Білки, що зв’язують il-1

Реферат: Винахід належить до IL-1-зв'язувальних білків, зокрема, антитіл, що є химерними, CDRщепленими і гуманізованими антитілами. Антитіла, відповідно до винаходу, мають високу афінність відносно IL-1 і нейтралізують активність IL-1, причому можуть бути повнорозмірним антитілом або його антигензв'язувальною частиною. Також пропонується спосіб одержання і спосіб застосування антитіл для виявлення IL-1 і для інгібування активності IL-1, наприклад, у людини, що страждає розладом, при якому активність IL-1 є шкідливою. UA 102722 C2 (12) UA 102722 C2 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднену заявку За даною заявкою вимагається пріоритет попередньої заявки на видачу патенту США № 61/206250, поданої 29 січня 2009 р. Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується білків, що зв'язують IL-1, і, зокрема, їх застосування для профілактики і/або лікування опосередкованих IL-1 захворювань. Рівень техніки Цитокіни, такі як інтерлейкін-1 (IL-1) і фактор некрозу пухлин (TNF), являють собою молекули, продуковані різними клітинами, такими як моноцити і макрофаги, що були ідентифіковані як медіатори запальних процесів. Інтерлейкін-1 є цитокіном із широким діапазоном біологічних і фізіологічних ефектів, включаючи підвищення температури, синтез простагландинів (наприклад, у фібробластах, м'язових і ендотеліальних клітинах), активацію Tлімфоцитів і продукцію інтерлейкіну-2. Надсімейство інтерлейкіну-1: вихідними представниками надсімейства IL-1 є IL-1α, IL-1β і антагоніст рецептора IL-1 (IL-1RA). IL-1α і -β є прозапальними цитокінами, залученими в імунний захист від інфекції. IL-1RA є молекулою, яка конкурує за зв'язування з рецептором з IL-1α і IL-1β, блокуючи їх роль в імунній активації. В останні роки були додані інші молекули до надсімейства IL-1, включаючи IL-18 (див. Dinarello C.A. (1994) FASEB J. 8(15): 1314-25; Huising M.O. et al. (2004), Dev. Comp. Immunol. 28(5): 395-413) і ще шість генів, структурно гомологічних IL-1α, IL-1β або IL-1RA. Останні зазначені шість представників названі IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9 і IL1F10. Відповідно до цього IL-1α, IL-1β і IL-1RA були перейменовані як IL-1F1, IL-1F2 і IL-1F3, відповідно (див. Sims J.E. et al. (2001), Trends Immunol. 22(10): 536-7; Dunn E. et al. (2001), Trends Immunol. 22(10): 533-6). Недавно був описаний наступний передбачуваний представник сімейства IL-1, що названий IL-33 або IL1F11, хоча його назва офіційно не прийнята в базі даних по номенклатурі сімейства генів HGNC. IL-1α і IL-1β: Обидва інтерлейкіни IL-1α і IL-1β продукуються макрофагами, моноцитами і дендритними клітинами. Вони складають важливу частину запальної відповіді організму проти інфекції. Такі цитокіни збільшують експресію факторів адгезії на ендотеліальних клітинах, роблячи можливою трансміграцію лейкоцитів, клітин, що борються з патогенами, до місць інфекції і перенастроювання терморегуляторного центра гіпоталамуса, що приводить до підвищеної температури тіла, яка як така виражається у вигляді пропасниці. Тому IL-1 називають ендогенним пірогеном. Підвищена температура тіла допомагає імунній системі організму боротися з інфекцією. IL-1 також важливий для регуляції гемопоезу. Продукція IL-1β у периферичній тканині також була пов'язана з гіперальгезією (підвищеною чутливістю до болю), пов'язаною з пропасницею (Morgan M.M. et al. (2004), Brain Res. 1022 (1-2): 96-100). В основному дві зазначені форми IL-1 зв'язуються з тим самим клітинним рецептором. Такий рецептор складається з двох споріднених, але не ідентичних субодиниць, які передають сигнали по шляху, що у більшій частині є загальним зі шляхами деяких інших рецепторів. До таких рецепторів належить Toll-сімейство природних імунних рецепторів і рецептор IL-18. Дві форми IL-1 також мають подібні біологічні властивості, включаючи індукцію підвищеної температури, повільнохвильового сну і нейтрофілії, активацію T- і B-лімфоцитів, проліферацію фібробластів, цитотоксичність відносно деяких клітин, індукцію колагенезу, синтезу білків гострої фази в печінці і підвищеної продукції колонієстимулюючих факторів і колагену. Виділені і експресовані кДНК, що кодують дві окремих форми IL-1; такі кДНК представляють два різних генних продукти, називані IL-1β (Auron et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7909) і IL-1α (Lomedico et al. (1984), Nature 312: 458). IL-1β є переважною формою, продукованою моноцитами людини, як на рівні мРНК, так і на рівні білка. Дві форми IL-1 людини мають лише 26 % гомологію амінокислот. Незважаючи на відмінні поліпептидні послідовності, дві форми IL-1 мають структурну подібність (Auron et al. (1985), J. Mol. Cell Immunol. 2: 169), оскільки амінокислотна гомологія обмежена окремими областями молекули IL-1. IL-1α і IL-1β продукуються у вигляді пептидів-попередників. Іншими словами, вони утворюються у вигляді довгого білка, який потім процесується з вивільненням більш короткої активної молекули, яку називають зрілим білком. Зрілий IL-1β, наприклад, вивільняється з проIL-1β після розщеплення визначеним представником каспазного сімейства білків, називаним каспаза-1, або інтерлейкін-1-перетворювальним ферментом (ICE). 3-Вимірна структура зрілих форм кожного представника надсімейства IL-1 людини складається з 12-14 β-ниток, які утворюють білок у формі барила. IL-1α є плейотропним цитокіном, залученим у різні імунні відповіді, запальні процеси і гематопоез. IL-1α продукується активованими макрофагами, стимулює проліферацію тимоцитів завдяки індукції вивільнення IL-2, дозрівання і проліферацію B-клітин і активність фактора росту фібробластів. Білки IL-1α залучені в запальну відповідь, при цьому вони ідентифіковані як 1 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ендогенні пірогени і відповідно до повідомлень стимулюють вивільнення простагландину і колагенази із синовіальних клітин. Він продукується у вигляді пробілка, який протеолітично процесується калпаїном і вивільняється з використанням механізму, який ще недостатньо досліджений. Зазначений ген і вісім інших генів сімейства інтерлейкіну-1 утворюють кластер цитокінових генів на хромосомі 2. IL-1α і його ефекти, що викликають захворювання, докладно описані в публікації Ibelgaufts, Lexikon Zytokine (Cytokine Dictionary), Medikon Verlag, Munich 1992, і в цитованій у зазначеній публікації літературі. Згадування про небажані ефекти IL-1α також зустрічається, наприклад, у публікації Oppenheimet et al., Immunology Today 7 (1986) 4556, Durum et al., Ann. Rev. Immunol. 3 (1985) 263-287 і Synnons et al., Lymphokine Research 8 (1989) 365-372. IL-1α початково був названий "катаболіном" у зв'язку з його ефектом у вигляді зростаючої резорбції хряща, а також "клітинним фактором моноцитів" (MCF) у зв'язку з його стимулюючим впливом на колагеназу і простагландин у синовіальних клітинах і "ендогенним фактором лейкоцитів" (LEM), що здійснюють стимулюючий вплив на реакції гострої фази. На доповнення до вищесказаного IL-1α має широкий спектр біологічної активності, оскільки IL-1α може бути синтезований у багатьох різних клітинах, таких як моноцити, макрофаги, фібробласти, ендотеліальні клітини і лімфоцити, і, крім того, багато клітин мають специфічні рецептори до IL-1α. Таким чином, зрозуміло, що IL-1α, зокрема, займає центральне положення як запускаючий сигнал для різних розладів і симптомів розладів. Такі розлади переважно є серйозними розладами, що на даний час можуть зовсім не піддаватися лікуванню, або їх лікують, але неадекватно. Одержане свідчення того, що поліморфізм зазначених генів асоційований з ревматоїдним артритом і хворобою Альцгеймера. IL-1, загалом, залучений у багато захворювань людини, включаючи артрит, фіброз легень, захворювання центральної нервової системи, цукровий діабет і деякі серцево-судинні захворювання. У даній галузі існує потреба в поліпшених антитілах, здатних зв'язувати IL-1α. Переважно антитіла зв'язують IL-1α. Переважно антитіла здатні нейтралізувати IL-1α. Даний винахід стосується нового сімейства зв'язувальних білків, CDR-щеплених антитіл, гуманізованих антитіл і їх фрагментів, здатних до зв'язування з IL-1α, зв'язування з високою афінністю і зв'язування і нейтралізації IL-1α. Винахід стосується терапевтичних засобів, які дозволяють інгібувати IL-1α, і композицій і способів лікування захворювань, асоційованих з підвищеними рівнями IL-1α, особливо запальних розладів. Суть винаходу Даний винахід стосується нового сімейства зв'язувальних білків, CDR-щеплених антитіл, гуманізованих антитіл і їх фрагментів, здатних до зв'язування з IL-1α, зв'язування з високою афінністю і зв'язування і нейтралізації IL-1α. Винахід стосується терапевтичних засобів, які дозволяють інгібувати IL-1α, і композицій і способів лікування захворювання, асоційованого з підвищеними рівнями IL-1α, особливо запальних розладів. В одному аспекті винахід стосується зв'язувального білка, який містить поліпептид варіабельної області важкого ланцюга з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52 і SEQ ID NO: 54; при цьому зазначений зв'язувальний білок здатний зв'язувати IL-1α людини. В іншому аспекті винахід стосується зв'язувального білка, який містить поліпептид варіабельної області легкого ланцюга з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з послідовностей SED ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53 і SEQ ID NO: 55; при цьому зазначений зв'язувальний білок здатний зв'язувати IL-1α людини. В одному аспекті винахід стосується зв'язувального білка, який містить поліпептид варіабельної області важкого ланцюга з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52 і SEQ ID NO: 54; і поліпептид варіабельної області легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53 і SEQ ID NO: 55; при цьому зазначений зв'язувальний білок здатний зв'язувати IL-1α людини. В іншому аспекті зв'язувальний білок містить поліпептид варіабельної області важкого ланцюга і поліпептид варіабельної області легкого ланцюга, вибраний із групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NO: 38 і SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO:40 і SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48 і SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 і SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 і SEQ ID NO: 53 і SEQ ID NO: 54 і SEQ ID NO: 55. Пропонується описаний вище зв'язувальний білок, при цьому зазначений зв'язувальний білок є молекулою імуноглобуліну, зв'язаним дисульфідом Fv, моноклональним антитілом, scFv, химерним антитілом, однодоменним антитілом, CDR-щепленим антитілом, 2 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 діантитілом, гуманізованим антитілом, поліспецифічним антитілом, Fab, антитілом з подвійною специфічністю, DVD, Fab', біспецифічним антитілом, F(ab') 2 або Fv. В іншому аспекті описаний вище зв'язувальний білок містить константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, вибраний із групи, яка складається з: константного домену IgМ людини, константного домену IgG4 людини, константного домену IgG1 людини, константного домену IgЕ людини, константного домену IgG2, константного домену IgG3 людини і константного домену IgА людини. В іншому аспекті зв'язувальний білок за винаходом, крім того, містить константну область важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 3, додатково константну область легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NO: 4 і SEQ ID NO: 5. Зв'язувальні білки за винаходом здатні модулювати біологічну функцію IL-1α людини і додатково здатні нейтралізувати IL-1α людини. В одному аспекті зв'язувальні білки мають константу швидкості утворення комплексу (k on) відносно зазначеної мішені, вибрану з групи, яка 2 -1 -1 3 -1 -1 складається з: щонайменше приблизно 10 М сек. ; щонайменше приблизно 10 М сек. ; 4 -1 -1 5 -1 -1 щонайменше приблизно 10 М сек. ; щонайменше приблизно 10 М сек. і щонайменше 6 -1 -1 приблизно 10 М сек. , на основі вимірювання резонансу поверхневого плазмону. В іншому аспекті зв'язувальні білки мають константу швидкості розпаду комплексу (k off) відносно -3 -1 зазначеної мішені, вибрану з групи, яка складається з: не більше ніж приблизно 10 сек. ; не -4 -1 -5 -1 більше ніж приблизно 10 сек. ; не більше ніж приблизно 10 сек. і не більше ніж приблизно -6 -1 10 сек. , на основі вимірювання резонансу поверхневого плазмону. В іншому аспекті зв'язувальні білки мають константу дисоціації (KD) відносно зазначеної мішені, вибрану з групи, -7 -8 яка складається з: не більше ніж приблизно 10 М; не більше ніж приблизно 10 М; не більше 9 10 -11 ніж приблизно 10- М; не більше ніж приблизно 10- М; не більше ніж приблизно 10 М; не -12 -13 більше ніж приблизно 10 М і не більше ніж 10 М. Додатково зв'язувальні білки мають -9 константу дисоціації (KD) відносно IL-1α, вибрану з групи, яка складається з: 1,34×10 М; -9 -9 -11 -11 -11 -11 -11 1,35×10 М; 2,09×10 М; 2,8×10 М; 1×10 М; 3,1×10 М; 3,2×10 М і 3,3×10 М. Зв'язувальні білки за винаходом додатково містять засіб, вибраний із групи, яка складається з: імуноадгезивної молекули, візуалізуючого засобу, терапевтичного засобу і цитотоксичного засобу. Візуалізуючим засобом може бути радіоактивна мітка, включаючи, але без обмеження, 3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153 H, C, S, Y, Tc, In, I, I, Lu, Ho і Sm, фермент, флуоресціююча мітка, люмінесцентна мітка, біолюмінесцентна мітка, магнітна мітка або біотин. Терапевтичним або цитотоксичним засобом може бути антиметаболіт, алкілувальний агент, антибіотик, фактор росту, цитокін, антиангіогенний засіб, антимітотичний засіб, антрациклін, токсин і апоптозний засіб. В іншому варіанті конструкція антитіла глікозилована. Переважно, глікозилування має картину глікозилування людини. В іншому варіанті зв'язувальний білок, описаний вище, існує у вигляді кристала. Переважно, кристал являє собою фармацевтичний кристал з контрольованим вивільненням, що не містить носія. В одному варіанті кристалізований зв'язувальний білок має більш тривалий час напівжиття in vivo, ніж його розчинний аналог. В іншому варіанті кристалізований зв'язувальний білок зберігає після кристалізації біологічну активність. В одному з аспектів винахід стосується виділеної нуклеїнової кислоті, яка кодує будь-який один зі зв'язувальних білків, розкритих вище. Наступний варіант стосується вектора, який містить виділену нуклеїнову кислоту, описану вище, при цьому зазначений вектор вибраний із групи, яка складається з pcDNA; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol. 30, № 2); pTT3 (pTT з додатковим сайтом множинного клонування); pEFBOS (Mizushima S. and Nagata S. (1990), Nucleic acids Research Vol. 18, № 17); pBV; pJV і pBJ. В іншому аспекті клітину-хазяїна трансформують описаним вище вектором. В одному з аспектів клітиною-хазяїном є прокаріотична клітина, включаючи, але без обмеження, E. coli. У спорідненому варіанті клітиною-хазяїном є еукаріотична клітина, включаючи, але без обмеження, клітину протисти, тваринну клітину, рослинну клітину і клітину гриба. В одному з аспектів клітиною-хазяїном є клітина ссавця, включаючи, але ними не обмежуючи, CHO і COS; або клітина гриба, така як клітина Saccharomyces cerevisiae; або клітина комахи, така як Sf9. В іншому аспекті винахід стосується способу одержання зв'язувального білка, що зв'язує IL1α, який включає культивування будь-якої з клітин-хазяїнів, зазначених вище, у культуральному середовищі в умовах, достатніх для продукування зв'язувального білка, що зв'язує IL-1α. В іншому варіанті винахід стосується зв'язувального білка, одержаного зазначеним вище способом. В одному з варіантів винахід стосується композиції для вивільнення зв'язувального білка, 3 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 при цьому композиція містить препарат, який у свою чергу містить кристалізований зв'язувальний білок, кристалізовану конструкцію антитіла або кристалізований кон'югат антитіла, що зазначені вище, і інгредієнт, і щонайменше один полімерний носій. В одному з аспектів полімерний носій являє собою полімер, вибраний з одного або декількох полімерів із групи, яка складається з: полі(акрилової кислоти), полі(ціаноакрилатів), полі(амінокислот), полі(ангідридів), полі(депсипептиду), складних полі(ефірів), полі(молочної кислоти), співполімеру (молочної-гліколевої кислоти) або PLGA, полі(b-гідроксибутирату), полі(капролактону), полі(діоксанону); полі(етиленгліколю), полі((гідроксипропіл)метакриламіду), полі[(органо)фосфазену], складних полі(ортоефірів), полі(вінілового спирту), полі(вінілпіролідону), співполімерів малеїновий ангідрид-алкілвініловий ефір, поліолів плюроніків, альбуміну, альгінату, целюлози і похідних целюлози, колагену, фібрину, желатину, гіалуронової кислоти, олігосахаридів, глікаміногліканів, сульфатованих полісахаридів, їх сумішей і співполімерів. В іншому аспекті інгредієнт вибраний із групи, яка складається з альбуміну, сахарози, трегалози, лактиту, желатину, гідроксипропіл-β-циклодекстрину, метоксиполіетиленгліколю і поліетиленгліколю. Інший варіант стосується способу лікування ссавця, який включає стадію введення ссавцю ефективної кількості зазначеної вище композиції. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка містить зв'язувальний білок, описаний вище, і фармацевтично прийнятний носій. У наступному варіанті фармацевтична композиція містить щонайменше один додатковий терапевтичний засіб для лікування розладу, при якому активність IL-1α є шкідливою. В одному аспекті додатковий засіб вибраний із групи, яка складається з: терапевтичного засобу, візуалізуючого засобу, цитотоксичного засобу, інгібіторів ангіогенезу; інгібіторів кіназ; блокаторів костимулюючих молекул; блокатора адгезійних молекул; антитіла проти цитокінів або його функціонального фрагмента; метотрексату; циклоспорину; рапаміцину; FK506; реєстрованої мітки або репортера; антагоніста TNF; протиревматичного засобу; м'язового релаксанту, наркотичного засобу, нестероїдного протизапального лікарського засобу (НПЗЗ), анальгетику, анестетику, седативного засобу, місцевого анестетику, нейром'язового блокатора, протимікробного засобу, протипсоріатичного засобу, кортикостероїду, анаболічного стероїду, еритропоетину, засобу для імунізації, імуноглобуліну, імунодепресанту, гормону росту, засобу для гормонозамісної терапії, радіоактивного фармацевтичного засобу, антидепресанту, антипсихотичного засобу, стимулятора, лікарського засобу проти астми, бета-агоніста, інгальованого стероїду, перорального стероїду, епінефрину або його аналога, цитокіну й антагоніста цитокіну. В іншому аспекті винахід стосується способу інгібування активності IL-1α людини, який включає здійснення контакту IL-1α людини зі зв'язувальним білком, зазначеним вище, так що активність IL-1α людини інгібується. У спорідненому аспекті винахід стосується способу інгібування активності IL-1α людини у людини, що страждає від розладу, при якому активність IL-1α є шкідливою, який включає введення людині зв'язувального білка, розкритого вище, щоб інгібувати активність IL-1α людини і здійснити лікування. В іншому аспекті винахід стосується способу лікування (наприклад, зцілення, пригнічення, ослаблення, уповільнення або запобігання появі або запобігання повторенню або рецидиву) або профілактики IL-1α-асоційованого розладу у індивіда. Спосіб включає: введення індивіду IL1α-зв'язувального засобу (зокрема, антагоніста), наприклад анти-IL-1α-антитіла або його фрагмента, що описані в даній публікації, у кількості, достатній для лікування або профілактики IL-1α-асоційованого розладу. Антагоніст IL-1α, наприклад анти-IL-1α-антитіло або його фрагмент, можна вводити індивіду окремо або в сполученні з іншими терапевтичними засобами, що описані в даній публікації. В іншому аспекті даний винахід стосується способу виявлення наявності IL-1α у зразку in vitro (наприклад, у біологічному зразку, такому як сироватка, плазма, тканина, біопсія). Такий спосіб можна застосовувати для діагностики розладу, наприклад асоційованого з імунними клітинами розладу. Спосіб включає: (і) приведення в контакт зразка або контрольного зразка з анти-IL-1α-антитілом або його фрагментом, що описані в даній публікації; і (ii) виявлення утворення комплексу між анти-IL-1α-антитілом або його фрагментом і зразком або контрольним зразком, при цьому статистично значима зміна в утворенні комплексу в зразку в порівнянні з контрольним зразком є показником наявності IL-1α у зразку. У наступному аспекті даний винахід стосується способу виявлення присутності IL-1α in vivo (наприклад, візуалізації у суб'єкта in vivo). Такий спосіб можна застосовувати для діагностики розладу, наприклад IL-1α-асоційованого розладу. Спосіб включає: (і) введення анти-IL-1αантитіла або його фрагмента, що описані в даній публікації, індивіду або контрольному індивіду в умовах, що забезпечують можливість зв'язування антитіла або фрагмента з IL-1α; і (ii) виявлення утворення комплексу між антитілом або фрагментом і IL-1α, при цьому статистично 4 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 значима зміна в утворенні комплексу у індивіда в порівнянні з контрольним індивідом є показником наявності IL-1α. В іншому аспекті зв'язувальні білки за винаходом можна використовувати для лікування розладу, вибраного з групи, яка складається з ревматоїдного артриту, остеоартриту, ювенільного хронічного артриту, септичного артриту, Лайм-артриту, псоріатичного артриту, реактивного артриту, спондилоартропатії, системного червоного вовчака, хвороби Крона, виразкового коліту, запального захворювання кишечнику, інсулінозалежного цукрового діабету, тиреоїдиту, астми, алергічних захворювань, псоріазу, дерматиту, склеродермії, хвороби "трансплантат проти хазяїна", відторгнення трансплантата органа, гострого або хронічного імунного захворювання, асоційованого з трансплантацією органів, саркоїдозу, атеросклерозу, дисемінованого внутрішньосудинного згортання, синдрому Кавасакі, дифузійного токсичного зоба, нефротичного синдрому, синдрому хронічної утоми, гранулематозу Вегенера, пурпури Геноха-Шенлейна, мікроскопічного васкуліту нирок, хронічного активного гепатиту, увеїту, септичного шоку, синдрому токсичного шоку, сепсису, кахексії, інфекційних хвороб, паразитарних хвороб, гострого поперечного мієліту, хореї Хантінгтона, хвороби Паркінсона, хвороби Альцгеймера, інсульту, первинного біліарного цирозу, гемолітичної анемії, злоякісних новоутворень, серцевої недостатності, інфаркту міокарда, Аддісонової хвороби, спорадичної полігландулярної недостатності типу I і полігландулярної недостатності типу II, синдрому Шмідта, (гострого) респіраторного дистрес-синдрому дорослих, алопеції, осередкової алопеції, серонегативної артропатії, артропатії, хвороби Рейтера, псоріатичної артропатії, артропатії при виразковому коліті, ентеропатичного синовіту, артропатії, асоційованої з хламідіями, ієрсиніями і сальмонелами, спондилоартропатії, атероматозного захворювання/артеріосклерозу, атопічної алергії, аутоімунного бульозного захворювання, вульгарного пемфігусу, листоподібного пемфігусу, пемфігоїду, лінійного IgA-залежного захворювання, аутоімунної гемолітичної анемії, Кумбс-позитивної гемолітичної анемії, набутої перніціозної анемії, ювенільної перніціозної анемії, міалгічного енцефаліту/поствірусного синдрому утоми, хронічного шкірно-слизового кандидозу, гігантоклітинного артеріїту, первинного склерозуючого гепатиту, криптогенного аутоімунного гепатиту, синдрому набутого імунодефіциту, захворювань, споріднених з синдромом набутого імунодефіциту, гепатиту B, гепатиту C, загального варіабельного імунодефіциту (загальної варіабельної гіпогаммаглобулінемії), дилатаційної кардіоміопатії, жіночої безплідності, недостатності яєчників, передчасної недостатності яєчників, легеневого фіброзу, криптогенного фіброзуючого альвеоліту, постзапального інтерстиціального захворювання легень, інтерстиціального пневмоніту, асоційованого із сполучнотканинним захворюванням інтерстиціального захворювання легень, захворювання легень, пов'язаного зі змішаним захворюванням сполучної тканини, пов'язаного із системним склерозом інтерстиціального захворювання легень, асоційованого з ревматоїдним артритом інтерстиціального захворювання легень, асоційованого із системним червоним вовчаком захворювання легень, асоційованого з дерматоміозитом/поліміозитом захворювання легень, асоційованого з хворобою Шегрена захворювання легень, асоційованого з анкілозуючим спондилітом захворювання легень, васкулітоподібної дифузійної хвороби легень, асоційованого з гемосидерозом захворювання легень, індукованого лікарськими засобами інтерстиціального захворювання легень, фіброзу, променевого фіброзу, облітеруючого бронхіоліту, хронічної еозинофільної пневмонії, лімфоцитарного інфільтративного захворювання легень, постінфекційного інтерстиціального захворювання легень, подагричного артриту, аутоімунного гепатиту, аутоімунного гепатиту типу 1 (класичного аутоімунного або люпоїдного гепатиту), аутоімунного гепатиту типу 2 (гепатити з анти-LKM-антитілами), опосередкованої аутоімунітетом гіпоглікемії, резистентності до інсуліну типу B з акантокератодермією, гіпопаратиреоїдизму, гострого імунного захворювання, асоційованого з трансплантацією органів, хронічного імунного захворювання, асоційованого з трансплантацією органів, остеоартрозу, первинного склерозуючого холангіту, псоріазу типу І, псоріазу типу ІІ, ідіопатичної лейкопенії, аутоімунної нейтропенії, асоційованого з NOS ниркового захворювання, гломерулонефриту, мікроскопічного васкуліту нирок, хвороби Лайма, дискоїдного червоного вовчака, чоловічої безплідності, ідіопатичної або пов'язаної з NOS, аутоімунітету до сперматозоїдів, розсіяного склерозу (усіх підтипів), симпатичної офтальмії, вторинної легеневої гіпертензії, асоційованої з захворюванням сполучної тканини, синдрому Гудпасчера, легеневого прояву нодозного поліартеріїту, гострої ревматичної пропасниці, ревматоїдного спондиліту, хвороби Стілла, системного склерозу, синдрому Шегрена, хвороби/артеріїту Такаясу, аутоімунної тромбоцитопенії, ідіопатичної тромбоцитопенії, аутоімунного захворювання щитовидної залози, гіпертиреоїдизму, аутоімунного гіпотиреоїдизму, зоба (хвороби Хашимото), атрофічного аутоімунного гіпотиреоїдизму, первинної мікседеми, факогенного увеїту, 5 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 первинного васкуліту, вітиліго, гострого захворювання печінки, хронічних захворювань печінки, алкогольного цирозу, індукованого алкоголем ушкодження печінки, холестазу, ідіосинкразичного захворювання печінки, індукованого лікарськими засобами гепатиту, неалкогольного стеатогепатиту, алергії й астми, інфекції стрептококами групи B (GBS), психіатричних розладів (наприклад, депресії і шизофренії), захворювань, опосередкованих лімфоцитами Th2-типу і Th1типу, гострого і хронічного болю (різних форм болю) і злоякісних пухлин, таких як рак легені, молочної залози, шлунка, сечового міхура, ободової кишки, підшлункової залози, яєчника, передміхурової залози і прямої кишки і гематопоетичні злоякісні захворювання (лейкоз і лімфома), абеталіпопротеїнемії, акроціанозу, гострих і хронічних паразитичних або інфекційних процесів, гострого лейкозу, гострого лімфобластного лейкозу (ALL), гострого мієлоїдного лейкозу (AML), гострої або хронічної бактеріальної інфекції, гострого панкреатиту, гострої ниркової недостатності, аденокарцином, атріальної ектопічної систоли, комплексу СНІДдеменція, індукованого алкоголем гепатиту, алергічного кон'юнктивіту, алергічного контактного дерматиту, алергічного риніту, відторгнення алотрансплантата, недостатності альфа-1антитрипсину, бічного аміотрофічного склерозу, анемії, стенокардії, дегенерації клітин переднього рога, анти-cd3-терапії, антифосфоліпідного синдрому, антирецепторних реакцій гіперчутливості, аневризмів аорти і периферичних судин, розшарування аорти, артеріальної гіпертензії, артеріосклерозу, артеріовенозної фістули, атаксії, фібриляції передсердь (персистуючої або пароксизмальної), тріпотіння передсердь, атріовентрикулярної блокади, Bклітинної лімфоми, відторгнення трансплантата кістки, відторгнення трансплантата кісткового мозку (BMT), блокади ніжки пучка Гіса, лімфоми Беркітта, опіків, серцевої аритмії, синдрому оглушення міокарда, пухлин серця, кардіоміопатії, запальної реакції на серцево-легеневе шунтування, відторгнення хрящового трансплантата, дегенерацій кори мозочка, розладів мозочка, хаотичної або багатоосередкової атріальної тахікардії, викликаних хіміотерапією розладів, хронічного мієлоцитарного лейкозу (CML), хронічного алкоголізму, хронічних запальних патологій, хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL), хронічного обструктивного легеневого захворювання (COPD), хронічної інтоксикації саліцилатами, карциноми прямої й ободової кишки, застійної серцевої недостатності, кон'юнктивіту, контактного дерматиту, легеневого серця, хвороби коронарних артерій, хвороби Крейтцфельдта-Якоба, сепсису з негативним посівом культури, кістозного фіброзу, асоційованих з терапією цитокінами розладів, деменції боксерів, демієлінізуючих захворювань, геморагічної пропасниці денге, дерматиту, дерматологічних станів, діабету, цукрового діабету, діабетичного атеросклеротичного захворювання, хвороби дифузійних тілець Леві, дилатованої застійної кардіоміопатії, розладів базальних гангліїв, синдрому Дауна в середньому віці, індукованих лікарськими засобами порушень руху, що індуковані лікарськими засобами, які блокують допамінові рецептори ЦНС, чутливості до лікарських засобів, екземи, енцефаломієліту, ендокардиту, ендокринопатії, епіглотиту, інфекції вірусом Епштейна-Барр, еритромелалгії, екстрапірамідальних і мозочкових розладів, сімейного гемофагоцитарного лімфогістіоцитозу, відторгнення трансплантата внаслідок вродженого порушення тимуса, атаксії Фрідрейха, функціональних розладів периферичних артерій, грибкового сепсису, газової гангрени, виразки шлунка, гломерулонефриту, відторгнення трансплантата будь-якого органа або тканини, грамнегативного сепсису, грампозитивного сепсису, гранульоми внаслідок присутності внутрішньоклітинних організмів, лейкозу ворсистих клітин, хвороби Халлеррордена-Шпатца, тиреоїдиту Хашимото, алергії на пилок, відторгнення трансплантата серця, гемохроматозу, гемодіалізу, гемолітико-уремічного синдрому/тромболітичної тромбоцитопенічної пурпури, геморагії, гепатиту (A), аритмій пучка Гіса, ВІЛ-інфекції/ВІЛ-невропатії, хвороби Ходжкіна, гіперкінетичних розладів руху, реакцій гіперчутливості, пневмоніту при гіперчутливості, гіпертензії, гіпокінетичних розладів руху, зміни гіпоталамо-гіпофізарно-наднирковозалозної осі, ідіопатичної Аддісонової хвороби, ідіопатичного фіброзу легень, опосередкованої антитілами цитотоксичності, астенії, спінальної м'язової атрофії у дітей раннього віку, запалення аорти, грипу A, впливу іонізуючої радіації, іридоцикліту/увеїту/невриту зорового нерва, ішемічнореперфузійного ушкодження, ішемічного інсульту, ювенільного ревматоїдного артриту, ювенільної спінальної м'язової атрофії, саркоми Капоші, відторгнення трансплантата нирки, легіонельозу, лейшманіозу, лепри, ушкоджень кортикоспінальної системи, жирового набряку, відторгнення трансплантата печінки, лімфедеми, малярії, злоякісної лімфоми, злоякісного гістіоцитозу, злоякісної меланоми, менінгіту, менінгококемії, метаболічної/ідіопатичної, мігреневого головного болю, мітохондріальних мультисистемних розладів, змішаного захворювання сполучної тканини, моноклональної гаммапатії, множинної мієломи, багатосистемних дегенерацій (Менцеля-Дежерина-Тома, Шая-Драгера і Макадо-Джозефа), важкої псевдопаралітичної міастенії, інфекції Mycobacterium avium intracellulare, інфекції 6 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Mycobacterium tuberculosis, мієлодиспластичного синдрому, інфаркту міокарда, ішемічної хвороби міокарда, назофарингеальної карциноми, неонатального хронічного легеневого захворювання, нефриту, нефрозу, нейродегенеративних захворювань, нейрогенної м'язової атрофії I, нейтропенічної пропасниці, неходжкінської лімфоми, оклюзії черевної аорти і її відгалужень, оклюзійних артеріальних розладів, терапії okt3, орхіту/епідидиміту, орхіту/процедури реверсивної вазектомії, органомегалії, остеопорозу, відторгнення трансплантата підшлункової залози, карциноми підшлункової залози, паранеопластичного синдрому/гіперкальціємії при злоякісних новоутвореннях, відторгнення трансплантата паращитовидної залози, запального захворювання тазових органів, хронічного алергічного риніту, хвороби перикарда, периферичного атеросклеротичного захворювання, захворювань периферичних судин, перитоніту, перніціозної анемії, пневмонії, викликаної Pneumocystis carinii, пневмонії, синдрому POEM (поліневропатії, органомегалії, ендокринопатії, моноклональної гаммапатії і синдрому шкірних змін), постперфузійного синдрому, постгемодіалізного синдрому, посткомісуротомного/посткардіотомного синдрому, прееклампсії, прогресуючого супрануклеарного паралічу, первинної легеневої гіпертензії, променевої терапії, феномена і хвороби Рейно, хвороби Рейно, хвороби Рефсума, регулярної тахікардії з вузькими комплексами QRS, реноваскулярної гіпертензії, реперфузійного ушкодження, рестриктивної кардіоміопатії, сарком, склеродермії, сенільної хореї, старечої деменції з тільцями типу Леві, серонегативної артропатії, шоку, серпоподібноклітинної анемії, відторгнення алотрансплантата шкіри, синдрому шкірних змін, відторгнення трансплантата тонкої кишки, солідних пухлин, специфічних аритмій, спінальної атаксії, спіноцеребелярних дегенерацій, стрептококового міозиту, структурних ушкоджень мозочка, підгострого склерозуючого паненцефаліту, непритомності, сифілісу серцево-судинної системи, системної анафілаксії, синдрому системної запальної реакції, системної форми ювенільного ревматоїдного артриту, T-клітинного або FABALL, телеангіектазії, облітеруючого тромбангіїту, тромбоцитопенії, токсичності, трансплантатів, травми/геморагії, реакцій гіперчутливості типу III, гіперчутливості типу IV, нестабільної стенокардії, уремії, уросепсису, кропивниці, пороків клапанів серця, варикозних вен, васкуліту, захворювань вен, тромбозу вен, фібриляції шлуночків, вірусних і грибкових інфекцій, вірусного енцефаліту/асептичного менінгіту, асоційованого з вірусами гемофагоцитарного синдрому, синдрому Верніке-Корсакова, хвороби Вільсона, відторгнення ксенотрансплантата будь-якого органа або тканини, гострих коронарних синдромів, гострого ідіопатичного поліневриту, гострої запальної демієлінізуючої полірадикулоневропатії, гострої ішемії, хвороби Стілла дорослих, осередкової алопеції, анафілаксії, синдрому антифосфоліпідних антитіл, апластичної анемії, артеріосклерозу, атопічної екземи, атопічного дерматиту, аутоімунного дерматиту, аутоімунного захворювання, асоційованого зі стрептококовою інфекцією, аутоімунної ентеропатії, аутоімунної втрати слуху, аутоімунного лімфопроліферативного синдрому (ALPS), аутоімунного міокардиту, аутоімунної передчасної недостатності яєчників, блефариту, бронхоектазу, бульозного пемфігоїду, серцево-судинного захворювання, катастрофічного антифосфоліпідного синдрому, целіакії, шийного спондильозу, хронічної ішемії, пемфігоїду, що рубцюється, клінічно ізольованого синдрому (CIS) з ризиком розсіяного склерозу, кон'юнктивіту, психіатричного розладу у дітей, хронічного обструктивного легеневого захворювання (COPD), дакріоциститу, дерматоміозиту, діабетичної ретинопатії, цукрового діабету, грижі міжхребцевого диска, пролапсу диска, індукованої лікарськими засобами імунної гемолітичної анемії, ендокардиту, ендометріозу, ендофтальміту, епісклериту, поліморфної еритеми, важкої поліморфної еритеми, пемфігоїду вагітних, синдрому Гійєна-Барре (GBS), сінної пропасниці, синдрому Хьюза, ідіопатичної хвороби Паркінсона, ідіопатичної інтерстиціальної пневмонії, IgE-опосередкованої алергії, імунної гемолітичної анемії, міозиту з тільцями включення, інфекційної запальної очної хвороби, запального демієлінізуючого захворювання, запального захворювання серця, запальної хвороби нирок, IPF/UIP, іриту, кератиту, сухого кератокон'юнктивіту, хвороби Куссмауля або хвороби Куссмауля-Мейєра, паралічу Ландрі, гістіоцитозу з клітин Лангерганса, сітчастого ліведо, макулярної дегенерації, мікроскопічного поліангіїту, хвороби Бехтерєва, розладів мотонейронів, пемфігоїду слизової оболонки, множинної органної недостатності, важкої псевдопаралітичний міастенії, мієлодиспластичного синдрому, міокардиту, захворювання нервових корінців, невропатії, не-A- і не-В-гепатиту, невриту зорового нерва, остеолізу, малосуглобового JRA, оклюзійного захворювання периферичних артерій (PAOD), захворювання периферичних судин (PVD), захворювання периферичних артерій (PAD), флебіту, нодозного поліартриту (або нодозного періартеріїту), поліхондрії, ревматичної поліміалгії, поліозу, багатосуглобового JRA, синдрому поліендокринної недостатності, поліміозиту, ревматичної поліміалгії (PMR), постгемодіалізного синдрому, первинного паркінсонізму, простатиту, істинної еритроцитарної аплазії, первинній недостатності 7 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 надниркових залоз, рецидивуючого нейромієліту зорового нерва, рестенозу, ревматичної хвороби серця, SAPHO (синовіту, акне, пустульозу, гіперостозу й оститу), склеродермії, вторинного амілоїдозу, інфаркту легені, склериту, ішіасу, вторинної недостатності надниркових залоз, асоційованого із силіконом захворювання сполучної тканини, дерматозу СнеддонаВілкінсона, анкілозуючого спондиліту, синдрому Стівенса-Джонсона (SJS), синдрому системної запальної реакції, темпорального артеріїту, токсоплазмозного ретиніту, токсичного епідермального некролізу, поперечного мієліту, TRAPS (синдрому, асоційованого з рецептором фактора некрозу пухлин), алергічної реакції типу 1, діабету типу II, кропивниці, звичайної інтерстиціальної пневмонії (UIP), васкуліту, весняного кон'юнктивіту, вірусного ретиніту, синдрому Вогта-Коянагі-Гарада (синдрому VKH), вологої макулодистрофії і загоєння ран. В одному з аспектів зв'язувальні білки за винаходом можуть використовуватися для лікування ревматоїдного артриту, остеоартриту, хвороби Крона, розсіяного склерозу, інсулінозалежного цукрового діабету і псоріазу. В іншому аспекті зв'язувальні білки за винаходом також можуть використовуватися для лікування людей, що страждають від аутоімунних захворювань, зокрема захворювань, пов'язаних із запаленням, включаючи анкілозуючий спондиліт, алергію, аутоімунний діабет, аутоімунний увеїт. В іншому аспекті винахід стосується способу лікування пацієнта, що страждає від розладу, при якому IL-1α є шкідливим, який включає стадію введення будь-якого зі зв'язувальних білків, розкритих далі, до, одночасно або після введення другого засобу, який описаний вище. В іншому варіанті додаткові терапевтичні засоби, які можна вводити разом і/або готувати у вигляді одного препарату з одним або декількома антагоністами IL-1α (наприклад, з анти-IL-1αантитілами або їх фрагментами), включають, без обмеження, антагоністи TNF; розчинний фрагмент рецептора TNF; енбрел; ферментні антагоністи TNF; інгібітори TNFперетворювального ферменту (TACE); антагоністи мускаринових рецепторів; антагоністи TGFбета; інтерферон гамма; перфенідон; хіміотерапевтичні засоби, метотрексат; лефлуномід; сиролімус (рапаміцин) або його аналог, CCI-779; інгібітори ЦОГ2 або cPLA2; НПЗП; імуномодулятори; інгібітори p38; інгібітори TPL-2, MK-2 і NFkВ; буденозид; епідермальний фактор росту; кортикостероїди; циклоспорин; сульфасалазин; аміносаліцилати; 6меркаптопурин; азатіоприн; метронідазол; інгібітори ліпоксигенази; месаламін; олсалазин; балсазазид; антиоксиданти; інгібітори тромбоксану; антагоністи рецептора IL-1; анти-IL-1βантитіла; анти-ІL-6-антитіла; фактори росту; інгібітори еластази; сполуки піридинілімідазолу; антитіла або агоністи TNF, LT, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF або PDGF; антитіла до CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 або їх лігандів; FK506; рапаміцин; мікофенолат мофетилу; ібупрофен; преднізолон; інгібітори фосфодіестерази; агоністи аденозину; антитромботичні засоби; інгібітори комплементу; адренергічні засоби; інгібітори IRAK, NIK, DCK, p38 або MAP-кіназ; інгібітори IL-1β-перетворювального ферменту; інгібітори TNFαперетворювального ферменту; інгібітори передачі T-клітинних сигналів; інгібітори металопротеїнази; 6-меркаптопурини; інгібітори ангіотензинперетворювального ферменту; розчинні рецептори цитокінів; розчинний рецептор TNF p55; розчинний рецептор TNF p75; sIL1RI; sIL-1RII; sIL-6R; протизапальні цитокіни; IL-4; IL-10; IL-11 і TGFβ. В одному варіанті фармацевтичні композиції, зазначені вище, вводять індивіду щонайменше одним шляхом, вибраним з парентерального, підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньовенного, внутрішньосуглобового, внутрішньобронхіального, інтраабдомінального, інтракапсулярного, внутрішньохрящового, внутрішньопорожнинного, інтравентрикулярного, внутрішньомозочкового, інтрацеребровентрикулярного, усередину ободової кишки, інтрацервікального, внутрішньошлункового, внутрішньопечінкового, інтраміокардіального, внутрішньокісткового, внутрішньотазового, внутрішньоперикардіального, внутрішньоочеревинного, внутрішньоплеврального, усередину простати, внутрішньолегеневого, внутрішньоректального, внутрішньониркового, інтраретинального, інтраспінального, інтрасиновіального, інтраторакального, внутрішньоматкового, інтравезикального, болюсного, вагінального, ректального, букального, під'язикового, інтраназального і трансдермального. В одному з аспектів винахід стосується щонайменше одного IL-1α-антиідіотипічного антитіла, щонайменше одного IL-1α-зв'язувального білка за даним винаходом. Антиідіотипічне антитіло включає будь-який білок або пептид, який містить молекулу, що містить щонайменше частину молекули імуноглобуліну, таку як, без обмеження, щонайменше одна область, що визначає комплементарність (CDR), важкого або легкого ланцюга або її лігандзв'язувальна частина, варіабельна область важкого ланцюга або легкого ланцюга, константна область важкого або легкого ланцюга, каркасна область або будь-яка їх частина, що можуть бути 8 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 введені в зв'язувальний білок за даним винаходом. Докладний опис винаходу Даний винахід стосується IL-1α-зв'язувальних білків, зокрема анти-IL-1α-антитіл або їх антигензв'язувальних частин, що зв'язують IL-1α. У різних аспектах винахід стосується антитіл і фрагментів антитіл і їх фармацевтичних композицій, а також нуклеїнових кислот, рекомбінантних експресуючих векторів і клітин-хазяїнів для одержання таких антитіл і фрагментів. Винахід також стосується способів застосування антитіл за винаходом для виявлення IL-1α людини, інгібування активності IL-1α людини, або in vitro, або in vivo, і для регуляції експресії генів. Якщо не зазначене інше, то наукові і технічні терміни, використовувані в зв'язку з даним винаходом, будуть мати значення, яке звичайно мається на увазі фахівцем у даній галузі. Значення й обсяг термінів повинні бути зрозумілі, однак, у випадку будь-якої можливої неясності, визначення, наведені в даному описі, відповідають визначенням, що зустрічаються в будь-якому словнику або іншому джерелі. Крім того, якщо відповідно до контексту не потрібне інше, то терміни в однині повинні включати терміни в множині, а терміни в множині повинні включати і форму однини. У даному описі використання "або" означає "і/або", якщо не зазначене інше. Крім того, використання терміна "включаючи", а також інших форм, таких як "включає" і "включно", не є обмежуючим. Також такі терміни як "елемент" або "компонент" охоплюють й елементи і компоненти, що містять одну одиницю, і елементи і компоненти, що містять більше однієї субодиниці, якщо спеціально не зазначене інше. Загалом, використовувана номенклатура і способи культивування клітин і тканин, молекулярної біології, імунології, мікробіології, генетики і хімії білка і нуклеїнових кислот і гібридизації, описані в даній публікації, стосуються номенклатури і способів, добре відомих і широко застосовуваних у даній галузі. Способи і методики згідно з даним винаходом звичайно здійснюють відповідно до звичайних способів, добре відомим у даній галузі й описаних у різних загальних і більш конкретних публікаціях, що цитовані й обговорюються протягом даного опису, якщо не зазначене інше. Ферментативні реакції і способи очищення здійснюють відповідно до описів виробника, як звичайно виконують у даній галузі або як описано в даній публікації. Номенклатура і лабораторні способи і методики аналітичної хімії, хімії органічного синтезу і медичної і фармацевтичної хімії, описані в даній публікації, добре відомі і широко застосовні в даній галузі. Застосовують стандартні методики для хімічного синтезу, хімічного аналізу, одержання фармацевтичних засобів, приготування препаратів і доставки і лікування пацієнтів. Щоб даний винахід був більш зрозумілим, нижче наведене визначення деяких термінів. Термін "поліпептид" у використовуваному в даному описі розумінні стосується будь-якого полімерного ланцюга амінокислот. Терміни "пептид" і "білок" використовують взаємозамінно з терміном "поліпептид", і терміни також стосуються полімерного ланцюга амінокислот. Термін "поліпептид" охоплює нативні або штучні білки, фрагменти білків і аналоги поліпептидів з послідовністю білка. Поліпептид може бути мономерним або полімерним. Термін "виділений білок" або "виділений поліпептид" означає білок або поліпептид, який через свою природу або джерело одержання не асоційований з асоційованими з ним у природі компонентами, що супроводжують його в нативному стані, по суті не містить інших білків з того ж виду, експресується клітиною іншого виду, або не зустрічається в природі. Таким чином, поліпептид, який синтезований хімічно або синтезований у клітинній системі, відмінній від клітини, з якої він походить у природі, буде "виділеним" від асоційованих з ним у природі компонентів. Білок також можна зробити таким, що по суті не містить асоційованих з ним у природі компонентів, шляхом виділення з застосуванням способів очищення білків, добре відомих у даній галузі. Термін "виділення" у використовуваному в даному описі розумінні стосується способу одержання хімічної молекули, такої як поліпептид, яка по суті не містить асоційованих з нею в природі компонентів, шляхом виділення, наприклад, з використанням способів очищення білка, відомих у даній галузі. Термін "IL-1α людини" (у даному описі скорочено hIL-1α або IL-1α) у використовуваному в даному описі розумінні включає плейотропний цитокін, залучений у різні імунні відповіді, запальні процеси і гематопоез. Наприклад, IL-1α включає цитокін людини, продукований активованими макрофагами, стимулює проліферацію тимоцитів завдяки індукції вивільнення IL2, дозрівання і проліферацію B-клітин і активність фактора росту фібробластів. Мається на увазі, що термін IL-1α людини включає рекомбінантний IL-1α людини (rhIL-1α), який може бути одержаний стандартними способами рекомбінантної експресії. 9 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 "Біологічна активність" у використовуваному в даному описі розумінні стосується всіх біологічних властивостей, характерних для цитокіну. Біологічні властивості IL-1α включають, але без обмеження, зв'язування з рецептором IL-1α (інші приклади включають: стимуляцію проліферації тимоцитів завдяки індукції вивільнення IL-2, дозрівання і проліферацію B-клітин і активність фактора росту фібробластів). Терміни "специфічне зв'язування" або "який специфічно зв'язується" у використовуваному в даному описі розумінні стосовно взаємодії антитіла, білка або пептиду з другим хімічним компонентом означає, що взаємодія залежить від наявності конкретної структури (наприклад, антигенної детермінанти або епітопа) на хімічному компоненті, наприклад, антитіло розпізнає і зв'язується з конкретною структурою білка, а не з білком узагалі. Якщо специфічно стосовно епітопа "A", то присутність молекули, що містить епітоп A (або вільний немічений) у реакційній суміші, що містить мічений "A" і антитіло, буде зменшувати кількість міченого A, зв'язаного з антитілом. Термін "антитіло" у використовуваному в даному описі широкому розумінні стосується будьякої молекули імуноглобуліну (Ig), що складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (H) ланцюгів і двох легких (L) ланцюгів, або його будь-якого функціонального фрагмента, мутанта, варіанта або похідного, котрі мають властивості молекули Ig у зв'язуванні суттєво важливого епітопа. Такі мутантні, варіантні або похідні форми антитіла відомі в даній галузі. Необмежувальні варіанти таких форм обговорюються нижче. У повнорозмірному антитілі кожен важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (у даному описі скорочено HCVR або VH) і константної області важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається з трьох доменів CH1, CH2 і CH3. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (у даному описі скорочено LCVR або VL) і константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домену CL. Області VH і VL можна додатково підрозділити на області гіперваріабельності, називані областями, що визначають комплементарність (CDR), у проміжку між якими знаходяться області, що є більш консервативними, називані каркасними областями (FR). Кожна VH і VL складаються з трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від амінокінця до карбоксильного кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Молекули імуноглобуліну можуть бути будь-якого типу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA і IgY), класу (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2) або підкласу. Термін "антигензв'язувальна частина" антитіла (або просто "частина антитіла") у використовуваному в даному описі розумінні стосується одного або декількох фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, hIL-1α). Було показано, що антигензв'язувальна функція антитіла може бути здійснена фрагментами повнорозмірного антитіла. Такі варіанти антитіла також можуть являти собою біспецифічні, з подвійною специфічністю або поліспецифічні форми, специфічно зв'язуються з двома або більше різними антигенами. Приклади зв'язувальних фрагментів, що входять в обсяг терміна "антигензв'язувальна частина" антитіла, включають (i) Fab-фрагмент, моновалентний фрагмент, 10 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 що складається з доменів VL, VH, CL і CH1; (ii) F(ab') 2-фрагмент, бівалентний фрагмент, що містить два Fab-фрагменти, зв'язаних дисульфідним зв'язком у шарнірній області; (iii) Fdфрагмент, що складається з доменів VH і CH1; (iv) Fv-фрагмент, що складається з доменів VL і VH одного плеча антитіла, (v) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989), Nature 341: 544-546, Winter et al., публікація PCT WO 90/05144 A1, включені в даний опис у вигляді посилання), що містить один варіабельний домен; і (vi) виділену область, що визначає комплементарність (CDR). Крім того, хоча два домени Fv-фрагмента, VL і VH, кодуються окремими генами, їх можна зв'язати, використовуючи способи рекомбінації, синтетичним лінкером, який дозволяє одержати їх у вигляді одного білкового ланцюга, у якому області VL і VH спарені з утворенням моновалентних молекул (відомих як одноланцюжковий Fv (scFv); див., наприклад, Bird et al. (1988), Science 242: 423-426; і Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Також мається на увазі, що такі одноланцюжкові антитіла входять в обсяг терміна "антигензв'язувальна частина" антитіла. Також включені інші форми одноланцюжкових антитіл, такі як діантитіла. Діантитіла є бівалентними, біспецифічними антитілами, у яких домени VH і VL експресовані в одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, який є занадто коротким, щоб забезпечити спарювання між двома доменами на одному і тому ж ланцюзі, що змушує домени спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга і приводить до створення двох антигензв'язувальних ділянок (див., наприклад, Holliger P. et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak R.J. et al. (1994), Structure 2: 1121-1123). Такі зв'язувальні частини антитіл відомі в даній галузі (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)). Термін "конструкція антитіла" у використовуваному в даному описі розумінні стосується поліпептиду, що містить одну або декілька антигензв'язувальних частин за винаходом, зв'язаних з лінкерним поліпептидом або константним доменом імуноглобуліну. Лінкерні поліпептиди містять два або більше амінокислотних залишків, зв'язаних пептидними зв'язками, і використовуються для зв'язування однієї або декількох антигензв'язувальних частин. Такі лінкерні поліпептиди добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Holliger P. et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak R.J. et al. (1994), Structure 2: 1121-1123). Константний домен імуноглобуліну стосується константного домену важкого або легкого ланцюга. Амінокислотні послідовності константних доменів важкого ланцюга і легкого ланцюга IgG людини відомі в даній галузі і представлені в таблиці 2. 11 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 Крім того, антитіло або його антигензв'язувальна частина може бути частиною більш великої молекули імуноадгезії, утвореної в результаті ковалентної або нековалентної асоціації антитіла або частини антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами. Приклади таких молекул імуноадгезії включають використання центральної області стрептавідину для одержання тетрамерної молекули scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1995), Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) і використання залишку цистеїну, маркерного пептиду і C-кінцевої полігістидинової мітки для одержання бівалентних і біотинільованих молекул scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1994), Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Частини антитіла, такі як Fab- і F(ab')2фрагменти, можуть бути одержані з цілих антитіл звичайними способами, такими як розщеплення цілих антитіл папаїном або пепсином, відповідно. Крім того, антитіла, частини антитіл і молекули імуноадгезії можуть бути одержані з використанням стандартних методик одержання рекомбінантної ДНК, які описані в даній публікації. Мається на увазі, що "виділене антитіло" у використовуваному в даному винаході розумінні стосується антитіла, яке по суті не містить інших антитіл, що мають інші антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, що специфічно зв'язує hIL-1α, по суті не містить антитіл, які специфічно зв'язують інші антигени, відмінні від hIL-1α). Однак виділене антитіло, що специфічно зв'язує hIL-1α, може мати перехресну реактивність відносно інших антигенів, таких як молекули IL-1α інших видів. Крім того, виділене антитіло може по суті не містити іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин. Передбачається, що термін "антитіло людини" у використовуваному в даному винаході розумінні охоплює антитіла, які мають варіабельні і константні області, одержані з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Антитіла людини відповідно до винаходу можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються послідовностями імуноглобуліну зародкової лінії людини (наприклад, мутації, введені в результаті випадкового або сайт-специфічного мутагенезу in vitro або в результаті соматичної мутації in vivo), наприклад, у CDR, зокрема в CDR3. Однак термін "антитіло людини" у використовуваному в даному винаході розумінні не призначений для визначення антитіл, послідовності CDR яких, одержані з зародкової лінії іншого виду ссавців, такого як миша, були щеплені в каркасні 12 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності людини. Передбачається, що термін "рекомбінантні антитіло людини" у використовуваному в даному винаході розумінні охоплює всі антитіла людини, які одержані, експресовані, створені або виділені основаними на рекомбінації способами, такі як антитіла, експресовані з використанням рекомбінантного експресуючого вектора, яким трансфікували клітину-хазяїна (додатково описана нижче в розділі II C), антитіла, виділені з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки антитіл людини (Hoogenboom H.R. (1997), TIB Tech. 15: 62-70; Azzazy H. and Highsmith W.E. (2002), Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo J.V. and Larrick J.W. (2002), BioTechniques 29: 128145; Hoogenboom H. and Chames P. (2000), Immunology Today 21: 371-378), антитіла, виділені з організму тварини (наприклад, миші), що є трансгенною по генах імуноглобуліну людини (див., наприклад, Taylor L.D. et al. (1992), Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295; Kellermann S-A. and Green L.L. (2002), Current Opinion in Biotechnology 13: 593-597; Little M. et al. (2000), Immunology Today 21: 364-370), або антитіла, одержані, експресовані, створені або виділені будь-яким іншим способом, який включає сплайсинг послідовностей генів імуноглобуліну людини з іншими послідовностями ДНК. Такі рекомбінантні антитіла людини мають варіабельні і константні області, одержані з послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Однак у деяких варіантах такі рекомбінантні антитіла людини піддають мутагенезу in vitro (або, коли використовують тварину, трансгенну по послідовностях Ig людини, соматичному мутагенезу in vivo), і, таким чином, амінокислотні послідовності областей VH і VL рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які хоча й одержані з послідовностей VH і VL зародкової лінії людини і є спорідненими з такими послідовностями, але не можуть існувати в природі в репертуарі антитіл людини зародкової лінії in vivo. Термін "химерне антитіло" стосується антитіл, які містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів одного виду і послідовності константних областей іншого виду, таких як антитіла, які мають варіабельні області важкого і легкого ланцюгів миші, зв'язані з константними областями людини. Термін "CDR-щеплене антитіло" стосується антитіл, які містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів одного виду, але в яких послідовності однієї або декількох областей CDR VH і/або VL замінені послідовностями CDR іншого виду, таких як антитіла, що мають варіабельні області важкого і легкого ланцюгів миші, у яких одна або декілька CDR миші (наприклад, CDR3) були замінені послідовностями CDR людини. Термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіл, які містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів виду тварини, відмінної від людини (наприклад, миші), але в яких щонайменше частина послідовності VH і/або VL була змінена до більш "подібної людській", тобто більш подібної з варіабельними послідовностями зародкової лінії людини. Один тип гуманізованого антитіла являє собою CDR-щеплене антитіло, у якому послідовності CDR людини введені в послідовності VH і VL тварини, відмінної від людини, щоб замінити відповідні послідовності CDR тварини, відмінної від людини. Терміни "нумерація за Кебатом", "визначення за Кебатом" і "маркування за Кебатом" використовують у даному описі взаємозамінно. Такі терміни, що відомі в даній галузі, стосуються системи нумерації амінокислотних залишків, які є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними), ніж інші амінокислотні залишки у варіабельних областях важкого і легкого ланцюгів антитіла або його антигензв'язувальної частини (Kabat et al. (1971), Ann. NY Acad., Sci. 190: 382-391; і Kabat E.A. et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication № 91-3242). У випадку варіабельної області важкого ланцюга гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні положень амінокислот 31-35 у випадку CDR1, положень амінокислот 50-65 у випадку CDR2 і положень амінокислот 95-102 у випадку CDR3. У випадку варіабельної області легкого ланцюга гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні положень амінокислот 24-34 у випадку CDR1, положень амінокислот 50-56 у випадку CDR2 і положень амінокислот 89-97 у випадку CDR3. У використовуваному в даному винаході розумінні терміни"акцептор" і "акцепторне антитіло" стосуються послідовності антитіла або нуклеїнової кислоти, яка являє собою або кодує щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або 100 % амінокислотних послідовностей однієї або декількох каркасних областей. У деяких варіантах термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла, яка являє собою або кодує константну область (області). У ще одному варіанті термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла, яка являє собою або кодує одну або декілька каркасних областей і константну область (області). У конкретному варіанті термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла 13 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людини, яка являє собою або кодує щонайменше 80 %, переважно щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або 100 % амінокислотних послідовностей однієї або декількох каркасних областей. Відповідно до зазначеного варіанта акцептор може містити щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5 або щонайменше 10 амінокислотних залишків, що не зустрічаються в одному або декількох конкретних положеннях в антитілі людини. Акцепторна каркасна область і/або акцепторна константна область (області) можуть бути, наприклад, одержані з гена антитіла зародкової лінії, гена зрілого антитіла, функціонального антитіла (наприклад, антитіл, відомих у даній галузі, розроблювальних антитіл або комерційно доступних антитіл). У використовуваному в даному винаході розумінні термін "CDR" стосується області, що визначає комплементарність, у варіабельних послідовностях антитіл. Існує три CDR у кожній з варіабельних областей важкого ланцюга і легкого ланцюгів, що названі CDR1, CDR2 і CDR3 у випадку кожної з варіабельних областей. Термін "набір CDR" у використовуваному в даному винаході розумінні стосується групи з трьох CDR, що знаходяться в одній варіабельній області, здатній зв'язувати антиген. Точні границі таких CDR визначають по-різному відповідно до різних систем. Система, описана Кебатом (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) і (1991)), не тільки забезпечує чітку систему нумерації залишків, застосовну до будь-якої варіабельної області антитіла, але також дозволяє виявити точні границі залишків, що визначають три CDR. Такі CDR можуть бути названі CDR відповідно до системи Кебата. Чотія зі співавторами (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) і Chothia et al., Nature 342:8 77-883 (1989)) знайшли, що деякі субфрагменти в CDR відповідно до системи Кебата приймають майже ідентичні конформації пептидного кістяка, незважаючи на наявність великої розмаїтості на рівні амінокислотної послідовності. Такі субфрагменти названі L1, L2 і L3 або H1, H2 і H3, де "L" і "H" означають області легкого ланцюга і важкого ланцюга, відповідно. Такі області можуть бути названі CDR відповідно до системи Чотія, що мають границі, які перекриваються з CDR відповідно до системи Кебата. Інші границі, що визначають CDR, які перекриваються з CDR відповідно до системи Кебата, описані Padlan (FASEB J. 9: 133-139 (1995)) і MacCallum (J. Mol. Biol. 262(5): 732-45 (1996)). Інші визначення границь CDR можуть не строго відповідати одній з зазначених вище систем, однак будуть перекриватися з CDR згідно з Кебатом, хоча вони можуть бути більш короткими або більш довгими у світлі попередніх оцінок або експериментальних даних про те, що конкретні залишки або групи залишків, або навіть повні CDR значимо не впливають на зв'язування антигену. У способах, застосовуваних згідно з даним винаходом, можна використовувати CDR, що визначаються відповідно до будь-якої з зазначених систем, хоча в конкретних варіантах використані CDR, що визначаються згідно з Кебатом і Чотія. У використовуваному в даному винаході розумінні термін "канонічний" залишок стосується залишку в CDR або каркасі, який визначає конкретну канонічну структуру CDR, що описана Чотія зі співавторами (J. Mol. Biol. 196: 901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992), обидві публікації включені в даний опис у вигляді посилання). Згідно з Чотія зі співавторами особливо важливі частини CDR багатьох антитіл мають майже ідентичні конформації пептидного кістяка, незважаючи на велику розмаїтість на рівні амінокислотної послідовності. Кожна канонічна структура, головним чином, визначає набір торсійних кутів для безперервної ділянки амінокислотних залишків, що утворюють петлю. У використовуваному в даному винаході розумінні терміни "донор" і "донорне антитіло" стосуються антитіла, що забезпечує одну або декілька CDR. У конкретному варіанті донорне антитіло являє собою антитіло виду, відмінного від антитіла, з якого походять або з якого одержують каркасні області. У контексті гуманізованого антитіла термін "донорне антитіло" стосується антитіла тварини, відмінної від людини, що є джерелом однієї або декількох CDR. У використовуваному в даному винаході розумінні термін "каркас" або "каркасна послідовність" стосується інших послідовностей варіабельної області за винятком CDR. Оскільки точне визначення послідовності CDR може бути здійснене з використанням різних систем, значення каркасної послідовності може бути, відповідно, інтерпретоване різним чином. Шість CDR (CDR-L1, -L2 і -L3 легкого ланцюга і CDR-H1, -H2 і -H3 важкого ланцюга) також поділяють каркасні області на легкому ланцюзі і важкому ланцюзі на чотири підобласті (FR1, FR2, FR3 і FR4) на кожному ланцюзі, при цьому CDR1 розташована між FR1 і FR2, CDR2 між FR2 і FR3, і CDR3 між FR3 і FR4. Без спеціальної характеристики конкретних підобластей FR1, FR2, FR3 або FR4, каркасна область, що вказується іншими авторами, являє собою об'єднані області FR у варіабельній області одного ланцюга імуноглобуліну, що зустрічається в природі. У використовуваному в даному винаході розумінні "область FR" являє собою одну з чотирьох підобластей, а "області FR" являють собою дві або більше з чотирьох підобластей, що 14 UA 102722 C2 складають каркасну область. Акцепторні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюгів людини відомі в даній галузі. В одному з варіантів здійснення винаходу акцепторні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюгів людини вибрані з послідовностей, описаних у таблиці 3 і таблиці 4. 5 15 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 У використовуваному в даному винаході розумінні термін "ген антитіла зародкової лінії" або "фрагмент гена" стосується послідовності імуноглобуліну, кодованої нелімфоїдними клітинами, що не були піддані процесу дозрівання, який приводить до генетичної перебудови і мутації для експресії конкретного імуноглобуліну. (Див., наприклад, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv. Exp Med. Biol. 484: 13-30 (2001)). Одна з переваг, пропонованих різними варіантами здійснення даного винаходу, пов'язана з відомими даними про те, що гени антитіл зародкової лінії більш імовірно, ніж зрілі гени антитіл, зберігають суттєві структури амінокислотної послідовності, характерні для особин даного виду, отже, антитіла менш ймовірно повинні розпізнаватися як такі, що походять з чужорідного джерела, при терапевтичному застосуванні у даного виду. У використовуваному в даному винаході розумінні термін "ключові" залишки стосується деяких залишків у варіабельній області, які здійснюють більший вплив на специфічність і/або афінність зв'язування антитіла, зокрема гуманізованого антитіла. Ключовим залишком, без обмеження, може бути один або декілька з наступних залишків: залишок, що сусідить з CDR, потенційний сайт глікозилування (може бути сайт або N-, або O-глікозилування), рідкий залишок, залишок, здатний взаємодіяти з антигеном, залишок, здатний взаємодіяти з CDR, канонічний залишок, залишок контакту між варіабельною областю важкого ланцюга і варіабельною областю легкого ланцюга, залишок у верньєр-зоні і залишок в області, що є областю перекривання між CDR1 варіабельної області важкого ланцюга відповідно до визначення Чотія і першою каркасною областю важкого ланцюга відповідно до визначення Кебата. У використовуваному в даному описі розумінні термін "гуманізоване антитіло" означає антитіло або його варіант, похідне, аналог або фрагмент, що імуноспецифічно зв'язується з антигеном, що представляє інтерес, і містить каркасну область (FR), яка по суті має 16 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотну послідовність антитіла людини, і область, що визначає комплементарність (CDR), яка по суті має амінокислотну послідовність антитіла тварини, відмінної від людини. У використовуваному в даному винаході розумінні термін "по суті" у контексті CDR стосується CDR, що має амінокислотну послідовність щонайменше на 80 %, переважно щонайменше на 85 %, щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 %, щонайменше на 98 % або щонайменше на 99 % ідентичну амінокислотній послідовності CDR антитіла тварини, відмінної від людини. Гуманізоване антитіло містить по суті всі, щонайменше один і звичайно два варіабельних домени (Fab, Fab', F(ab') 2, FabС, Fv), у яких всі або по суті всі області CDR відповідають областям CDR імуноглобуліну тварини, відмінної від людини (тобто донорного антитіла), і всі або по суті всі каркасні області являють собою каркасні області консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. Переважно, гуманізоване антитіло також містить щонайменше частину константної області (Fc) імуноглобуліну, звичайно константної області імуноглобуліну людини. У деяких варіантах гуманізоване антитіло містить як легкий ланцюг, так і щонайменше варіабельний домен важкого ланцюга. Антитіло також може включати області CH1, шарніра, CH2, CH3 і CH4 важкого ланцюга. У деяких варіантах гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований легкий ланцюг. У деяких варіантах гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований важкий ланцюг. У конкретних варіантах гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований варіабельний домен легкого ланцюга і/або гуманізований важкий ланцюг. Гуманізоване антитіло може бути вибране з будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи IgM, IgG, IgD, IgA і IgE, і будь-якого ізотипу, включаючи, без обмеження, IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4. Гуманізоване антитіло може містити послідовності з більше ніж одного класу або ізотипу, і, зокрема, константні домени можуть бути вибрані для оптимізації необхідних ефекторних функцій з використанням методик, добре відомих у даній галузі. Каркасні області й області CDR гуманізованого антитіла не повинні обов'язково точно відповідати вихідним послідовностям, наприклад CDR донорного антитіла або консенсусний каркас можуть бути піддані мутагенезу шляхом заміни, інсерції і/або делеції щонайменше одного амінокислотного залишку, так щоб залишок CDR або каркаса в даному сайті не відповідав ні донорному антитілу, ні консенсусному каркасу. Однак у конкретному варіанті такі мутації не будуть великими. Звичайно, щонайменше 80 %, переважно щонайменше 85 %, більш переважно щонайменше 90 % і найбільш переважно щонайменше 95 % залишків гуманізованого антитіла будуть відповідати залишкам вихідних послідовностей FR і CDR. У використовуваному в даному винаході розумінні термін "консенсусний каркас" стосується каркасної області в консенсусній послідовності імуноглобуліну. У використовуваному в даному винаході розумінні термін "консенсусна послідовність імуноглобуліну" стосується послідовності, утвореної з амінокислот, що найбільш часто зустрічаються (або нуклеотидів), у сімействі споріднених послідовностей імуноглобуліну (див., наприклад, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)). У сімействі імуноглобулінів кожне положення в консенсусній послідовності зайняте амінокислотою, що зустрічається найбільш часто в даному положенні в сімействі. Якщо дві амінокислоти зустрічаються з однаковою частотою, у консенсусну послідовність може бути включена будь-яка з них. У використовуваному в даному винаході розумінні "верньєр-зона" стосується підгрупи каркасних залишків, що можуть коректувати структуру CDR і точну підгонку до антигену, як описано Foote і Winter (1992, J. Mol. Biol. 224: 487-499, публікація включена в даний опис у вигляді посилання). Залишки верньєр-зони утворюють шар, що лежить під CDR, і можуть впливати на структуру CDR і афінність антитіла. Термін "полівалентний зв'язувальний білок" використовують у даному описі для позначення зв'язувального білка, який містить дві або більше антигензв'язувальних ділянок. Полівалентний зв'язувальний білок конструюють так, щоб він мав три або більше антигензв'язувальних ділянок, і звичайно такий білок являє собою антитіло, що не зустрічається в природі. Термін "поліспецифічний зв'язувальний білок" стосується зв'язувального білка, здатного зв'язувати дві або більше споріднених або неспоріднених мішеней. Зв'язувальні білки з подвійними варіабельними доменами (DVD) у використовуваному в даному описі розумінні являють собою зв'язувальні білки, що містять дві або більше антигензв'язувальних ділянок і є тетравалентними або полівалентними зв'язувальними білками. Такі DVD можуть бути моноспецифічними, тобто здатними зв'язувати один антиген, або поліспецифічними, тобто здатними зв'язувати два або більше антигенів. Зв'язувальні білки з DVD, що містять два DVD-поліпептиди важкого ланцюга і два DVD-поліпептиди легкого ланцюга, називають DVD-Ig. Кожна половина DVD-Ig містить DVDполіпептид важкого ланцюга і DVD-поліпептид легкого ланцюга і дві антигензв'язувальні ділянки. Кожна ділянка зв'язування містить варіабельний домен важкого ланцюга і варіабельний домен легкого ланцюга усього з 6 CDR, залученими в зв'язування антигену, на одну 17 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигензв'язувальну ділянку. Зв'язувальні DVD-білки і способи одержання зв'язувальних DVDбілків розкриті в заявці на видачу патенту США № 11/507050, яка включена в даний опис у вигляді посилання. В одному з аспектів винахід стосується зв'язувального DVD-білка, що містить зв'язувальні білки, здатні зв'язувати IL-1α. В іншому аспекті зв'язувальний DVD-білок здатний зв'язувати IL1α і другу мішень. В одному варіанті DVD-білок здатний упізнавати IL-1α і IL-1β. У використовуваному в даному винаході розумінні термін "нейтралізація" стосується нейтралізації біологічної активності цитокіну, коли зв'язувальний білок специфічно зв'язує цитокін. Переважно нейтралізуючий зв'язувальний білок являє собою нейтралізуюче антитіло, зв'язування якого з hIL-1α приводить до інгібування біологічної активності hIL-1α. Переважно нейтралізуючий зв'язувальний білок зв'язує hIL-1α і знижує біологічну активність hIL-1α щонайменше приблизно на 20, 40, 60, 80, 85 % або більше. Інгібування біологічної активності hIL-1α нейтралізуючим зв'язувальним білком можна оцінити, вимірюючи один або декілька показників біологічної активності hIL-1α, добре відомих у даній галузі. Термін "епітоп" включає будь-яку поліпептидну детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з імуноглобуліном або T-клітинним рецептором. У деяких варіантах епітопні детермінанти включають хімічно активні поверхневі групи молекул, таких як амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорил або сульфоніл, і в деяких варіантах можуть мати специфічні ознаки тривимірної структури і/або специфічні характеристики заряду. Епітоп являє собою область антигену, яка зв'язується антитілом. У деяких варіантах говорять, що антитіло специфічно зв'язує антиген, коли воно переважно розпізнає свій антиген-мішень у складній суміші білків і/або макромолекул. Термін "резонанс поверхневого плазмону" у використовуваному в даному описі розумінні стосується оптичного явища, яке забезпечує можливість аналізу біспецифічних взаємодій у режимі реального часу за допомогою виявлення змін концентрацій білків на біосенсорній матриці, наприклад, з використанням системи BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Додатковий опис див. у Jönsson U. et al. (1993), Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jönsson, U. et al. (1991), Biotechniques 11: 620-627; Johnsson B. et al. (1995), J. Mol. Recognit. 8: 125-131; і Johnnson B. et al. (1991), Anal. Biochem. 198: 268-277. Мається на увазі, що термін "k on" у використовуваному в даному винаході розумінні стосується константи швидкості асоціації антитіла з антигеном з утворенням комплексу антитіло/антиген, як відомо в даній галузі. Під терміном "koff", як використовується в даному винаході, розуміють константу швидкості дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген, як відомо в даній галузі. Під терміном "KD", як використовується в даному винаході, розуміють константу дисоціації при конкретній взаємодії антитіло-антиген, як відомо в даній галузі. Термін "мічений зв'язувальний білок" у використовуваному в даному винаході розумінні стосується білка з включеною міткою, яка забезпечує ідентифікацію зв'язувального білка. В одному аспекті мітка являє собою реєстрований маркер, наприклад, включення радіоактивно міченої амінокислоти або зв'язування з поліпептидом залишків біотинілу, що можуть бути виявлені за допомогою міченого авідину (наприклад, стрептавідин, що містить флуоресціюючий маркер або ферментативну активність, яка може бути виявлена оптичними або калориметричними способами). Приклади міток для поліпептидів включають, без обмеження, 3 14 35 90 99 111 125 наступні мітки: радіоактивні ізотопи або радіонукліди (наприклад, H, C, S, Y, Tc, In, I, 131 177 166 153 I, Lu, Ho або Sm); флуоресціюючі мітки (наприклад, ФІТЦ, родамін, лантанідні люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, пероксидаза хрону, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні мітки; біотинільовані групи; попередньо визначувані поліпептидні епітопи, упізнавані другим репортером (наприклад, парні послідовності лейцинової блискавки, сайти зв'язування для других антитіл, домени зв'язування металів, епітопні мітки), і магнітні засоби, такі як хелати гадолінію. Термін "кон'югат антитіла" стосується зв'язувального білка, такого як антитіло, хімічно зв'язаного з другим хімічним компонентом, таким як терапевтичний або цитотоксичний засіб. Термін "засіб" використаний у даному описі для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних сполук, біологічної макромолекули або екстракту, одержаного з біологічних матеріалів. Зокрема, терапевтичні або цитотоксичні засоби включають, без обмеження, коклюшний токсин, таксол, цитохалазин B, граміцидин D, бромід етидію, еметин, мітоміцин, етопозид, теніпозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин і їх аналоги або гомологи. Терміни "кристал" і "кристалізоване" у використовуваному в даному винаході розумінні 18 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стосуються антитіла або його антигензв'язувальної частини, що існують у формі кристала. Кристали являють собою одну з форм твердого стану речовини, що відрізняється від інших форм, таких як аморфний твердий стан або рідкокристалічний стан. Кристали складаються з правильних повторюваних тривимірних решіток атомів, іонів, молекул (наприклад, білків, таких як антитіла) або молекулярних ансамблів (наприклад, комплексів антиген/антитіло). Такі тривимірні решітки розташовані відповідно до конкретних математичних взаємозв'язків, що добре відомі в даній галузі. Фундаментальну одиницю або будівельний блок, що повторюється в кристалі, називають асиметричною одиницею. Повторення асиметричної одиниці в структурі, що відповідає деякій добре визначеній кристалографічній симетрії, створює "елементарну комірку" кристала. Повторення елементарної комірки в результаті регулярних трансляцій у всіх трьох напрямках створює кристал. Див. Giege R. and Ducruix A. Barrett, Crystallization of Nucleic nd Acids and Proteins, a Practical Approach, 2 ed., pp. 201-16, Oxford University Press, New York, N.Y. (1999). Термін "полінуклеотид", як використовується в даному описі, означає полімерну форму двох або більше нуклеотидів або рибонуклеотидів, або дезоксирибонуклеотидів, або модифікованої форми будь-якого типу нуклеотиду. Термін охоплює однониткові і двониткові форми ДНК, але особливо двониткову ДНК. Термін "виділений полінуклеотид", як використовується в даному винаході, означає полінуклеотид (наприклад, геномний, кДНК або полінуклеотид синтетичного походження або їх визначені сполучення), який через свою природу як "ізольований полінуклеотид": не асоційований з повним або частиною полінуклеотиду, з яким "виділений полінуклеотид" зустрічається в природі; оперативно зв'язаний з полінуклеотидом, з яким він не зв'язаний у природі; або не зустрічається в природі у вигляді частини більш великої послідовності. Під терміном "вектор", як використовується в даному винаході, розуміють молекулу нуклеїнової кислоти, здатну до транспорту іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв'язана. Одним з типів векторів є "плазміда", що являє собою кільцеву двониткову петлю ДНК, у яку можуть бути ліговані додаткові ділянки ДНК. Іншим типом вектора є вірусний вектор, у випадку якого додаткові фрагменти ДНК можуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори здатні до автономної реплікації в клітині-хазяїні, у яку вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальне начало реплікації, і епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) можуть бути інтегровані в геном клітини-хазяїна при введенні в клітину-хазяїна і при цьому реплікуються разом з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори здатні керувати експресією генів, з якими вони оперативно зв'язані. Такі вектори в даному описі називають "рекомбінантними експресуючими векторами" (або просто "експресуючими векторами"). Загалом, експресуючі вектори, застосовні в способах рекомбінації ДНК, часто мають форму плазмід. У даному описі терміни "плазміда" і "вектор" можуть бути використані взаємозамінно, оскільки плазміда є найбільш широко застосовуваною формою вектора. Однак мається на увазі, що винахід включає й інші форми експресуючих векторів, такі як вірусні вектори (наприклад, дефіцитні по реплікації ретровіруси, аденовіруси й аденоасоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції. Термін "функціонально зв'язаний" стосується зв'язування, при якому описувані компоненти знаходяться у взаємозв'язку, який дозволяє їм функціонувати таким чином, для якого вони призначені. Регуляторна послідовність, "функціонально зв'язана" з кодуючою послідовністю, лігована таким чином, що досягається експресія кодуючої послідовності в умовах, сумісних з регуляторними послідовностями. "Функціонально зв'язаними" послідовностями є як послідовності регуляції експресії, які граничать з геном, що представляє інтерес, так і послідовності регуляції експресії, які діють у транс-положенні або на відстані, регулюючи ген, що представляє інтерес. Термін "послідовність регуляції експресії" у використовуваному в даному описі розумінні стосується полінуклеотидних послідовностей, які необхідні для здійснення експресії і процесингу кодуючих послідовностей, з якими вони ліговані. Послідовності регуляції експресії включають відповідні послідовності ініціації транскрипції, термінації, промоторні і енхансерні послідовності; ефективні сигнали процесингу РНК, такі як сигнали сплайсингу і поліаденілювання; послідовності, що стабілізують цитоплазматичну мРНК; послідовності, що підвищують ефективність трансляції (тобто консенсусна послідовність Козака); послідовності, що підвищують стабільність білка; і, за необхідності, послідовності, що підсилюють секрецію білка. Природа таких регуляторних послідовностей різна, залежно від організму-хазяїна; у прокаріот такими регуляторними послідовностями є промотор, сайт зв'язування рибосом і послідовність термінації транскрипції; у еукаріот звичайно такими регуляторними послідовностями є промотори і послідовність термінації транскрипції. Мається на увазі, що термін "регуляторні послідовності" включає компоненти, присутність яких необхідна 19 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для експресії і процесингу, і також може включати додаткові компоненти, присутність яких корисна, наприклад лідерні послідовності і послідовності партнерів для злиття. "Трансформація", як визначено в даному описі, стосується будь-якого процесу, у ході якого екзогенна ДНК проникає в клітину-хазяїна. Трансформація може бути здійснена в природних або штучних умовах з використанням різних способів, добре відомих у даній галузі. Трансформація може бути основана на будь-якому відомому способі вбудовування чужорідних послідовностей нуклеїнової кислоти в прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна. Спосіб вибирають залежно від трансформованої клітини-хазяїна, і способи можуть включати, без обмеження, вірусну інфекцію, електропорацію, ліпофекцію і бомбардування частинками. Такі "трансформовані" клітини можуть являти собою стабільно трансформовані клітини, у яких вбудована ДНК здатна реплікуватися, або у вигляді плазміди, що автономно реплікується, або у вигляді частини хромосоми хазяїна. Також вони можуть являти собою клітини, у яких тимчасово експресуються вбудовані ДНК або РНК протягом обмежених періодів часу. Мається на увазі, що під терміном "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітинахазяїн") розуміють, як використовується в даному винаході, клітину, у яку була введена екзогенна ДНК. Варто розуміти, що такі терміни призначені для опису не тільки конкретної клітини суб'єкта, але і потомства такої клітини. Оскільки в наступних поколіннях можуть мати місце деякі модифікації або внаслідок мутації, або внаслідок впливу навколишнього середовища, таке потомство в дійсності може бути не ідентичним вихідній клітині, але усе ще буде входити в обсяг терміна "клітина-хазяїн" у використовуваному в даному описі розумінні. В одному аспекті клітини-хазяїни включають прокаріотичні і еукаріотичні клітини, вибрані з будьякого царства живих організмів. Еукаріотичні клітини включають клітини найпростіших, грибів, рослин і тварин. В іншому аспекті клітини-хазяїни включають, але ними не обмежуються, лінію прокаріотичних клітин E. coli; лінії клітин ссавців CHO, HEK 293 і COS; лінію клітин комах Sf9 і клітини грибів Saccharomyces cerevisiae. Можна використовувати стандартні способи одержання рекомбінантної ДНК, синтезу олігонуклеотидів і культивування тканин і трансформації (наприклад, електропорацію, ліпофекцію). Ферментативні реакції і способи очищення можна здійснювати відповідно до інструкцій виробників або як звичайно здійснюють у даній галузі, або як описано в даній публікації. Зазначені вище методики і способи, загалом, можна здійснювати звичайними способами, добре відомими в даній галузі, і як описано в різних загальних і більш спеціалізованих публікаціях, що цитовані й обговорюються в даному описі. Див., наприклад, публікацію Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), що включена в даний опис у вигляді посилання для будь-якої мети. "Трансгенний організм", як відомо в даній галузі й у використовуваному в даному описі розумінні, стосується організму, який має клітини, що містять трансген, при цьому трансген, введений в організм (або в предка даного організму), експресує поліпептид, що не експресується у даному організмі в природі. "Трансген" являє собою конструкцію ДНК, що стабільно й оперативно інтегрована в геном клітини, з якої розвивається трансгенний організм, при цьому трансген керує експресією кодованого генного продукту в одному або декількох типах клітин або тканин трансгенного організму. Терміни "регулювати" і "модулювати" використовують взаємозамінно, і у використовуваному в даному описі розумінні вони стосуються зміни або варіації активності молекули, що представляє інтерес (наприклад, біологічної активності hIL-1α). Модулювання може являти собою збільшення або зменшення значення визначеної активності або функції молекули, що представляє інтерес. Прикладами активностей і функцій є, без обмеження, характеристики зв'язування, ферментативна активність, активація клітинного рецептора і сигнальна трансдукція. Відповідно, термін "модулятор" у використовуваному в даному описі розумінні означає сполуку, здатну змінювати активність або функцію молекули, що представляє інтерес (наприклад, біологічну активність hIL-1α). Наприклад, модулятор може викликати збільшення або зменшення значення визначеної активності або функції молекули в порівнянні з величиною активності або функції, спостережуваної за відсутності модулятора. У деяких варіантах модулятор є інгібітором, який зменшує величину щонайменше однієї активності або функції молекули. Приклади інгібіторів включають, без обмеження, білки, пептиди, антитіла, пептидотіла, вуглеводи або малі органічні молекули. Пептидотіла описані, наприклад, у WO 01/83525. Термін "агоніст" у використовуваному в даному описі розумінні стосується модулятора, який при контакті з молекулою, що представляє інтерес, викликає збільшення значення визначеної 20 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активності або функції молекули в порівнянні зі значенням активності або функції, спостережуваним за відсутності агоніста. Конкретні агоністи, що представляють інтерес, можуть включати, без обмеження, поліпептиди IL-1α або поліпептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи або будь-які інші молекули, що зв'язуються з IL-1α. Термін "антагоніст" або "інгібітор" у використовуваному в даному описі розумінні стосується модулятора, який при контакті з молекулою, що представляє інтерес, викликає зменшення значення визначеної активності або функції молекули в порівнянні зі значенням активності або функції, спостережуваним за відсутності антагоніста. Конкретні антагоністи, що представляють інтерес, включають антагоністи, які блокують або модулюють біологічну або імунологічну активність IL-1α. Антагоністи й інгібітори IL-1α можуть включати, без обмеження, білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи або будь-які інші молекули, що зв'язуються з IL-1α. У використовуваному в даному описі розумінні термін "ефективна кількість" стосується кількості терапевтичного засобу, яка є достатньою для зменшення або ослаблення тяжкості і/або тривалості розладу або одного або декількох його симптомів, щоб запобігти прогресуванню розладу, викликати регресію розладу, запобігти рецидиву, розвитку, появі або прогресуванню одного або декількох симптомів, асоційованих з розладом, виявити розлад або підсилити або поліпшити профілактичний або терапевтичний ефект (ефекти) іншого терапевтичного засобу (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу). Термін "зразок" у використовуваному в даному описі розумінні застосовують у самому широкому розумінні. "Біологічний зразок" у використовуваному в даному описі розумінні включає, без обмеження, будь-яку кількість речовини з живого організму або організму, що раніше жив. Такі живі організми включають, без обмеження, людину, мишей, щурів, мавп, собак, кроликів і інших тварин. Такими речовинами, без обмеження, є кров, сироватка, сеча, синовіальна рідина, клітини, органи, тканини, кістковий мозок, лімфатичні вузли і селезінка. I. Антитіла, що зв'язують IL-1α людини Один аспект даного винаходу стосується ізольованих мишачих моноклональних антитіл або їх антигензв'язувальних частин, що зв'язуються з IL-1α з високою афінністю, повільною швидкістю розпаду комплексу і високою нейтралізуючою здатністю. Другий аспект винаходу стосується химерних антитіл, що зв'язують IL-1α. Третій аспект винаходу стосується CDRщеплених антитіл або їх антигензв'язувальних частин, що зв'язують IL-1α. Четвертий аспект винаходу стосується гуманізованих антитіл або їх антигензв'язувальних частин, що зв'язують IL1α. Переважно, антитіла або їх частини є ізольованими антитілами. Переважно антитіла за винаходом є нейтралізуючими анти-IL-1α-антитілами людини. A. Спосіб одержання анти-IL-1α-антитіл Антитіла за даним винаходом можуть бути одержані будь-яким з ряду способів, відомих у даній галузі. 1. Моноклональні анти-IL-1α-антитіла, одержані з використанням методики на основі гібридом Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням широкої множини способів, відомих у даній галузі, включаючи використання гібридом, способів рекомбінації і фагового дисплея або їх сполучення. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням методики гібридом, включаючи методики, відомі в даній галузі й описані, наприклад, у Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, nd 2 ed. 1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (зазначені публікації включені в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Термін "моноклональне антитіло" у використовуваному в даному описі розумінні не обмежений антитілами, одержаними з використанням методики гібридом. Термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, яке одержане з одного клону, включаючи будь-який еукаріотичний, прокаріотичний або фаговий клон, а не способу, яким воно одержане. Способи одержання і скринінгу специфічних антитіл з використанням методики гібридом є рутинними і добре відомі в даній галузі. В одному варіанті даний винахід стосується способів створення моноклональних антитіл, а також антитіл, одержаних способом, який включає культивування гібридомної клітини, секретуючої антитіло за винаходом, при цьому переважно гібридому, зокрема, створюють злиттям спленоцитів, виділених з організму миші, імунізованої антигеном за винаходом, із клітинами мієломи, і потім проводять скринінг гібридом, одержаних у результаті злиття, відносно клонів гібридом, що секретують антитіло, здатне зв'язувати поліпептид відповідно до винаходу. Коротко, миші можуть бути імунізовані антигеном IL-1α. У переважному варіанті антиген IL-1α вводять з ад'ювантом, щоб стимулювати імунну відповідь. Такі ад'юванти включають повний або неповний ад'ювант Фрейнда, RIBI (мурамілдипептиди) або ISCOM (імуностимулюючі комплекси). Такі ад'юванти можуть захищати поліпептид від 21 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 швидкого поширення завдяки утворенню комплексів у вигляді локального відкладення або вони можуть містити речовини, що стимулюють у хазяїна секрецію факторів, які є хемотаксичними для макрофагів і інших компонентів імунної системи. Переважно, якщо вводять поліпептид, то схема імунізації буде включати два або більше введень поліпептиду з інтервалами в декілька тижнів. Після імунізації тварини IL-1-антигеном від тварини можна одержати антитіла і/або клітини, що продукують антитіла. Сироватку, що містить анти-IL-1α-антитіла, одержують від тварини, використовуючи узяття крові або умертвіння тварини. Сироватку можна використовувати в тому вигляді, у якому вона одержана від тварини, із сироватки може бути одержана фракція імуноглобулінів або із сироватки можуть бути очищені анти-IL-1α-антитіла. Сироватка або імуноглобуліни, одержані таким чином, є поліклональними і тому мають гетерогенний набір властивостей. Після виявлення імунної відповіді, наприклад після виявлення антитіл, специфічних для антигену IL-1α, у сироватці мишей, збирають селезінки мишей і виділяють спленоцити. Потім спленоцити зливають добре відомими способами з будь-якими придатними клітинами мієломи, наприклад із клітинами з клітинної лінії SP20, доступної з ATCC. Гібридоми відбирають і клонують способом лімітуючого розведення. Потім клони гібридом аналізують способами, відомими в даній галузі, відносно клітин, що секретують антитіла, здатні зв'язувати IL-1α. Може бути одержана асцитна рідина, яка звичайно містить високі рівні антитіл, шляхом імунізації мишей позитивними клонами гібридом. В іншому варіанті імморталізовані гібридоми, продукуючі антитіла, можуть бути одержані від імунізованої тварини. Після імунізації тварину умертвляють, і B-клітини селезінки зливають з імморталізованими клітинами мієломи, що добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Harlow and Lane, вище). У переважному варіанті клітини мієломи не секретують поліпептиди імуноглобуліну (лінія несекретуючих клітин). Після злиття і селекції з використанням антибіотиків проводять скринінг гібридом, використовуючи IL-1α або його частину, або клітину, експресуючу IL-1α. У переважному варіанті початковий скринінг здійснюють, використовуючи твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) або радіоімуноаналіз (РІА), переважно ELISA. Зразковий скринінг на основі ELISA описаний у заявці WO 00/37504, включеній в даний опис у вигляді посилання. Гібридоми, продукуючі анти-IL-1α-антитіло, відбирають, клонують і піддають додатковому скринінгу відносно необхідних властивостей, включаючи сильний ріст гібридом, високу продукцію антитіл і необхідні характеристики антитіла, які додатково обговорюються нижче. Гібридоми можна культивувати і розмножуватиin vivo в сингенних тваринах, у тваринах, у яких відсутня імунна система, наприклад у мишей nude, або в культурі клітин in vitro. Способи відбору, клонування і розмноження гібридом добре відомі фахівцям у даній галузі. У переважному варіанті гібридоми являють собою мишачі гібридоми, які описані вище. В іншому переважному варіанті гібридоми одержують для виду, відмінного від людини і відмінного від миші, такого як щури, вівці, свині, кози, велика рогата худоба або коні. В іншому варіанті гібридоми являють собою гібридоми людини, у яких несекретуюча мієлома людини злита з клітиною людини, експресуючою анти-IL-1α-антитіло. Фрагменти антитіл, які упізнають специфічні епітопи, можуть бути створені відомими способами. Наприклад, Fab- і F(ab')2-фрагменти відповідно до винаходу можуть бути одержані протеолітичним розщепленням молекул імуноглобуліну з використанням таких ферментів, як папаїн (щоб одержати Fab-фрагменти) або пепсин (щоб одержати F(ab')2-фрагменти). F(ab')2фрагменти містять варіабельну область, константну область легкого ланцюга і домен CH1 важкого ланцюга. 2. Моноклональні анти-IL-1α-антитіла, одержані з використанням SLAM В іншому аспекті винаходу рекомбінантні антитіла одержують з окремих ізольованих лімфоцитів, використовуючи спосіб, який називається у даній галузі способом одержання антитіл з відібраних лімфоцитів (SLAM), що описаний у патенті США № 5627052, публікації PCT WO 92/02551 і в публікації Babcock J. S. et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848. У даному способі окремі клітини, секретуючі антитіла, що представляють інтерес, наприклад лімфоцити, одержані від однієї з імунізованих тварин, описаних у розділі 1, піддають скринінгу, використовуючи аналіз антигенспецифічних гемолітичних бляшок, у якому антиген IL-1α або його фрагмент зв'язують з еритроцитами барана, використовуючи лінкер, такий як біотин, і використовують для ідентифікації окремих клітин, які секретують антитіла, що мають специфічність відносно IL-1α. Після ідентифікації клітин, що представляють інтерес, секретуючих антитіла, кДНК варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів "рятують" із клітин за допомогою ПЛР зі зворотною транскриптазою, і такі варіабельні області потім можна 22 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 експресувати у контексті придатних константних областей імуноглобуліну (наприклад, константних областей людини) у клітинах-хазяїнах ссавців, таких як клітини COS або CHO. Клітини-хазяїни, трансфіковані ампліфікованими послідовностями імуноглобуліну, одержаними з відібраних in vivo лімфоцитів, потім можуть бути піддані додатковому аналізу і селекції in vitro, наприклад, за допомогою пенінгу трансфікованих клітин, для того, щоб виділити клітини, експресуючі антитіла до IL-1α. Ампліфіковані послідовності імуноглобуліну можуть бути додатково піддані обробці in vitro, наприклад, способами дозрівання афінності in vitro, такими як способи, описані в публікації PCT WO 97/29131 і публікації PCT WO 00/56772. 3. Моноклональні анти-IL-1α-антитіла, одержані з використанням трансгенних тварин В іншому варіанті здійснення даного винаходу антитіла одержують за допомогою імунізації тварини, відмінної від людини, що містить деякі або всі локуси імуноглобуліну людини, антигеном IL-1α. У переважному варіанті твариною, відмінною від людини, є трансгенна миша XENOMOUSE, сконструйована лінія мишей, що містять великі фрагменти локусів імуноглобулінів людини і є дефіцитними по продукції мишачих антитіл. Див., наприклад, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994) і патенти США № 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 і 6130364. Див. також WO 91/10741, опубліковану 25 липня 1991 р., WO 94/02602, опубліковану 3 лютого 1994 р., WO 96/34096 і WO 96/33735, опубліковані 31 жовтня 1996 р., WO 98/16654, опубліковану 23 квітня 1998 р., WO 98/24893, опубліковану 11 червня 1998 р., WO 98/50433, опубліковану 12 листопада 1998 р., WO 99/45031, опубліковану 10 вересня 1999 р., WO 99/53049, опубліковану 21 жовтня 1999 р., WO 00 09560, опубліковану 24 лютого 2000 р., і WO 00/037504, опубліковану 29 червня 2000 р. Трансгенна миша XENOMOUSE продукує репертуар повністю людських антитіл людини, подібний до репертуару дорослої людини, і продукує специфічні для антигену мАт людини. Трансгенна миша XENOMOUSE містить приблизно 80 % репертуару антитіл людини завдяки введенню YACфрагментів, що мають конфігурацію зародкової лінії, розміром у декілька мегабаз з локусів важкого ланцюга людини і локусів легкого ланцюга. Див. публікації Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998), зміст яких включений в даний опис у вигляді посилання. 4. Моноклональні анти-IL-1α-антитіла, одержані з використанням бібліотек рекомбінантних антитіл Способи in vitro також можна використовувати для одержання антитіл відповідно до винаходу, при цьому проводять скринінг бібліотеки антитіл, щоб ідентифікувати антитіло, яке має необхідну специфічність зв'язування. Способи такого скринінгу бібліотек рекомбінантних антитіл добре відомі в даній галузі і включають способи, описані, наприклад, Ladner зі співавторами в патенті США № 5223409, Kang зі співавторами в публікації PCT WO 92/18619; Dower зі співавторами в публікації PCT WO 91/17271; Winter зі співавторами в публікації PCT WO 92/20791; Markland зі співавторами в публікації PCT WO 92/15679; Breitling зі співавторами в публікації PCT WO 93/01288; McCafferty зі співавторами в публікації PCT WO PNAS 88:7978-7982, у публікації заявки на видачу патенту США № 20030186374 і публікації PCT № WO 97/29131, зміст кожної з публікацій включений в даний опис у вигляді посилання. Бібліотека рекомбінантних антитіл може бути одержана від суб'єкта, імунізованого IL-1α або частиною IL-1α. Альтернативно бібліотека рекомбінантних антитіл може бути одержана від нативного суб'єкта, тобто суб'єкта, що не був імунізований IL-1α, така як бібліотека антитіл людини, одержаних від людини, яка не була імунізована IL-1α людини. Антитіла відповідно до винаходу відбирають за допомогою скринінгу бібліотеки рекомбінантних антитіл з використанням пептиду, що містить IL-1α людини, щоб таким чином відібрати такі антитіла, які упізнають IL-1α. Способи проведення такого скринінгу і відбору добре відомі в даній галузі, такі як способи, описані в публікаціях, зазначених у попередньому абзаці. Щоб відібрати антитіла відповідно до винаходу, які мають конкретні афінності зв'язування з hIL-1α, наприклад антитіла, що дисоціюють з комплексу з IL-1α людини з конкретною константою швидкості k off, можна використовувати відомий у даній галузі спосіб резонансу поверхневого плазмону, щоб відібрати 23 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла, що мають необхідну константу швидкості k off. Щоб відібрати антитіла відповідно до винаходу, які мають конкретну нейтралізуючу активність відносно hIL-1α, такі як антитіла з конкретним значенням IC50, можна використовувати стандартні способи, відомі в даній галузі, для оцінки інгібування активності hIL-1α. В одному аспекті винахід стосується виділеного антитіла або його антигензв'язувальної частини, що зв'язує IL-1α людини. Переважно антитіло являє собою нейтралізуюче антитіло. У різних варіантах антитіло являє собою рекомбінантне антитіло або моноклональне антитіло. Наприклад, антитіла згідно з даним винаходом також можуть бути створені з використанням різних способів фагового дисплея, відомих у даній галузі. У способах фагового дисплея функціональні домени антитіл презентують на поверхні фагових частинок, які несуть полінуклеотидні послідовності, що кодують такі домени. Зокрема, такий фаг може бути використаний для презентації антигензв'язувальних доменів, експресованих з бібліотеки репертуару антитіл або комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людини або миші). Фаг, експресуючий антигензв'язувальний домен, який зв'язує антиген, що представляє інтерес, може бути відібраний або ідентифікований з використанням антигену, наприклад з використанням міченого антигену або антигену, зв'язаного або іммобілізованого на твердій поверхні або кульці. Фаг, використовуваний у таких способах, звичайно є нитчастим фагом, включаючи fd і M13, при цьому зв'язувальні домени, експресовані фагом, мають Fab-, Fv- або стабілізовані дисульфідом Fv-домени антитіл, рекомбінантно злиті з білком або фагового гена III, або фагового гена VIII. Приклади способів фагового дисплея, які можна використовувати для одержання антитіл згідно з даним винаходом, включають способи, описані в Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 4150 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994); у заявці PCT № PCT/GB91/01134; у публікаціях PCT WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 і в патентах США №№ 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 і 5969108; при цьому кожна з публікацій включена в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Як описано в зазначених вище публікаціях, після відбору фага області, що кодують антитіла, з фага можуть бути виділені і використані для створення цілих антитіл, антитіла людини, або будь-якого іншого необхідного антигензв'язувального фрагмента, і експресовані в будь-якому необхідному хазяїні, включаючи клітини ссавців, клітини комах, клітини рослин, дріжджі і бактерії, наприклад, як докладно описано нижче. Наприклад, методики одержання рекомбінантних Fab-, Fab’- і F(ab’)2-фрагментів також можна застосовувати з використанням способів, відомих у даній галузі, таких як способи, описані в публікації PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., AJRI 34: 26-34 (1995); і Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) (зазначені публікації включені в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Прикладами способів, які можна застосовувати для одержання одноланцюжкових Fv і антитіл, є способи, описані в патентах США №№ 4946778 і 5258498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); і Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988). Як альтернативу скринінгу рекомбінантних бібліотек антитіл на основі фагового дисплея можна застосовувати інші методики, відомі в даній галузі для скринінгу великих комбінаторних бібліотек, для ідентифікації антитіл з подвійною специфічністю відповідно до винаходу. Одним з типів альтернативної системи експресії є система, у якій бібліотеку рекомбінантних антитіл експресують у вигляді злиттів РНК-білок, як описано в публікації PCT WO 98/31700, Szostak і Roberts, і в публікації Roberts R.W. and Szostak J.W. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1229712302. У такій системі створюють ковалентне злиття між мРНК і пептидом або білком, який вона кодує, при трансляції in vitro синтетичних мРНК, що несуть пуроміцин, антибіотик, що є акцептором пептидилу, на своєму 3'-кінці. Таким чином, можна збагатити складну суміш мРНК (наприклад, у комбінаторній бібліотеці) популяцією специфічної мРНК на основі властивостей кодованого пептиду або білка, наприклад антитіла або його частини, таких як зв'язування антитіла або його частини з антигеном, що має подвійну специфічність. Послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують антитіла або їх частини, витягнуті в результаті скринінгу таких бібліотек, можуть бути експресовані з використанням основаних на рекомбінації способів, що описані вище (наприклад, у клітинах-хазяїнах ссавців), і, крім того, можуть бути піддані додатковому дозріванню афінності або в результаті додаткових раундів скринінгу злиттів мРНКпептид, у які були введені мутації в початково відібраній послідовності (послідовностях), або з використанням інших способів дозрівання афінності рекомбінантних антитіл in vitro, що описані вище. 24 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому способі антитіла згідно з даним винаходом також можуть бути створені з використанням способів дріжджового дисплея, відомих у даній галузі. У способах дріжджового дисплея застосовують генетичні способи, щоб зв'язати домени антитіл із клітинною стінкою дріжджів і презентувати їх на поверхні дріжджів. Зокрема, такі дріжджі можуть бути застосовні для дисплея антигензв'язувальних доменів, експресованих з бібліотеки репертуару антитіл або комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людини або миші). Прикладами способів дріжджового дисплея, які можна застосовувати для одержання антитіл згідно з даним винаходом, є способи, описані Wittrup зі співавторами в патенті США № 6699658, включеному в даний опис у вигляді посилання. B. Одержання рекомбінантних IL-1α-антитіл Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути одержані будь-яким з цілого ряду способів, відомих у даній галузі. Наприклад, експресією в клітинах-хазяїнах, при цьому клітину-хазяїна трансфікують експресуючим вектором(ами), що кодує важкий і легкий ланцюги, стандартними способами. Мається на увазі, що різні форми терміна "трансфекція" охоплюють широку множину способів, звичайно застосовуваних для введення екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, наприклад електропорацію, преципітацію фосфатом кальцію, трансфекцію з використанням DEAE-декстрану і тому подібні. Хоча можна експресувати антитіла відповідно до винаходу в будь-яких прокаріотичних або еукаріотичних клітинаххазяїнах, переважною є експресія антитіл у еукаріотичних клітинах і найбільш переважно в клітинах-хазяїнах ссавців, оскільки в таких еукаріотичних клітинах (і зокрема клітинах ссавців) більш імовірно, ніж у прокаріотичних клітинах, відбувається збирання і секреція підданого правильному фолдингу і імунологічно активного антитіла. Переважними клітинами-хазяїнами ссавців для експресії рекомбінантних антитіл відповідно до винаходу є клітини яєчника китайського хом'ячка (клітини CHO) (включаючи клітини dhfrCHO, описані в Urlaub and Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, використовувані із селектованим маркером DHFR, наприклад, як описано в Kaufman R.J. and Sharp P.A. (1982), Mol. Biol. 159: 601-621), клітини мієломи NS0, клітини COS і клітини SP2. Коли рекомбінантні експресуючі вектори, що кодують гени антитіл, вводять у клітини-хазяїни ссавців, антитіла одержують за допомогою культивування клітин-хазяїнів протягом періоду часу, достатнього для того, щоб забезпечити експресію антитіла в клітинах-хазяїнах або більш переважно секрецію антитіла в культуральне середовище, у якому клітини-хазяїни вирощують. Антитіла можуть бути витягнуті з культурального середовища з використанням стандартних способів очищення білка. Клітини-хазяїни також можна використовувати для одержання функціональних фрагментів антитіл, таких як Fab-фрагменти або молекули scFv. Буде зрозуміло, що зміни зазначеного вище способу входять в обсяг даного винаходу. Наприклад, може бути бажаною трансфекція клітини-хазяїна з використанням ДНК, що кодує функціональні фрагменти легкого ланцюга і/або важкого ланцюга антитіла згідно з даним винаходом. Також можна використовувати методику рекомбінантної ДНК для видалення деяких або всіх ДНК, що кодують будь-який або обидва легкий і важкий ланцюги, що не є необхідними для зв'язування з антигенами, що представляють інтерес. Молекули, експресовані з таких укорочених молекул ДНК, також належать до антитіл відповідно до винаходу. Крім того, можуть бути одержані біфункціональні антитіла, у яких один важкий й один легкий ланцюги представляють антитіло відповідно до винаходу, а інші важкий і легкий ланцюги специфічні для іншого антигену, відмінного від антигенів, що представляють інтерес, за допомогою поперечного зшивання антитіла відповідно до винаходу з другим антитілом стандартними хімічними способами поперечного зшивання. У переважній системі рекомбінантної експресії антитіла або його антигензв'язувальної частини відповідно до винаходу, рекомбінантний експресуючий вектор, що кодує і важкий ланцюг антитіла, і легкий ланцюг антитіла, вводять у клітини dhfr-CHO шляхом опосередкованої фосфатом кальцію трансфекції. У рекомбінантному експресуючому векторі гени важкого і легкого ланцюгів антитіла оперативно зв'язані з регуляторними елементами енхансером CMV/промотором AdMLP, щоб одержувати високі рівні транскрипції генів. Рекомбінантний експресуючий вектор також несе ген DHFR, що забезпечує можливість селекції клітин CHO, які були трансфіковані вектором, з використанням селекції/ампліфікації в присутності метотрексату. Відібрані трансформовані клітини-хазяїни культивують, забезпечуючи можливість експресії важкого і легкого ланцюгів антитіла, і інтактне антитіло витягають з культурального середовища. Використовують стандартні способи молекулярної біології для одержання рекомбінантного експресуючого вектора, трансфекції клітин-хазяїнів, селекції трансформантів, культивування клітин-хазяїнів і витягання антитіла з культурального середовища. Крім того, винахід стосується способу синтезу рекомбінантного антитіла відповідно до винаходу за 25 UA 102722 C2 5 допомогою культивування клітини-хазяїна відповідно до винаходу в придатному культуральному середовищі аж до синтезу рекомбінантного антитіла відповідно до винаходу. Крім того, спосіб може включати виділення рекомбінантного антитіла з культурального середовища. 1. Анти-IL-1α-антитіла У таблиці 5 наведений список амінокислотних послідовностей областей VH і VL переважних анти-IL-1α-антитіл відповідно до винаходу. 10 15 20 25 30 2. Химерні анти-IL-1α-антитіла Химерне антитіло являє собою молекулу, у якій різні частини антитіла одержані від різних видів тварин, таку як антитіла, що мають варіабельну область, одержану з мишачого моноклонального антитіла, і константну область імуноглобуліну людини. Способи одержання химерних антитіл відомі в даній галузі і докладно обговорюються в прикладі 2.1. Див., наприклад, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al. (1989), J. Immunol. Methods 125: 191-202; патенти США №№ 5807715, 4816567 і 4816397, що включені в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі. Крім того, можна використовувати способи, розроблені для одержання "химерних антитіл" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452454, публікації включені в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі) за допомогою сплайсингу генів молекули антитіла миші з відповідною антигенною специфічністю разом з генами молекули антитіла людини з відповідною біологічною активністю. 3. CDR-щеплені анти-IL-1α-антитіла CDR-щеплені антитіла відповідно до винаходу містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів антитіла людини, у яких одна або декілька областей CDR VH і/або VL замінені послідовностями CDR мишачих антитіл відповідно до винаходу. Каркасна послідовність будь-якого антитіла людини може служити як матриця для щеплення CDR. Однак заміна прямого ланцюгав такому каркасі часто приводить до деякої втрати афінності зв'язування з антигеном. Чим більше гомологія антитіла людини з вихідним мишачим антитілом, тим менш імовірно, що комбінування мишачих CDR з каркасом людини буде вносити перекручування в CDR, що можуть зменшувати афінність. Тому переважно, щоб варіабельні області каркаса людини, які вибирають для заміни варіабельними областями мишачого каркаса, 26 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 крім CDR мали щонайменше 65 % ідентичність послідовності з варіабельною областю каркаса мишачого антитіла. Більш переважно, щоб варіабельні області людини і миші крім CDR мали щонайменше 70 % ідентичність послідовностей. Ще більш переважно, щоб варіабельні області людини і миші крім CDR мали щонайменше 75 % ідентичність послідовностей. Найбільше переважно, щоб варіабельні області миші і людини крім CDR мали щонайменше 80 % ідентичність послідовностей. Способи одержання химерних антитіл відомі в даній галузі і докладно обговорюються в прикладі 2.2 (також див. EP 239400; публікацію PCT WO 91/09967; патенти США №№ 5225539, 5530101 і 5585089), "облицювання" і "зміна поверхні" (EP 592106, EP 519596, Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91: 969-973 (1994)), і перетасування ланцюгів (патент США № 5565352). 4. Гуманізовані анти-IL-1α-антитіла Гуманізовані антитіла являють собою молекули антитіл, одержані з антитіла виду тварини, відмінного від людини, що зв'язує необхідний антиген, які мають одну або декілька областей, що визначають комплементарність (CDR), виду тварини, відмінного від людини, і каркасні області з молекули імуноглобуліну людини. Відомі послідовності Ig людини описані, наприклад, у кожна публікація включена в даний опис у вигляді посилання. Такі імпортовані послідовності можна використовувати для зменшення імуногенності або зменшення, посилення або модифікації зв'язування, афінності, швидкості утворення комплексу, швидкості розпаду комплексу, авідності, специфічності, часу напівжиття або будь-яких інших придатних властивостей, що відомі в даній галузі. Каркасні залишки в каркасних областях людини можуть бути замінені відповідним залишком з антитіла-донора CDR, щоб змінити, переважно поліпшити, зв'язування антигену. Такі заміни в каркасі ідентифікують способами, добре відомими в даній галузі, наприклад, за допомогою моделювання взаємодій CDR і каркасних залишків, щоб ідентифікувати каркасні залишки, 27 UA 102722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 важливі для зв'язування антигену, і порівнянням послідовностей, щоб ідентифікувати незвичайні каркасні залишки в конкретних положеннях (див., наприклад, публікації Queen зі співавторами, патент США № 5585089, Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), що включені в даний опис у вигляді посилання в повному обсязі). Тривимірні моделі імуноглобулінів загальнодоступні і відомі фахівцям у даній галузі. Доступні комп'ютерні програми, що ілюструють і показують можливі тривимірні конформаційні структури вибраних послідовностей імуноглобулінів. Перегляд таких зображень дозволяє проаналізувати ймовірну роль залишків у функціонуванні вибраної для дослідження послідовності імуноглобуліну, тобто провести аналіз залишків, що впливають на здатність вибраного для дослідження імуноглобуліну зв'язувати його антиген. Таким чином, можна вибирати і комбінувати залишки FR з консенсусних і імпортованих послідовностей, так щоб досягти необхідної властивості антитіла, такої як підвищена афінність відносно антигену-мішені (антигенів-мішеней). Загалом, залишки CDR безпосередньо і найбільш значимо впливають на зв'язування антигену. Антитіла можуть бути гуманізовані з використанням різних способів, відомих у даній галузі, таких як, без обмеження, способи, описані в Jones et al., у публікації PCT WO 91/09967, PCT: US 98/16280, US 96/18978, US 91/09630, US 91/05939, US 94/01234, GB 89/01334, GB 91/01134, GB 92/01755; WO 90/14443, WO 90/14424, WO 90/14430, EP 229246, EP 592106; EP 519596, EP 239400, у патентах США №№ 5565332, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567; кожна з публікацій включена в даний опис у вигляді посилання, цитованого в даному описі. C. Одержання антитіл і продукуючих антитіла клітинних ліній Переважно анти-IL-1α-антитіла згідно з даним винаходом виявляють високу здатність знижувати або нейтралізувати активність IL-1α, наприклад, судячи з оцінки будь-яким з декількох аналізів in vitro і in vivo, відомих у даній галузі. Переважно анти-IL-1α-антитіла згідно з даним винаходом також виявляють високу здатність знижувати або нейтралізувати активність IL-1α. У переважних варіантах ізольоване антитіло або його антигензв'язувальна частина зв'язує IL-1α людини, при цьому антитіло або його антигензв'язувальна частина дисоціює з комплексу з -1 IL-1α людини з константою швидкості k off, що складає приблизно 0,1 сек. або менше, судячи з визначення на основі резонансу поверхневого плазмону, або інгібує активність IL-1α людини з -6 IC50 приблизно 1×10 М або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати з комплексу з IL-1α людини з константою швидкості k off, що складає -2 -1 приблизно 1×10 сек. або менше, судячи з визначення на основі резонансу поверхневого -7 плазмону, або може інгібувати активність IL-1α людини з IC50 приблизно 1×10 М або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати з комплексу з -3 -1 IL-1α людини з константою швидкості k off, що складає приблизно 1×10 сек. або менше, судячи з визначення на основі резонансу поверхневого плазмону, або може інгібувати IL-1α людини з -8 IC50 приблизно 1×10 М або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати з комплексу з IL-1α людини з константою швидкості k off, що складає -4 -1 приблизно 1×10 сек. або менше, судячи з визначення на основі резонансу поверхневого -9 плазмону, або може інгібувати активність IL-1α з IC50 приблизно 1×10 М або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати з комплексу з -5 -1 IL-1α людини з константою швидкості k off, що складає приблизно 1×10 сек. або менше, судячи з визначення резонансу поверхневого плазмону, або може інгібувати активність IL-1α з IC50 -10 приблизно 1×10 М або менше. Альтернативно, антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати з комплексу з IL-1α людини з константою швидкості k off, що складає -5 -1 приблизно 1×10 сек. або менше, судячи з визначення на основі резонансу поверхневого -11 плазмону, або може інгібувати активність IL-1α людини з IC50 приблизно 1×10 М або менше. У деяких варіантах антитіло містить константну область важкого ланцюга, таку як константна область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD. Переважно константною областю важкого ланцюга є константна область важкого ланцюга IgG1 або константна область важкого ланцюга IgG4. Крім того, антитіло може містити константну область легкого ланцюга 28