Спосіб біоремедіації системи ґрунт-ґрунтова біота-рослина за забруднення важкими металами як фактора хімічної та біологічної деградації

Реферат: Спосіб біоремедіації системи ґрунт-ґрунтова біота-рослина за забруднення важкими металами як фактора хімічної та біологічної деградації включає використання активного агента біопрепарату з активізацією функціонування мікробної системи ґрунту, продуктивності рослин. Як активний біохімічний агент використовують Триходермін БТ на основі мікокультури виду Trichoderma viride шляхом щорічного його внесення навесні при оранці безпосередньо у ґрунт за 5-6 днів до посіву рослин і температури повітря вище +12 °C, у вигляді порошку або робочого розчину (40-60 мл мікопрепарату на 2 л теплої води) у день його виготовлення з подальшим боронуванням ґрунту з отриманням максимального біоремедіаційного ефекту за обмеженого терміну зберігання у ґрунті, підвищенням імунного статусу рослин та зниженням норм використання біопрепарату з одночасним посиленням його біологічної ефективності. UA 100982 U (54) СПОСІБ БІОРЕМЕДІАЦІЇ СИСТЕМИ ҐРУНТ-ҐРУНТОВА БІОТА-РОСЛИНА ЗА ЗАБРУДНЕННЯ ВАЖКИМИ МЕТАЛАМИ ЯК ФАКТОРА ХІМІЧНОЇ ТА БІОЛОГІЧНОЇ ДЕГРАДАЦІЇ UA 100982 U UA 100982 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сфери охорони ґрунтів і відновлення їх родючості, належить до способів біологічної ремедіації забруднених важкими металами (ВМ) ґрунтів за використання активних агентів біопрепаратів у системі ґрунт - мікроорганізми - рослина. Спосіб може знайти застосування в агроекології, екоменеджменті ґрунтів за екологічного контролю техногенно забруднених ґрунтів земельних ділянок різного призначення та їх використання; у науково-дослідній практиці - для розробки системи заходів щодо біологічної ремедіації забруднених територій у складі комплексу біологічних технологічних прийомів відновлення забруднених ґрунтів та відтворення їх ресурсного потенціалу, і, як наслідок, зниження інтенсивності процесів хімічної і біологічної деградації ґрунтів за впливу техногенного забруднення ВМ; для поліпшення якості ґрунтів. Відомо спосіб очищення ґрунтів від ВМ [Пат. RU № 2258687 Биопрепарат на основе гуминовых веществ], що передбачає застосування біопрепарату на основі гумінових речовин, що отримують шляхом змішування у певному співвідношенні у дезінтеграторі за подрібнення торфу, пташиного посліду та лугу з додаванням води. Біопрепарат характеризується відновними функціями щодо оксидів важких металів і може використовуватися для поліпшення екології ґрунтів з підвищенням вмісту гумусу з відновленням біоти у ґрунтах. Проте безумовними недоліками способу є обмеженість його застосування за ґрунтами, тільки профілактично і для зниження ступеня забруднення та нейтралізації токсичності лише оксидів ВМ, які, як відомо, не є водорозчинними сполуками у ґрунтах. Інший відомий мікробіологічний спосіб, що використовують на забруднених ВМ ґрунтах [Пат. RU № 2354690 Средство для повышения всхожести семян злаковых растений в почвах, загрязненных тяжелыми металлами] передбачає застосування за новим призначенням 6 8 біопрепарату зі штамом бактерій Bacillus subtilis 11B з концентрацією 1,0×10 -1×10 клітин у 1 мл, що має широкий спектр антагоністичної активності до фітопатогенних бактерій і грибів з підвищенням схожості насіння злакових рослин на забруднених ВМ ґрунтах. Проте за позитивного впливу на насіння рослин не зафіксовано позитивного впливу способу на інші показники функціонування рослин та характеристики властивостей ґрунту за невідомості наслідків інтродукції запропонованого у способі штаму бактерій у ґрунтовий біоценоз, що значно обмежує застосування способу в системі ґрунт-мікроорганізми-рослина. До того ж відомо, що видовий склад, чисельність і структура спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus відповідно до природно-кліматичних умов закономірно зонально змінюється (Мишустин, 1978; Патика, 2002) та може ефективно застосовуватись тільки на тих ґрунтах, з яких було виділено цей штам бактерій, що значно обмежує їх використання на ґрунтах різного генезису та потребує додаткового отримання активних штамів-інактиваторів забруднювачів за відповідності збільшення витрат на досягнення технічного результату. Найбільш близьким за механізмом біологічної ремедіації ґрунту, забрудненого ВМ, технологічним виконанням і результатом, що досягається, є спосіб [Пат. UA № 57758 Мікробіологічний спосіб біоремедіації чорнозему опідзоленого, забрудненого важкими металами], що включає передпосівну бактеризацію насіння за використанні біопрепарату, що містить як біоагент активні штами бактерій В531 роду Bacillus, адаптованих до тих ґрунтовокліматичних умов, з яких їх було виділено. Спосіб підвищує біологічну активність ґрунту, покращує продуктивність рослинної продукції. Проте, недоліками способу можна вважати: обмеженість способу на ґрунтах інших типів з можливістю його використання лише на чорноземі опідзоленому важкосуглинковому, де активні штами бактерій В531 роду Bacillus ефективно діють за моноелементного забруднення ґрунту ВМ; трудомісткість отримання, виділення та зберігання чистих бактеріальних культур роду Bacillus за необхідності отримання накопиченої культури і створення селективних умов, постійного мікроскопічного контролю чистоти культур бацил та їх фітотоксичності тощо, значно збільшують вартість робіт всіх етапів отримання і застосування штамів бактерій роду Bacillus. Окрім того, за неоднозначності впливу бактеризації на систему ґрунт-мікроорганізми-рослини необхідним є обов'язкове урахування специфічності штамів і різної біологічної активності спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus на ґрунтах різних типів, рослинах різних видів та родин разом зі специфікою формування мікробіоти прикореневої зони рослин. До того ж необхідним є урахування як токсичності окремих видів роду Bacillus, так і активності функціонування і змін родового, видового складу інших ґрунтових мікроорганізмів і грибів та їх конкурентної взаємодії у системі ґрунтмікроорганізми-рослина. Обмеженість використання бактеріальних препаратів за умов забруднення ґрунту ВМ, у тому числі із залученням видів роду Bacillus, внаслідок багатофакторності впливу на їх ефективність у системі ґрунт-мікроорганізми-рослина актуалізує необхідність проведення більш 1 UA 100982 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поглиблених досліджень біоскладової ґрунту, що значно підвищує витратність ресурсів на досягнення технічного результату щодо біоремедіації техногенно забруднених ВМ ґрунтів. Таким чином доцільним є залучення більш стійких або толерантних до забруднення ВМ груп ґрунтової біоти, наприклад мікобіоти, що характеризуються значно більшою біохімічною активністю, достатньою чисельністю домінуючих родів і видів у ґрунтах, також антагоністичними властивостями широкого спектра дії відносно ґрунтових патогенів (наприклад, гриби роду Aspergillus, Fusarium, що активно розвиваються за умов забруднення ВМ), біостимуляційним ефектом відносно рослин та відсутністю фітотоксичності; схожими з рослинами фізіологобіохімічними механізмами регуляції та стійкого функціонування у присутності надлишку ВМ у ґрунтах та біологічними механізмами їх ремедіації. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення відомого способу біоремедіації системи ґрунт-ґрунтова біота-рослина за забруднення ВМ, як фактора хімічної та біологічної деградації, за рахунок розширення банку мікопрепаратів, як природного засобу, що сприяє біоремедіаційному ефекту, екологічній стабілізації середовища з одночасною активізацією біологічного потенціалу ґрунту, продуктивності рослин і економії ресурсів. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі біоремедіації системи ґрунтґрунтова біота-рослина за забруднення ВМ, як фактора хімічної та біологічної деградації, який включає використання активного агента біопрепарату з активізацією функціонування мікробної системи ґрунту, продуктивності рослин, згідно з корисною моделлю, як активний біохімічний агент використовують Триходермін БТ на основі мікокультури виду Trichoderma viride шляхом щорічного його внесення навесні при оранці безпосередньо у ґрунт за 5-6 днів до посіву рослин і температури повітря вище +12 °C, у вигляді порошку або робочого розчину (40-60 мл мікопрепарату на 2 л теплої води) у день його виготовлення з подальшим боронуванням ґрунту з отриманням максимального біоремедіаційного ефекту, підвищенням імунного статусу рослин та зниженням норм використання біопрепарату з одночасним посиленням його біологічної ефективності. Біопрепарат Триходермін БТ містить спори ґрунтових сапротрофних мікроміцетівантагоністів роду Trichoderma Pers. виду Trichoderma viride відділу Ascomycota, родини Hypocreaceae (Штам 16 ЦКМ F-59M, Державне свідоцтво № 01406; ТОВ "Защита-Агро" НААН України). За проведення довгострокових польових досліджень системи ґрунт-ґрунтова біота-рослина в зонах техногенного впливу емісії ВМ нами було встановлено, що таксономічний склад мікоценозу ґрунту за умов забруднення ВМ складають гриби родів Mucor, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus (фіг. 1, % від загальної кількості мікроскопічних грибів). За умов високих рівнів забруднення ґрунту ВМ доля грибів роду Trichoderma, що не є фітопатогенними, у мікоценозі ґрунту суттєво збільшувалась відповідно до 13 %, що свідчить про стійкість функціонування у присутності надлишку ВМ у ґрунтах. Серед роду грибів Trichoderma, за результатами, що досліджувались було встановлено найбільшу активність у виду Trichoderma viride. Також було встановлено, що гриби, порівняно з бактеріями ґрунту, є більш стійкими до забруднення ВМ, антагонізм і ефект пригнічення розвитку окремих бактерій грибами, які складають конкуренцію аборигенній мікрофлорі (Самохвалова В.Л., Фатєєв А.І., 2004, 2006, 2008). А за мікропольового і лабораторних досліджень ефективності біопрепарату Триходерміну БТ на основі мікокультури виду Trichoderma viride, окрім встановленого його позитивного впливу на підвищення біологічної активності ґрунту, ріст і розвиток та продуктивність рослин, нами було встановлено нову властивість мікопрепарату, а саме: здатність інтенсифікувати процеси біоремедіації та відновлення якості техногенно забруднених ВМ ґрунтів, що дозволило використати мікопрепарат у новій якості - як біологічного меліоранту для попередження біологічної та хімічної деградації ґрунтів. У ґрунті гриби роду Trichoderma (Сенчакова, 2007; Свистова, 2008) пригнічують більш 60 видів патогенів на широкому спектрі видів рослин, тому що у процесі розвитку Trichoderma (Арнольд, 1971) синтезує широкий спектр антибіотиків, а також продукує інші біологічно активні речовини (ферменти), що також пригнічують розвиток патогенів і стимулюють ріст та розвиток рослин (Беккер, 1988), посилення мобілізації елементів живлення рослин, що сприяє більш повному використанню рослинами захисних механізмів з підвищенням їх імунного статусу. Окрім того, за рахунок високої біологічної активності гриби роду Trichoderma активно розкладають органічні сполуки ґрунту з утворенням легкодоступних для рослин сполук, приймають участь в процесах амоніфікації та нітрифікації, посиленні мобілізації фосфору та калію збагачуючи ґрунт рухомими сполуками елементів живлення. Тим самим позитивно впливаючи на функціонування мікроорганізмів та мікоценозу ґрунту, на взаємодію рослинномікробних систем. 2 UA 100982 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Окрім того, обмежений термін ефективної дії препарату (30 діб) є також оптимальним і достатнім для вирішення завдання біоремедіації техногенно забрудненого ВМ ґрунту. Відомо, що основними процесами мікробної трансформації ВМ є окисно-відновна біотрансформація і трансформація неорганічних сполук в органічні (Марфенина, 2005). Гриби мають властивості резистентності або толерантності до ВМ з біологічними механізмами, що включають внутрішньоклітинну акумуляцію, комплексоутворення, трансформацію металів шляхом окиснення, відновлення, метилування, біосорбцію клітинними стінками, пігментами або полісахаридами, зниження транспорту або проникності, внутрішньоклітинний розподіл, осадження і/або відчуження (Gadd, 1992). Таким чином забезпечується утворення оптимальних умов функціонування системи ґрунт - мікроорганізми - рослина для інтенсифікації процесів біоремедіації техногенно забруднених ВМ ґрунтів. Приклад здійснення способу. Запропонований спосіб полягає у визначені на забруднених ґрунтах рівнів вмісту легкорухомих та обмінних рухомих форм ME і ВМ у ґрунтах методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії використовуючи ацетатно-амонійний буферний розчин з рН 4,8 та 1н НСl (екстрагенти ВМ) та визначанні типу і рівня забруднення ґрунту за оцінювання екологічного стану ґрунту певного типу згідно з діючими нормативами і методичною базою та з урахуванням фонових рівнів вмісту ВМ для ґрунтів (Фатєєв А.І., Самохвалова В.Л., 2012). Отримані дані для експертного якісного та кількісного їх оцінювання зведено у таблиці і візуалізовано на діаграмах, що характеризують найвищий досліджуваний рівень моноелементного забруднення ґрунту рухомими формами ВМ у 8 кларків перевищення фонового рівня їх вмісту та експериментально встановлену ефективну концентрацію біоагенту у складі мікопрепарату Триходермін БТ (фіг. 2-7). Далі на забрудненому ґрунті застосовували біопрепарат Триходермін БТ. Для отримання максимального біоремедіаційного ефекту грибний препарат вносили щорічно при оранці навесні безпосередньо у ґрунт у вигляді порошку згідно з ТУ У 24.2-00011050-254:2005 та робочого розчину (40-60 мл на 2 л теплої води) у день його виготовлення за 5-6 днів до посіву рослин і температури повітря вище +12 °C з метою стимуляції антагоністичної дії гриба - сапрофіта Trichoderma viride. Після внесення препарату проводили боронування ґрунту легкими боронами. Ефективність застосування біопрепарату Триходермін БТ на забрудненому ВМ ґрунті, наприклад, Cd, Pb, Ni і Сr встановлено у довгострокових модельних дослідженнях зростанням біогенності ґрунту за позитивного впливу на його біологічну компоненту, використовуючи відомі методи мікробіологічних (Звягинцев, 1980) і біохімічних (Хазиев, 2005) досліджень ґрунту та показники його мікробіологічної і ферментативної активності. Результати, що сформовано у відповідні таблиці за блоками для зручності користування, також підтверджують зростання біологічної активності самого препарату. Таким чином, доведено ефективний вплив запропонованого мікопрепарату, насамперед, на функціональну структуру мікробного ценозу з урахуванням основних еколого-трофічних угруповань та, відповідно, показників мікробіологічного стану ґрунту (фіг. 2, 2а-2є); активності ферментів різних класів (фіг. 3): дегідрогенази (клас оксидоредуктаз, фіг. 3а), що відіграє провідну роль у окислювальновідновлювальних процесах ґрунту, синтезі гумусових речовин у ґрунті інвертази (клас гідролаз, фіг. 3в), що впливає на збагачення ґрунту доступними для рослин і мікроорганізмів поживними речовинами, руйнуючі високомолекулярні органічні сполуки; нітрифікаційної (фіг. 3б) і амоніфікаційної здатності (фіг. 3г); актуальної целюлозолітичної здатності за структурної перебудови мікробних ценозів за специфічного впливу ВМ (фіг. 4-5) - Cd (фіг. 4в - 4д); Рb (фіг. 4є - 4з); Ni (фіг. 5а - 5в); Сr (фіг. 5г - 5є) у порівнянні з контролем (фіг. 4а) та використанням мікопрепарату (фіг. 4б). Так, позитивний вплив ефективної дози мікопрепарату встановлено аплікаційним методом (Звягинцев Д.Г., 1980) в умовах оптимальної температури і вологи ґрунту результатами щодо показників загальної целюлозолітичної активності забрудненого ВМ чорнозему типового, досліджених у два терміни - 3 та 6 тижнів (фіг. 4-5). Інтенсивність розкладу клітковини, що є індикатором швидкості трансформації органічної речовини в ґрунті та обумовлює рівень вивільнення поживних речовин з органічних решток, визначали за деградацією лляної або бавовняної тканини. А оцінювання інтенсивності розкладу тканини проводили за шкалою (%): дуже слабка - 80 %. Обробка ґрунту біопрепаратом Триходермін БТ стимулювала целюлозолітичну активність до 20,9 %. Застосування триходерміну на забрудненому Cd, Pb, Сr ґрунті підвищило інтенсивність целюлозолітичної активності ґрунту до 21 %, що також підтверджує ефективність біоремедіації. До того ж через 6 тижнів позитивний ефект підвищився (контроль - 46,5 %, середній рівень інтенсивності; триходермін - 65,6 %, сильний рівень розкладу; на варіантах з забрудненням ґрунту ВМ - суттєве гальмування целюлозолітичної активності ґрунту - до 21,1 3 UA 100982 U 5 10 15 20 25 30 27,9 %, НІР 3,94 % та Р=0,95; вплив варіантів складав 98 %, критерій Фішера Fфакт.=121, Fтабл.=2,5). Отже внесення триходерміну за забруднення ВМ забезпечило посилення інтенсивності целюлозолітичної активності на 35,2 % на фоні надлишку Cd, на 19,4 % - при забрудненні Сr, на 16,4 % при забрудненні Ni і на 11,9 % за впливу надлишку Рb. Отже результат підтверджує високу біологічну активність мікопрепарату Триходермін БТ, що забезпечує активне розкладання органічних сполук і зростання целюлозолітичної активності чорнозему типового. Також позитивний вплив біопрепарату у системі ґрунт-ґрунтова біта підтверджено розрахунковими показниками трансформації органічних речовин та мінералізації, інтегральних показників біологічного стану і біогенності ґрунту (фіг. 6). Оскільки мікопрепарати, як і гриби ґрунту, часто проявляють фітотоксичність, було досліджено вплив біопрепарату на посівну якість насіння рослинах, вирощених на забрудненому ґрунті (фіг. 7а - 7г), що свідчить про позитивний вплив мікопрепарату Триходермін БТ з високо ефективним біоагентом Trichoderma viride на формування продуктивності тест-культури і також підтверджує ефективність біоремедіації забрудненого ВМ ґрунту. Відмітними рисами та перевагами запропонованої корисної моделі у порівнянні з відомими способами та підходами, є наступні: спосіб сприяє реалізації екологобезпечного шляху біоремедіації ґрунту за використання мікопрепарату чим забезпечується екологічна стабілізація середовища системи забруднений ґрунт-мікробіоценоз-рослина за одночасної нейтралізації негативних процесів забруднення та поліпшення екологічного стану ґрунту шляхом активізації природного біологічного потенціалу ґрунту, продуктивності рослин; спосіб сприяє збереженню природних біологічних властивостей ґрунту за створення оптимальних умов для формування мікро- та мікобіоти ґрунту з більш високим рівнем біологічної активності і утворення оптимальних умов функціонування компонент системи ґрунтґрунтова біота-рослина для проведення ефективної біоремедіації забруднених ВМ ґрунтів та відновлення їх якості, попередження біологічної та хімічної деградації ґрунтів; спосіб сприяє збільшенню біологічної активності біопрепарату чим забезпечується економія його використання та застосування інших ресурсів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб біоремедіації системи ґрунт-ґрунтова біота-рослина за забруднення важкими металами як фактора хімічної та біологічної деградації, який включає використання активного агента біопрепарату з активізацією функціонування мікробної системи ґрунту, продуктивності рослин, який відрізняється тим, що як активний біохімічний агент використовують Триходермін БТ на основі мікокультури виду Trichoderma viride шляхом щорічного його внесення навесні при оранці безпосередньо у ґрунт за 5-6 днів до посіву рослин і температури повітря вище +12 °C, у вигляді порошку або робочого розчину (40-60 мл мікопрепарату на 2 л теплої води) у день його виготовлення з подальшим боронуванням ґрунту з отриманням максимального біоремедіаційного ефекту за обмеженого терміну зберігання у ґрунті, підвищенням імунного статусу рослин та зниженням норм використання біопрепарату з одночасним посиленням його біологічної ефективності. 4 UA 100982 U 5 UA 100982 U 6 UA 100982 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7