Зшиваючі реагенти та їх застосування

Реферат: Винахід стосується заряджених зшиваючих реагентів або їх попередників, кон'югатів клітинозв'язувальних речовин з лікарськими препаратами, які містять заряджені лінкери або пролінкери, і способів їх отримання. UA 113830 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід має відношення до синтезу нових заряджених зшиваючих реагентів (crosslinkers) і таких зшиваючих реагентів, які можуть бути підданими обробці в клітинах мішені з утворенням заряджених молекул. Даний винахід також стосується способів отримання кон’югатів клітинозв’язувальних речовин з лікарськими препаратами, які передбачають модифікування клітинозв’язувальних речовин цими зшиваючими реагентами з подальшою реакцією з препаратами або модифікування лікарських препаратів цими зшиваючими реагентами з подальшою реакцією з клітинозв’язувальними речовинами. Покращений спосіб отримання кон’югатів забезпечує можливість приєднання більшого числа молекул препарату до клітинозв’язувальної речовини, що призводить до більшої активності і надає кон’югатам більшої водорозчинності. Рівень техніки Біфункціональний модифікуючий реагент N-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо) пропіонат (SPDP) застосовується для сполуки двох білків через дисульфідний зв'язок. Реагент вступає в реакцію з першим білком і вводить активну групу, яка містить дисульфід, на стадії модифікації. Потім надається другий білок, який містить вільну тіолову групу, утворюючи дисульфідний зв'язок між двома білками на стадії кон’югації. Описано багато похідних SPDP і імідних версій SPDP (U.S. Patent 4,563,304; Carlsson J. et al., 173 Biochem. J. 723-737 (1978); Goff D.A. and Carroll S.F., 1 BioConjugate Chem. 381-386 (1990); Delprino L. et al., 82 J. Pharm. Sci. 506-512 (1993); Arpicco S. et al., 8 BioConjugate Chem 327-337 (1997)). Були описані кон’югати клітинозв’язувальних речовин з високоцитотоксичними препаратами (U.S. Patent Nos. 5,208,020, 5,416,064, 5,475,092, 5,585,499, 6,436,931, 6,372,738 and 6,340,701; Chari R.V.J. et al., 52 Cancer Res. 127-131 (1992)). У цих кон’югатів спочатку проводиться модифікація клітинозв’язувальної речовини за допомогою біфункціонального реагенту типу SPDP, SPP або SMCC для введення активного дисульфідного або малеімідного угрупування. А реакція з цитотоксичним лікарським препаратом, який містить тіол, дає кон’югат, в якому клітинозв’язувальна речовина типу моноклонального антитіла і лікарський препарат з'єднуються через дисульфідні зв'язки або тіоефірні зв'язки. Були описані гетеробіфункціональні зшиваючі реагенти, які містять нітропіридилтіо-, N,Nдиалкілкарбоксамідопіридилтіоабо ди-(N,N-диалкілкарбоксамідо) піридилтіогрупу і реакційноздатну ефірну групу карбонової кислоти типу складноефірної групи N-сукцинімідилу або N-сульфосукцинімідилу (U.S. Patent No. 6,913,748). Стверджується, що присутність Nсульфосукцинімідильної групи надає цим зшиваючим реагентам більшої водорозчинності. Проте, як тільки клітинозв’язувальна речовина прореагує з цими зшиваючими реагентами, Nсульфосукцинімідильна група витісняється, і перевага в розчинності втрачається, як у модифікованої клітинозв’язувальної речовини, так і у її кон’югата з лікарським препаратом. Оскільки цитотоксичні лікарські препарати, які використовуються в кон’югатах клітинозв’язувальних речовин з препаратами, часто є вельми важкорозчинними у водних розчинах, то буває важко приєднати достатнє число молекул препарату до клітинозв’язувальної речовини і при цьому зберегти водорозчинність. Крім того, реакції доводиться проводити в розбавлених розчинах, що є незручним для розширення виробництва внаслідок необхідності використовувати великі об'єми розчину. Сутність винаходу Даним винаходом запропоновані заряджені зшиваючі реагенти (лінкери), у яких заряд зберігається як після модифікації клітинозв’язувальної речовини, так і в кон’югаті, який утворюється з лікарським препаратом. Зокрема, даний винахід стосується застосування заряджених лінкерів для сполуки препаратів з клітинозв’язувальною речовиною (напр., антитілом). У одному аспекті винаходу заряджені лінкери застосовуються для модифікації клітинозв’язувальних речовин і сполуки їх з препаратами. У іншому аспекті винаходу заряджені лінкери застосовуються для модифікації лікарських препаратів і сполуки їх з клітинозв’язувальними речовинами. У наступному аспекті винаходу заряджені лінкери застосовуються для одночасного сполуки лікарських препаратів з клітинозв’язувальними речовинами. У всіх випадках бажаним кінцевим результатом є кон’югат типу препаратc заряженний лінкер-клітинозв’язувальна речовина, який можна представити формулою CB-(-L c D)q, де CB позначає клітинозв’язувальну речовину, L – заряджений лінкер, D – молекула препарату, а q – ціле число від 1 до 20. Наявність заряджених груп у лінкера в кон’югаті клітинозв’язувальної речовини з лікарським препаратом дає ряд переваг, як то i) більшу водорозчинність кінцевого продукту, ii) можливість працювати за вищої концентрації у водних розчинах, iii) можливість приєднати більше число молекул препарату до однієї молекули клітинозв’язувальної речовини, що призводить до більшої активності, iv) можливість для 1 UA 113830 C2 5 10 зарядженого кон’югата зберігатися усередині клітин мішені, що веде до більшої активності, і v) поліпшення чутливості клітин з множинною лікарською стійкістю, які не зможуть виводити заряджені молекули препарату з клітини. У винаході також описані лінкери, які можна кон’югувати з лікарським препаратом і клітинозв’язувальною речовиною і отримати кон’югат, який може бути піддано метаболізму в клітині з утворенням метаболіту, який несе препарат, і містить одне або декілька заряджених угрупувань. Такі лінкери надалі іменуються попередниками заряджених лінкерів (пролінкерами). Ті угрупування лінкера, які стануть зарядженими після клітинної обробки, надалі іменуються попередниками заряджених угрупувань. У одному аспекті даного винаходу заряджений зшиваючий реагент або попередник зарядженого лінкера представлені формулою (I), в якій Y' може реагувати з клітинозв’язувальною речовиною, а Q може реагувати з цитотоксичним лікарським препаратом: R7 R8 R3 R4 Z Y' l m R9 R10 R5R6 15 20 25 30 35 40 45 Ag n Q R1 R2 (I) де: Y' позначає функціональну групу, яка зумовлює можливість реакції з клітинозв’язувальною речовиною; Q позначає функціональну групу, яка зумовлює можливість приєднання цитотоксичного лікарського препарату через дисульфідний, тіоефірний, складнотіоефірний, пептидний, гідразоновий, ефірний, складноефірний, карбаматний або амідний зв'язок; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є однаковими або різними і позначають H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкиніл, який містить 2-6 атомів 2222вуглецю, аніони типу SO3 , X-SO3 , OPO3 , X-OPO3 , PO3 , X-PO3 , CO2 , катіони типу + + азотовмісних гетероциклічних сполук N R11R12R13 або X-N R11R12R13, або феніл, причому: R11, R12 і R13 є однаковими або різними і означають H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, а X позначає феніл або лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю; l, m і n дорівнюють 0 або цілому числу від 1 до 4; A позначає феніл або заміщений феніл, причому замісником є лінійний алкіл, який містить 16 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, або ж 2222заряджений замісник, вибраний з аніонів типу SO3 , X-SO3 , OPO3 , X-OPO3 , PO3 , X-PO3 , CO2 + + і катіонів типу азотовмісних гетероциклічних сполук N R11R12R13 або X-N R11R12R13, де X має ті ж значення, що і вище, а g = 0 або 1; Z позначає необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000, або ланку F1-E1-P-E2-F2, в якій E1 і E2 є однаковими або різними і позначають C=O, O або NR14, де R14 позначає H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкиніл, який містить 2-6 атомів вуглецю; P позначає пептидну ланку завдовжки від 2 до 20 амінокислот, причому E1 або E2 може з'єднуватися з пептидом через кінцевий азот, кінцевий вуглець або через бічний ланцюг однієї з амінокислот пептиду; а F1 і F2 є однаковими або різними і означають необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000, за умови, що якщо Z не є F1-E1-P-E2-F2, то щонайменше один з R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є зарядженим замісником, а якщо g = 1, то щонайменше один з A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є зарядженим замісником. У іншому аспекті даного винаходу передбачений кон’югат клітинозв’язувальної речовини з лікарським препаратом формули (II), в якому клітинозв’язувальна речовина CB і препарат D прореагували на двох кінцях зарядженого зшиваючого реагенту або його попередника: 2 UA 113830 C2 R7 R8 CB R3 Z Y l m 10 15 20 25 30 35 R1 D R2 q (II) де: CB позначає клітинозв’язувальну речовину; D позначає лікарський препарат, сполучений з клітинозв’язувальною речовиною дисульфідним, тіоефірним, складнотіоефірним, пептидним, гідразоновим, ефірним, складноефірним, карбаматним або амідним зв'язком; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є однаковими або різними і позначають H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкиніл, який містить 2-6 атомів 2222вуглецю, аніони типу SO3 , X-SO3 , OPO3 , X-OPO3 , PO3 , X-PO3 , CO2 , катіони типу + + азотовмісних гетероциклічних сполук N R11R12R13 або X-N R11R12R13, або феніл, причому: R11, R12 і R13 є однаковими або різними і позначають H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, а X позначає феніл або лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю; l, m і n дорівнюють 0 або цілому числу від 1 до 4; A позначає феніл або заміщений феніл, причому замісником є лінійний алкіл, який містить 16 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, або ж 2222заряджений замісник, вибраний з аніонів типу SO3 , X-SO3 , OPO3 , X-OPO3 , PO3 , X-PO3 , CO2 + + і катіонів типу азотовмісних гетероциклічних сполук N R11R12R13 або X-N R11R12R13, де X має ті ж значення, що і вище, а g = 0 або 1; Z позначає необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000, або ланку F1-E1-P-E2-F2, в якій E1 і E2 є однаковими або різними і означають C=O, O або NR14, де R14 позначає H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкиніл, який містить 2-6 атомів вуглецю; P позначає пептидну ланку завдовжки від 2 до 20 амінокислот, причому E1 або E2 може з'єднуватися з пептидом через кінцевий азот, кінцевий вуглець або через бічний ланцюг однієї з амінокислот пептиду; а F1 і F2 є однаковими або різними і означають необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000, за умови, що якщо Z не F1-E1-P-E2-F2, то щонайменше один з R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є зарядженим замісником, а якщо g = 1, то щонайменше один з A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є зарядженим замісником; Y позначає карбонільну, тіоефірну, амідну, дисульфідну або гідразонову групу; а q позначає ціле число від 1 до 20. У наступному аспекті даного винаходу запропонована модифікована клітинозв’язувальна речовина формули (III), в якій клітинозв’язувальна речовина CB прореагувала із зшиваючим реагентом, який все ще містить групу Q, здатну реагувати з цитотоксичним лікарським препаратом: R7 R8 CB R3 R4 Z Y l m R9 R10 R5R6 40 n Ag R9 R10 R5R6 5 R4 n Ag R1 Q R2 q (III) де замісники вже визначені вище. У наступному аспекті даного винаходу передбачений модифікований лікарський препарат формули (IV), в якому препарат D прореагував із зшиваючим реагентом, який все ще містить групу Y', здатну реагувати з клітинозв’язувальною речовиною: 3 UA 113830 C2 R7 R8 R3 R4 Y' Z l m R9 R10 R5 R6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ag n D R1 R2 (IV) де замісники вже визначені вище. Далі даний винахід стосується способу отримання кон’югата клітинозв’язувальної речовини з лікарським препаратом формули (II), в якому препарат з'єднується з клітинозв’язувальною речовиною через заряджений лінкер або пролінкер. Даний винахід також стосується способу отримання модифікованої клітинозв’язувальної речовини формули (III), в якій клітинозв’язувальна речовина піддається реакції із зарядженим лінкером або пролінкером. Даний винахід також стосується способу отримання модифікованого лікарського препарату формули (IV), в якому лікарський препарат піддається реакції із зарядженим лінкером або пролінкером. Даний винахід охоплює і композиції (напр., фармацевтичні композиції), включаючи кон’югати або їх похідні (і/або їх сольвати, гідрати і/або солі) і носій (фармацевтично прийнятний носій). Даний винахід також охоплює композиції (напр., фармацевтичні композиції), включаючи кон’югати або їх похідні (і/або їх сольвати, гідрати і/або солі) і носій (фармацевтично прийнятний носій), які додатково містять другий терапевтичний засіб. Дані композиції можуть бути застосовані для інгібірування аномального росту клітин або лікування проліферативних захворювань у ссавців (напр., людини). Даний винахід охоплює і спосіб інгібірування аномального росту клітин або лікування проліферативних захворювань у ссавців (напр., людини), який передбачає введення даному ссавцеві терапевтично ефективної кількості кон’югатів або їх похідних (і/або їх сольватів і солей) або композиції, яка їх містить, окремо або в комбінації з іншим терапевтичним засобом. Сполуки даного винаходу, їх похідні або їх кон’югати, а також композиції, які їх містять, придатні для лікування або зменшення тяжкості таких захворювань, які характеризуються аномальним ростом клітин (напр., раки). Інші застосування сполук або кон’югатів даного винаходу включають лікування остеопорозу, депресії, тривоги, стресу, фобій, паніки, дисфорії, психіатричних захворювань і болю, або як протиепілептичні, антибактеріальні засоби, діуретики, гіпотензивні, гіполіпідемічні засоби і антидепресанти. Короткий опис креслень На Фіг. 1 представлений синтез сульфованих зшиваючих реагентів, які містять нітропіридилдисульфідну групу і реакційноздатну ефірну групу. Спочатку складні ефіри гідроксиалканоатів перетворюються на складні ефіри дибромалканоатів, як показано, після чого відбувається перетворення α-бромзаміщеної сполуки на сульфонову кислоту. На Фіг. 2 представлений синтез сульфованих зшиваючих реагентів, які містять піридилдисульфідну групу і реакційноздатну ефірну групу. На Фіг. 3, 4 і 5 представлені різні шляхи синтезу заряджених зшиваючих реагентів, які несуть, реакційноздатну, ефірну групу і малеімідний замісник, який сприяє приєднанню через тіоефірні зв'язки. На Фіг. 6 і 7 представлений синтез фосфатованих зшиваючих реагентів, які містять піридилдисульфідну групу і реакційноздатну ефірну групу. На Фіг. 8 представлений синтез фосфатованих зшиваючих реагентів, які містять нітропіридилдисульфідну групу і реакційноздатну ефірну групу. На Фіг. 9 і 10 представлені різні шляхи синтезу фосфатованих заряджених зшиваючих реагентів, які несуть, реакційноздатну, ефірну групу і малеімідний замісник, який сприяє приєднанню через тіоефірні зв'язки. На Фіг. 11 представлений синтез сульфованих зшиваючих реагентів, при якому сульфозамісник приєднується через розгалужену алкільну групу. Ці реагенти також містять піридилдисульфідну групу і реакційноздатну ефірну групу. На Фіг. 12 представлений синтез сульфованих зшиваючих реагентів, при якому сульфозамісник приєднується через розгалужену алкільну групу. Ці реагенти також містять реакційноздатну ефірну групу і малеімідну групу, яка сприяє приєднанню через тіоефірні зв'язки. 4 UA 113830 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фіг. 13 представлений синтез зшиваючих реагентів, які містять четвертинний амін, і які несуть піридилдисульфідну групу і реакційноздатну ефірну групу. На Фіг. 14 представлений синтез зшиваючих реагентів, які містять четвертинний амін, які несуть, реакційноздатну ефірну групу і малеімідний замісник, який сприяє приєднанню через тіоефірні зв'язки. На Фіг. 15 представлений синтез сульфованих зшиваючих реагентів, які містять піридилдисульфідну групу і реакційноздатну ефірну групу. У цих сполуках сульфозамісник знаходиться на атомі вуглецю в β-положенні відносно ефірної групи. На Фіг. 16 представлений синтез фосфатованих зшиваючих реагентів, які містять піридилдисульфідну групу і реакційноздатну ефірну групу. У цих сполуках фосфатний замісник знаходиться в β-положенні відносно ефірної групи. На Фіг. 17, 18 і 19 представлений синтез різних сульфованих зшиваючих реагентів, які містять ланцюг поліетиленгліколю (PEG) разом з нітропіридилдисульфідною групою і реакційноздатною ефірною групою. На Фіг. 20 і 21 представлений синтез різних сульфованих зшиваючих реагентів, які містять ланцюг поліетиленгліколю (PEG) разом з малеімідною групою і реакційноздатною ефірною групою. На Фіг. 22 представлений синтез фосфатованих зшиваючих реагентів, при якому фосфатний замісник приєднується через ароматичну групу. Ці реагенти також несуть реакційноздатну ефірну групу і нітропіридилдитіогрупу, яка сприяє приєднанню через дисульфідні зв'язки. На Фіг. 23 представлений синтез фосфатованих зшиваючих реагентів, при якому фосфатний замісник приєднується через розгалужену алкільну групу. Ці реагенти також несуть реакційноздатну ефірну групу і нітропіридилдитіогрупу, яка сприяє приєднанню через дисульфідні зв'язки. На Фіг. 24-31 представлений синтез сульфованих зшиваючих реагентів, які також включають гідразидну групу, яка сприяє приєднанню через кислотолабільні зв'язки. На Фіг. 32-36 представлений синтез фосфатованих зшиваючих реагентів, які також включають гідразидну групу, яка сприяє приєднанню через кислотолабільні зв'язки. На Фіг. 37-38 представлений синтез зшиваючих реагентів, які містять четвертинний амін, які також несуть гідразидну групу, яка сприяє приєднанню через кислотолабільні зв'язки. На Фіг. 39-42 представлений синтез заряджених зшиваючих реагентів, які також включають групу поліетиленггліколю (PEG). На Фіг. 43-44 представлений синтез фосфатованих зшиваючих реагентів, при якому фосфатний замісник приєднується через ароматичне кільце або через алкільну групу. Ці реагенти також несуть реакційноздатну ефірну групу і нітропіридилдитіогрупу, яка сприяє приєднанню через дисульфідні зв'язки. На Фіг. 45-49 представлений синтез заряджених зшиваючих реагентів, які несуть, реакційноздатну ефірну групу і галоацетильний замісник, який сприяє приєднанню через тіоефірні зв'язки. На Фіг. 50 представлений синтез попередника зарядженого лінкера, який генеруватиме метаболіт з негативно зарядженим карбоксилатом. На Фіг. 51 представлений кон’югат лінкера 158 з лікарським препаратом і моноклональним антитілом і те, як цей кон’югат піддаватиметься обробці в лізосомах клітин мішені з утворенням метаболіту, який містить препарат, що несе негативно заряджений карбоксилат. На Фіг. 52 представлений синтез попередника зарядженого лінкера, який генеруватиме метаболіт, який містить позитивно заряджений амін. На Фіг. 53 представлений кон’югат зарядженого пролінкера з лікарським препаратом і моноклональним антитілом і те, як цей кон’югат піддаватиметься обробці в лізосомах клітин мішені з утворенням метаболіта, який містить препарат, що несе позитивно заряджений амін. На Фіг. 54 представлений синтез попередника зарядженого лінкера, який генеруватиме метаболіт із зарядженим карбоксилатом. На Фіг. 55 представлений кон’югат лінкера 172 з лікарським препаратом і моноклональним антитілом і те, як цей кон’югат піддаватиметься обробці в лізосомах клітин мішені з утворенням метаболіта, який містить препарат, що несе карбонову кислоту і залишок лізину. На Фіг. 56 представлено застосування зарядженого лінкера при модифікації клітинозв’язувальної речовини і отриманні кон’югата препарат-клітинозв’язувальна речовина, який несе заряджений лінкер. На Фіг. 57(A), (B) і (C) представлена активність in vitro кон’югатів препаратклітинозв’язувальна речовина, в яких включений заряджений лінкер. 5 UA 113830 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фіг. 58 представлена активність in vitro і вибірковість щодо мішені кон’югатів препаратклітинозв’язувальна речовина, які несуть заряджений лінкер. На Фіг. 59 представлений мас спектр кон’югатів препарат-клітинозв’язувальна речовина, які несуть заряджений лінкер. На Фіг. 60 представлена цитотоксичність кон’югатів анти-CanAg (huC242) -сульфонатний лінкер-майтансиноїд при зростанні частки майтансиноїдів (E:A) для клітин COLO205. На Фіг. 61 представлена цитотоксичність кон’югатів анти-CanAg (huC242) -сульфонатний лінкер-майтансиноїд при зростанні частки майтансиноїдів (E:A) для клітин COLO205-MDR з множинною лікарською стійкістю. На Фіг. 62 представлено порівняння цитотоксичності кон’югатів анти-CanAg (huC242) майтансиноїд з сульфогрупою в лінкері або без неї для клітин COLO205-MDR з множинною лікарською стійкістю. На Фіг. 63 представлено порівняння цитотоксичності кон’югатів анти-EpCAM (B38.1) майтансиноїд з сульфогрупою в лінкері або без неї для клітин COLO205-MDR з множинною лікарською стійкістю. На Фіг. 64 представлено порівняння цитотоксичності кон’югатів анти-EpCAM (B38.1) майтансиноїд з сульфогрупою в лінкері або без неї для клітин HCT15 з множинною лікарською стійкістю. На Фіг. 65 представлено порівняння цитотоксичності кон’югатів анти-EpCAM (B38.1) майтансиноїд з сульфогрупою в лінкері або без неї для клітин COLO205-MDR з множинною лікарською стійкістю. На Фіг. 66 представлена протипухлинна активність in vivo кон’югатів антитіло проти EpCAMмайтансиноїд на ксенотрансплантати COLO205 mdr (індивідуальні пухлини). На Фіг. 67 представлена протипухлинна активність in vivo кон’югатів антитіло проти EpCAMмайтансиноїд на ксенотрансплантати COLO205 (індивідуальні пухлини). На Фіг. 68-70 представлені способи синтезу сульфованих зшиваючих реагентів. Ці реагенти містять реакційноздатну ефірну групу і малеімідну групу, яка сприяє приєднанню через тіоефірні зв'язки. На Фіг. 71 представлені способи синтезу зшиваючих реагентів, які містять четвертинний амін. Ці реагенти також несуть реакційноздатну ефірну групу і піридилдитіогрупу, яка сприяє приєднанню через дисульфідні зв'язки. На Фіг. 72(A) і (B) представлена фармакокінетика в плазмі кон’югатів антитіло huC2423 сульфо-Mal-[ H-мічений] DM4 при 3,5 DM4/Ab або 6,4 DM4/Ab в дозах 12,9 міліграм/кг і 7,9 міліграм/кг (i.v.), відповідно, у мишей CD-1. A. Концентрація Ab (при вимірюванні методом ELISA 3 або методом H-радіометрії) залежно від часу після введення. B. Співвідношення майтансиноїд (DM4) /антитіло (Ab) залежно від часу після введення. На Фіг. 1-71, де це може бути застосованим, n позначає 0 або ціле число від 1 до 10, а m позначає 0 або ціле число від 1 до 2000. Здійснення винаходу У нових кон’югатах, розкритих у даному винаході, застосовуються заряджені зшиваючі реагенти або їх попередники. Приклади деяких відповідних зшиваючих реагентів та їх синтезу представлені на Фіг. 1-10. Переважно заряджені зшиваючі реагенти або їх попередники містять такі замісники, як сульфогрупа, фосфатна група, карбоксил або четвертинна аміногрупа, які істотно підвищують розчинність модифікованої клітинозв’язувальної речовини і кон’югатів клітинозв’язувальної речовини з лікарськими препаратами, особливо у кон’югатів моноклональне антитіло-препарат при співвідношенні від 2 до 20 молекул препарату на антитіло. Кон'югати, приготовані з лінкерів, які містять попередник зарядженої групи, утворюють одне або декілька заряджених угрупувань після того, як кон’югат піддасться метаболізму в клітині. Зшиваючі реагенти Шляхи синтезу для отримання заряджених зшиваючих реагентів даного винаходу представлені на Фіг. 1-49. Шляхи синтезу для отримання зшиваючих реагентів із зарядженими попередниками представлені на Фіг. 50, 52 і 54. На Фіг. 51, 53 і 55 представлені кон’югати кожного з відповідних попередників заряджених лінкерів з лікарським препаратом і моноклональним антитілом і те, як ці кон’югати піддаватимуться метаболізму в клітинах мішені з утворенням заряджених метаболітів. Зшиваючі реагенти мають три елементи: а) замісник, який або є зарядженим, або стане зарядженим при метаболізмі кон’югатів з цими лінкерами в клітинах. Заряд повинен бути або аніонним типу карбоксилату, сульфонату або фосфату, або катіонним типу третинного, четвертинного або первинного аміну або азотовмісного гетероциклу; b) групу типу складного ефіру N-гідроксисукциніміду, малеімідної групи, галоацетильної групи 6 UA 113830 C2 5 10 15 або гідразиду, здатну реагувати з клітинозв’язувальною речовиною; і с) групу типу дисульфідної, малеімідної, галоацетильної або гідразиду, здатну реагувати з лікарським препаратом. Заряджений замісник або його попередник може бути введений описаними у даному винаході способами. Наприклад, заряд сульфонату можна ввести спочатку шляхом обробки комерційно доступного складного галоефіру тіоацетатом, отримуючи тіоацетильну сполуку, а потім окислення тіоацетильної групи за допомогою перекису водню до сульфонатної групи. Фосфатовані зшиваючі реагенти можна синтезувати описаними в даному винаході способами. Спочатку вводиться потрібна реакційноздатна група типу тіолу, малеіміду, галоацетилу або гідразиду за допомогою реакцій, приведених на Фіг. 6-10, а потім проводиться гідроліз ефіру фосфату, отримуючи заряджений зшиваючий реагент, який несе фосфат. Позитивно заряджену заміщаючу групу четвертинного аміну можна ввести в зшиваючий реагент в результаті реакції аміну з α,β-ненасиченим кетоном (наприклад, див. Фіг. 13 і 37). Як альтернатива заряджену заміщаючу аміногрупу можна ввести шляхом заміщення галогену аміном або азотовмісною гетероциклічною сполукою. Переважно зшиваючими реагентами є сполуки нижчеприведеної формули (I): R7 R8 R3 R4 Z Y' l m R9 R10 R5R6 20 25 30 35 40 45 50 55 Ag n Q R1 R2 (I) де: Y' позначає функціональну групу, яка зумовлює можливість реакції з клітинозв’язувальною речовиною; Q позначає функціональну групу, яка зумовлює можливість приєднання цитотоксичного лікарського препарату через дисульфідний, тіоефірний, складнотіоефірний, пептидний, гідразоновий, ефірний, складноефірний, карбаматний або амідний зв'язок; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є однаковими або різними і означають H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкиніл, який містить 2-6 атомів 2222вуглецю, аніони типу SO3 , X-SO3 , OPO3 , X-OPO3 , PO3 , X-PO3 , CO2 , катіони типу + + азотовмісних гетероциклічних сполук N R11R12R13 або X-N R11R12R13, або феніл, причому: R11, R12 і R13 є однаковими або різними і означають H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, а X позначає феніл або лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю; l, m і n дорівнюють 0 або цілому числу від 1 до 4; A позначає феніл або заміщений феніл, причому замісником є лінійний алкіл, який містить 16 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, або ж 222зарядженого замісника, вибраного з поміж аніонів типу SO3 , X-SO3 , OPO3 , X-OPO3 , PO3 , X2+ + PO3 , CO2 і катіонів типу азотовмісних гетероциклічних сполук N R11R12R13 або X-N R11R12R13,де X має ті ж значення, що і вище, а g = 0 або 1; Z позначає необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000, або ланку F1-E1-P-E2-F2, в якій E1 і E2 є однаковими або різними і означають C=O, O або NR14, де R14 позначає H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкиніл, який містить 2-6 атомів вуглецю; P позначає пептидну ланку завдовжки від 2 до 20 амінокислот, причому E1 або E2 може з'єднуватися з пептидом через кінцевий азот, кінцевий вуглець або через бічний ланцюг однієї з амінокислот пептиду; а F1 і F2 є однаковими або різними і означають необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000, за умови, що якщо Z не F1-E1-P-E2-F2, то щонайменше один з R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є зарядженим замісником, а якщо g = 1, то щонайменше один з A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є зарядженим замісником. Приклади функціональної групи Y', яка зумовлює можливість реакції з клітинозв’язувальною речовиною, включають реагенти, які реагують з амінами, типу складних ефірів Nгідроксисукциніміду, n-нітрофенілу, динітрофенілу, пентафторфенілу; реагенти, які реагують з тіолами типу піридилдисульфідів, нітропіридилдисульфідів, малеімідів, галоацетатів і галоангідридів карбонових кислот. Приклади функціональної групи Q, яка зумовлює можливість приєднання цитотоксичного лікарського препарату, включають групи, які сприяють приєднанню через дисульфідний, 7 UA 113830 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 тіоефірний, складнотіоефірний, пептидний, гідразоновий, складноефірний або амідний зв'язок. До таких функціональних груп відносяться тіоли, дисульфіди, аміногрупи, карбоксигрупи, альдегідні, малеімідні, галоацетили, гідразини і гідроксили. Приклади лінійних алкілів включають метил, етил, пропіл, бутил, пентил і гексил. Приклади розгалужених або циклічних алкілів, які містять 3-6 атомів вуглецю, включають ізопропіл, вторбутил, ізобутил, трет-бутил, пентил, гексил, циклопропіл, циклобутил, циклопентил і циклогексил. Приклади лінійних алкенілів, які містять 2-6 атомів вуглецю, включають етеніл, пропеніл, бутеніл, пентеніл, гексеніл. Приклади розгалужених або циклічних алкенілів, які містять 2-6 атомів вуглецю, включають ізобутеніл, ізопентеніл, 2-метил-1-пентеніл, 2-метил-2-пентеніл. Приклади лінійних алкинілів, які містять 2-6 атомів вуглецю, включають етиніл, пропініл, бутиніл, пентиніл, гексиніл. Приклади розгалужених або циклічних алкинілів, які містять до 6 атомів вуглецю, включають 3-метил-1-бутиніл, 3-метил-1-пентиніл, 4-метил-2-гексиніл. У кращих втіленнях один з R1, R2, R3, R4, R9, R10 є зарядженим замісником з поміж сульфонату, фосфату або триалкіламонію, а всі решта – H; всі l, g і m = 0; n = 1; Q і Y', незалежно один від одного, означають заміщаючу групу дисульфіду, малеіміду, галоацетилу або складного ефіру N-гідроксисукциніміду. У кращому втіленні один з R1, R2, R3, R4, R9, R10 є сульфонатом, а всі решта – H; всі l, g і m = 0; n = 1; Q позначає групу дисульфіду, малеіміду або галоацетилу; а Y' позначає групу малеіміду або складного ефіру N-гідроксисукциніміду. У ще кращому втіленні один з поміж R1, R2, R3, R4, R9, R10 є сульфонатом, а всі решта – H; всі l, g і m = 0; n = 1; Q позначає піридилдитіо- або нітропіридилдитіогрупу, групу малеіміду або галоацетилу; а Y' – складного ефіру N-гідроксисукциніміду. Синтез зшиваючих реагентів формули (I), які містять 2-дитіонітропіридил і 2дитіодинітропіридил представлений, наприклад, на Фіг. 1 і 2, а синтез зшиваючих реагентів формули (I), які містять, відповідно, 4-дитіонітропіридил і 4-дитіодинітропіридил, представлений, наприклад, на Фіг. 6. Синтез заряджених зшиваючих реагентів формули (I) з сульфогрупою, які містять малеімід, представлений, наприклад, на Фіг. 3, 4 і 5. Синтез заряджених зшиваючих реагентів формули (I) з фосфатною групою, які містять малеімід, представлений, наприклад, на Фіг. 9 і 10. Синтез зшиваючих реагентів, які містять четвертинний амін формули (I) представлений, наприклад, на Фіг. 13 і 14. Синтез заряджених зшиваючих реагентів формули (I), які містять поліетиленгліколь, представлений, наприклад, на Фіг. 17-21. Синтез заряджених зшиваючих реагентів формули (I), що несуть групу гідразиду, яка сприяє приєднанню через кислотолабільні зв'язки, представлений, наприклад, на Фіг. 24-36. Кон'югати клітинозв’язувальних речовин з лікарськими препаратами За допомогою заряджених зшиваючих реагентів або попередників заряджених лінкерів можна вводити велике число (>6) молекул лікарського препарату. Як приклад на Фіг. 57 видно, що кон’югати клітинозв’язувальних речовин з препаратами, отримані за допомогою заряджених зшиваючих реагентів даного винаходу, проявляють високу активність. До того ж активність є вибірковою до мішені (наприклад, див. Фіг. 58), оскільки навіть після приєднання великого числа молекул препарату кон’югат проявляє високу активність у відношенні до клітин мішені, але набагато меншу активність у відношенні до клітин, які не відносяться до мішені. Як видно з Фіг. 59, мас-спектрометричний аналіз свідчить, що молекули препарату ковалентно з'єднуються з клітинозв’язувальною речовиною через заряджений лінкер. Кон'югати запропоновані даним винаходом можна представити наступною формулою: CB-(c c L -D)q, де CB позначає клітинозв’язувальну речовину, L – заряджений лінкер або пролінкер, D – молекула препарату, а q – ціле число від 1 до 20. Переважно кон’югати мають наступну формулу (II): R7 R8 CB R3 Z Y l m R9 R10 R5R6 50 R4 n Ag R1 D R2 q (II) де: CB позначає клітинозв’язувальну речовину; D позначає лікарський препарат, сполучений з клітинозв’язувальною речовиною дисульфідним, тіоефірним, складнотіоефірним, пептидним, гідразоновим, ефірним, складноефірним, карбаматним або амідним зв'язком; 8 UA 113830 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є однаковими або різними і означають H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкиніл, що містить 2-6 атомів 2222вуглецю, аніони типу SO3 , X-SO3 , OPO3 , X-OPO3 , PO3 , X-PO3 , CO2 катіони типу + + азотовмісних гетероциклічних сполук N R11R12R13 або X-N R11R12R13, або феніл, причому: R11, R12 і R13 є однаковими або різними і означають H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, а X позначає феніл або лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю; l, m і n дорівнюють 0 або цілому числу від 1 до 4; A позначає феніл або заміщений феніл, причому замісником є лінійний алкіл, який містить 16 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, або ж 222заряджений замісник, вибраний з поміж аніонів типу SO3 , X-SO3 , OPO3 , X-OPO3 , PO3 , X2+ + PO3 , CO2 і катіонів типу азотовмісних гетероциклічних сполук N R11R12R13 або X-N R11R12R13, де X має ті ж значення, що і вище, а g = 0 або 1; Z позначає необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000, або ланку F1-E1-P-E2-F2, в якій E1 і E2 є однаковими або різними і означають C=O, O або NR14, де R14 позначає H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкиніл, що містить 2-6 атомів вуглецю; P позначає пептидну ланку завдовжки від 2 до 20 амінокислот, причому E1 або E2 може з'єднуватися з пептидом через кінцевий азот, кінцевий вуглець або через бічний ланцюг однієї з амінокислот пептиду; а F1 і F2 є однаковими або різними і означають необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000, за умови, що якщо Z не F1-E1-P-E2-F2, то щонайменше один з поміж R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є зарядженим замісником, а якщо g = 1, то щонайменше один з поміж A, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 і R10 є зарядженим замісником; Y позначає карбонільну, тіоефірну, амідну, дисульфідну або гідразонову групу; а q позначає ціле число від 1 до 20. Як детальніше описано нижче, лікарський препарат може бути будь-яким з поміж багатьох препаратів типу невеликих молекул, включаючи майтансиноїди, аналоги CC-1065, морфоліни, доксорубіцини, таксани, криптофіцини, епотілони, каліхеаміцини, ауристатіни і димери піролобензодіазепінів. У кращих втіленнях один з поміж R1, R2, R3, R4, R9, R10 є зарядженим замісником з поміж сульфонату, фосфату, карбоксилату або триалкіламонію, а всі решта – H; всі l, g і m = 0; n = 1; D позначає майтансиноїд, аналог CC-1065 або димер піролобензодіазепіну. У кращому втіленні один з поміж R1, R2, R3, R4, R9, R10 є сульфонатом, а всі решта – H; всі l, g і m = 0; n = 1; D позначає майтансиноїд, аналог CC-1065 або димер піролобензодіазепіну, приєднаний через дисульфідний, тіоефірний або складнотіоефірний зв'язок. У ще кращому втіленні один з поміж R1, R2, R3, R4, R9, R10 є сульфонатом, а всі решта – H; всі l, g і m = 0; n = 1; і D позначає майтансиноїд, аналог CC-1065 або таксан. У кращому втіленні, якщо Z є ланкою F1-E1-P-E2-F2, то E1 і E2 є однаковими або різними і означають C=O або NR14, де R14 позначає H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю; P позначає пептидну ланку завдовжки від 2 до 8амінокислот, причому E1 або E2 може з'єднуватися з пептидом через кінцевий азот, кінцевий вуглець або через бічний ланцюг однієї з амінокислот пептиду, а кращими амінокислотними залишками є гліцин (gly), аланін (ala), лейцин (leu), глутамінова кислота (glu) або лізин (lys), які можуть використовуватися в будь-якій комбінації або у будьякому порядку (напр., gly-gly-gly або ala-leu-ala-leu тощо); а F1 і F2 є однаковими або різними і означають необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000. У кращому втіленні, якщо Z є ланкою F1-E1-P-E2-F2, то E1 і E2 є однаковими або різними і означають C=O або NR14, де R14 позначає H або лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю; P позначає пептидну ланку завдовжки від 2 до 5 амінокислот, причому E1 або E2 може з'єднуватися з пептидом через кінцевий азот, кінцевий вуглець або через бічний ланцюг однієї з амінокислот пептиду; а F1 і F2 є однаковими або різними і означають необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 24. Бажано q, число молекул препарату, приєднаних до кожної клітинозв’язувальної речовини, складає 1-20, краще 2-18, ще краще 2-16 і найкраще 2-10. Для того, щоб синтезувати кон’югат, можна модифікувати клітинозв’язувальну речовину за 9 UA 113830 C2 5 10 15 20 25 30 35 допомогою зшиваючих реагентів даного винаходу, вводячи реакційноздатні дисульфідні, малеімідні, галоацетильні або гідразидні групи. Синтез кон’югатів клітинозв’язувальних речовин з препаратами, сполученими через дисульфідні зв'язки, здійснюється шляхом дисульфідного обміну між дисульфідним зв'язком в модифікованій клітинозв’язувальній речовині і препаратом, який містить вільну тіолову групу. Синтез кон’югатів клітинозв’язувальних речовин з препаратами, сполученими через тіоефірні зв'язки, здійснюється шляхом реакції модифікованої малеімідом або галоацетилом клітинозв’язувальної речовини з препаратом, який містить вільну тіолову групу. Синтез кон’югатів, які несуть кислотолабільний гідразоновий зв'язок, може здійснюватися шляхом реакції карбонільної групи з гідразидною групою в лінкері за допомогою відомих методів (наприклад, див. Hamann P. et al., BioConjugate Chem., 13, 40-46, 2002; Laguzza B. et al., J. Med. Chem., 32, 548-555, 1959; Trail P. et al., Cancer Res., 57, 100-105, 1997). З іншого боку, можна модифікувати лікарський препарат за допомогою зшиваючих реагентів даного винаходу, отримуючи модифікований препарат формули (IV), який несе функціональну групу, здатну реагувати з клітинозв’язувальною речовиною. Наприклад, препарат, який містить тіол можна піддати реакції із зарядженим зшиваючим реагентом або його попередником формули (I), які несуть заміщаючу групу малеіміду, при нейтральному pH у водному буфері, отримуючи препарат, сполучений із зарядженим лінкером через тіоефірний зв'язок. Препарат, який містить тіол можна піддати дисульфідному обміну із зарядженим лінкером, який несе групу дитіопіридилу, отримуючи модифікований препарат, приєднаний через дисульфідний зв'язок до зарядженого лінкера. Препарат, який несе гідроксильну групу, можна піддати реакції із зарядженим зшиваючим реагентом або його попередником, які містять галоген, у присутності слабкої основи, отримуючи модифікований препарат, який несе ефірний зв'язок. Препарат, який містить гідроксильну групу, можна піддати конденсації із зарядженим зшиваючим реагентом формули (I), який несе карбоксильну групу, у присутності дегідратуючого агента типу дициклогексилкарбодиіміду, отримуючи складноефірний зв'язок. Аналогічним чином препарат, який містить аміногрупу, можна піддати конденсації з карбоксильною групою на зарядженому зшиваючому реагенті або його попереднику формули (I), отримуючи амідний зв'язок. Кон'югат може бути очищений стандартними біохімічними способами, як то методами гельфільтрації на колонці Sephadex G25 або Sephacryl S300, адсорбційної або іонообмінної хроматографії або діалізу, як описано раніше. В деяких випадках (напр., фолієвої кислоти, меланоцит-стимулюючого гормону, EGF тощо) кон’югати клітинозв’язувальних речовин з препаратами можна очистити таким методом хроматографії, як HPLC, колоночна хроматографія середнього тиску або іонообмінна хроматографія. Модифіковані клітинозв’язувальні речовини Клітинозв’язувальні речовини, модифіковані в результаті реакції із зшиваючими реагентами даного винаходу, переважно представлені формулою (III): R7 R8 CB R3 Z Y l m R9 R10 R5R6 40 45 50 R4 n Ag R1 Q R2 q (III) де замісники вже визначені вище як для зарядженого лінкера або пролінкера і кон’югата клітинозв’язувальної речовини з лікарським препаратом. У кращих втіленнях один з R1, R2, R3, R4, R9, R10 є зарядженим замісником обраним з поміж сульфонату, фосфату, карбоксилу або триалкіламонію, а всі решта – H; всі l, g і m = 0; n = 1; Q позначає заміщаючу групу дисульфіду, малеіміду, галоацетилу або складного ефіру Nгідроксисукциніміду, а Y позначає тіоефір, амід або дисульфід. У кращому втіленні один з поміж R1, R2, R3, R4, R9, R10 є сульфонатом, а всі решта – H; всі l, g і m = 0; n = 1; Q позначає угрупування дисульфіду, малеіміду або галоацетилу; а Y позначає тіоефір, амід або дисульфід. У ще кращому втіленні один з поміж R1, R2, R3, R4, R9, R10 є сульфонатом, а всі решта – H; всі l, g і m = 0; n = 1; Q позначає піридилдитіо- або нітропіридилдитіогрупу; а Y позначає тіоефір, амід або дисульфід. У кращому втіленні, якщо Z є ланкою F1-E1-P-E2-F2, то E1 і E2 є однаковими або різними і означають C=O або NR14, де R14 позначає H, лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, який містить 3-6 атомів вуглецю; P позначає пептидну ланку завдовжки від 2 до 8 амінокислот, причому E1 або E2 може з'єднуватися з пептидом через 10 UA 113830 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кінцевий азот, кінцевий вуглець або через бічний ланцюг однієї з амінокислот пептиду, а кращими амінокислотними залишками є гліцин (gly), аланін (ala), лейцин (leu), глутамінова кислота (glu) або лізин (lys), які можуть використовуватися в будь-якій комбінації або у будьякому порядку (напр., gly-gly-gly або ala-leu-ala-leu і так далі); а F1 і F2 є однаковими або різними і означають необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 1000. У кращому втіленні, якщо Z є ланкою F1-E1-P-E2-F2, то E1 і E2 є однаковими або різними і означають C=O або NR14, де R14 позначає H або лінійний алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю; P позначає пептидну ланку завдовжки від 2 до 5 амінокислот, причому E1 або E2 може з'єднуватися з пептидом через кінцевий азот, кінцевий вуглець або через бічний ланцюг однієї з амінокислот пептиду; а F1 і F2 є однаковими або різними і означають необов'язкову поліоксиетиленову ланку формули (OCH2CH2)p, де p = 0 або цілому числу від 2 до 24. Модифіковану клітинозв’язувальну речовину можна отримати в результаті реакції клітинозв’язувальної речовини із зарядженими зшиваючими реагентами за допомогою методів, відомих для інших зшиваючих реагентів (U.S. Patent Nos. 6,340,701 B1, 5,846,545, 5,585,499, 5,475,092, 5,414,064, 5,208,020 і 4,563,304; Chari R.V.J. et al., Cancer Research 52, 127-131, 1992; Chari R.V.J. et al., Cancer Research 55, 4079-4084, 1995; Carlsson J. et al., 173 Biochem. J. (1978) 723-737(1978); Goff D.A. and Carroll S.F., 1 BioConjugate Chem. 381-386 (1990); Delprino L. et al., 82 J. Pharm. Sci. 506-512 (1993); Arpicco S. et al., 8 BioConjugate Chem. 327-337 (1997)). Бажано, оскільки групи зшиваючого реагенту розчинні у воді або вимагають лише невеликого відсотка органічного розчинника для підтримування розчинності у водних розчинах, реакція між клітинозв’язувальною речовиною і зшиваючим реагентом може проводитися у водному розчині. Зшиваючий реагент розчиняють у водному буфері, який необов'язково містить невелику кількість (зазвичай 90% N3 O SO3H Метил-4-бром-2-сульфобутират (1,07 г, 4,11 ммоль) і азид натрію (0,70 г, 10,7 ммоль) в DMF (50 мл) перемішували протягом ночі. Суміш випаровували і очищали методом хроматографії в SiO2 (елюювали сумішшю CH3OH/CH2Cl2/HAc 1:5:0,01), а потім піддавали кристалізації в суміші CH3OH/толуол/гексан, отримуючи 1,00 г (95%) вказаної в заголовку сполуки. Т.пл. = 267-272 °C 1 (розл.). H-ЯМР (DMF-d7): 12.06 (br, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.59 (dd, 1H, J = 5.4, 8.9 Hz), 3.47 (m, 2H), 13 2.24 (m, 2H); C-ЯМР: 171.10, 64.29, 52.24, 50.64, 21.35. ESI MS: m/z+ 267.9 (M+2Na-H), m/z222.0 (M-H); HRMS: m/z- (C5H9N3O5S-H) теор. 222.0185, факт. 222.0179. 4-Азидо-2-сульфоолійна кислота O O 1M HCl N3 N3 O OH HAc, 100C SO3H SO3H >95% Метил-4-азидо-2-сульфобутират (1,00 г, 4,08 ммоль) в суміші HCl (50 мл, 1,0 M) і HAC (5 мл) нагрівали при 100 °C протягом 8 год. Суміш випаровували і знову випаровували з 3×50 мл води, 27 UA 113830 C2 5 а потім піддавали кристалізації в суміші вода/ацетон, отримуючи 1,0 г (99%) вказаної в 1 13 заголовку сполуки. H-ЯМР (DMF-d7): 3.60 (m, 2H), 3.52 (m, 1H), 2.24 (m, 2H); C-ЯМР: 170.96, 63.04, 50.66, 29.12. ESI MS: m/z- 207.7 (M-H); HRMS: m/z- (C4H7N3O5S-H) теор. 208.0028, факт. 208.0021. 4-Аміно-2-сульфоолійна кислота O O H2/Pd/C N3 OH SO3H 10 H2N 20 25 O SO3H O HN OH O DMF, >90% OH SO3H O O O OH SO3H 1). HMDS/ZnCl/DMA N 2). CH3OH/HCl (cat) > 85% O O OH SO3H (Z)-4-(3-Карбокси-3-сульфопропіламіно)-4-оксобут-2-єнову кислоту (310 міліграм, 1,10 ммоль) нагрівали в суміші безводного DMA (5 мл) і безводного толуолу (20 мл). Після того, як температура досягла 80 °C, додавали HMDS (гексаметилдисилазан) (1,40 мл, 6,71 ммоль) і ZnCl2 (1,85 мл, 1,0 M в діетиловому ефірі, 1,85 ммоль). Суміш продовжували нагрівати до 115~125 °C і збирали толуол пасткою Dean-Stark. Реакційну суміш кип'ятили при 120 °C протягом 6 год. За цей час додавали 2×20 мл безводного толуолу, щоб підтримати об'єм суміші близько 8~10 мл. Потім суміш охолоджували, додавали 1 мл суміші 1:10 конц. HCl/CH 3OH, випаровували і очищали методом хроматографії в SiO2 (елюювали сумішшю CH3OH/CH2Cl2/HAc 1 від 1:5:0,01 до 1:4:0,01), отримуючи 260 міліграм (92%) вказаного в заголовку продукту. H-ЯМР 13 (DMF-d7): 10.83 (br, 1H), 6.95 (s, 2H), 1H, J = 12.8 Hz), 3.65 (m, 1H), 3.54 (m, 2H), 2.27 (m, 2H); CЯМР: 173.61, 172.04, 135.47, 64.18, 37.1, 27.89. ESI MS: m/z- 261.8 (M-H); HRMS: m/z(C8H9NO7S-H) теор. 262.0021, факт. 262.0027. Сукцинімідил-4-N-малеімідо-2-сульфобутират O O O N O 40 O До вищенаведеної HCl-солі 4-аміно-2-сульфоолійної кислоти (476 міліграм, 2,16 ммоль) в безводному DMF (20 ml) додавали малеїновий ангідрид (232 міліграми, 2,36 ммоль). Суміш перемішували в атмосфері Ar протягом ночі, випаровували і очищали на заповненій колонці C18 1,0×25 см, елююючи водою. Фракції, які містять продукт, об'єднували, випаровували і піддавали кристалізації в суміші H 2O/ацетон, отримуючи 552 міліграми (91%) вказаного в 1 заголовку продукту. H-ЯМР (DMF-d7): 9.70 (br, 1H), 6.73 (d, 1H, J = 12.8 Hz), 6.32 (d, 1H, J = 12.8 13 Hz), 3.69 (m, 1H), 3.47 (m, 2H), 2.27 (m, 2H); C-ЯМР: 171.47, 167.32, 165.87, 135.44, 133.07, 63.82, 39.13, 27.62. ESI MS: m/z- 279.8 (M-H); HRMS: m/z- (C8H11NO8S-H) теор. 280.0127, факт. 280.0121. 4-N-Малеімідо-2-сульфобутанова кислота HN OH 35 O O OH O 30 OH SO3H У гідрогенізаційний качалочний посуд на 250 мл вносили 4-азидо-2-сульфоолійну кислоту (500 міліграм, 2,40 ммоль), воду (20 мл) і Pd/C (110 міліграм, 10% Pd, 50% у вологому стані). Після того, як повітря з посудини було відкачане під вакуумом, в посудину подавали водень при 20 psi. Суміш струшували протягом 8 год., після чого фільтрували крізь целіт, промивали DMF, випаровували і знову випаровували з безводним DMF, отримуючи 476 міліграм (91% солі HCl) вказаного в заголовку продукту. ESI MS: m/z- 181.8 (M-H). Цей продукт використовували безпосередньо без подальшого очищення. (Z)-4-(3-Карбокси-3-сульфопропіламіно)-4-оксобут-2-єнова кислота O 15 H2N H2O, >95% OH SO3H O HO N O N EDC/DMA O O O O SO3H N O 4-N-Малеімідо-2-сульфобутанову кислоту (260 міліграм, 0,99 ммоль) в DMA (10 мл) вносили до NHS (220 міліграм, 1,91 ммоль) і EDC (500 міліграм, 2,60 ммоль). Суміш перемішували в атмосфері Ar протягом ночі, випаровували і очищали методом хроматографії в SiO2 (елюювали 28