Мультиплексна плр тест-система для детекції збудника туляремії

Реферат: Мультиплексна ПЛР тест-система для детекції збудника туляремії, що містить більше однієї пари праймерів, специфічних до ДНК-мішеней хромосоми туляремійного мікроба, причому одна пара праймерів є специфічною до ділянки гена lрnА (білок 17 кД), видоспецифічної для F. tularensis, а дві інші - до локусу FT-M19 і ділянки області відмінностей RD1 (фрагмент RDA), розмір ампліконів яких диференціює F. tularensis на рівні субвидів і становить для F. tularensis holarctica 220 і 177, а для F. tularensis tularensis 250 і 350 пар нуклеотидів за умов режиму термоциклювання: 95 °C - 5 хв, 42 цикли (95 °C - 10 сек., 61 °C - 10 сек., 72 °C - 10 сек.), заключний етап 72 °C - 2 хв, складу реакційної суміші: 10хПЛР-буфер, дНТФ (1 мМ) - 1-2 мкл, Taq-ДНК-полімерази (5 од./мкл) - 0,2-0,4 мкл, що забезпечує можливість в одній пробі одночасної індикації та ідентифікації збудника туляремії на рівні виду та субвиду. UA 75546 U (12) UA 75546 U UA 75546 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, зокрема, до медичної мікробіології, а саме, для виявлення та ідентифікації збудника туляремії, і може бути використана для санітарноепідеміологічних установ та наукових досліджень. Туляремія є однією з найбільш поширених в світі зоонозних інфекцій. В останні роки спалахи і спорадичні випадки туляремії реєструються не тільки в ендемічних регіонах, але і на нових географічних територіях (Швеція, Росія, Фінляндія, Іспанія, США). В Україні природні вогнища туляремії зареєстровані в 23 з 25 областей. З чотирьох відомих підвидів Francisella tularensis [1] захворювання людей спричиняють два: високовірулентний підвид F. tularensis tularensis (тип А), що циркулює в Північній Америці, і менш вірулентний F. tularensis holarctica (тип В), ендемічний для всіх континентів Північної півкулі. Традиційні бактеріологічні, біологічні та біохімічні методи виявлення та ідентифікації збудника туляремії складні і тривалі. Разом з тим, контроль за епідемічною та епізоотичною ситуацією вимагає швидких і високочутливих методів виявлення збудника туляремії та прогнозування потенційної епідемічної небезпеки природних вогнищ. Останнім часом розробляються високоефективні методи молекулярно-генетичної детекції та ідентифікації мікроорганізмів, що відрізняються високою специфічністю і чутливістю. Найбільш широко з цією метою використовується полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), яка основана на прямому визначенні специфічних фрагментів геному збудника хвороби [1, 2, 3, 4]. Актуальність створення генодіагностичної ПЛР тест-системи для детекції та ідентифікації збудника туляремії обумовлена відсутністю в Україні вітчизняних ПЛР тест-систем, наявністю на території України численних природних вогнищ туляремії, здатністю збудника туляремії персистувати в природних резервуарах тривалий час, активізацією епідпроцесу в останні роки, непередбачуваністю спалахів захворювань, можливістю використання туляремійних мікробів в якості агента біотероризму. Зростання кількості лабораторій, які використовують молекулярногенетичні технології, визначають особливу актуальність розробки відповідних діагностичних тест-систем і практичне впровадження методів молекулярного аналізу для індикації мікроорганізмів та діагностики інфекційних захворювань. Для виявлення збудника туляремії запропоновано декілька ПЛР тест-систем на основі використання ДНК-мішеней туляремійного мікроба, що дозволяють детектувати ген iglC, який кодує білок 23 кД [5], інсерції ISFtu2 [6], ген lрnА, який кодує білок 17 кД і 16pS РНК [1]. Втім ці ПЛР тест-системи містять праймери, комплементарні ділянкам ДНК генома туляремійного мікроба, видоспецифічні лише для виду F. tularensis, і не дозволяють ідентифікувати збудник на рівні субвиду. Для підвищення ефективності виявлення ДНК збудника туляремії в Ставропольському НДПІ (Росія) створена мультиплексна ПЛР тест-система з праймерами, комплементарними ділянкам інсерцій ISFtu2 і генів iglC, fopA F. tularensis [7]. Ця тест-система також дає змогу детектувати ДНК туляремійного мікроба, але не дозволяє диференціювати високовірулентний субвид F. tularensis tularensis від менш вірулентного F. tularensis holarctica, що має вкрай важливе значення у разі біотерористичних актів та виявлення F. tularensis в природних умовах, а також призначення специфічного лікування. Для субвидової диференціації ВООЗ [1] рекомендує використовувати як ДНК мішень VNTRлокус FT-M19 (variable number tandem repeat), який має делецію 30 пар нуклеотидів (п. н.) у підвиду F. tularensis holarctica, на відміну від F. tularensis tularensis і F. tularensis novicida. Такий висновок підтверджується даними дослідження 192-х штамів [8] та 688 штамів F. tularensis [9]. Відомий генодіагностичний набір для детекції збудника туляремії (ПЛР тест-система "Ген Francisella tularensis - РЭФ" [10]. ПЛР тест-система містить одну пару специфічних праймерів для виявлення фрагмента гена iglC (білок 23 кД). Тест-система дозволяє виявляти вид, але не ідентифікувати субвиди F. tularensis. Нами не виявлено даних про тест-системи в науково-технічній та патентній літературі, що дозволяють проводити синхронно виявлення та ідентифікацію штамів F. tularensis на основі присутності в геномі діагностично значущих фрагментів ДНК [4] в одній пробі. Відома мультиплексна ПЛР тест-система [7] для виявлення трьох специфічних фрагментів ДНК F. tularensis: мобільного елемента ISFtu2 і генів iglC та fopA (прототип). Дана тест-система підвищує чутливість та специфічність детекції ДНК збудника туляремії, але не дозволяє воднораз ідентифікувати F. tularensis на рівні субвиду (F. tularensis tularensis і F. tularensis holarctica). Задача корисної моделі полягає у розробці мультиплексної генодіагностичної ПЛР тестсистеми, яка б дозволяла здійснювати виявлення та ідентифікацію збудника туляремії в одній пробі одночасно на основі вибору специфічних послідовностей ДНК хромосоми геному F. 1 UA 75546 U 5 10 tularensis, що характеризують таксономічну належність штаму на рівні виду і субвиду, а використання відповідних праймерів та розробка технічних умов режиму термоциклювання і складу реакційної суміші створюють умови для ампліфікації в одній пробірці досліджуваних фрагментів ДНК геному туляремійного мікроба, чим забезпечується прискорення диференційованої (епідеміологічно важливої) діагностики різних за вірулентністю підвидів F. tularensis holarctica та F. tularensis tularensis. Поставлена задача вирішується включенням в мультиплексну тест-систему набору синтезованих специфічних праймерів (табл. 1) до ділянки гена lрnА (білок 17 кД), видоспецифічного для F. tularensis та VNTR-локусу FT-M19 і ділянки області відмінностей RD1 (фрагмент RDA), розмір ампліконів яких чітко диференціюється на рівні субвидів F. tularensis tularensis-250 і 350 п. н. і F. tularensis holarctica-220 і 177 п. н. при режимі термоциклювання: 95 C - 5 хв. 95 C - 10 сек.  61 C - 10 сек.42 цикли 72 C - 10 сек.  15 72 C - 2 хв.- заключний етап. Склад реакційної суміші: 2 пари праймерів на 1 пробу - 10 х ПЛР-буфер - 2,5 мкл; суміш дНТФ (1 мМ) - 1,0-2,0 мкл; Taq-ДНК-полімерази (5 од./мкл) - 0,2-0,4 мкл. Час проведення дослідження - 8 годин. Таблиця Нуклеотидні послідовності специфічних праймерів до ДНК-мішеней туляремійного мікроба (F. tularensis) ДНК-мішені Назва фрагмент гена lрnА tul-4-435 tul-4-863 VNTR-локус FT-M19 FT-M19 фрагмент RDA області відмінностей RD1 RDA Праймери Нуклеотидна послідовність 5'-GCTGTATCATCATTTAA TAACTGCTG 5'- TTGGGAAGCTTGTATC ATGGCACT F-5'- AGGCGGAGATCTAGGA ACCTTT R-5'- AGCCCAAGCTGACTAA AATCTTT F-5' -CTGTTGTTTTTCAAATACATTCAA R-5'AAAAATGGCTGGAGTGAAGATACTA Посилання "Туляремия", ВОЗ, (2007) "Туляремия", ВОЗ, (2007) Водопьянов А.С., (2007) Примітки: 1. F - прямий праймер. 2. R - зворотний праймер. 20 25 30 35 Новизна корисної моделі полягає в тому, що до теперішнього часу не було створено ПЛР тест-системи для аналізу складу варіабельного тандемного повтору FT-M19, а також області відмінностей RD1, які відрізняються у субвидів F. tularensis tularensis та F. tularensis holarctica [3, 11]. Заявлена мультиплексна ПЛР тест-система включає наступні етапи аналізу: Приготування мікробної зависі для виділення ДНК. Для приготування мікробної зависі використовують тридобову культуру штамів F. tularensis, вирощену на FT агарі. Готують завись 9 бактерій на фізіологічному розчині 10 м.к./мл за стандартним зразком мутності ГСЗ 42-28-85-07 П (10 МО), виробництва ДНДІСКМБП ім. Л. А. Тарасевича (Росія). Виділення ДНК з інактивованої бактеріальної зависі. Виділення проводять згідно з інструкцією із застосування комплекту реагентів для виділення ДНК, зокрема виробництва "ДНК-сорб-В" (Росія, Москва). Постановка ПЛР. Для проведення ПЛР реакційну суміш ретельно перемішують на вортексі, переносять по 15 мкл в мікропробірки та нашаровують на поверхню 30 мкл (1 крапля) мінерального масла. Одноразовими наконечниками з аерозольним бар'єром у всі мікропробірки, крім контрольних, вносять під мінеральне масло по 10 мкл досліджуваних зразків ДНК. У мікропробірку для позитивного контролю вносять 10 мкл ДНК вакцинного штаму F. tularensis 15 Райського, а для негативного контролю - 10 мкл деіонізованої води. 2 UA 75546 U 5 10 15 Продукти ПЛР аналізують методом горизонтального електрофорезу в 1,7 % агарозному гелі або вертикального електрофорезу в 6 % неденатуруючому поліакриламідному гелі з фарбуванням відповідно бромистим етидієм і азотистим сріблом. Оцінку результатів здійснюють порівнянням смуг з позитивним контролем і маркером довжини pUC 19 DNA/ Msp I. Специфічність розробленого набору мультиплексної ПЛР тест-системи оцінювалась на еталонному штамі F. tularensis 15 Райського та колекції природних штамів F. tularensis, ізольованих від гризунів, кліщів, води і від людини, належність яких до субвиду F. tularensis holarctica встановлена за таксономічними ознаками (культурально-біохімічними та біологічними властивостями). Приклад 1. Визначення видової приналежності бактерій до роду Francisella На FT агарі вирощують культури F. tularensis (еталонний штам Райського 15, штами № № 225 і 284 від кліщів, № 340 від гризуна, № 48 - водний штам та від людини № 359) впродовж 3-х 9 діб. Готують завись бактерій на фізіологічному розчині 10 м.к./мл за стандартним зразком мутності. Виділення ДНК здійснюють згідно з інструкцією до комплекту реагентів для виділення ДНК, виробництва "ДНК-сорб-В" (Росія, Москва). Готують загальну реакційну суміш з розрахунку необхідних інгредієнтів на 1 пробу: Кількість компонентів на 1 пробу (в мкл) 2,5 1,0 0,4 0,4 0,2 до 25,0 мкл Компоненти 10хПЛР-буфер суміш дНТФ (1 мМ) TUL 435(80пМ/мкл) TUL 863 (80 пМ/мкл) Taq-ДНК-полімераза (5 од./мкл) Деіонізована вода 20 25 30 35 40 45 50 Для проведення ПЛР суміш ретельно перемішують на вортексі, переносять по 15 мкл в мікропробірки та нашаровують на поверхню 30 мкл (1 крапля) мінерального масла. Одноразовими наконечниками з аерозольним бар'єром у всі мікропробірки, крім контрольних, вносять під мінеральне масло по 10 мкл всіх досліджуваних зразків ДНК. У мікропробірку для позитивного контролю вносять 10 мкл ДНК вакцинного штаму F. tularensis 15 Райського, а для негативного контролю - 10,0 мкл деіонізованої води. Ампліфікацію проводять за наступною програмою: Продукти ПЛР аналізують методом горизонтального електрофорезу в 1,7 % агарозному гелі або вертикального електрофорезу в 6 % неденатуруючому поліакриламідному гелі з фарбуванням відповідно бромистим етидієм і азотистим сріблом. Оцінку результатів проводять порівнянням смуг з позитивним контролем і маркером довжини pUC 19 DNA/ Msp I. На фіг. 1 Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК-мішені штамів F. tularensis в 6 % поліакриламідному гелі. Лунки: 2 - набір маркерів молекулярної маси; 9 - негативний контроль; 3 - амплікон фрагмента гена lрnА еталонного штаму 15 Ганського, вакцинний штам (довжина 386 п. н.); 4 - амплікон фрагмента гена lрnА природного ізоляту від кліщів штаму № 284 (довжина 386 п. н.); 5 - амплікон фрагмента гена lрnА природного ізоляту від кліщів штаму № 225 (довжина 386 п. н.); 6 - амплікон фрагмента гена lрnА природного ізоляту від гризуна штаму № 340 (довжина 386 п. н.); 7 - амплікон фрагмента гена lрnА природного ізоляту водного штаму № 48 (довжина 386 п. н.); 8 - амплікон фрагмента гена lрnА ізоляту від людини, штам № 359 (довжина 386 п. н.). У всіх штамів F. tularensis (фіг. 1, лунки 4-8) виявляється чітка смуга на рівні 386 п. н., за її наявності досліджуваний штам відносять до виду F. tularensis. Висновок: Електрофореграма підтверджує визначення виду Francisella tularensis. Приклад 2. Визначення виду і субвиду F. tularensis на прикладі природних ізолятів Приготування ДНК досліджуваних зразків і реакційних сумішей, режим термоциклювання, здійснюють як у прикладі 3 UA 75546 U 1, але в реакційну суміш в одну мікропробірку додають дві пари праймерів, специфічних до фрагмента гена lрnА (17 кД) і VNTR-локусу FT-M19, а також подвійну кількість Taq-ДНКполімерази і дезоксинуклеозидтрифосфату: Компоненти 10хПЦР-буфер суміш дНТФ(1 мМ) TUL 435(80пМ/мкл) TUL 863 (80 пМ/мкл) Forward primer до FT-M19 (80 пМ/мкл) Reverse primer до FT-M19 (80 пМ/мкл) Taq-ДНК-полімераза (5 од./мкл) ДНК досліджуваного штаму Деіонізована вода Кількість компонентів на 1 пробу (в мкл) 2,5 2,0 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 10,0 до 25,0 мкл 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Продукти ПЛР аналізують методом горизонтального електрофорезу в 1,7 % агарозному гелі або вертикального електрофорезу в 6 % неденатуруючому поліакриламідному гелі з фарбуванням відповідно бромистим етидієм і азотистим сріблом. Оцінку результатів здійснюють порівнянням смуг з позитивним контролем і маркером довжини pUC 19 DNA/Msp I. На фіг. 2. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК-мішеней штамів F. tularensis в 6 % поліакриламідному гелі. Лунки: 5, 14- набір маркерів молекулярної маси; 8, 11, 15 - негативні контролі; 2 - амплікон фрагмента гена ІрnА еталонного штаму 15 Райського, вакцинний штам (довжина 386 п. н.); 3 - амплікон локусу FT-M19 еталонного штаму 15 Райського, вакцинний штам (довжина 220 п. н.); 4 - амплікон фрагмента RDA еталонного штаму 15 Райського, вакцинний штам (довжина 177 п. н.); 6 - амплікони фрагмента гена ІрnА та локусу FT-М19 природного ізоляту від кліщів штаму № 502 (довжини відповідно 386 п. н. та 220 п. н.); 7 - амплікони фрагмента гена lрnА та локусу FT-М19 природного ізоляту від гризуна штаму № 20 (довжини відповідно 386 п. н. та 220 п. н.); 9 - амплікони фрагмента гена lрnА та фрагмента RDA природного ізоляту від кліщів штаму № 502 (довжини відповідно 386 п. н. та 177 п. н.); 10 - амплікони фрагмента гена lрnА та фрагмента RDA природного ізоляту від гризуна штаму № 20 (довжини відповідно 386 п. н. та 177 п. н.); 12 - амплікони локусу FT-M19 та фрагмента RDA природного ізоляту від кліщів штаму № 502 (довжини відповідно 220 п. н. та 177 п. н.); 13 - амплікони локусу FT-M19 та фрагмента RDA природного ізоляту від гризуна штаму № 20 (довжини відповідно 220 п. н. та 177 п. н.). На електрофореграмі виявляються дві смуги, розмір ампліконів яких складає 386 п. н. і 220 п. н., що відповідає структурі фрагмента гена lрnА F. tularensis і VNTR-локусу FT-M19 штамів F. tularensis holarctica. Приклад 3. Визначення виду і субвиду F. tularensis на прикладі природних ізолятів Приготування зразків ДНК досліджуваних штамів F. tularensis і реакційних сумішей, режим термоциклювання, здійснюють як у прикладі 2, але в реакційну суміш додають 2 пари праймерів, які фланкують фрагменти гена lрnА (17 кД) і RDA області відмінностей RD1. В разі використання специфічних праймерів до фрагментів гена lрnА і RDA області відмінностей RD1 виявляють одну смугу довжиною 386 п. н. (фрагмент гена lрnА) та другу смугу довжиною 177 п.н. (фрагмент RDA), що свідчить про належність штаму до субвиду F. tularensis holarctica (фіг. 2, 3). При використанні двох пар праймерів до локусу FT-M19 і RDA області відмінностей RD1 також виявляються дві смуги в 220 п. н. та 177 п. н. у разі наявності в досліджуваному зразку ДНК F. tularensis holarctica і 250 п. н. та 350 п. н. - у разі F. tularensis tularensis. Досліджуваний штам з високим ступенем ймовірності відносять до F. tularensis holarctica або F. tularensis tularensis (фіг. 2). На фіг. 3 Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК-мішеней штамів F. tularensis в 6 % поліакриламідному гелі. Лунки: 4 UA 75546 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1, 11 - набір маркерів молекулярної маси; 2, 5, 8, 14 - негативний контроль; 3 - позитивний контроль - амплікон фрагмента гена lрnА F. tularensis holarctica (386 п. н.); 4 - позитивний контроль - амплікон фрагмента гена lрnА F. tularensis tularensis (386 п. н.); 6 - позитивний контроль - амплікон локусу FT-M19 F. tularensis holarctica (220 п. н.); 7 - позитивний контроль - амплікон локусу FT-M19 F. tularensis tularensis (250 п. н.); 9 - позитивний контроль - амплікон фрагмента RDA F. tularensis holarctica (177 п. н.); 10 - позитивний контроль - амплікон фрагмента RDA F. tularensis tularensis (350 п. н.); 12 - амплікони фрагмента гена lрnА та локусу FT-M19 еталонного штаму 15 Гайського F. tularensis holarctica (довжини відповідно 386 п. н. та 220 п. н.); 13 - амплікони фрагмента гена lрnА та локусу FT-M19 природного ізоляту від кліщів штаму № 291 (довжини відповідно 386 п. н. та 220 п. н.); 15 - амплікони фрагмента гена lрnА та фрагмента RDA еталонного штаму 15 Гайського F. tularensis holarctica (довжини відповідно 386 п. н. та 177 п. н.); 16 - амплікони фрагмента гена lрnА та фрагмента RDА природного ізоляту від кліщів штаму № 291 (довжини відповідно 386 п. н. та 177 п. н.). На електрофореграмі (фіг. 3) виявляють дві смуги, розмір ампліконів яких складає 220 п. н. і 177 п. н., що відповідає структурі VNTR-локусу FT-M19 та фрагменту RDA області відмінностей RD1 виду F. tularensis субвиду holarctica. Відсутність смуги на рівні 250 п. н. та 350 п. н. підтверджує висновок, що досліджувані штами: еталонний штам Райського та природний ізолят від кліщів № 291 належать до виду F. tularensis субвиду holarctica. Специфічність і діагностичну значущість розробленого набору мультиплексної ПЛР тестсистеми підтверджена на еталонному штамі F. tularensis 15 Райського та на природних штамах F. tularensis, ізольованих з різних джерел (кліщів, гризунів, води і людини), належність яких до субвиду F. tularensis holarctica встановлена за таксономічними ознаками (культуральнобіохімічні та біологічні властивості) і підтверджена прикладами щодо детекції ДНК туляремійного мікроба. Таким чином, заявлена корисна модель може бути здійснена практично і дозволяє виявляти діагностично значимі гени і фрагменти ДНК туляремійного мікроба, що забезпечує детекцію та ідентифікацію за ознакою таксономічної належності штамів F. tularensis до рівня виду та субвиду, що спрощує, скорочує час дослідження та економічні затрати, дозволяє використовувати як метод експрес-діагностики. Джерела інформації: 1. WHO guidelines on Tularemia. World Health Organization.-2007.-115 p. 2. Пат. 2164532 Российская Федерация. Способы и наборы для генамплификации диагностики методами ПЦР и РНК-ПЦР / Федоров Н. А., Елов А. А., Суханов Ю.С. Опубл. 27.03.2001 г. 3. Водопьянов А.С., Павлович Н.В., Водопьянов CO., Мишанькин Б.Н. Возбудитель туляремии: дифференциация подвидов с помощью ПЦР // Биотехнология.-2007. - № 6. - С. 8285. 4. Пат. 2443772 Российская Федерация. Набор штаммов бактерий вида Francisella tularensis для получения комплекта контрольных ДНК препаратов, комплект ДНК препаратов для геннодиагностических исследований / Осина Н.А., Уткин Д.В., Сеничкина А. М., БугорковаТ.В., Кутырев В.В.; заявитель и патентообладатель "РосНИПЧИ "Микроб". - № 2010131304/10; заявл.26.07.10; опубл. 27.02.12. 5. Романова Л.В. Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики: дисс. … доктора биологических наук: 03.00.07 / Романова Людмила Васильевна. - Ростов-на-Дону.2008.-298 с. 6. Peterssen J. М., Schriefer М. Е., Carter L. G., et. al. Laboratory Analysis of Tularemia in WildTrapped, Commercially Traded Prairie Dogs, Texas, 2002 // Emerging Infectious Diseases. Vol. 10, № 10, March, 2004.-P. 419-425. 7. Солодовников Б.В. Разработка мультиплексной ПЦР-тест-системы для детекции возбудителя туляремии в режиме реального времени. // Мат-лы VII Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010", 2426 ноября 2010 г. - Том 1. - Разд. 6. Особо опасные инфекции. - С. 425-428. 8. Johansson A., J. Farlow, P. Larsson. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determited by Multiple-locus Variable-Number Tandem Repeat Analisis // Bacteriol.-2004. - P. 5808-5818. 9. Broman Т., Thelaus J., Andersson A.-C, Backman S., Larsson E., Granberg M., Karlsson L., Back E., Eliasson H., Mattsson R., Sjostedt A., Forsman M. Molecular detection of persistent 5 UA 75546 U 5 10 Francisella tularensis subspecies holarctica in natural waters // International Journal of Microbiology.2011. - Vol. 2011. - Article ID 851946, 10 P. 10. Набор реагентов "Ген Francisella tularensis РЭФ". Предназначен для выявления ДНК возбудителя туляремии в пробах биологического материала и объектов окружающей среды методом ПЦР. Саратов. Россия. 11. Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A., Bystrom M., Eriksson U., Larsson E., Prior R. G., Sjostedt A., Titball R. W. and Forsman M. Genome-wide DNA microarray analysis of Francisella tularensis strains demonstrates extensive genetic conservation within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent F. tularensis suhsp tularensis. Clin. Microbiol.-2003. - Vol. 41, № 7. - P. 2924-2931. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Мультиплексна ПЛР тест-система для детекції збудника туляремії, що містить більше однієї пари праймерів, специфічних до ДНК-мішеней хромосоми туляремійного мікроба, яка відрізняється тим, що одна пара праймерів є специфічною до ділянки гена lрnА (білок 17 кД), видоспецифічної для F. tularensis, а дві інші - до локусу FT-M19 і ділянки області відмінностей RD1 (фрагмент RDA), розмір ампліконів яких диференціює F. tularensis на рівні субвидів і становить для F. tularensis holarctica 220 і 177, а для F. tularensis tularensis 250 і 350 пар нуклеотидів за умов режиму термоциклювання: 95 °C - 5 хв, 42 цикли (95 °C - 10 сек., 61 °C - 10 сек., 72 °C - 10 сек.), заключний етап 72 °C - 2 хв; складу реакційної суміші: 10хПЛР-буфер, дНТФ (1 мМ) - 1-2 мкл, Taq-ДНК-полімерази (5 од./мкл) - 0,2-0,4 мкл, що забезпечує можливість в одній пробі одночасної індикації та ідентифікації збудника туляремії на рівні виду та субвиду. 6 UA 75546 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7