Тест-система імуноферментна для кількісного виявлення антитіл класу igg до збудника токсоплазмозу людини (toxoplasma gondii) уніфікована “dia-toxo-igg-u”

Реферат: Тест-система імуноферментна для кількісного виявлення антитіл класу IgG до збудника токсоплазмозу людини (Toxoplasma gondii) уніфікована "DIA-TOXO-IgG-u", в якій антигени збудника Т. gondii, використані в складі імуносорбенту, а як кон'югат застосовані антилюдські антитіла проти IgG, зв'язані з пероксидазою. В тест-системі застосовується імуносорбент з сорбованими антигенами Т. gondii, два позитивних контролів (один - високотитражний, другий низькотитражний), відкалібровані по Міжнародному стандарту ВООЗ - Anti-Toxoplasma serum, Human TOXM, (NIBSC) для кількісного визначення наявності антитіл класу IgG в досліджуваних зразках, кон'югат моноклональних антитіл проти IgG людини, мічених ферментом і однокомпонентний розчин хромогену. UA 72430 U (12) UA 72430 U UA 72430 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для кількісного виявлення антитіл класу IgG до збудника токсоплазмозу в сироватці або плазмі крові людини. Токсоплазмоз - протозойне захворювання, збудником якого є облігатний внутріклітинний паразит Toxoplasma gondii. Зараження токсоплазмозом відбувається при вживанні в їжу термічно недостатньо оброблених м'ясопродуктів, уражених цистами токсоплазм. Можлива також трансплантаційна передача токсоплазм - при трансплантації органів інфікованих донорів, і конгенітальна - при внутрішньоутробному зараженні плоду від матері через плаценту. Інфікування в першому триместрі вагітності призводить до завмирання та абортуванню плоду. В переважній більшості випадків набутий токсоплазмоз протікає в латентній або хронічній формі. Латентна форма токсоплазмозу характеризується безсимптомним перебігом, що ускладнює клінічну діагностику захворювання. Виявлення специфічних IgM у обстежуваного є ознакою первинної інфекції або реактивації інфекційного процесу та має пряме діагностичне значення при наявності клінічних симптомів захворювання. При первинному інфікуванні IgG антитіла до T.gondii з'являються в крові через 1-2 місяці та зберігаються протягом всього життя, при рецидивах захворювання їх рівень різко підвищується. Відома тест-система для виявлення імуноглобулінів класу G проти Т. gondii у сироватках і плазмі крові людини [1]. В основі тест-системи лежать антигени збудника або рекомбінантні поліпептиди аналоги антигенів Т.gondii, використані в складі імуносорбенту, а як кон'югат застосовані антилюдські антитіла проти IgG, зв'язані з пероксидазою. Суть корисної моделі в створенні імуноферментної тест-системи для визначення наявності антитіл класу IgG до Т. gondii в сироватці або плазмі крові людини. Поставлена задача вирішується шляхом використання імуносорбенту з сорбованими антигенами Т. gondii, двох позитивних контролів (одного - високотитражного, другого низькотитражного), відкаліброваних по Міжнародному стандарту ВООЗ - Anti-Toxoplasma serum, Human TOXM, (NIBSC) для кількісного визначення наявності антитіл класу IgG в досліджуваних зразках, кон'югату моноклональних антитіл проти IgG людини, мічених ферментом і однокомпонентного розчину хромогену. При внесенні в лунки зразків досліджуваних сироваток антитіла класу IgG до Т. gondii, у випадку їх наявності, зв'язуються з антигенами Т. gondii, сорбованими на твердій фазі, утворюючи комплекси антиген-антитіло, які виявляють за допомогою пероксидазного кон'югату моноклональних антитіл до імуноглобулінів класу IgG людини. Після відмивання незв'язаних компонентів в лунки додають розчин однокомпонентного проявника -хромогену. Пероксидазну реакцію зупиняють, додаючи стоп-реагент, і вимірюють оптичну густину суміші у лунках при довжині хвилі 450/620 нм, яка пропорційна концентрації специфічних IgG антитіл до цитомегаловірусу у зразках сироваток або плазми крові. Концентрація антитіл класу IgG до Т. gondii виражається в Міжнародних одиницях (МО) при використанні калібрувальної кривої. Позитивні контролі тест-системи (один - високотитражний, другий - низькотитражний), що застосовуються для будування кривої, відкалібровані відносно 3го Міжнародного стандарту ВООЗ - Anti-Toxoplasma serum, Human TOXM, (NIBSC). Приклад 1. Визначення наявності антитіл до Т. gondii в сироватці крові хворої О, 1970 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього в лунки імуносорбенту з фіксованими на ньому антигенами Т. gondii вносять по 100 мкл зразків сироваток, попередньо розведених до 1:50 в розчині для розведення сироваток, і по 100 мкл двох позитивних та одного негативного контролів. Накривають планшет кришкою та інкубують при температурі (37±2)°С протягом 60 хв. Після закінчення інкубації промивають планшет 4 рази розчином для промивання і вносять в лунки по 100 мкл кон'югату. Знову інкубують планшет вже при кімнатній температурі (18-23)°С протягом 30 хвилин. Промивають планшет 6 разів розчином для промивання і вносять в лунки по 100 мкл однокомпонентного розчину хромогену. Накривають планшет кришкою та інкубують при температурі (18-25)°С в темному місці протягом 30 хвилин. Для зупинення кольорової реакції вносять в лунки по 100 мкл стоп-реагенту (в тій же послідовності внесення, що й хромоген). Не більше як через 5 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (450 нм відносно 620 нм). Досліджений матеріал від хворої було ідентифіковано як позитивний на наявність антитіл класу IgG до Т. gondi. Позитивний результат на IgG антитіла до Т. gondii свідчить про уповільнений перебіг інфекції або захворювання в минулому, в результаті якого сформувався постінфекційний імунітет. Специфічні IgG до Т. gondii можуть виявлятися в організмі протягом всього життя. 1 UA 72430 U 5 10 15 Приклад 2. Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи і тестсистеми "ВектоТоксо-антитела - стрип", Новосибирск, РФ, Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові (по 20 достеменно позитивних та 100 достеменно негативних сироваток). Усі сироватки досліджували у двох повторностях кожною тест-системою за описаною методикою. Обидві тест-системи по показнику виявлення антитіл до Т. gondii показали однакові результати: з 20 позитивних сироваток всі зразки виявлено як позитивні, що складає 100 % чутливості. З 100 негативних сироваток виявилися справді негативними 100 (специфічність - 100 %). Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл класу IgG до Т. gondii. Проста і надійна в роботі. Джерела інформації: 1. Инструкция по применению тест-системи "ВектоТоксо-антитела - стрип", Новосибирск, РФ, 2010. 2. А.Т.Михайлов, В.Н.Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития". М. "Наука", 1981. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Тест-система імуноферментна для кількісного виявлення антитіл класу IgG до збудника токсоплазмозу людини (Toxoplasma gondii) уніфікована, в якій антигени збудника Т. gondii, використані в складі імуносорбенту, а як кон'югат застосовані антилюдські антитіла проти IgG, зв'язані з пероксидазою, яка відрізняється тим, що в тест-системі застосовується імуносорбент з сорбованими антигенами Т. gondii, два позитивних контролів (один - високотитражний, другий - низькотитражний), відкалібровані по Міжнародному стандарту ВООЗ - Anti-Toxoplasma serum, Human TOXM, (NIBSC) для кількісного визначення наявності антитіл класу IgG в досліджуваних зразках, кон'югат моноклональних антитіл проти IgG людини, мічених ферментом і однокомпонентний розчин хромогену. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2