N’-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4н-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід, що проявляє протитуберкульозну активність

Реферат: N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід, що проявляє протитуберкульозну активність. UA 119202 U (12) UA 119202 U UA 119202 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до фармації, медицини та ветеринарії і може бути використаний у створенні нових біологічно активних сполук у ряді похідних 1,2,4-триазолу та для підвищення ефективності бактеріологічної діагностики туберкульозу тварин, селекції вакцинних штамів для конструювання препаратів специфічної профілактики хвороби. Cучасний стан виробництва протитуберкульозних препаратів в Україні далеко не ідеальний, тому необхідно розширювати виробництво вітчизняних протитуберкульозних препаратів. З огляду на вищевикладене, можна сказати, що головним завданням пошуку нових протитуберкульозних препаратів є створення високоактивних і малотоксичних препаратів, позбавлених побічних ефектів. Також дуже важливо, щоб резистентність до них мікобактерій туберкульозу розвивалася якомога повільніше. До протитуберкульозних лікарських засобів належать синтетичні (ізоніазид, етамбутол, ПАСК, бепаск, етіонамід, протіонамід, піразинамід), антибіотики (рифампіцин, циклосерин, канаміцин, флориміцин, стрептоміцин) та фторхінолони (ломефлоксацин) [Машковский М.Д., 1998, 2000; Мишин В.Ю., 2002; Фрейдович А.И., 2001]. Антибіотики і фторхінолони, що застосовуються для лікування туберкульозу, характеризуються широким спектром дії, синтетичні препарати діють тільки на мікобактерії туберкульозу. В основу сучасних класифікацій покладена клінічна ефективність і стерплюваність протитуберкульозних препаратів. Питання біологічних властивостей мікобактерій, зокрема бичачого виду, дотепер потребують вивчення. Прототипом речовин, похідної 1,2,4-триазолу, що заявляються, є Ізоніазид (гідразид ізонікотинової кислоти), що виявляє протитуберкульозну активність [М.Д. Машковський. Лікарські засоби, 1988], формули: . Найближчий аналог хоча і виявляє протитуберкульозну активність, однак володіє низкою недоліків, зокрема: високою токсичною дією та виникненням ряду побічних ефектів. В основу корисної моделі поставлено задачу створення нової біологічно активної сполуки в ряді 1,2,4-триазолу, яка має протитуберкульозну дію. Спільні суттєві ознаки прототипу та корисної моделі, що заявляється, є такі: - в структурі прототипу і винаходу присутні групи С-N; - наявність в структурах ароматичних фрагментів; - наявність в структурах карбоксильних груп. Задачею корисної моделі є вивчення та дослідження впливу різних концентрації N'-(2-((5(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду та рН середовища на культивування патогенних штамів М. bovis за температур 37 °C. Поставлена задача вирішується тим, що створено нову похідну 1,2,4-триазолу, що проявляє протитуберкульозну дію: N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду, який містить морфолінометильний замісник за С5 положенням та фенільний радикал за N4 атомом, фрагмент оцтової кислоти, зв'язаний з ядром 1,2,4-триазолу атомом сульфуру, та залишок гідразиду ізонікотинової кислоти у вигляді гідроброміду: 1 UA 119202 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сполуку, що заявляється, отримують шляхом взаємодії ізопропіл 2-((4-феніл-5(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетатату із гідразидом ізонікотинової кислоти в середовищі і-пропанолу з наступним виділенням у вигляді гідроброміду. Приклад До розчину ізопропіл 2-((4-феніл-5-(морфолінометил)-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетатату (3,48 г) у 30 мл і-пропанолу додають 0,01 моль гідразиду ізонікотинової кислоти. Розчин кип'ятять на водяному огрівнику 8 год., випаровують досуха та виділяють у вигляді гідроброміду. Для аналізу сполуку перекристалізовують із метанолу. о Кристалічна речовина жовтого кольору з Тпл. 195-197 С , добре розчинна у воді, малорозчинна у н-пропанолі, н-бутанолі та в неполярних розчинниках. Вихід N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду складає 81 %. Вирахувано: С 47,20 %, Н 4,53 %, N 18,35 %, S 6,00 %. Знайдено: С 47,29 %, Н 4,55 %, N 18,39 %, S 6,03 %. -1 В ІЧ-спектрі сполуки, що заявляється, наявні смуги поглинання –C–S–групи при 689 см , -1 -1 симетричні при 1410 см та асиметричні при 1600 см смуги поглинання СOO -групи. Протитуберкульозна активність Протитуберкульозну активність вивчали, проводячи культивування патогенних штамів М. bovis за температури 37 °C на середовищі із рН 6,5 та 7,1, що додатково містить N'-(2-((5(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід у масових концентраціях 0,1; 0,5; 1 %. Культивування та накопичення біомаси досліджуваних штамів M. bovis проводили на яєчному живильному середовищі, яке за складом було ідентичним стандартному, виготовленому ДП "Ветеринарна медицина" (м. Харків, Україна). До середовища додавали препарат ПКР-266 у концентрації 0,1 %; 0,5 %; 1 %. Дослідження проводили зі встановленням двох рівнів рН: 6,5 та 7,1. Відмірювання необхідної кількості препарату проводили згідно з ГОСТ 27025-86. Розчини препарату готували згідно з методиками, описаних у ГОСТ 4212-76 та ГОСТ 4517-87. У виділених та накопичених мікобактерій вивчали строки появи первинного росту, його інтенсивність і характер субкультури. Аналіз та оцінку колоній проводили за кількістю, величиною, формою, поверхнею, консистенцією, пігментоутворенням, прозорістю, блиском та емульгованістю у фізіологічному розчині [В. М. Манченко, З. Р. Троценко, М. С. Павленко та ін., 1994; О. А. Ткаченко, М. В. Білан, В. В. Зажарський, Л. О. Ковальова, 2010]. Гравіметричні вимірювання виконували на лабораторних електронних аналітичних вагах моделі ESJ-200-4 (США). Вплив N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід на M. bovis На початку досліду виявляли вплив концентрації препарату та рН середовища на інтенсивність росту культури за температур 37 °C. Для цього відбирали M. bovis 100 пасажу, який культивували за температури 37 °C на середовищі з N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромідом у зазначених концентраціях у термостаті протягом трьох місяців на середовищі з рН 6,5 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату) та рН 7,1 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату). Як контроль використовували M.bovis 100 пасажу без додавання до середовища N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду. Після закінчення цих термінів так само, як і після культивування за температури 37 °C, проводили облік й характеризували ріст колоній мікобактерій (культур) [В. М. Манченко, З. Р. Троценко, М. С. Павленко та ін., 1994; О. А. Ткаченко, М. В. Білан, В. В. Зажарський, Л. О. Ковальова, 2010]. У підсумку були одержані дані впливу концентрацій N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду на культивування M. bovis за температур 37 °C на середовищі з різним рН на інтенсивність росту культури. У таблиці 1 систематизовано дані про культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 7,1, що додатково містить N'-(2-((5-(морфолінометил)-4феніл-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід у трьох концентраціях. До 7 доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis в контрольній групі на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C не відмічався. Починаючи з 7-ї доби виявляли вздовж лінії посіву шорсткий наліт, з 14-ї доби з'являлись характерні поодинокі колонії, які до 90-ї доби досліду утворювали значну кількість макроскопічно сформованих колоній мікобактерій у вигляді суцільного росту. 2 UA 119202 U Результати, наведені в табл. 1, засвідчили відсутність росту культури M. bovis 100 пасажу за усіх (0,1, 0,5 та 1 %) концентрацій препарату N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду впродовж усього періоду спостереження (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату. 5 Таблиця 1 Характеристика культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C 7-а доба досліду Концентрація препарату N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4тріазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 14-а доба досліду Концентрація N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Контроль Шорсткий наліт Контроль Шорсткий наліт та поодинокі білі колонії за лінією посіву Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 30-а доба досліду Концентрація N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Контроль Суцільний ріст. Гладенькі, дрібні колонії білуватого кольору Без змін Без змін Без змін 60-а доба досліду Концентрація N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Контроль Суцільний ріст. Гладенькі, дрібні колонії білуватого кольору Ріст відсутній Контроль 90-а доба досліду Концентрація N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній Суцільний ріст 10 Ріст відсутній Ріст відсутній У таблиці 2 систематизовано дані щодо культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 6,5, яке додатково містило N'-(2-((5-(морфолінометил)-4феніл-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід у трьох концентраціях. До 30-ї доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C не відмічався. Таблиця 2 Характеристика культуральних властивостей M. bovis 100 пасажу, культивованих на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C Контроль 7-а доба досліду Концентрація N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4тріазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% 3 UA 119202 U Продовження таблиці 2 Поодинокі колонії вздовж лінії посіву Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі Контроль Суцільний ріст. Колонії дрібні, білі, гладенькі 5 10 15 20 25 Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 14-а доба досліду Концентрація N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Ріст відсутній Ріст відсутній Ріст відсутній 30-а доба досліду Концентрація N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Вздовж лінії посіву шорсткий Ріст відсутній Ріст відсутній наліт 60-а доба досліду Концентрація N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Вздовж лінії посіву шорсткий Ріст відсутній Ріст відсутній наліт 90-а доба досліду Концентрація N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду 0,1 % 0,5 % 1% Дрібні колонії Ріст відсутній Ріст відсутній білого кольору Результати, наведені в табл. 2, засвідчили, що за 0,1 % концентрації препарату відзначається поступовий ріст колоній, починаючи з 30-го до 60-го дня досліду – вздовж лінії посіву шорсткий наліт, на 90-у добу з'являються поодинокі гладкі (S-форми), дрібні колонії білого кольору. Нами встановлена відсутність росту культури M. bovis 100 пасажу за 0,5 та 1 % концентрацій N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідроброміду впродовж усього періоду спостереження (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату. Вплив ізоніазиду (гідразид ізонікотинової кислоти) на M. Bovis Використовувався класичний туберкулостатичний препарат ізоніазид за різних концентрацій, рН середовища та температури 37 °C. Ізоніазид, згідно класифікації протитуберкульозних препаратів міжнародної спілки боротьби із туберкульозом, належить до I групи - препарати високої ефективності. Як контроль використовували M. bovis 100 пасажу без додавання до середовища препарату ізоніазид. Для цього відбирали M. bovis 100 пасажу, який культивували за температури 37 °C на середовищі з препаратом ізоніазид у зазначених концентраціях у термостаті протягом трьох місяців на середовищі з рН 6,5 та рН 7,1 (в кількості десять пробірок із кожною концентрацією препарату). У виділених мікобактерій вивчали строки появи первинного росту, його інтенсивність і характер субкультури. У таблиці 3 систематизовано дані про культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, який культивували на середовищі з рН 7,1, що додатково містить препарат ізоніазид у трьох концентраціях. До 7-ї доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C не відмічався. 4 UA 119202 U Таблиця 3 Характеристика культуральних властивостей 100 пасажу M. bovis, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C 7-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Слизовий наліт Слизовий наліт Слизовий наліт жовтуватого кольору 14-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Поодинокі гладенькі Без змін Без змін колонії 30-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Численні колонії білого Поодинокі колонії Дрібні колонії білого кольору білуватого кольору кольору 60-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Суцільний ріст. Дещо збільшилася Гладенькі, дрібні Дрібні колонії білого кількість поодиноких колонії білуватого кольору дрібних колоній кольору 90-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % Дещо збільшилася Суцільний ріст Суцільний ріст кількість поодиноких дрібних колоній 5 10 15 20 25 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній 1% Ріст відсутній Характеризуючи отримані дані, що наведені в таблиці 3 нами визначена відсутність росту культури M. bovis 100 пасажу за 1 % концентрації препарату ізоніазид. На сьому добу досліду за 0,1 % концентрації виявлений слизовий наліт жовтуватого кольору, на 30-у добу з'являються поодинокі дрібні білуватого кольору, на 60-добу їх кількість збільшується і на 90-у добу визначаємо суцільний ріст, як і в контролі. За використання 0,5 % концентрації препарату ізоніазид на 7-у добу виявлений слизовий наліт, на 14 добу досліду з'являються поодинокі гладенькі колонії, на 30 та 60 добу – дрібні колонії білого кольору. На 90 добу збільшилася кількість поодиноких дрібних колоній. Аналізуючи 1 % концентрацію препарату ізоніазид нами визначено відсутність росту патогенного штаму M. bovis 100 пасажу протягом усього періоду досліду (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату. Культуральні властивості M. bovis 100 пасажу, накопиченого та культивованого на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C з препаратом ізоніазид у трьох концентраціях представлений в таблиці 4. До 14 доби досліду ріст культури 100 пасажу M. bovis на середовищі з рН 6,5 за температури 37 °C не відмічався. Аналізуючи результати досліду, що наведено в табл.4, нами визначені відмінності дії 1 % концентрації препарату ізоніазид на середовищі з рН 6,5, ніж за рН 7,1. Якщо на середовищі з рН 7,1 ріст культури M. bovis 100 пасажу протягом 90 діб культивування не спостерігався, то на середовищі з рН 6,5 з 30 доби з'являються поодинокі дрібні колонії, кількість яких на 90 добу збільшувалась. 0,1 % концентрація препарату ізоніазид незначно впливає на ріст M. bovis – вже на 7 добу виявлені поодинокі колонії білуватого кольору, кількість яких поступово збільшується з терміном спостереження. 5 UA 119202 U За 0,5 % концентрації препарату ізоніазид ріст колоній відмічається на 14 добу – колонії дрібні, гладенькі, білого кольору, кількість яких має тенденцію до збільшення протягом терміну спостереження. Таблиця 4 Характеристика культуральних властивостей 100 пасажу M. bovis, культивованих на середовищі з рН 6,5 з препаратом ізоніазид за температури 37 °C 7-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі колонії Слизовий наліт Шорсткий наліт Ріст відсутній білуватого кольору 14-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Поодинокі колонії Поодинокі гладенькі Без змін Ріст відсутній білуватого кольору колонії 30-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Численні колонії білого Поодинокі дрібні Поодинокі колонії Дрібні колонії білого кольору колонії вздовж лінії білуватого кольору кольору посіву 60-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Ріст білуватих, Ріст білуватих, Суцільний ріст. Колонії поодиноких гладеньких поодиноких гладеньких Без змін дрібні, білі, гладенькі колоній колоній 90-а доба досліду Концентрація препарату ізоніазид Контроль 0,1 % 0,5 % 1% Збільшилася кількість Збільшилася кількість Збільшилася кількість Суцільний ріст. Колонії поодиноких дрібних поодиноких дрібних поодиноких дрібних дрібні, білі, гладенькі колоній колоній колоній 5 10 Отже, проведені дослідження засвідчили, що препарат ізоніазид за 1 % концентрації пригнічує ріст і розвиток патогенного штаму M. bovis, культивованого на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °C, що свідчить про туберкулостатичну його дію. Низька концентрація (0,1 та 0,5 %) препарату ізоніазид на середовищі з рН 6,5 та 7,1 за температури 37 °C ріст патогенного штаму M. bovis 100-го пасажу не стримує. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 N'-(2-((5-(морфолінометил)-4-феніл-4H-1,2,4-триазол-3-іл)тіо)ацетил)ізонікотиногідразиду гідробромід формули: 6 UA 119202 U , що проявляє протитуберкульозну активність. 5 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7