можуть бути очищені за стандартними методами, прийнятими у цій галузі, у тому числі шляхом фракціонування сульфатом амонію, за допомогою іонообмінної, афінної, з оберненою фазою, гідрофобної хроматографії на колонках, гель-електрофорезу тощо. Для фармацевтичного застосування перевага віддається по суті чистим імуноглобулінам, які мають щонайменше приблизно 90 %, 92 %, 94 % або 96 % однорідність, і найбільша перевага віддається імуноглобулінам, які мають 98 %-99 % або більший ступінь однорідності. Після завершення очищення, часткового або до однорідності, за потребою, пептиди у подальшому можуть застосовуватись із терапевтичними або профілактичними цілями, як вказується у цьому описі. Химерне антитіло Термін "химерне антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, означає моновалентні, двовалентні або полівалентні імуноглобуліни. Моновалентне химерне антитіло являє собою димер, утворений химерним важким ланцюгом, зв'язаним через дисульфідні містки з химерним легким ланцюгом. Двовалентне химерне антитіло являє собою тетрамер, утворений двома димерами важкий ланцюг-легкий ланцюг, зв'язаними щонайменше одним дисульфідним містком. Химерний важкий ланцюг антитіла містить антигензв'язувальний домен, який одержують із важкого ланцюга нелюдського антитіла, специфічного відносно міостатину, який є функціонально зв'язаним із принаймні частиною константної ділянки людського або по суті людського (або виду, який відрізняється від того виду, від якого походить антигензв'язувальний домен) важкого ланцюга. Химерний легкий ланцюг антитіла містить антигензв'язувальний домен, який повністю або значною мірою одержують із легкого ланцюга нелюдського антитіла, який є функціонально зв'язаним із принаймні частиною константної ділянки (CL) людського або по суті людського (або виду, який відрізняється від того виду, від якого походить антигензв'язувальний домен) легкого ланцюга. Антитіла, фрагменти або похідні, які мають химерні важкі ланцюги і легкі ланцюги з такою самою або іншою зв'язувальною специфічністю варіабельної ділянки, можуть також бути одержані шляхом відповідного зв'язування окремих поліпептидних ланцюгів за допомогою стадій відомих методів. У разі подібного варіанта підходу хазяїв, які експресують химерні важкі ланцюги, культивують окремо від хазяїв, що експресують химерні легкі ланцюги, а імуноглобулінові ланцюги виділяють окремо з подальшим об'єднанням. Альтернативно хазяї можуть бути сумісно культивовані із забезпеченням умов для спонтанного об'єднання ланцюгів у культуральному середовищі з подальшим виділенням зібраного імуноглобуліну або фрагмента. Методи продукування химерних антитіл є відомими у цій галузі [дивись, наприклад, патенти США 35 № 6,284,471; № 5,807,715; № 4,816,567; та № 4,816,397]. Гуманізовані антитіла За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, призначене для застосування у терапевтичних цілях, повинно мати послідовність каркаса та константної ділянки (тією мірою, у якій вона існує у антитіла), одержану від ссавця, у якого воно повинно бути застосоване як терапевтичний засіб, для того, щоб зменшити ймовірність того, що у ссавця виникне імунна реакція проти терапевтичного антитіла. Гуманізовані антитіла становлять особливий інтерес, оскільки вони вважаються цінними для терапевтичного застосування і запобігають утворенню людських антимишачих антитіл, що часто спостерігається у разі антитіл гризунів. Окрім того, у гуманізованих антитіл ефекторна частина є людською, завдяки чому вона може краще взаємодіяти з іншими частинами людської імунної системи (наприклад, із більшою ефективністю знищувати клітини-мішені шляхом комплементзалежної цитотоксичності або антитілозалежної клітинної цитотоксичності). Введені гуманізовані антитіла можуть також мати період напіввиведення, який більше нагадує відповідний показник природних людських антитіл, порівняно з, наприклад, мишачими антитілами, що надає можливість введення менших і рідших доз. Термін "гуманізоване антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, означає антитіло, яке містить частини антитіл різного походження, де щонайменше одна частина має людське походження. Наприклад, гуманізоване антитіло може містити частини, одержані з антитіла нелюдського походження з необхідною специфічністю, наприклад, мишачого, і з антитіла людського походження, об'єднані разом хімічним шляхом за допомогою традиційних методів (наприклад, синтетичних) або одержані у вигляді безперервного суміжного поліпептиду за допомогою методів генної інженерії. За варіантом, якому віддається перевага, "гуманізоване антитіло" має гіперваріабельні ділянки, які походять із нелюдського антитіла (за варіантом, якому віддається перевага, мишачого моноклонального антитіла), у той час як каркас і константна ділянка, тією мірою, до якої вона присутня (або її суттєва чи значна частина, тобто щонайменше приблизно 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 %) кодуються інформацією нуклеїновокислотної послідовності, яка знаходиться на людській імуноглобуліновій ділянці ембріонального типу (дивись, наприклад, міжнародну базу даних ImMunoGeneTics) або її рекомбінованих чи мутованих формах, незалежно від того, чи продукуються згадані антитіла у людській клітині. Гіперваріабельні ділянки гуманізованого антитіла можуть бути оптимізовані з гіперваріабельних ділянок нелюдського вихідного антитіла, з якого вони походять, для одержання бажаних властивостей, наприклад, специфічності, афінності і потенціалу. Оптимізовані гіперваріабельні ділянки можуть мати амінокислотні заміни, додання та/або делеції, порівняно з вихідними гіперваріабельними ділянками. Наприклад, амінокислотні положення 95457 36 ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 57, № ЗО, № 58, № 59, № 60 та № 61, які підкреслені та виділені жирним шрифтом на Фіг. 9, являють собою положення, які були оптимізовані з вихідних гіперваріабельних ділянок, як показано на Фіг. 10 і Фіг. 11. Однак мається на увазі, що будь-яке нелюдське антиміостатинове антитіло (і) одержане проти пептиду, який містить послідовність, зображену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 53 або № 62, або (іі) одержане проти пептиду, який містить послідовність, зображену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 53 або № 62 і реакційноздатне відносно пептиду, який містить послідовність, зображену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 53 або № 62, може бути вихідним антитілом, яке може бути перетворене на вихідне антитіло, яке може бути перетворене на гуманізоване або химерне антитіло стандартними методами, доступними у цій галузі. Гуманізовані форми нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл включають інтактне антитіло, по суті інтактне антитіло, частину антитіла, яка містить антигензв'язувальний домен або частину антитіла, яка містить Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, Р(аb')2-фрагмент або одноланцюговий Fvфрагмент. Гуманізовані антитіла за варіантом, якому віддається перевага, містять мінімальну послідовність, яка була одержана з нелюдського імуноглобуліну. Гуманізовані антитіла можуть також містити залишки, яких немає ні у антитілареципієнта, ні у занесених CDR або каркасних послідовностей. Взагалі, гуманізоване антитіло буде містити по суті усі із щонайменше однієї, а як правило, двох варіабельних ділянок, у яких усі або по суті усі амінокислоти гіперваріабельних ділянок відповідають амінокислотам нелюдського імуноглобуліну, і усі або по суті усі амінокислоти каркасних ділянок відповідають амінокислотам консенсусної послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло за оптимальним варіантом містить також принаймні частину константної ділянки (Fc) імуноглобуліну, як правило, константної ділянки людського імуноглобуліну. [Джоунс (Jones) та інші, Nature, 321:522-525 (1986); Річмен (Riechmann) та інші, Nature, 332:323-329 (1988); та Преста (Presta), Curr. Op. Struct. Bioi, 2:593-596 (1992)]. Гуманізовані антитіла можуть бути піддані in vitro мутагенезу за методами повсякденного застосування у цій галузі (або, у разі застосування тварини, трансгенної за послідовностями людського Ig, in vivo соматичному мутагенезу) і, таким чином, амінокислотні послідовності каркасної ділянки HCVR та LCVR гуманізованих рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які, незважаючи на походження від послідовностей, споріднених із людськими HCVR та LCVR послідовностями ембріонального типу, можуть не існувати за природних умов у межах репертуару людських антитіл ембріонального типу in vivo. Передбачається, що такі амінокислотні послідовності каркасних ділянок HCVR та LCVR гуманізованих рекомбінантних антитіл є щонайменше на 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 98 % або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, щонайменше на 99 % ідентичними людській послідовності ембріонального типу. За варіантом, якому віддається пере 37 вага, будуть збереженими ті каркасні залишки вихідного антитіла (наприклад, мишачого антитіла або, взагалі, того антитіла, похідним якого є гуманізоване антитіло), які підтримують або впливають на структуру антигензв'язувальних центрів антитіла. Ці залишки можуть бути ідентифіковані, наприклад, шляхом рентгенівської кристалографії вихідного антитіла або Fab-фрагмента, з ідентифікуванням, тим самим, об'ємної структури антигензв'язувального центру антитіла. Гуманізоване антитіло за цим винаходом може містити або бути похідним з каркаса легкого ланцюга людської зародкової лінії. За конкретними варіантами здійснення послідовність легкого ланцюга ембріонального типу вибрана з-посеред людських VK послідовностей, у тому числі (але без обмеження) А1, А10, A11, А14, А17, А18, А19, А2, А20, А23, А26, А27, A3, АЗО, А5, А7, В2, ВЗ, LI, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4 та O8. За певними варіантами здійснення цей каркас легкого ланцюга людської зародкової лінії вибраний з-посеред V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V13, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 та V5-6. Дивись опис різних послідовностей ембріонального типу у W0 2005/005604. За іншими варіантами здійснення гуманізоване антитіло за цим винаходом може містити або бути похідним із каркаса важкого ланцюга людської зародкової лінії. За конкретними варіантами здійснення каркас важкого ланцюга людської зародкової лінії вибирають з-посеред VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 та VH7-81. Дивись опис різних послідовностей ембріонального типу у WO 2005/005604. За конкретними варіантами здійснення варіабельна ділянка легкого ланцюга та/або варіабельна ділянка важкого ланцюга містить каркасну ділянку або принаймні частину каркасної ділянки (таку, наприклад, що містить 2 або З субрайони, наприклад, FR2 та FR3). За певними варіантами здійснення принаймні FRL1, FRL2, FRL3 або FRL4 є повністю людськими. За іншими варіантами здійснення принаймні FRH1, FRH2, FRH3 або FRH4 є повністю людськими. За деякими варіантами здійснення принаймні FRL1, FRL2, FRL3 або FRL4 являють собою послідовність ембріонального типу (наприклад, людської зародкової лінії) або містять людські консенсусні послідовності для конкретного каркаса. За іншими варіантами здійснення принаймні FRH1, FRH2, FRH3 або FRH4 являють собою послідовність ембріонального типу (наприклад, людської зародкової лінії) або містять людські консенсусні послідовності для конкретного каркаса. За варіантами здійснення, яким віддаєть 95457 38 ся перевага, каркасна ділянка являє собою людську каркасну ділянку. Взагалі, гуманізовані антитіла можуть продукуватись шляхом одержання нуклеїновокислотних послідовностей, що кодують HCVR та LCVR антитіла, наприклад, мишачого антитіла або антитіла, що продукується гібридомою, яке зв'язує антигенну детермінанту міостатину за цим винаходом, виявлення гіперваріабельних ділянок на згаданих HCVR та LCVR (нелюдських) і пересадження таких нуклеїновокислотних послідовностей, що кодують гіперваріабельні ділянки на вибрані нуклеїновокислотні послідовності, які кодують людський каркас. Факультативно гіперваріабельна ділянка може бути оптимізована шляхом піддання мутагенезу довільно або у конкретних місцях для заміни, видалення або додання однієї або декількох амінокислот гіперваріабельної ділянки перед пересадженням згаданої гіперваріабельної ділянки до каркасної ділянки. Альтернативно гіперваріабельна ділянка може бути оптимізована після введення до людської каркасної ділянки за допомогою способів, доступних фахівцю у цій галузі. За варіантом, якому віддається перевага, амінокислотні послідовності людського каркаса вибирають таким чином, щоб антитіло, яке одержують, було ймовірно придатним для in vivo введення людям. Це може визначатись, наприклад, виходячи з попереднього застосування антитіл, які містять такі людські каркасні послідовності. За варіантом, якому віддається перевага, людська каркасна послідовність сама по собі не буде мати значної імуногенності. Альтернативно амінокислотні послідовності каркасів для антитіла, яке призначається для гуманізації, можуть порівнюватись з амінокислотними послідовностями відомих людських каркасів, призначених для пересадження гіперваріабельних ділянок, і вибиратись виходячи з того, що вони містять послідовності, дуже подібні до послідовностей вихідного антитіла, наприклад, мишачого антитіла, яке зв'язує міостатин. У цій галузі були виділені численні людські каркасні послідовності з повідомленням їхніх послідовностей. Це підвищує ймовірність того, що одержане гуманізоване антитіло з пересадженими гіперваріабельними ділянками, яке містить гіперваріабельні ділянки вихідного (наприклад, мишачого) антитіла або оптимізовані гіперваріабельні ділянки вихідного антитіла, пересаджені на вибрані людські каркаси (і, можливо, також людську константну ділянку), по суті збережуть антигензв'язувальний центр антитіла і тим самим збережуть зв'язувальну афінність вихідного антитіла. Для значного збереження антигензв'язувальної спорідненості вибраними людськими каркасними ділянками будуть, за варіантом, якому віддається перевага, ті ділянки, які, як очікується, є придатними для in vivo введення, тобто неімуногенними. За будь-яким методом одержують послідовність ДНК, яка кодує HCVR і LCVR ділянки, за варіантом, якому віддається перевага, мишачого антиміостатинового антитіла. Методи клонування нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують імуноглобуліни, є добре відомими у цій галузі. Ці 39 методи можуть, наприклад, включати ампліфікацію послідовностей, які кодують імуноглобуліни, призначених для клонування із застосуванням відповідних праймерів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR). У літературі представлені праймери, придатні для ампліфікування імуноглобулінових нуклеїновокислотних послідовностей і, конкретно, мишачих HCVR та LCVR послідовностей. Після завершення клонування таких послідовностей, які кодують імуноглобуліни, їх піддають секвенуванню за методами, добре відомими у цій галузі. Після перенесення послідовностей, які кодують гіперваріабельні ділянки, на вибрані послідовності, які кодують людський каркас, одержані послідовності ДНК, які кодують "гуманізовані" послідовності варіабельних ділянок важкого ланцюга і варіабельних ділянок легкого ланцюга, експресують з одержанням гуманізованого Fv або гуманізованого антитіла, яке зв'язує міостатин. Гуманізовані HCVR і LCVR можуть експресуватись як частина цілої молекули антиміостатинового антитіла, тобто як гібридний білок із послідовностями людських константних ділянок, де послідовності ДНК, які їх кодують, були одержані з комерційно доступної бібліотеки або за допомогою, наприклад, одного з вищеописаних методів одержання послідовностей ДНК або таких, які існують у цій галузі. Однак послідовності HCVR та LCVR можуть також експресуватись за відсутності константних послідовностей для продукування гуманізованого антиміостатинового Fv. Незважаючи на це, злиття людських константних послідовностей з варіабельною ділянкою є потенційно бажаним, оскільки одержане у результаті цього гуманізоване антиміостатинове антитіло може мати людські ефекторні функції. Методи синтезування ДНК, які кодують білок відомої послідовності, добре відомі у цій галузі. За допомогою таких методів синтезують послідовності ДНК, які кодують цільові гуманізовані послідовності HCVR та LCVR (з константними ділянками або без них), після чого експресують їх у векторній системі, придатній для експресії рекомбінантних антитіл. Це може здійснюватись у будь-якій векторній системі, яка забезпечує можливість експресії цільових гуманізованих послідовностей HCVR та LCVR у вигляді гібридного білка з людськими послідовностями константних ділянок і об'єднання з одержанням функціональних (антигензв'язувальних) антитіл або фрагментів антитіл. Людські послідовності константних ділянок добре відомі у цій галузі і наведені у літературі. Людськими послідовностями константних ділянок легкого ланцюга, яким віддається перевага, є послідовності константних ділянок легких ланцюгів типу каппа і лямбда. Людськими послідовностями константних ділянок важких ланцюгів, яким віддається перевага, є людський IgG1 людський IgG2, людський IgG3, людський IgG4 та їхні мутовані варіанти, які забезпечують одержання зміненої ефекторної функції, наприклад, збільшеного in vivo періоду напіввиведення, зменшеного зв'язування Fc рецептора або зміненого профілю деамідування. 95457 40 У разі присутності, людські каркасні ділянки за варіантом, якому віддається перевага, одержують із варіабельної ділянки людського антитіла, яке має схожість послідовності з аналогічною або еквівалентною ділянкою донора антигензв'язувального центра (тобто вихідного антитіла). Іншими джерелами каркасних ділянок для частин людського походження гуманізованого антитіла є людські консенсусні послідовності варіабельної ділянки [дивись, наприклад, Кеттлборо К.А. (Kettleborough C.A.) та інші, Protein Engineering, 4:773-783 (1991); Картер (Carter) та інші, WO 94/04679]. Наприклад, послідовність антитіла або варіабельної ділянки, яка застосовується для одержання нелюдської частини, може порівнюватись із людськими послідовностями, як описано у Кебот (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'яте видання, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). За варіантом здійснення, якому віддається особлива перевага, каркасні ділянки ланцюга гуманізованого антитіла одержують із людської варіабельної ділянки, яка має щонайменше приблизно 60 % загальну ідентичність послідовності, за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше приблизно 70 % загальну ідентичність послідовності, і за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно 85 % загальну ідентичність послідовності з варіабельною ділянкою нелюдського донора. Людська частина може також одержуватись із людського антитіла, яке має щонайменше приблизно 65 % ідентичність послідовності, а за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше приблизно 70 % ідентичність послідовності у межах конкретної частини (наприклад, FR), яка застосовується, у разі порівняння з еквівалентною частиною (наприклад, FR) нелюдського донора. Додатковими джерелами з описом методів, залучених до гуманізації мишачого антитіла, які можуть застосовуватись, є, наприклад, такі як Квін (Queen) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2869, 1991; патент США № 5,693,761; патент США № 4,816,397; патент США № 5,225,539; комп'ютерні програми ABMOD та ENCAD, опис яких наведено у Левітт М. (Levitt M.), /. Моl. Віоl, 168:595-620, 1983; гуманізація може по суті здійснюватись за методом Вінтер (Winter) та співробітників [Джоунс (Jones) та інші, Nature, 321:522-525 (1986); Річмен (Riechmann) та інші, Nature, 332:323-327 (1988); Веройєн (Verhoeyen) та інші, Science, 239:15341536 (1988)]. Людські антитіла Альтернативою гуманізації є одержання людських антитіл. Людські антитіла можна одержати за допомогою різних методів, відомих у цій галузі, у тому числі за допомогою бібліотек проявлення у фагах. Хугенбум (Hoogenboom), Вінтер (Winter), /. Моl Віоl, 227:381 (1991); Маркс (Marks) та інші, /. Моl. Віоl, 222:581 (1991). Методи Коул (Cole) та інших і Бернер (Boerner) та інших також доступні для одержання людських моноклональних антитіл. Коул (Cole) та інші, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, стор. 77 (1985) та Бернер (Boerner) та інші, /. Immunol, 147(l):86-95 (1991). Подібним же чином людські антитіла мож 41 на одержати шляхом введення людських імуноглобулінових локусів трансгенним тваринам, наприклад, мишам, у яких ендогенні імуноглобулінові гени були частково або повністю інактивовані. Після імунізації, наприклад, антигеном, який містить імуногенну антигенну детермінанту за цим винаходом, одержують продукування повного репертуару людських антитіл, яке, в усіх відношеннях, близько нагадує те, що спостерігається у людей, у тому числі реаранжування генів, складання і репертуар антитіл. Цей варіант підходу описано, наприклад, у патентах США № 5,545,807; № 5,545,806; № 5,569,825; № 5,589,369; № 5,591,669; № 5,625,126; № 5,633,425; № 5,661,016 і у наведених далі наукових публікаціях: Маркс (Marks) та інші, BioTechnology, 10:779-783, 1992; Лонберг (Lonberg) та інші, Nature, 368:856-859, 1994; Моррісон (Morrison), Nature, 368:812-813, 1994; Фішвайлд (Fishwild) та інші, Nature Biotechnology, 14:845-851, 1996; Нюбергер (Neuberger), Nature Biotechnology, 14:826 (1996); Лонберг (Lonberg) та Хушар (Huszar), Intern. Rev. Immunol, 13:65-93 (1995) і Джобкобовіц (Jobkobovits) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551, 1993. Людські імуноглобулінові гени, введені мишам, з одержанням, тим самим, трансгенних мишей, здатних реагувати на антигени антитілами, що мають людські послідовності, описані також у Брюггеманн (Bruggemann) та інші, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 86:6709-6713 (1989)]. Існує декілька стратегій одержання ссавців, що продукують людські антитіла. Зокрема, існує "мінілокусний" підхід, за яким екзогенний Ig локус імітується шляхом включення частинок (окремих генів) Ig локусу [дивись, наприклад, патенти США № 5,545,807, № 5,545,806, № 5,625,825, № 5,625,126, № 5,633,425, № 5,661,016, № 5,770,429, № 5,789,650 та № 5,814,318, № 5,612,205, № 5,721,367, № 5,789,215], введення до YAC (штучна дріжджова хромосома) великих і значною мірою ембріональних фрагментів Ig локусів [дивись Мендес (Mendez) та інші, Nature Genetics, 15:146-156 (1997), Грін (Green) та Джакобовіц (Jakobovits), /. Exp. Med., 188:483-495 (1998)], та введення повних або по суті повних локусів шляхом злиття мініатюрних клітин [дивись заявку на Європатент № ЕР 0 843 961 А1]. Будь-яка трансгенна миша, здатна до реагування на імунізацію антитілами, що мають людські послідовності, може застосовуватись для продукування антиміостатинового антитіла за цим винаходом у разі застосування методів, доступних фахівцю у цій галузі, наприклад, коли таку мишу імунізують поліпептидом, що містить імуногенну антигенну детермінанту за цим винаходом. Варіанти застосування Антитіла за цим винаходом придатні для терапевтичного, профілактичного, діагностичного та науково-дослідного застосування, як описано у цьому описі. Антитіло за цим винаходом може бути застосоване для діагностування розладу або захворювання, пов'язаного з експресією людського міостатину. Подібним же чином антитіло за цим винаходом може застосовуватись у аналізі для контролювання рівнів міостатину у суб'єкта, якого піддають лікуванню з приводу стану, пов'язаного з 95457 42 міостатином. Діагностичні аналізи включають методи, за якими застосовують антитіло за цим винаходом і мітку для виявлення міостатину у зразку, наприклад, у рідині у тілі людини або у клітинному або тканинному екстракті. Антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись із модифікуванням або без нього і мітитись шляхом ковалентного або нековалентного приєднання виявної складової. Виявною складовою може бути будь-яка складова, здатна до продукування, безпосередньо або опосередковано, виявного сигналу. Виявною складовою може бути, наприклад, радіоактивний ізотоп, 3 14 32 35 125 наприклад, Н, С, Р, S або І, флуоресцентна або хемілюмінесцентна сполука, наприклад, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін або люциферин; або фермент, наприклад, лужна фосфатаза, бетагалактозидаза або пероксидаза з хрону. Може застосовуватись будь-який метод, відомий у цій галузі, для окремого кон'югування антитіла з виявною складовою, у тому числі методи, описані Хантер (Hunter) та інші, Nature, 144:945, 1962; Девід (David) та інші, Biochemistry, 13:1014, 1974; Пейн (Pain) та інші, /. Immunol Meth., 40:219, 1981; та Нігрен (Nygren), /. Histochem. And Cytochem., 30:407, 1982. У цій галузі відомі різноманітні традиційні методи визначення рівнів міостатину, у тому числі, наприклад, ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), RIA (радіоімунологічний аналіз) і FACS (клітинний сортер із збудженням флуоресценції), які становлять основу для діагностування змінених або патологічних рівнів експресії міостатину. Нормальні або стандартні рівні експресії встановлюють за допомогою будь-якого відомого у цій галузі методу, наприклад, шляхом об'єднання зразка, який містить поліпептид міостатин з, наприклад, антитілами, за умов, придатних для утворення комплексу антиген:антитіло. Згадане антитіло безпосередньо або опосередковано мітять виявною речовиною для полегшення виявлення зв'язаного або незв'язаного антитіла. Придатними виявними речовинами є різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали та радіоактивні матеріали. Приклади придатних ферментів включають пероксидазу з хрону, лужну фосфатазу, р-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади придатних комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин та авідин/біотин; приклади придатних флуоресцентних матеріалів включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, діхлоротриазиніламінфлуоресцеїн, дансилу хлорид або фікоеритрин; прикладом люмінесцентного матеріалу є люмінол; приклади радіоактивно125 131 35 3 го матеріалу включають І, І, S або Н. (Дивись, наприклад, Золя (Zola), Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). Кількісне визначення утвореного стандартного комплексу здійснюють різними методами, наприклад, фотометричним методом. Кількість поліпептиду міостатину, експресованого суб'єктом, контролем та у зразках (наприклад, із біоптатів), після цього порівнюють зі стандартними значеннями. Відхилення значень між стандартом та у суб'єкта 43 встановлює параметри для кореляції конкретного розладу, стану, синдрому або захворювання з певним рівнем експресії (або її відсутності) поліпептиду міостатину. Після встановлення наявності розладу, стану, синдрому або захворювання і започаткування лікування, аналізи регулярно повторюють для контролювання рівня експресії міостатину. Результати, одержані при проведенні послідовних аналізів, застосовують для демонстрування ефективності лікування впродовж періоду часу, тривалість якого становить від декількох днів до місяців. Щодо конкретних розладів (наприклад, слабкість або кахексія), присутність зміненої кількості міостатину у біоптаті або рідині (наприклад, сироватці або сечі) від суб'єкта може вказувати на схильність до розвитку розладу, стану, синдрому або захворювання чи може надати засіб для виявлення такого розладу, стану, синдрому або захворювання до появи реальних клінічних симптомів або може визначити групу, у якої з більшою ймовірністю буде спостерігатись терапевтична реакція на антитіло за цим винаходом. Точніше початкове виявлення надасть можливість ранішого започаткування лікування і, тим самим, запобігання та/або полегшення симптомів подальшого розвитку захворювання або розладу, пов'язаного з експресією міостатину, наприклад, деградації м'язів або кісткової тканини. Для зручності антитіло за цим винаходом може надаватись у вигляді набору, запакованої комбінації реактивів у попередньо визначених кількостях з інструкціями для здійснення діагностичного аналізу. У разі, коли антитіло мітять ферментом, згаданий набір буде включати субстрати і кофактори, які необхідні для згаданого фермента (наприклад, попередник субстрату, який забезпечує виявний хромофор або флуорофор). Окрім того, можуть включатись інші додаткові речовини, наприклад, стабілізатори, буфери (наприклад, блокувальний буфер або лізисний буфер) тощо. Відносні кількості різних реактивів можуть коливатись у широких межах для забезпечення концентрацій у розчині реактивів, які по суті оптимізують чутливість згаданого аналізу. Зокрема, реактиви можуть постачатись у вигляді сухих порошків, як правило, ліофілізованих, у тому числі наповнювачів, які, у разі розчинення, забезпечать одержання розчину реактивів, який має відповідну концентрацію. Варіанти терапевтичного застосування антитіла Міостатин відіграє роль у процесі розвитку м'язів та у ряді пов'язаних з ним розладів або захворювань. У дорослих мРНК міостатину виявляють, головним чином, у скелетних м'язах, хоча менші концентрації знаходять також у жировій тканині і серцевій тканині [Шарма М. (Sharma M.) та інші, /. Cell Physiol, 180:1, 1999]. Маса м'язів у мишей з блокованим міостатином у два-три рази перевищує відповідний показник у одноприплідних тварин дикого типу. Збільшена маса м'язів є наслідком гіпертрофії і гіперплазії волокна [Макферрон A. (McPherron А.) та інші, Nature, 387:83-90, 1997 і Жу Кс. (Zhu X.) та інші, FEBS Letters, 474:71]. На додаток до цього, миші з блокованим міостатином накопичують менше жирового компонента тіла, аніж одноприплідні тварини дикого ти 95457 44 пу, але виглядають нормальними і здоровими у всіх інших відношеннях. Нещодавно було показано, що міостатин є важливим регулятором адіпогенезу [Реббапрагада A. (Rebbapragada А.) та інші, Мої. and Cell. Bio., 23:7230-7242, 2003]. На додаток до цього, нещодавно у мишей з дефіцитом міостатину досліджували структуру і вміст кісткової тканини [Хемрік М.В. (Hamrick M.W.) та інші, /. Orthopaedic Research, 21:1025, 2003; Хемрік М.В. (Hamrick M.W.) та інші, Calcif Tissue Int, 71:63, 2002]. Таким чином, фармацевтична композиція, яка містить антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом, може застосовуватись для збільшення м'язової маси, підвищення густини кісткової тканини, зменшення виснаження м'язів або може застосовуватись для лікування або профілактики станів, у разі яких присутність міостатину спричинює або сприяє виникненню небажаних патологічних ефектів або зниження рівнів міостатину терапевтично ефективно діє на ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, людей, у тому числі (але без обмеження) у разі виснаження м'язів, пошкодження м'язів, хірургічного втручання, відновлення пошкодженого м'яза, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності, остеопорозу, остеоартриту, росту і відновлення зв'язок, ожиріння, пригнічення накопичення жирового компонента тіла, ожиріння, дистрофії м'язів будь-якого типу, міопатії у разі інтенсивної терапії і реанімації, алкогольної міопатії, кахексії (наприклад, ракової кахексії або кахексії у разі ВІЛ, кахексії унаслідок COPD, хронічної хвороби легень, видужання від сепсису, ниркової недостатності, печінкової недостатності, серцевої недостатності або захворювання), порушення обміну речовин, післяопікового виснаження м'язів та діабету типу II. Атрофія від бездіяльності може бути наслідком численних причин або випадків, у тому числі будь-якого розладу, захворювання або стану, що обумовлює тривалу непорушність, бездіяльність або постільний режим, у тому числі (але без обмеження) трансплантації паренхіматозних органів, протезування суглобів, інсульту, пошкодження спинного мозку, видужання від тяжкого опіку, стаціонарного хронічного гемодіалізу, видужання після сепсису та впливу зменшеної сили тяжіння. Оскільки послідовність і функція міостатину є висококонсервативними у різних видів тварин, антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись для збільшення м'язової маси, підвищення густини кісткової тканини або лікування чи профілактики станів у ссавців окрім людини чи видів птахів [наприклад, домашніх тварин (наприклад, собак і кішок), спортивних тварин (наприклад, коней), сільськогосподарських тварин (наприклад, великої рогатої худоби, свиней і овець), видів птахів (наприклад, курок, індиків, інших мисливських або домашніх птахів], де присутність міостатину спричинює або сприяє виникненню небажаних патологічних ефектів або зниження рівнів міостатину має сприятливий терапевтичний ефект. Цим винаходом передбачається застосування антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом для лікування або профілактики 45 щонайменше одного з вищезгаданих розладів, у разі якого активність міостатину є шкідливою або корисним для якого є зниження рівнів біоактивного міостатину. На додаток до цього, передбачається застосування антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом при виготовленні лікарського засобу для лікування щонайменше одного з вищезгаданих розладів. Терміни "лікування", "лікувати" тощо, у значенні, вживаному у цьому описі, означає досягнення бажаного фармакологічного та/або фізіологічного ефекту. Згаданий ефект може бути профілактичним з точки зору повного або часткового запобігання захворюванню або його симптому та/або може бути терапевтичним з точки зору часткового або повного вилікування від захворювання та/або позбавлення від негативного впливу, пов'язаного із захворюванням. Термін "лікування", у значенні, вживаному у цьому описі, означає введення сполуки за цим винаходом для лікування захворювання або стану у ссавця, зокрема, у людини, і включає: (а) запобігання виникненню захворювання у суб'єкта, що є схильним до згаданого захворювання, але який ще не був діагностований як такий, що має згадане захворювання; (b) пригнічення захворювання, тобто припинення його розвитку; і (c) полегшення симптомів захворювання, тобто спричинення зворотного розвитку захворювання або розладу чи полегшення його симптомів або ускладнень. Схеми приймання лікарського засобу можуть підбиратись таким чином, щоб забезпечити оптимальну бажану реакцію (наприклад, терапевтичну або профілактичну реакцію). Наприклад, може вводитись одноразова ударна доза, впродовж певного періоду часу можуть вводитись декілька менших доз або доза може пропорційно зменшуватись або збільшуватись у залежності від вимог терапевтичної ситуації. Фармацевтична композиція Антитіло за цим винаходом може включатись до складу фармацевтичних композицій, придатних для введення суб'єкту. Сполуки за цим винаходом можуть вводитись самостійно або у поєднанні з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем та/або наповнювачами у вигляді одно- чи багаторазових доз. Фармацевтичні композиції для введення розробляються таким чином, щоб бути придатними для вибраного способу введення і відповідним чином застосовуються фармацевтично прийнятні розріджувачі, носії, та/або наповнювачі, наприклад, диспергувальні речовини, буфери, поверхнево-активні речовини, консерванти, солюбілізатори, агенти для регулювання ізотонічності тощо. Згадані композиції розробляються за традиційними методами, опис яких наведено, наприклад, у довіднику Remington. The Science and Practice of Pharmacy, 19-е видання, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, штат Пенсільванія, 1995, який надає стислий опис способів одержання лікарських форм, які є загальновідомими лікарям-практикам. Фармацевтична композиція, що містить антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом, може вводитись суб'єкту, якому загрожує або який демонструє патолога, опис яких наведе 95457 46 но, за допомогою стандартних методів введення, у тому числі шляхом перорального, внутрішньовенного, внутрішньоочеревинного, підшкірного, легеневого, черезшкірного, внутрішньом'язового, інтраназального, защічного, сублінгвальнового або супозиторного введення. Фармацевтична композиція за цим винаходом за варіантом, якому віддається перевага, являє собою "терапевтично ефективну кількість" або "профілактично ефективну кількість" антитіла за цим винаходом. "Терапевтично ефективна кількість" означає кількість, ефективну, у дозах та впродовж необхідних періодів часу, для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість антитіла може змінюватись у залежності від таких факторів, як стан захворювання, вік, стать і маса особи, здатність антитіла або частини антитіла до викликання бажаної реакції у індивіда. Терапевтично ефективною кількістю є також кількість, для якої будь-який токсичний або шкідливий ефекти антитіла переважаються терапевтично сприятливими ефектами. "Профілактично ефективна кількість" означає кількість, ефективну, у дозах та впродовж необхідних періодів часу, для досягнення бажаного профілактичного результату. Як правило, оскільки профілактична доза застосовується до суб'єктів перед або на початковій стадії захворювання, профілактично ефективна кількість буде меншою, аніж терапевтично ефективна кількість. Терапевтично ефективна або профілактично ефективна кількість є принаймні мінімальною дозою, але меншою за токсичну дозу активного агента, яка є необхідною для корисної дії на суб'єкта. Інакше кажучи, терапевтично ефективною кількістю антитіла за цим винаходом є кількість, яка у ссавцш, за варіантом, якому віддається перевага, людей, збільшує м'язову масу, підвищує густину кісткової тканини або лікує стани, у разі яких присутність міостатину спричинює або сприяє виникненню небажаних патологічних ефектів або наслідком зниження рівнів міостатину є корисний терапевтичний ефект у ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людини, у тому числі (але без обмеження) у разі виснаження м'язш, пошкодження м'язів, хірургічного втручання, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності, остеопорозу, остеоартриту, росту і відновлення зв'язок, ожиріння, пригнічення накопичення жирового компонента тіла, дистрофії м'язів будь-якого типу, міопатії у разі інтенсивної терапії і реанімації, кахексії (наприклад, ракової кахексії або кахексії у разі ВІЛ, кахексії унаслідок COPD, ниркової недостатності, печінкової недостатності, серцевої недостатності або захворювання), порушення обміну речовин та діабету типу II. Атрофія від бездіяльності може бути наслідком численних причин або випадків, у тому числі будь-якого розладу, захворювання або стану, що обумовлює тривалу непорушність, бездіяльність або постільний режим, у тому числі (але без обмеження) трансплантації паренхіматозних органів, протезування суглобш, інсульту, пошкодження спинного мозку, видужання від тяжкого опіку, стаціонарного хронічного гемоді 47 алізу, видужання після сепсису та впливу зменшеної сили тяжіння. Шлях введення антитіла за цим винаходом може бути пероральним, парентеральним, інгаляційним або місцевим. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом можуть включатись до складу фармацевтичної композиції, придатної для парентерального введення. Термін "парентеральне", у значенні, вживаному у цьому описі, означає внутрішньовенне, внутрішньом'язове, підшкірне, ректальне, вагінальне або внутрішньоочеревинне введення. Перевага віддається периферичній системній доставці шляхом внутрішньовенного, внутрішньоочеревинного або підшкірного введення. Придатні носії для такого введення відомі у цій галузі. Фармацевтична композиція за типовим варіантом повинна бути стерильною і стійкою за умов виготовлення і збереження у наданому контейнері, у тому числі, наприклад, герметизованому флаконі або шприці. Таким чином, фармацевтичні композиції можуть фільтруватись за стерильних умов після їх виготовлення або їх мікробіологічна прийнятність повинна забезпечуватись іншими способами. Типова композиція для внутрішньовенного вливання повинна містити 250-1000 мл рідини, наприклад, стерильного розчину Рінгера, фізіологічного розчину, розчину декстрози, розчину Хенкса, і терапевтично ефективну дозу (наприклад, від 1 мг/мл до 100 мг/мл або більше) концентрації антитіла. Доза може змінюватись у залежності від типу і тяжкості захворювання. Як добре відомо у галузі медицини, дози для будь-якого із суб'єктів залежать від багатьох факторів, у тому числі розміру хворого, площі поверхні тіла, віку, конкретної сполуки, призначеної для введення, статі, часу і шляху введення, загального стану здоров'я та інших лікарських засобів, які вводяться одночасно. Типова доза може бути, наприклад, у межах від 0,001 мкг до 1000 мкг; передбачаються, однак, дози, які є меншими або більшими за цей зразковий діапазон, особливо приймаючи до уваги вищезгадані фактори. За схемою приймання лікарського засобу, добова доза повинна становити приблизно від 0,1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг загальної маси тіла, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 0,3 мкг/кг до приблизно 10 мг/кг, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 1 мкг/кг до 1 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 0,5 мкг/кг до 10 мг/кг маси тіла на добу. Розвиток може контролюватись шляхом періодичних визначень. Для повторних введень впродовж декількох днів або довше, у залежності від стану, лікування повторюють доти, доки не відбудеться бажаного пригнічення симптомів захворювання. Корисними, однак, можуть бути інші схеми приймання лікарського засобу, які не виключаються з цього винаходу. Бажана доза може доставлятись шляхом введення одноразової ударної дози, шляхом багаторазового введення ударної дози або шляхом безперервного вливання антитіла, у залежності від характеру фармакокінетичних показників, яких бажає досягти лікар-практик. 95457 48 Такі запропоновані кількості антитіла приймаються, значною мірою, за розсудом лікаря. Ключовим фактором у виборі відповідної дози і схеми застосування лікарського засобу є одержаний результат. Факторами, які повинні прийматись до уваги у цьому контексті, є конкретний розлад, який піддають лікуванню, конкретний ссавець, якого піддають лікуванню, клінічний стан індивідуального хворого, причина захворювання, місце введення антитіла, конкретний тип антитіла, спосіб введення, схема застосування та інші фактори, відомі лікарям-практикам. Терапевтичні агенти за цим винаходом можуть заморожуватись або ліофілізуватись для збереження та відновлюватись у відповідному стерильному носії перед застосуванням. Наслідком ліофілізації і відновлення може бути втрата активності антитіла різного ступеня. Дози повинні регулюватись для компенсування можливої втрати активності. Взагалі, перевага віддається рН у межах 6-8. Готові вироби За іншим варіантом здійснення цього винаходу пропонується готовий виріб, який включає в себе матеріали, придатні для лікування або запобігання розладів або станів, опис яких наведено вище. Готовий виріб включає в себе контейнер і етикетку. Відповідними контейнерами є, наприклад, флакони, ампули, шприци і контрольні пробірки. Контейнери можуть виготовлятись із різноманітних матеріалів, наприклад, скла або пластика. Контейнер вміщує композицію за цим винаходом, що є ефективною для запобігання або лікування розладу чи стану, і може мати стерильний вхідний отвір (наприклад, контейнер може бути пластиковим пакетом із розчином для внутрішньовенного введення або флаконом із пробкою, яку проколюють голкою шприца для підшкірних ін'єкцій). Активним агентом у згаданій композиції є антиміостатинове антитіло за цим винаходом. На етикетці, яка розміщується на контейнері або додається до нього, зазначається, що композиція застосовується для лікування відповідного стану. Готовий виріб може додатково включати другий контейнер, який вміщує фармацевтично прийнятний буфер, наприклад, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин декстрози. Він може додатково включати інші матеріали, необхідні з комерційної точки зору або точки зору споживача, у тому числі інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци і пакувальні вкладки з інструкціями для застосування. Наведені нижче приклади пропонуються лише з ілюстративними цілями і не призначені для будьякого обмеження обсягу цього винаходу. Приклади Приклад 1: Твердофазні імуноферментні аналізи А. Антиміостатинові Fabs переважно зв'язують міостатин порівняно з GDF-11 Антиміостатинові Fabs (або непроцесовані моноклональні антитіла (mAbs)) за цим винаходом перевіряють шляхом проведення ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), за допомогою якого визначають зв'язування Fab зі зрілим міостатином (димерна форма), нанесеним із різними концентраціями на 96 49 лунковий планшет. Перевіряють також зв'язування Fabs з GDF-11. Кожну лунку двох 96-лункових планшетів сенсибілізують 200 нг/лунка рекомбінантного мишачого міостатину (компанія R&D systems, номер за каталогом 788-G8/CF, без носія, у карбонатному буфері, рН 9,6) або 200 нг/лунка рекомбінантного людського GDF-11 (компанія Peprotech, Inc., номер за каталогом 120-11, без носія, у карбонатному буфері, рН 9,6). Планшети інкубують при температурі 4 °C впродовж ночі. Вміст лунок відсмоктують і лунки двічі промивають промивним буфером (20 мМ розчин трис-(гідроксиметил)амінометану, рН 7,4, 0,15 М розчин NaCl, 0,1 % Твін-20). Планшети блокують 200 мкл блокувального буфера/лунка (5 % розчин швидкорозчинного сухого молока (компанія Carnation) у вищевказаному промивному буфері) впродовж 5 год. Fabs або mabs, призначені для перевірки, розбавляють у блокувальному буфері з різними концентраціями, наприклад, 10 мкг/мл, 2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,08 мкг/мл та 0,016 мкг/мл. П'ятдесят мікролітрів розчину кожного Fab додають до сенсибілізованих GDF-8 та GDF-11 лунок із подвоєнням. Планшети інкубують впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Лунки після цього тричі промивають промивним буфером. До кожної лунки додають кон'юговане з лужною фосфатазою (АР) друге антитіло (50 мкл козячого антикаппа АР (компанія Southern Biotech), розбавленого 1:1000 у блокувальному буфері) та інкубують впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Лунки після цього тричі промивають промивним буфером. До кожної лунки додають 50 мкл хромогенного субстрату (тобто АР субстрату) і витримують з проявленням при кімнатній температурі. Оптичну густину лунок визначають при OD=560 нм. Визначають середню оптичну густину за двома лунками. Усі антитіла за цим винаходом зв'язуються із зв'язаним із планшетом людським зрілим міостатином і переважно зв'язуються з міостатином у разі порівняння із зв'язуванням з GDF-11. У разі випробування GDF-8 за допомогою ELISA, Fab С12 має ІС50 0,25 мкг/мл; Fab 510C2 має ІС50 0,27 мкг/мл. В. Гуманізовані оптимізовані антиміостатинові антитіла зв'язують міостатиновий пептид При проведенні ELISA, антитіла за цим винаходом зв'язують очищений, біотинілований пептид із послідовністю, що стягує амінокислоти 40-64 зрілого людського міостатину (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 53), за виключенням того, що замість залишку цистеїну у положенні 47 знаходиться аміномасляна кислота. Антитіла за цим винаходом також зв'язують пептид із послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНІСТЮ № 62 (з цистеїном або серином у положенні 47 зрілого міостатину), а також зрілу форму міостатину у мономерній та димерній формах. При проведенні зразкового ELISA, 50 мкл розчину (1 мкг/мл) козячого антилюдського каппа антитіла (UNLB, компанія Southern Biotech, номер за каталогом 2060-01) у 50 мМ натрійбікарбонатному буфері (рН 8,0) застосовують для сенсибілізації кожної лунки титраційного мікропланшета з висо 95457 50 ким рівнем зв'язування (компанія Greiner EK, номер за каталогом 20061). Вміст лунок відсмоктують, і лунки промивають PBST (PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин), 0,1 % Твій), після чого блокують впродовж 1 год. за допомогою PBST-BSA (PBS, 1 % BSA (сироватковий альбумін великої рогатої худоби), 0,1 % Твій). Після цього лунки знову промивають PBST. Усі стадії аналізу здійснюють при кімнатній температурі. Титроване гуманізоване оптимізоване антиміостатинове антитіло (непроцесоване антитіло, що містить Fc ділянку IgG4, тимчасово експресовану у 293 клітинах), розведене у PBST-BSA, розпочинаючи з 50 нг/лунка, додають до лунок, планшет додатково інкубують впродовж 1 год., промивають, як вказувалось вище і зондують 50 мкл біотинілованого пептиду, опис якого було наведено вище, з концентрацією 50 нМ (розведеного у PBST-BSA). Після цього додають 50 мкл NeutrAvidin-AP (2 мкг/мл) (1:1000 у PBST-BSA, компанія Pierce, номер за каталогом 31002) і виявлення здійснюють шляхом додання АР субстрату (компанія Pierce, номер за каталогом 31002) за інструкціями виробника. Як контроль застосовують лише буфер. Оптичну густину визначають при 560 нм. 510С2 та С12 Fabs зв'язують пептид із значеннями ІС50 6,73 нг/лунка та 5,42 нг/лунка відповідно. Антитіла за цим винаходом здатні до зв'язування пептиду, який містить амінокислоти 40-64 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 53) зрілого міостатину, та/або пептиду, який містить амінокислоти 43-57 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 62) зрілого міостатину (з амінокислотами цистеїном або серином у положенні 47). Антитіла за цим винаходом однак не здатні до зв'язування (на рівнях, які значно перевищують фонові) пептидів, які містять амінокислоти 60-73, 74-86, 87-97, 96-108, 16-29, 1-15 або 3042 зрілого міостатину. Мишаче антитіло, назване Mab 3 [дивись включені до цього опису заявки на патент США № 60/559,621 та № 60/555,456], яке містить мишачі варіабельні ділянки (дивись Фіг. 10 і Фіг. 11), функціонально зв'язане з Fc ділянкою мишачого IgGl, не зв'язує пептиди, які містять амінокислоти 60-73, 74-86, 87-97, 96-108, 16-29, 1-15 або 30-42 зрілого міостатину і є вихідним антитілом для антитіл за цим винаходом. Гуманізовані антитіла 510С2 і С12 однаковою мірою зв'язують пептиди, які містять амінокислоти 43-57 та 45-59 зрілого міостатину (як показано у наведеній нижче Таблиці 1). Це вказує на те, що точніше визначеним місцезнаходженням антигенної детермінанти за цим винаходом є пептид, що стягує амінокислоти 45-57 зрілого міостатину. Зв'язування є дещо меншим, коли антитіла перевіряють на зв'язування з пептидом, який містить амінокислоти 47-61 зрілого міостатину, що показує важливість амінокислот 45-46 зрілого міостатину для зв'язування або для збереження конформації пептиду, яка забезпечує можливість зв'язування. Зв'язування додатково зменшується, коли антитіла перевіряють на зв'язування з пептидом, який містить амінокислоти 49-63 зрілого міостатину, що показує важливість амінокислот 47-48 зрілого міостатину для зв'язування або для збереження конформації пептиду, яка забезпечує можливість зв'я 51 95457 зування. Зв'язування знижується до фонових рівнів, коли антитіла перевіряють на зв'язування пептиду, який містить амінокислоти 39-53 зрілого міо 52 статину, що вказує на важливість ділянки від залишків 54-57. Таблиця 1 Пептид ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA CSGES*EFVFLQKYPH GECEFVFLQKYPHTH CEFVFLQKYPHTHLV FVFLQKYPHTHLVHQ KANYCSGECEFVFLQ (*залишок являє собою С у міостатині) Залишки 40-64 43-57 45-59 47-61 49-63 39-53 С. Твердофазний імуноферментний аналіз гуманізованого оптимізованого антиміостатинового моноклонального антитіла Гуманізовані непроцесовані моноклональні антитіла 510С2 та С12 проти людського міостатину перевіряють за допомогою ELISA, при проведенні якого визначають зв'язування згаданого антитіла з антигеном GDF-8, який знаходиться на планшеті. Перевіряють також перехресну реактивність згаданих моноклональних антитіл з GDF-11. Відсутність моноклонального антитіла, ізотипове контрольне антитіло та неспоріднений білок (HGF (глюкагон)) відіграють роль негативних контролей. Кожну лунку 96-лункових планшетів сенсибілізують 70 мкл людського GDF-8 (без носія, 1 мкг/мл у карбонатному буфері, рН 9,6), рекомбінантним людським GDF-11 (від компанії Peprotech, Inc., номер за каталогом: 120-11, без носія, 1 мкг/мл у карбонатному буфері, рН 9,6) або рекомбінантним людським HGF (від компанії R&D Systems, номер за каталогом 294-HG/CF, без носія, 1 мкг/мл у карбонатному буфері, рН 9,6). Планшети інкубують при температурі 4 °C впродовж ночі. Вміст лунок відсмоктують і лунки двічі промивають промивним буфером (20 мМ розчин трис(гідроксиметил)амінометану, рН 7,4, 0,15 М розчин NaCl, 0,1 % Твін-20). Планшети блокують 200 мкл блокувального буфера/лунка (5 % розчин швидкорозчинного сухого молока (компанія Carnation) у вищевказаному промивному буфері) впродовж 4 год. при кімнатній температурі. Планшети двічі промивають промивним буфером. Mabs розбавляють у блокувальному буфері з концентрацією 1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,04 мкг/мл, 0,008 мкг/мл, 0,0016 мкг/мл та 0,00032 мкг/мл. Для контролю застосовують розчин лише блокувально Відносне зв'язування +++ +++ +++ ++ + Номер Послідовності 53 62 92 93 94 95 го буфера без Mab. Ізотипове контрольне антитіло також застосовують як негативний контроль із концентрацією 1 мкг/мл. Після цього 50 мкл кожного розчину Mab з подвоєнням додають до лунок, сенсибілізованих GDF-8 та GDF-11. Планшети інкубують впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Після цього лунки тричі промивають промивним буфером. Після цього до кожної лунки додають 50 мкл кон'югованого з HRP (пероксидаза з хрону) другого антитіла (козяче антилюдське IgG HRP, специфічне до Fc-фрагмента ланцюга типу гамма, компанія Jackson ImmunoResearch, номер за каталогом 109035-008) у розведенні 1:2000 у блокувальному буфері і інкубують впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Після цього лунки тричі промивають промивним буфером. Потім до кожної лунки додають 50 мкл хромогенного субстрату (тобто OPD (офенілендіаміндигідрохлорид) субстрату) і витримують із проявленням при кімнатній температурі впродовж 2,5 хв. Реакцію припиняють доданням 100 мкл IN розчину НС1 до кожної лунки. Оптичну густину лунок визначають при 490 нм. Визначають середню оптичну густину подвоєних лунок і ці значення представлені у наведеній нижче Таблиці 2. Ці дані демонструють, що моноклональні антитіла 510С2 та С12 зв'язуються з міостатином на планшеті. Щодо специфічності, ці моноклональні антитіла переважно зв'язують GDF-8 порівняно з GDF-11. Моноклональне антитіло 510С2 демонструє зв'язування з міостатином (GDF-8), яке приблизно у 25 разів перевищує зв'язування з GDF11. Mab C12 демонструє зв'язування з міостатином, яке приблизно у 5 разів перевищує зв'язування з GDF-11. Таблиця 2 1 мкг/мл 0,2 мкг/мл 0,04 мкг/мл 0,008 мкг/мл 0,0016 мкг/мл 0,00032 мкг/мл Без Mab Ізотиповий контроль 510С2 GDF-8 1,62275 1,20585 0,55695 0,2482 0,11425 0,0876 0,08645 0,09075 510С2 GDF-11 0,67645 0,24605 0,11485 0,09125 0,09385 0,08245 0,0936 0,0919 510С2 HGF 0,0723 0,071 0,07525 0,07105 0,07255 0,0722 0,0721 0,0804 С12 GDF-8 1,5785 1,37095 0,8177 0,32805 0,1257 0,07415 0,0544 0,05185 С12 GDF-11 1,3021 0,87605 0,34495 0,11915 0,07 0,05475 0,05185 0,0487 С12 HGF 0,0665 0,0543 0,0564 0,0507 0,058 0,0554 0,0522 0,049 53 На додаток до цього, за допомогою ELISA було продемонстровано, що непроцесоване моноклональне антитіло С12 не зв'язує інших членів надродини TGF-: ВМР-2, ВМР-3, BMP-3b/GDF-10, BMP-4, ВМР-7, ВМР-8В, активін А, активін В, TGF, TGF-1, TGF-2 та GDF-3; згадане антитіло демонструвало мінімальне зв'язування з ВМР-5. Передбачається, що інші антиміостатинові антитіла за цим винаходом подібним же чином не зв'язують або мінімально зв'язують згадані інші члени надродини TGF-. Приклад 3: Аналіз нейтралізації міостатину Ектодермальні експлантати відбирають із бластули зародків Xenopus 8-9 стадії стандартними методами і культивують у 0,5Х MBS (1Х MBS: 88 мМ розчин NaCl, 1 мМ розчин КС1, 0,7 мМ розчин СаСІ2, 1 мМ розчин MgSO4, 5 мМ розчин ГЕПЕС, 2,5 мМ розчин NaHCO3, 1:1000 (у об'ємному відношенні) гентаміцину, 0,1 % розчин сироваткового альбуміну великої рогатої худоби) з доданням фактора росту (GDF8 або GDF11) (додатково або за показаннями), впродовж 18 год. при температурі 18 °C. За цей час контрольні зародки досягають стадії ранньої нейрули (стадія 15-16). Експлантати фотографують і довжину кожного експлантата визначають за допомогою алгоритму аналізу зображень, розробленого для кількісного визначення тваринних кепів. Експлантати, які не оброблялись ні фактором росту, ні Fab (контролі), згортаються у кульки епідермісу. Міостатин і GDF-11 індукують мезодерму у цих ектодермальних експлантатів, завдяки чому експлантати видовжуються і утворюють гантелеподібні структури. Антитіла або Fabs у разі їх перевірки на нейтралізуючу активність додаються до культурального середовища, яке містить міостатин, впродовж усього періоду культивування, і оцінюється їхня здатність до пригнічення індукованих фактором росту видовжувальних рухів. Міостатин додають до експлантатів із концентрацією 25 нг/мл. Антитіла або Fabs, призначені до перевірки, додають із концентрацією 20 мкг/мл. Fab, яке одержали проти стороннього антигену, застосовують як контроль. Комерційно доступне моноклональне антитіло проти мишачого GDF-8 може випробуватись як контроль; це антитіло продукується козами, імунізованими очищеним мишачим GDF-8, і виробники продемонстрували, що воно нейтралізує видовження кепів Xenopus, утворення яких було викликане 25 нг/мл мишачого GDF-8 у разі його присутності з концентрацією приблизно 10-20 мкг/мл (компанія R&D Systems, номер за каталогом МАВ788). Для обробки зображень застосовують апарат Image Pro (V4.5.1.22, від компанії Media Cybernetics). Для автоматизації обробки зображень пишуть макрос. Макрос обробляє зображення і реєструє довжину у бітах. Як відомо у цій галузі, може застосовуватись альтернативний спосіб вимірювання. Спостерігається, що антитіла за цим винаходом нейтралізують активність GDF-8 у аналізі кепів тварин і не мають активності щодо нейтралізації GDF-11. Приклад 4: Визначення афінності непроцесованих моноклональних антитіл (Fabs) 95457 54 Афінність (КD) та швидкості коn і коff антиміостатинових Fabs за цим винаходом визначають за допомогою приладу ВІАсоге® 2000, який включає в себе сенсорний чіп СМ4. ВІАсоге® застосовує оптичні властивості поверхневого плазмонного резонансу для виявлення змін концентрації білка молекул, які взаємодіють, у межах декстранової біосенсорної матриці. За виключенням означеного, усі реактиви і матеріали закупаються від компанії ВІАсоге® АВ (Upsala, Швеція). Усі вимірювання здійснюють при температурі 25 °C. Зразки, які містять Fabs, розчиняють у буфері HBS-EP (150 мМ розчин хлориду натрію, 3 мМ розчин EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота), 0,05 % розчин (у відношенні маси до об'єму) поверхнево-активної речовини Р-20 і 10 мМ розчин ГЕПЕС, рН 7,4). Міостатин або GDF-11 (компанія R&D Systems) іммобілізують у протокових кюветах чіпу СМ4 засобами аміносполучної хімії. Протокові кювети (14) активізують сумішшю (1:1) 0,1 М розчину Nгідроксисукциніміду та 0,1 М розчину 3-(N,Nдиметиламіно)пропіл-К-етилкарбодііміду зі швидкістю потоку 20 мкл/хв. Міостатин або GDF-11 (2,5 мкг/мл у 10 мМ розчині ацетату натрію, рН 4,5) вручну вводять у окремі протокові кювети зі швидкістю потоку 10 мкл/хв. Поверхневу густину контролюють доти, доки у кожній протоковій кюветі вона не досягне рівня ~150 реакційних одиниць (RU). Поверхні блокують шляхом введення 50 мкл 1 М розчину етаноламіну-НСІ, рН 8,5 (10 мкл/хв). Для забезпечення повного видалення будь-якого нековалентно зв'язаного міостатину або GDF-11, двічі вводять 15 мкл 10 мМ розчину гліцину, рН 1,5. Протоковий буфер, який застосовують для кінетичних експериментів, містить 10 мМ розчин ГЕПЕС, рН 7,4, 150 мМ розчин NaCl, 0,005 % розчин Р20. Дані кінетичного зв'язування збирають при максимальній швидкості потоку (100 мкл/хв). Кожний аналітичний цикл включає: (і) введення 250 мкл Fab (діапазон концентрацій від 50 нМ до 0,4 нМ із двохкратним прирощенням розведення) до всіх 4 протокових кювет, де протокова кювета 1 відіграє роль еталонної кювети, (іі) 20 хв дисоціацію (потік буфера), (ііі) регенерацію поверхні GDF-8 або GDF-11 шляхом дворазового введення 15 мкл 10 мМ розчину гліцину, рН 1,5, (iv) контрольне введення 15 мкл протокового буфера, і (v) стабілізаційний період тривалістю 2 хв перед початком наступного циклу. Сигнал контролюють таким чином: протокова кювета 2 мінус протокова кювета 1, протокова кювета 3 мінус протокова кювета 1, протокова кювета 4 мінус протокова кювета 1. Зразки і контрольний буфер вводять із повторенням у довільному порядку. Дані обробляють за допомогою програми SCRUBBER (Аналітичний центр біомолекулярних взаємодій (Center for Biomolecular Interaction Analysis), Університет штату Юта). Швидкість асоціації та дисоціації для кожного циклу визначають шляхом підбирання біосенсорних даних за простою моделлю асоціації із застосуванням програми ClampXP (Аналітичний центр біомолекулярних взаємодій, Університет штату Юта) для добування констант коn та koff, кон 55 95457 станту зв'язування у стані рівноваги Кd обчислюють за допомогою залежності Kd= koff/коn. Дані щодо афінності, визначені для зв'язування міостатину 5 з 510С2 Fab, виглядають таким чином: k on 5,4x10 -1c-1 -4 -1 M , koff 4,67x10 c і KD (обчисл.) 0,87 нМ. Зв'язування 510С2 Fab з GDF-11 не спостерігалось. Приклад 5: Визначення афінності моноклональних антитіл (Mabs) Визначення спорідненості непроцесованих моноклональних антитіл за цим винаходом до зв'язування здійснюють за допомогою аналізу Sapidyne KINEXA. NHS (Nгідроксисукцинімід)-активовані сефарозні кульки для швидкопротокового аналізу (компанія GE Healthcare) попередньо сенсибілізують антитілом за цим винаходом (50 мкг антиміостатинового антитіла/мл кульок) і блокують розчином (10 мг/мл) BSA у 1 М трис-НСІ, рН 8,0. Після цього 20 пМ і 50 пМ антитіла за цим винаходом інкубують із різними концентраціями (наприклад, від 2,4 пМ до 20 нМ, серійні розведення) міостатину у протоковому буфері (PBS, 0,005 % (у об'ємному відношенні) Твін-20, 1 мг/мл овальбуміну) впродовж 10 год. при кімнатній температурі. Для визначення кількості вільного антитіла, присутнього у стані рівноваги, кожен зразок пропускають через кульки, вкриті міостатином. Після цього кількість зв'язаного з кульками антитіла визначають шляхом пропускання через кульки розчину міченого флуорофором (Су5) козячого антилюдського Fc антитіла (компа 56 нія Jackson Immuno Research) у розведенні 1:4000 у протоковому буфері. Визначений флуоресцентний сигнал є пропорційним до концентрації вільного антитіла у стані рівноваги. Кожну концентрацію міостатину визначають із повторенням. Константу дисоціації у стані рівноваги (Kq) визначають за нелінійною регресією конкурентних кривих із застосуванням однофакторної моделі однорідного зв'язування з великою кількістю кривих (програма KINEXA), і дані представляють із 95 % довірчими інтервалами (СІ). Константу асоціації (kon) У разі зв'язування GDF-8 також визначають за допомогою аналізу Sapidyne KINEXA. Двадцять пМ антитіла змішують із 1 нМ GDF-8 за таких самих умов, опис яких наведено вище. У різні + зразки зондують на присутність вільного антитіла за умов, опис яких було наведено вище для зв'язування у стані рівноваги, після чого визначену часову залежність підбирають за допомогою програми KINEXA для визначення швидкості асоціації (kon). Константу дисоціації (koff) обчислюють за рівнянням koff = KDkon. При проведенні аналізу, опис якого наведено вище, з непроцесованими 510С2 і С12 (функціонально зв'язаними з Fc-ділянкою IgG4), були одержані результати, наведені у представленій нижче Таблиці 3. Таблиця Mab Kd, пM (95 % СI) 510С2 80 (41-134) С12 108 (23-294) -1 -1 kon, М , с (95 % СI) 5 1,38×10 5 (1,08-1,75×10 ) 4 7,42 х 10 -4 (6,83-8,01 х 10 ) Приклад 6: Аналіз міостатину/SBE "репортерної" групи У цьому аналізі "репортерної" групи плазміда, яка кодує "репортерний" ген, тобто ген люциферази у 5'-3' напрямку відносно SMADзв'язувального елемента ("SBE"), конкретніше, (CAGA)12, експресує білок люциферази, коли молекула, наприклад, міостатин, GDF-11 або інший член надродини TGF- зв'язує свій власний рецептор, з ініціюванням, тим самим, передавання сигналу SMAD, наслідком чого є утворення фосфорилованого комплексу SMAD, який є здатним до зв'язування SBE. Раніше повідомлялось, що послідовність CAGA являє собою TGF--реагуючу послідовність у межах промотору індукованого TGF- гена РАІ-1 (Деннер (Denner) та інші, ЕМВО J., 17:3091-3100, 1998). Кількість активного міостатину, яка впливає на клітини, є прямо пропорційною кількості продукованого фермента люциферази, яка є прямо пропорційною кількості продукованого і вимірного світла. Присутність інгібітора (наприклад, антитіла, яке зв'язує міостатин) зменшує кількість міостатину, здатного активізувати SBE, наслідком чого, зрештою, є зменшене продукування світла. Опис цього аналізу наведено також у включеній до цього опису WO 2004/037861. Koff, с 1, обчислена 1,11×10 -5 8,02×10 -6 Передбачається, що аналіз міостатину/"репортерної" групи не обмежується точними умовами, опис яких наведено; можуть застосовуватись клітини інших типів, наприклад, 293НЕК (культура клітин нирок людського ембріона) (АТСС (Американська колекція типових культур)) або клітини рабдоміосаркоми лінії А204 (дивись, наприклад, Уіттмор (Whittemore) та інші, BBRC, 200:965971, 2003); можуть застосовуватись "репортерні" групи інших типів, наприклад, CAT (хлорамфеніколацетилтрансфераза), -gal (-галактозидаза), GFP (зелений флуоресцентний білок), та інші умови культивування клітин та проведення аналізу, у тому числі можуть застосовуватись змінні кількості міостатину у реакції. Фахівцю у цій галузі буде легко встановити, чи вписується будь-який аналіз у межі обсягу згаданого аналізу міостатину/SBE "репортерної" групи, оскільки цей аналіз повинен мати вектор, який містить SBE елемент у 3'-5'напрямку відносно "репортерного" гена, який було введено до клітини-хазяїна, де застосовуваний SBE елемент реагує на SMAD, продукований у відповідь на зв'язування міостатином свого рецептора. Р.С. Тіз (R.S. Thies) та інші, Growth Factors, 18:251-259, 2001, описує подібний аналіз, у той час як Уіттмор Л. (Wittemore L.) та інші, BBRC, 300:965-971, 2003, описує SBE елемент, який реа 57 гує на SMAD, продукований у відповідь на зв'язування міостатином свого рецептора. У цьому аналізі клітини лінії 293Е (компанія Edge Biosystems) у живильному середовищі DMEM (модифіковане за способом Дульбекко середовище Iглa)/F12 (3:1) (компанія Gibco, номер за каталогом 93-0152DK), 10 % FBS (сироватка плода корови), 20 мМ розчин ГЕПЕС, 4 мМ розчин Lглутаміну, висівають з розрахунку приблизно 25000 клітин/лунка на внутрішні, сенсибілізовані полілізином, лунки 96-лункового планшета (компанія BD Biocoat, номер за каталогом 35-4461) та інкубують впродовж ночі при температурі 37 °C. Наступного дня клітини промивають PBS і до кожної лунки додають 50 мкл середовища OptiMEM І (компанія Gibco, номер за каталогом 31985-070). Клітини трансфікують 50 мкл наведеної нижче суміші SBE-ДНК люциферази: (і) 80 мкл ліпофектаміну (Lipofectamine) (компанія Gibco, номер за каталогом 11668-019) у поєднанні з 1,5 мл середовища OptiMEM із витримуванням до осадження впродовж 5 хв із подальшим перенесенням до (іі) пробірки, у якій об'єднують 20 мкг SBE ДНК люциферази з 1,5 мл середовища OptiMEM і 200 мкл реактиву Plus, перемішують і витримують до осадження впродовж 5 хв. Після об'єднання двох сумішей розчин енергійно перемішують і витримують із відстоюванням впродовж 30 хв перед доданням 50 мкл до кожної лунки. Після цього клітини інкубують впродовж ночі при температурі 37 °C у 5 % СО2. Для кожного планшета з клітинами 5 мл міостатину (компанія R&D Systems, номер за каталогом 788-G8) розбавляють до 20 нг/мл у живильному середовищі повного складу. Кожне антитіло за цим винаходом, призначене для перевірки, титрують у живильному середовищі повного складу, наприклад, від приблизно 40 мкг/мл до приблизно 50 нг/мл. Трансфекційне середовище видаляють із лунок, і додають 50 мкл розведення антитіла на лунку і 50 мкл GDF-8 (міостатину) або GDF-11 (компанія R&D Systems) на лунку. Планшети з клітинами після цього інкубують впродовж ночі при температурі 37 °C у 5 % СО2. Наступного дня середовище відсмоктують, клітини промивають PBS, і додають 75 мкл лізисного буфера (компанія Promega, номер за каталогом Е266А). Активність люциферази у клітинному лізаті визначають за допомогою люциферазного реактиву за інструкціями виробника (компанія Promega Е2620). Лю 95457 58 мінесценцію наносять на криву залежності від Logio концентрації Mab (мкг/мл) і обчислюють ІС50 для кожного Mab для міостатину і GDF-11. Моноклональні антитіла 510С2, С12 у разі випробування за таких умов із GDF-8 дають значення ІС50 (за середнім значенням двох випробувань) 5,15 нМ (5,74 нМ та 4,57 нМ) і 16,07 нМ (23,04 нМ і 9,12 нМ) відповідно. Ні моноклональне антитіло 510С2, ні моноклональне антитіло С12 не демонструвало нейтралізуючої активності у цьому аналізі у разі перевірки з GDF-11 замість GDF-8. Приклад 7: Фармакокінетика Фармакокінетика (РК) антитіл за цим винаходом може оцінюватись на мишах лінії C57B6/SCID у дозі 1 мг/кг після одноразового внутрішньовенного (IV) або внутрішньоочеревинного (IP) введення. 125 Тварини одержують суміш неміченого і Іміченого антитіла у дозі, опис якої наведено вище, і концентрацію у сироватці визначають, виходячи з 125 радіоактивності І у сироватці і питомої активності введеної дози. На криву наносять концентрацію у сироватці антитіла, введеного IV або IP, у залежності від часу. Приклад 8: In vivo вплив на масу і силу м'язів Для визначення того, чи блокує антитіло за цим винаходом активність міостатину in vivo, антитіло за цим винаходом може перевірятись на статевозрілих мишах лінії SCID. Миші лінії SCID страждають на тяжкий комбінований імунодефіцит і, унаслідок цього, у них не може виникнути імунологічної реакції після введення антитіла за цим винаходом. Масу м'язів застосовують як індикатор активності міостатину у мишей, яким ввели антитіло за цим винаходом. Мишей-самців лінії С57В6 SCID віком вісім тижнів зважують і рівномірно розподіляють за масою тіла на групи по 8 голів. Антитіло за цим винаходом у PBS буфері вводять мишам внутрішньоочеревинно у різних дозах (наприклад, 60 мг/кг, 10 мг/кг, 5 мг/кг та 1 мг/кг) щотижнево. Оброблені PBS і необроблені миші застосовуються як контролі. Обробка триває впродовж 4-12 тижнів. Для оцінки маси м'язів, литковий і чотириголовий м'язи після обробки вирізають і зважують. Для визначення сили м'язів, силу передньої лапки визначають за допомогою приладу для визначення сили лапки (наприклад, модель 1027 csx, компанія Columbus Instruments). 59 95457 60