Ін’єкційний лікувальний засіб “цитофлавин”, який має цитопротекторну дію

Ін'єційний лікарський засіб, який має цитопротекторну дію, що містить активну композицію при родних метаболітів та коферментів у розчиннику, який відрізняється тим, що як природні метаболіти містить янтарну кислоту та рибоксин (інозин), як коферменти - нікотинамід і рибофлавш-5-мононуклеотид натрію, як розчинник - воду для ІН'ЄКЦІЙ, а також додатково містить натрію гідроокис та N-метилглюкамш при такому співвідношенні компонентів, мас , % янтарна кислота рибоксин (інозин) нікотинамід рибофлавін-5-мононуклеотид натрію натрію гідроокис N-метилглюкамш вода для ІН'ЄКЦІЙ 9,5-Й 0,5 1,9-Ь2,1 0,95-И ,05 0,19-5-0,21 3,3-ьЗ,7 15,7-Й 7,3 ДО 100 О Винахід належить до медицини, зокрема до комплексного лікарського ІН'ЄКЦІЙНОГО препарату, що має цитопротекторну дію Препарат може бути використаний для лікування гострого інфаркту, ішемії головного мозгу, ппоксичного інсульту, коронарної недостатності, ішемічної хвороби серця, захворювань печінки та нирок Відома велика КІЛЬКІСТЬ різних фармакологічних активностей янтарної кислоти, її солей - сукцинатівта похідних Серед них - антиппотичний засіб на основі сукцината янтарної кислоти для лікування внутрішньоутробної патології плода, що зв'язана з ГІПОКСІЄЮ та інфекцією (патент Роси 2056842, МПК А61К 1/19, ЗО 06 92, гепатопротекторний засіб на основі похідних янтарної кислоти (патент Японії 09/188 664, МПК С07С 323/51, 22 07 97), лікарський засіб для лікування ішемії мозку на основі сукцинату янтарної кислоти (патент Роси 2108095, МПКА61К31/19, 2211 94) Проте в списку дозволених до медичного використання та впроваджених у медичну практику лікарських засобів, що містять янтарну кислоту як основний активний компонент, є єдина лікарська форма - таблетки "Лимонтар" (0,2г вільної янтар ної кислоти та 0,05г лимонної кислоти), які застосовують у дорослих як діагностичні засоби для дослідження секреторної здатності шлунка (Машковский М Д Лекарственные средства, т 2 , — изд 13-ое, Харьков, "Торсинг", 1997, с 494) Широкий спектр фармакологічної активності янтарної кислоти обумовлено тим, що вона є природним метаболітом організму, беручи участь в окислювально-відновному циклі дикарбонових кислот (цикл Кребса) і забезпечуючи тим самим нормальну ЖИТТЄДІЯЛЬНІСТЬ клітини Відомо також комплексні препарати на основі природних пуринових нуклеозидів, наприклад, інозин (рибоксин), гуанозин, аденозин, що використовуються як лікарські засоби вузькоспрямованої дії, або кардюпротекторної (патент Роси 1769428, МПК А61К 31/70, 09 04 90, патент Роси 2035908, МПК А61К 31/52, 24 09 91), або геп ато протекторної дії (патент Японії 61,277619, МПК А61К 31/505, 04 01 85) Найбільш близьким до лікарського засобу, що заявляється, є ІН'ЄКЦІЙНИЙ лікарський препарат вузько спрямованої гепатопротекторної дії, який містить у своєму складі суміш метаболітів та вітамінів (патент Великобританії 1178984, МПК А61К 25/00, 23 06 66) такого складу ю (О ю 00 ю 58565 об'ємом 5мл Вихід 90% 0,9мг Кожна ампула містить - янтарної кислоти 0,5мг 500мг (10%), рибоксину 100мг (2%), рибофлавшу5-мононуклеотиду натрію Юмг (0,2%), натрію гід0,5мг роокису 170мг (3,4%), N-метилглюкамшу 825мг 60,0мг (16,5%), води для ІН'ЄКЦІЙ ДО 100% 20,0мг 10,0мг Використання даного лікарського засобу до2,73мг зволило отримати високий цитопротекторний ефект на різних моделях пошкодження клітин при для ІН'ЄКЦІЙ ДО 3,0Г патології серця, печінки та нирок Проте при тяжких патолопях виникає потреба Вивчення цитопротекторної активності препав комплексних лікарських препаратах, що захирату щають уражену клітину та одночасно нормалізуВивчення лікарського засобу, що заявляється, ють її ЖИТТЄДІЯЛЬНІСТЬ проводили в порівнянні з прототипом При різних патологічних процесах в організмі Дослід 1 Вивчення кардюпротекторної дії на нормальна ЖИТТЄДІЯЛЬНІСТЬ КЛІТИН порушується, моделі антиаритмічної активності що виявляється погіршенням дихальної (окислюВраховуючи, що аритмії є одним з перших повально-відновної) функції клітин, зменшенням або казників розвитку патології клітин міокарду при припиненням синтезу білків і ферментів клітиною, різних серцево-судинних, захворюваннях, які суіншими порушеннями Остаточно ці порушення проводжуються ушкодженням клітин міокарду, призводять до ушкодження клітинних мембран, таких як гострий інфаркт міокарду та ішемічна зниження рівня утилізації метаболітів, загибелі хвороба серця, для оцінки цитопротекторної дії "Цитофлавіну" на клітини міокарду видавалося КЛІТИН необхідним вивчити та оцінити перш за все антиТому створення комплексних лікарських преаритмічну активність лікарського засобу, що пропаратів, які захищають клітину від руйнування та понується загибелі та сприяють її нормальній ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ, так званих цитопротекторів, є актуальною і важДослід проводили на ЛІНІЙНИХ білих мишах СВА, яких було поділено на п'ять груп по 25 тваливою задачею рин Такі препарати повинні містити як речовини, Експериментальну аритмію серця моделюващо сприяють посиленню метаболічних процесів, ли загальноприйнятим методом - введенням алкатак і компоненти, що сприяють швидкій та ефектилоїду аконітину підшкірно в разовій дозі 200мкг/кг вній утилізації метаболітів в клітинах уражених маси тварини та пропранолу підшкірно в разовій органів і тканин дозі 40мг/кг В зв'язку з цим заявник розробив комплексний Введення алкалоїду аконітину в організм випрепарат, що має цитопротекторну дію, до складу кликає стійке підвищення натрієвої проникності якого включено як компоненти метаболітної примембран кардюмюцитів (Орлов Б Н Ядовитые роди (янтарна кислота і рибоксин), так і кофермеживотные и растения СССР — М — Высшая тні компоненти - вітаміни (нікотинамід та рибошкола, 1990, с 192-194) флавш-5-мононуклеотид натрію), при такому Введення пропранолу, викликає брадикардію співвідношенню компонентів, мас % серця за рахунок блокади р-адренорецепторів у Янтарна кислота 9,5-ь 10,5 міокарді та зміни внутрішньоклітинного співвідноРибоксин(шозін) 1,9 -ь 2,1 шення ІОНІВ калію і натрію (Working Group on Нікотинамід 0,95 -ь 1,05 Anthmias-Circulation — 1991, V 84, № 4, p 1831 Рибофлавін-5-мононуклеотид на1851) трію 0,19 ч-0,21 "Цитофлавін", прототип і контроль - 0,9% ІЗОНатрію гідроокис 3,3 -ь 3,7 ТОНІЧНОГО розчину хлориду натрію вводили внутріN-метилглюкамш 15,7 -ь 17,3 шньовенно в хвостову вену в разовій дозі 1,2мл/кг вода для ІН'ЄКЦІЙ ДО 100 маси тварини, одноразово за п'ять хвилин до ввеПриклад конкретного отримання "Цитофлавідення аконітину або пропранолу Запис електрону" для ІН'ЄКЦІЙ кардіограми у мишей проводився на початку доУ скляний апарат з мішалкою ємністю 100л сліду, а далі - через 10, ЗО та 60 хвилин після завантажують 50,0л води для ІН'ЄКЦІЙ, 10,0кг янтавведення препаратів рної кислоти, 3,4кг їдкого натрію, 0,6кг рибофлавіДля визначення часу виникнення та тривалості ну-5-мононуклеотиду натрію, 16,5кг Nекстрасистолії під час досліду проводився монітометилглюкамшу, 1,0кг нікотинаміду, 2,0кг рибоксиринг електрокардіограми протягом 60 хвилин ну Одержану суміш перемішують до повного розОтримані експериментальні дані були обробчинення компонентів і потім додають воду для лені статистично з використанням критерію Ст'юІН'ЄКЦІЙ ДО отримання об'єму 100л Одержаний дента при Р < 0,05 розчин фільтрують крізь стерилізуючий фільтр Дані по випробуванню антиаритмічної активтипу "Палл", розливають у стерильні ампули об'ності препаратів наведені в Таблиці 1 ємом 5мл та запаюють Отримують 18000 ампул Кальцієва сіль 1-L-5формілтетрапдрофолієвої кислоти Гідроксикобаламшу пдрохлорид Ціанкобаламш Рибоксин Аденін Нікотинамід Рибофлавін-5-мононуклеотид натрію Решта дистильована стерильна вода 58565 Таблиця 1 Вплив розчину "Цитофлавін" і прототипу на аконітиновута пропранолову аритмію у мишей Препарат, який використано у ДОСЛІДІ Аконітин Аконітин + "Цитофлавін" Аконітин + прототип Пропранол Пропранол + "Цитофлавін" Пропранол + прототип Число мишей з екстрасистолією, % 100,0 Латентний період до екстрасистолії, хвил 32,0 ± 2,8* 25,0 Тривалість екстрасис- Число екстрасистолії, хвил толії 19,6 ±1,3* 306 ±14* 21,3 ±1,7* 11,4 ±1,5* 127 ±11 * 75,0 100,0 29,6 ± 2,2* 18,6 ±1,4* 19,2 ±1,1 10,4 ±1,1* 312 ±15* 359 ± 23* 40,0 13,2 ±1,2* 6,2 ±1,0* 112±9* 50,0 16,4 ±1,2* 10,5 ±1,0* 208 ± 20* Примітка * - вірогідність різниць при Р < 0,05 При моделюванні аконітинової аритмії введення аконітину викликало полігонну екстросистолію у 100% тварин (див Табл 1) При введенні "Цитофлавшу" в дозі 1,2мл/кг за 5 хвил до введення аконітину екстрасистолія розвивалася лише у 25% мишей, при цьому період екстрасистолії зменшився на 35%, а саме, число екстасистол зменшилося в 2,4 раза Таким чином, "Цитофлавін" проявив виявлену цитопротекторну антиаритмічну дію на клітини міокарду на моделі антинітинової аритмії Враховуючи механізм дії алкалоїду аконітину, механізм захисної дії "Цитофлавшу" обумовлено стабілізацією мембран клітин кардюмюцитів та зниженням їх проникності для ІОНІВ натрію Навпаки, при введенні розчину прототипу за 5 хвил до введення аконітину розвивалася цілком протилежна картина екстрасистолія спостерігалася у 75% мишей, а латентний період, тривалість та загальне число екстрасистол взагалі не змінилося в порівнянні з аконітином Таким чином, прототип проявляв слабо виражену захисну антиаритмічну активність на клітини міокарду на моделі антинітинової аритмії та не мав на даній моделі стабілізуючої дії на клітини кардюмюцитів При аритмії, що викликана введенням пропранолу, політонна екстрасистолія також викликалася у 100% мишей При попередньому введенні "Цитофлавшу" в дозі 1,2мл/кг у хвостову вену за 5 хвил до введення пропанолу екстросистолія розвивалася у 40% тварин, при цьому латентний період екстрасистолії зменшився на 29%, а загальне число екстрасистол зменшилося в 3,2 раза Отримані дані свідчать про високий цитопротективний ефект "Цитофлавіну" на клітини міокарду на моделі аритмії, яка викликана введенням пропранолу Механізм захисної дії обумовлено нормалізацією біохімії натрій/калієвого обміну крізь мембрану клітини При введенні розчину прототипу політомна екстросистолія виявлялася у 50% мишей, латентний період екстрасистолії практично не змінився, а середнє число екстрасистол зменшилося тільки в 1,7 раза (Табл 1) Це свідчить про помірну захисну дію прототипу на клітини міокарду Таким чином, на моделі пропранолової аритмії "Цитофлавін" також проявляє виражену цитопротекторну антиаритмічну дію, а розчин-прототип має тільки слабий захисний антиаритмічний ефект Така різниця пояснюється створенням оптимальної комбінації природних метаболітів - янтарної кислоти (енергетичний компонент), рибоксину (субстрат для синтезу АТФ) та коферментіввітамшів для одержання цитопротекторного ефекту Внаслідок прискорення засвоєння клітинами організму метаболітів виникає прискорення біохімічних процесів всередині клітини та здійснюється протекторна дія на клітини міокарду - кардюмюцити Дослід 2 Вивчення кардюпротекторної дії на моделі ішемії міокарду Ішемія (нестача кисню) в клітинах міокарду призводить до порушення біохімічних процесів всередині кардюмюцитів, що зв'язані зі споживанням енергії з наступним некрозом (руйнуванням) клітинної мембрани Дослідження протиішемічної активності "Цитофлавшу" в порівнянні з розчином-прототипом проводили на білих ЛІНІЙНИХ щурах породи Вистар Усі тварини були поділені на три групи по 25 голів Для досліджень використовували загальноприйняту модель ішемії, що викликана оклюзією (хірургічним зменшенням діаметра судини - перев'язкою) лівої коронарної артерії (Winslow E Methods for the detection and assessment of antiarrhythmic activity / Pharmacology and therapy — 1984 V 84, p 401 - 433) Дана модель найкраще ілюструє розвиток гострого інфаркту міокарду в людини Щурів наркотизували внутрішньочеревинним введенням етамшалу натрію в дозі 50мг/кг, фіксували та здійснювали реєстрацію елекрокадюграми Щурів з порушенням ритму із досліду виводили Всього було відібрано 36 щурів, розділених на три групи по 12 тварин У тварин, що лишилися, катетеризували стегнову вену та стегнову артерію Потім при штучній вентиляції легким щурам розкривали грудну клітину та перев'язували низхідну гілку лівої коронарної 58565 8 артерії у нижнього краю вушка лівого передсердя нки дихання, що викликається постоперацшним У всіх тварин реєстрували середній артеріальний пневмотораксом За даними електрокардіограми тиск у стегновій артерії за допомогою ртутного оцінювали частоту серцевих скорочень, середній манометра та здійснювали 30-хвилинне моніторуартеріальний тиск, частоту виникнення та сумарну вання електрокардіограми для виявлення ранніх тривалість періодів фібриляції та шлункової тахішлункових аритмій, що розвиваються на фоні кардії ішемії міокарду Ефективність препаратів по загальнозахисній Першій групі тварин вводили "Цитофлавін" у цитопротекторній дії на клітини організму оцінювахвостову вену в дозі 1,2мл/кг через п'ять хвилин ли за летальністю в кожній групі після перев'язки Протягом всього досліду в усіх тварин реєстрували артеріальний тиск у стегновій вені та зніДругій групі вводили розчин прототипу в дозі мали електрокардіограму через 1, 5, 15, ЗО, 45 і 60 1,2мл/кг хвилин від початку введення розчинів у хвостову Третій контрольній групі вводили в хвостову вену вену 0,9% фізіологічного розчину хлориду натрію в дозі 1,2мл/кг Статистичну значимість оцінювали за допомоПротягом всього досліду продовжували штучгою критерію Ст'юдента Узагальнені дані по ексну вентиляцію легенів з метою профілактики зупиперименту наведені в Таблиці 2 Таблиця 2 Протиішемічний ефект "Цитофлавшу" Розчин* препаратів "Цитофлавін" Прототип Контроль Тахікардія Тривалість, Частота, % сек* 100 42 ± 3 * 100 90 ± 7 * 100 127 ±23* Число шлункових екстросистол 137 ±12* 221 ±15* 359 ± 24* Фібриляція шлуночків Частота виникнення Тривалість, порушень, % сек* 40 28 ± 5 60 27 ± 3 86 28 ± 4 Примітка * - вірогідність різниць при Р < 0,05 Результати дослідження протиішемічної активності "Цитофлавіну" показали, що при ішемії серця препарат вірогідно в 2,62 раза знижує КІЛЬКІСТЬ шлуночкових екстрасистолій у порівнянні з контролем та в 1,6 раза в порівнянні з прототипом Тривалість тахікардії зменшилася в 3 рази в порівнянні з контролем та в 2,1 раза в порівнянні з прототипом, хоча частота виникнення тахікардії не зменшилася в усіх випадках "Цитофлавін" також вірогідно зменшив частоту фібриляції шлуночків у 2,2 раза в порівнянні з контролем та в 1,5 раза в порівнянні з прототипом, хоча практично не впливав на тривалість часу фібриляції Отримані дані свідчать про високу цитопротекторну активність "Цитофлавіну" на клітини міокарду за умов ішемії Дані по виживанню тварин в умовах експерименту також свідчать про високу цитопротекторну активність "Цитофлавіну", при введенні якого після операції перев'язки вижило 100% (12 щурів), при введенні прототипу - 50% (6 щурів), а при введенні контрольного фізіологічного розчину - лише 25% (З щури) (див Таблицю 3) Таблиця З Вплив "Цитофлавіну" на виживання тварин в умовах виникнення ранніх постішемічних аритмій Препарат "Цитофлавін" Прототип Контроль КІЛЬКІСТЬ прооперованих щурів 12 12 12 Моніторинг середнього артеріального тиску та частоти серцевих скорочень (див Таблицю 4) показали, що "Цитофлавін" швидше за прототип відновлював середній артеріальний тиск у ранньому періоді після оклюзм, практично не впливаючи на частоту серцевих скорочень Такий ефект свідчить Виживання після 60 хвилин ішемії міокарду КІЛЬКІСТЬ 12 6 3 % 100 50 25 про більш виражену компенсаторну дію "Цитофлавіну" в порівнянні з контролем та з прототипом у відновленні біохімічних процесів, що відбуваються в клітинах при ішемії кардюміцитів, і, отже, про загальну цитопротекторну дію на міокард 58565 10 Таблиця 4 Вплив "Цитофлавіну" на середній артеріальний тиск (CAT) та частоту серцевих скорочень (ЧСС) за умов виникнення ранніх постішемічних аритмій Показник Препарат "Цитофлавін" CAT у % до поПрототип чаткового Контроль "Цитофлавін" ЧСС у % до поПрототип чаткового Контроль 0 100 100 100 100 100 100 Час ішемії 15 67 ± 2 * 59 ± 5 * 44 ± 5 * 93 ± 6 * 90 ± 6 * 83 ± 4 * 5 57 ±12 45 ± 8 31 ± 5 94 ±12 92 ±16 85 ± 7 міокарду, хв ЗО 45 72 ± 4 * 73 ± 1 * 65 ± 7 * 67 ± 6 * 53 ± 9 68 ±12 95 ± 8 * 95 ± 8 * 86 ± 5 * 84 ± 6 * 82 ± 5 * 80 ± 6 * 60 73 ± 4 * 73 ± 7 * 73 ± 6 * 96 ± 8 * 82 ± 5 * 75 ± 8 * Примітка * - вірогідність різниць при Р< 0,05 Дослід 3 Дослідження гепатопротекторної та репопротекторної активності "Цитофлавіну" при отруєнні етиленгліколем Для моделювання уражених клітин печінки та нирок використали загальновідому модель токсичного гепатиту та нефрозо-нефриту - отруєння 1,2етиленпколем (Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевтических исследований Под ред Н В Лазарева М «Медгиз», 1964, 392с) У ДОСЛІДІ було сформовано 6 експериментальних груп тварин по 12 щурів-самок А - інтактні тварини, яким вводили фізіологічний розчин, Б інтактні тварини, яким вводили «Цитофлавін», В інтактні тварини, яким вводили прототип, Г - тварини з інтоксикацією етиленгліколем без лікування, Д - тварини з інтоксикацією та лікуванням «Цитофлавіном», Е - тварини з інтоксикацією етиленгліколем та лікуванням прототипом Етиленгліколь вводили одноразово внутрішньошлунково крізь атравматичний зонд у дозі 1,5г/кг «Цитофлавін», прототип та фізіологічний розчин у контролі вводили в хвостову вену щурів один раз на добу протягом п'яти днів у дозі 1,2мл/кг БІОЛОГІЧНІ дослідження проводили за стандартними методиками (Стальная И Д , Гаришвилй Т Г Современные методы в биохимии М Медицина, 1978 95с, Клиническая оценка лабораторных тестов / Под ред Н У Тица, М Медицина, 1986, 480с) Отримані експериментальні дані обробляли статистичними методами за Ст'юдентом - Фішером Клінічна картина в групі щурів, що отримали етиленгліколь без лікування, характеризувалася гіподинамією, загальмованістю реакцій, скуйовдженістю шерсті та неохайністю тварин На 2-ий день у них розвилася макрогематурія, а з 4-го дня - олігурія БІОХІМІЧНИЙ І ГІСТОЛОГІЧНИЙ аналіз печінки та нирок підтвердив розвиток ураження нирок і печінки - нефрозо-нефриту та токсичного гепатиту Інтоксикація етиленгліколем порушувала всі функції печінки білковосинтезуючу та пігментну, що супроводжувалося біохімічними ознаками цитолізу У всіх тварин без винятку розвивалися виражені симптоми ураження нирок в аналізі сечі визначалися еритроцити, білок, циліндри, кристали щавлевого кальцію, клітини ниркового епітелію Страждали всі функції нирок - видільна, екстреторна та секреторна, а в крові наростали продукти азотистого обміну, показники цитолізу При морфологічному обстеженнів нирках виявлялися дегенеративні зміни та дрібні крововиливи в паренхіму органів, спостерігалася жирова дистрофія нейроепітелію, в цитоплазмі клітин звитих канальців було видно краплі жиру Гепатопротекторну ефективність "Цитофлавіну" в порівнянні з прототипом висновували за КЛІНІЧНОЮ картиною, вмістом загального білірубіну, аланш-амінотрансферази (АЛТ), аспартатамінотрансферази (ACT), лужної фосфатази, загального білка, ЛІПІДІВ сироватки, глікогену, глутатюну в печінці та навантажувальною пробою - гексеналовим тестом Експериментальні дані по гепатопротекторній дії "Цитофлавіну" наведені в Таблиці 5 Таблиця 5 Гепатопротекторний ефекті "Цитофлавіну" в порівнянні з прототипом Показники Загальний лок, г/л бі Загальні ЛІПІДИ, г/л ACT, мкат/л ЩФ, мкат/л Експериментальні групи В Г Прототип Без лікування А фіз розчин Б Цитофлавін Д Цитофлавін Е Прототип 64 ± 2 65 ± 5 64 ± 6 40 ± 4 * 58 ± 4 * 46 ± 5 * 3,7 ±0,3 3,7 ±0,3 3,5 ±0,1 3,0 ±0,3* 3,4 ±0,1* 3,4 ±0,1* 0,60 ± 0,05 0,69 ±0,11 0,60 ± 0,06 0,69 ±0,12 0,60 ± 0,06 0,69 ±0,11 0,99 ±0,12* 2,65 ± 0,24* 0,73 ± 0,06* 0,73 ± 0,04* 0,88 ±0,12* 0,96 ±0,14* 11 58565 12 Продовження таблиці 5 Показники КФ, мкат/л Тимолова проба, од АЛТ, мккат/л Глутатюн печінки, мг % Глікоген печінки, мг % Гексеналовий сон, хвил Загальний білірубін А фіз розчин 0,74 ±0,12 Б Цитофлавін 0,75 ±0,11 Експериментальні групи В Г Прототип Без лікування 0,73 ±0,12 1,99 ±0,20* Д Цитофлавін 0,72 ± 0,04* Е Прототип 0,96 ±0,11* 1,46 ±0,04 1,48 ±0,03 1,43 ±0,12 5,77 ± 0,26* 1,56 ±0,12* 2,88 ±0,13* 0,20 ± 0,03 0,20 ± 0,02 0,25 ± 0,04 1,68 ± 0,11* 0,32 ± 0,06* 0,52 ± 0,08* 160 ± 5 155 ± 5 170 ± 12 70 ±10* 130 ±10* 100 ±10* 2500 ±100 2400 ± 90 2460 ±110 850 ± 80* 2000 ±150* 1800 ±200 25,0 ±1,5 26,0 ±1,8 24,0 ±1,6 46,5 ± 2,5* 27,0 ±1,5* 35,2 ±1,0* 3,0 ±0,3 3,0 ±0,1 3,2 ±0,2 6,8 ±0,4* 3,2 ±0,2* 4,2 ±0,1* інтактні тварини ДОСЛІДНІ тварини Примітка * - вірогідність різниць при Р < 0,05 ACT - аспартат-амшотрансфераза ЩФ - лужна фосфатаза КФ - креатин фосфат АЛТ - аланш-амшотрансфераза Досліди показали, що введення "Цитофлавшу" та прототипу здоровим тваринам (групи А, Б, В) не викликало порушень функцій печінки та поведшкових реакцій щурів Введення етиленгліколю (група Г) супроводжувалося серйозним порушенням усіх функцій печінки Зниження загального білка та ЛІПІДІВ І запасу глікогену в печінці свідчить про порушення білковосинтезуючої функції печінки Наростання рівня амінотранфераз, лужної фосфатази, білірубіну та тимонової проби свідчить про значне руйнування клітин печінки - гепатоцитів та про порушення пігментної функції Збільшення часу гексанового сну, зниження рівня відновлюваного глутатюну і креатинфосфату показує зменшення детоксикуючої функції печінки Використання "Цитофлавшу" для лікування ураження печінки, викликаного етиленгліколем (група Д), показало вірогідну нормалізацію усіх функцій печінки білковосинтезуючої (загальний білок, ЛІПІДИ, глікоген) до 80 - 91% від норми, піг ментної (білірубін, амінотрансферази, лужна фосфата, тимолова проба) до 62 - 97% від норми, детоксикуючої (гексеналовий сон, глутатюн, креатинфосфат) на рівень 82 - 97% від норми (група А) Лікування прототипом (група Е) також мало позитивний ефект після отруєння етиленгліколем, проте прототип відновлював білковосинтезуючу функцію печінки на 60 - 90%, пігментну - на 68 71%, а детоксикуючу - всього на 50 - 70% Таким чином, "Цитофлавін" має виражену цитопротекторну дію на клітини печінки - гепатоцити при отруєнні етиленгліколем (дивись Таблицю 5) Ефективність "Цитофлавіну" як ренопротектора (захисту клітин нирок) оцінювали за комплексом біохімічних показників у порівнянні з нормою, контрольною групою та прототипом відносною масою нирок, добовим діурезом, білком сечі, хлоридами сечі, цукром сечі, сечовиною, креатиніном, лактатдепдрогеназом Експериментальні дані по ренопротекторній дії "Цитофлавіну" наведені в Таблиці 6 Таблиця 6 Ренопротекторний ефект "Цитофлавіну" в порівнянні з прототипом, М ± Показники Маса тіла, г Відносна маса нирок, г Добовий діурез, мл Білок сечі, мг/мл Хлориди сечі, мг/мл А Б фіз розчин цитофлавін Експериментальні групи Г В на лікуванПрототип ні 188 ± 11 154 ± 11* Д Цитофлавін Е Прототип 181 ±11 160 ± 11 184 ± 6 183 ± 7 7,9 ±0,9 7,8 ±1,2 7,7 ±1,0 11, 2 ±1,5* 8,4 ±0,7 10,8 ±1,1 3,7 ±0,2 4,4 ±0,5 4,0 ±0,3 3,5 ±0,3 4,5 ±0,4 3,8 ±0,4 3,5 ±0,4 4,5 ±0,4 4,0 ±0,3 1,9 ±0,3* 12,4 ±1,3* 1,2 ±0,3* 2,8 ±0,4* 6,0 ±0,6* 3,3 ±0,3* 1,9 ±0,5 8,7 ±0,8* 2,5 ±0,4* 13 58565 14 Продовження таблиці 6 Показники А фіз розчин Б цитофлавін Цукор сечі, моль/л 1,5 ±0,5 1,4 ±0,3 Сечовина, моль/л 4,12 ±0,34 4,22 ± 0,28 ЩІЛЬНІСТЬ сечі 1,02 ±0,006 1,02 ±0,005 Креатинш, ммоль/л 0,075 ± 0,012 0,0075 ± 0,012 Лактатдегідрогеназа, ммоль/год/л 4,90 ± 0,26 Експериментальні групи Г В на лікуванПрототип ні 1,6 ± 0,1 4,2 ±0,3* 12,35 ± 4,18 ±0,32 0,77* 0,91 ± 1,02 ±0,004 0,006* 0,065 ± 0,073 ±0,011 0,08* 4,77 ± 0,33 4,87 ±0,31 8,08 ± 0,76* Інтактні тварини Д Цитофлавін Е Прототип 2,4 ±0,4 3,0 ±0,5 5,17 ± 0,11* 8,77 ± 0,52* 1,02 ±0,003* 1,00 ± 0,003* 0,047 ± 0,04* 0,35 ± 0,09* 5,85 ± 0,55* 7,93 ± 0,62* ДОСЛІДНІ тварини Примітка * - вірогідні відзнаки від інтактних тварин при Р < 0,05 Експериментальні дані показали, що введення як "Цитофлавшу", так і прототипу здоровим тваринам (групи А, Б, В) не виявило негативного впливу на функціональну активність нирок В умовах патології - отруєння етиленгліколем (група Г) у щурів збільшувалася маса нирок, що свідчить про набряк Вірогідне збільшення в сечі вмісту білка, хлоридів, цукру, сечовини та збільшення ЩІЛЬНОСТІ сечі свідчать про порушення екстреторної та секреторної функції нирок Різке зменшення добового об'єму сечі на фоні підвищення рівня креатину та ферменту лактатдегідрогенази свідчить про порушення клітин ниркових канальців, розвиток нефрозо-нефриту та внаслідок цього - анурії Використання "Цитофлавшу" (група Д) для лікування ураження нирок, викликаного етиленгліколем, показало відновлення функціональної активності нирок за всіма показниками набряк різко зменшився (маса нирок стала 94% від норми), екстреторна функція (діурез, ЩІЛЬНІСТЬ сечі, креатинш) відновилася на 62 - 100%, секреторна функція (вміст у сечі білка, цукру, хлоридів, сечовини, рівень лактатдегідрогенази) поліпшилася до 62 82% від норми Застосування прототипу (група Е) для лікування також мало позитивний лікувальний ефект при нефро-нефриті, але за різними показниками було менш ефективне, ніж у "Цитофлавшу" маса нирок була 73% від норми, екскреторна функція відновилася на 51 - 93%, а секреторна функція на 45 60% від норми (дивись Таблицю 6) Аналіз ГІСТОЛОГІЧНИХ даних у тварин груп Д та Е також показав зменшення дистрофічних змін у тканині нирок та печінки, яке більш яскраво виражене в групі Д при лікуванні "Цитофлавіном" Таким чином, "Цитофлавін" виявляє виражений цитопротекторний ефект на клітини нефроепітелію та гепатоцити, який перевищує дію прототипу при експериментальному гепатиті та нефрозонефриті, викликаному застосуванням етиленгліколю Таким чином, вивчення біологічної активності препарату показало, що він має цитопротекторну дію, тобто виявляє захисний ефект на клітини серця та печінки, нормалізуючи роботу цих органів при різних патолопях Для створення стабільної лікарської форми експериментально підібрані необхідні КІЛЬКОСТІ Nметилглюкамшу та натрію гідроокису Ці компоненти не є активними компонентами лікарської форми, але забезпечують необхідні фізико-хімічні параметри Дослід 4 Вивчення впливу вмісту Nметилглюкамшу та гідроокису натрію на стабільність "Цитофлавшу" Враховуючи складний багатокомпонентний склад "Цитофлавшу" та наявність у ньому N-нуклеозиду - рибоксину (шозину) та рибофлавіну мононуклеотиду, що легко гідролізуються у водних розчинах по N-глікозидному зв'язку в кислотній та лужній середі (Справочник биохимика перевод с англ / Досон Р , Эллиот Д, Джонс К — М МИР, 1991, с 71 - 88, 115), було проведено дослідження впливу вмісту стабілізатора та комплексоутворювача N-метиленглюкамшу на рН розчину та стабільність (відсутність розпаду компонентів) при дворічному зберігання при кімнатній температурі водного розчину "Цитофлавін" - препарат, призначений для внутрішньовенного введення Розчини, що вводяться у кров'яне русло, повинні фізіологічно сполучатися з фізико-хімічними параметрами крові, зокрема з рН Введення кислих та/або лужних розчинів у кров'яне русло є неприпустимим, тому що це може призвести до утворення тромбів, пошкодження стінок вен, виведення в осад лікарських речовин та до закупорки великих та дрібних кровоносних сосудів (И Л Муравьев — Технология лекарств, т 2, М — Медицина, — 1980, — с 622 689, Государственная фармакология СССР, М — Медицина, 1990 — с 140) Було досліджено вплив КІЛЬКОСТІ натрію гідроокису на величину рН розчину препарату та властивості лікарської форми (Таблиця 7) 15 58565 16 Таблиця 7 Вплив вмісту натрію гідроокису на рН розчину "Цитофлавшу" гідроокису, % Значення рН розчину А 0 4,01 Б 1 4,88 В 2 5,7 Г 3,3 6,4 Д 3,7 7,2 Е 5 8,3 Варіант КІЛЬКІСТЬ натрію Характеристика отриманого розчину Неповне розчинення янтарної кислоти Неповне розчинення янтарної кислоти Примітка Лікарська форма не придатна для використання Лікарська форма не придатна для використання Розчин не придатний для внуКисле значення рН трішньовенного введення ФІЗІОЛОГІЧНО прийнятне Розчин придатний для внутзначення рішньовенного введення ФІЗІОЛОГІЧНО прийнятне Розчин придатний для внутзначення рішньовенного введення Розчин не придатний для внуЛужне значення рН трішньовенного введення Проведені дослідження показали, щооптимальним для даної лікарської форми є вміст натрію гідроокису в КІЛЬКОСТІ 3,3 - 3,7% Експериментальні дані досліду наведені в Таблиці 8 Таблиця 8 Вплив вмісту N-метилглюкамшу на рН та стабільність "Цитофлавшу" Варіант Вміст Nметилглюкамшу, % А 0 Б 5,0 В 10,0 Г Д 15,7 17,3 Е 20,0 Ж 25,0 Характеристика стабільності лікарської форми При зберіганні випадає осад - виникає кислий гідроліз При зберіганні випадає осад - виникає кислий гідроліз Розчин стабільний при зберіганні, але має кисле значення рН Розчин стабільний при зберіганні Розчин стабільний при зберіганні Розчин стабільний при зберіганні, але має лужне значення рН Розчин при зберіганні чорніє - виникає лужний гідроліз Проведені дослідження показали, що для створення стабільного лікарського засобу оптимальним є вміст N-метилглюкаміну в "Цитафлавші" від 15,7 до 17,3% - варіанти Г, Д (Таблиця 8) та вміст гідроокису натрію від 3,3 до 3,7% - варіанти Г, Д (Таблиця 7) Дослід 5 Визначення гострої токсичності "Цитофлавшу" Примітка Для використання не придатний Для використання не придатний Не придатний для внутрішньовенного введення Придатний для використання Придатний для використання Не придатний для внутрішньовенного введення Для використання не придатний Визначення гострої токсичності "Цитофлавшу" проводили на ЛІНІЙНИХ білих мишах-самцах СВА в групах по 10 тварин Препарат вводили в хвостову вену в зростаючих дозах за Вільконсоном-Літчфільдом та визначали показник ЛДбо - дозу препарату, що викликає загибель 50% тварин Результати дослідження наведені в Таблиці 9 Таблиця 9 Гостра токсичність "Цитофлавшу" Доза "Цитофлавшу", мг/кг Вижило мишей Загинуло мишей 794 10 0 Результати досліду показали, що препарат "Цитофлавін" належить до малотоксичних сполук ЛД5о складає 1146 ± 124мг/кг 1000 6 4 1260 4 6 1580 0 10 2000 0 10 На слово "Цитофлавін" подана заявка № 98708522 на реєстрацію товарного знаку в РОСІЙСЬКІЙ Федерації, дата подання 19 05 98 17 Комп'ютерна верстка А Крулевський 58565 18 Підписано до друку 05 09 2003 Тираж 39 при м Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна