Портативна потенціометрична біосенсорна система для одночасного визначення концентрацій сечовини та креатиніну

Реферат: Портативна потенціометрична біосенсорна система для одночасного визначення концентрацій сечовини та креатиніну складається з двох потенціометричних біосенсорів, перший з яких має два рН-чутливих польових транзистора, на один з яких нанесена робоча мембрана на основі рекомбінантної уреази, селективна до сечовини, на другий нанесена референтна мембрана, другий біосенсор, також має два рН-чутливих польових транзистора, на один з яких нанесена робоча мембрана, селективна до креатиніну, на другий нанесена референтна мембрана, а вказані біосенсори призначені для підключення до аналого-цифрового іонно-сенсорного вимірювача параметрів рідких середовищ, а виходи цього приладу підключені до відповідних входів комп'ютера. UA 78180 U (12) UA 78180 U UA 78180 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини та охорони здоров'я, і може бути використана з метою вивчення функціонального стану нирок, печінки, частково щитовидної залози, а саме визначення вмісту сечовини та креатиніну в сироватці крові хворих на ниркову недостатність, контролю під час процедури гемодіалізу, а більш конкретно до портативної потенціометричної біосенсорної системи для одночасного визначення концентрації сечовини та креатиніну. Ниркова терапія у вигляді гемодіалізу чи більш радикальне рішення - трансплантація нирки це єдині ключові елементи, що забезпечують підтримку життя хворим на ниркову недостатність. Більшість хворих вибирає гемодіаліз. Існує жорстка кореляція між смертністю та виживаністю пацієнтів в залежності від адекватності процедури гемодіалізу, тому даний процес повинен жорстко контролюватись [1, 2]. Головна мета гемодіалізу - виведення продуктів розпаду з організму пацієнта. Відомо понад 200 уремічних токсинів, які цитовані у медичній літературі. В клініці практично не можливо виявити та ідентифікувати їх всі [3]. Однак, хоча такий широкий спектр цих продуктів не виявлений, існують маркери уремічних токсинів - сечовина і креатинін. Близько 95 % і 5 % азоту білків метаболізується в азот сечовини та азот креатиніну відповідно. Отже, сечовина - це головний і кінцевий продукт обміну білків, синтез якої відбувається в печінці з діоксиду вуглецю та амонію в результаті дезамінування амінокислот. З печінки сечовина потрапляє в кров, а далі в нирки, де і відбувається її фільтрація та виведення з сечею [4]. Зниження вмісту сечовини в плазмі крові спостерігається рідко і є характерним для пацієнтів з тяжким захворюванням печінки чи недостатнім вживанням білка. Дуже високий рівень сечовини в сироватці крові пов'язаний з тяжкою нирковою дисфункцією і називається синдромом уремії. В такому випадку необхідно проводити гемодіаліз чи трансплантацію нирки. Фізіологічний рівень сечовини знаходиться в межах 2,5-7,5 мМ залежно від харчування [5]. Значне підвищення концентрації сечовини спостерігається під час хронічної та гострої форм ниркової недостатності (50-70 та 120-150 мМ відповідно). Такий патологічний рівень сечовини можна понизити до 10 мМ за рахунок гемодіалізу чи перитоніального діалізу. Рівень сечовини у діалізаті може варіювати від 3 до 16 мМ [6]. Креатинін - це ще один із кінцевих продуктів азотистого обміну людини. В організмі креатинін продукується в результаті дефосфорилювання фосфокреатину або ж за рахунок дегідратації креатину [7]. Синтез креатиніну відбувається в печінці з аргініну, метіоніну та гліцину і перетворюється у фосфокреатин, який виконує роль високо енергетичного джерела в м'язах. Креатинін є одним з найважливіших аналітів у сучасній лабораторній діагностиці. Визначення рівня даного метаболіту у різних фізіологічних рідинах є корисним для оцінки ниркової, м'язової та щитовидної дисфункції [8]. Креатинін є маркером м'язової маси і є відображенням повільного обміну білка у м'язах. Креатиніновий показник можна розглядати як індекс пулу амінокислот у м'язах, а зменшення цього показника означає пропорційне зниження запасів азоту (наприклад, пацієнти з дистрофією мають низький вихід креатиніну). Фізіологічний рівень креатиніну сироватки крові знаходиться в межах 0,05-0,11 мМ [6]. Концентрація креатиніну вища, як 0,14 мМ вимагає додаткових лабораторних досліджень, тоді як рівень 0,5 мМ є індикатором ниркової дисфункції. За патологічних екстремальних умов концентрація креатиніну може сягати 1 мМ [9, 10]. Рівень креатиніну у діалізаті становить 0,05-0,35 мМ. Для моніторингу цих двох аналітів існують колориметричні методи аналізу. Для сечовини колориметричними реагентами являються діацетилмонооксим, фталальдегід, нафтил етилен діамін, хромотропова кислота [11]. Всі ці методи складні у використанні: необхідний контроль температури, рН, що значно сповільнює аналіз. Колориметричне визначення креатиніну базується на реакції Яффе з використанням пікрату [12]. Метод Яффе простий, дешевий і може бути автоматизованим. Але, основним недоліком є велика кількість інтерферентів, що призводять до хибних результатів. Необхідно проводити додаткову обробку біозразків: адсорбцію, екстракцію, діаліз, використовувати ферменти, щоб видалити інтерферуючі речовини. Даний шлях призводить до зниження точності та підвищення вартості аналізу на креатинін. Окрім колориметричного визначення сечовини та креатиніну існує друга група методів більш специфічних, які ґрунтуються на ферментативних реакціях з колориметричною детекцією. Для сечовини всі сучасні ферментативні методи ґрунтуються на використанні ферменту уреази. Метод складається з двох етапів. На першому при гідролізі сечовини утворюється іон амонію, концентрацію якого (другий етап) визначають з використанням послідовних ферментативних реакцій, потенціометричних методів чи технології "сухої хімії" [13]. У ферментативних колориметричних методах визначення креатиніну використовують креатиніназу, що каталізує гідроліз креатиніну до креатину, який потім визначають в креатинкіназній реакції [14]. 1 UA 78180 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Ферментативні оптичні методи є специфічними і чутливими, але їх застосування для визначення сечовини і креатиніну обмежене нестійкістю ферментів при зберіганні та експлуатації, складністю методики аналізу, а також високою вартістю обладнання і затратних матеріалів, крім того необхідна наявність висококваліфікованого персоналу. Альтернативою вирішення вказаних вище проблем може бути використання біосенсорів нових біоаналітичних приладів. На сьогоднішній день існує декілька біпараметричних біосенсорних систем для одночасного визначення сечовини та креатиніну [2, 11, 15, 16]. В основі роботи всіх цих систем лежать потенціометричні перетворювачі, які чутливі до амонію, тому ендогенний амоній, який присутній в біозразках, а також К+, Na+, стають причиною інтерференції. Для видалення інтерферуючих речовин було розроблено декілька стратегічних напрямків, наприклад розділення за допомогою газової дифузії чи іонообмінної колонки, що в свою чергу призводить до складної попередньої підготовки проби з використанням додаткового обладнання. Відома біосенсорна система для визначення концентрації сечовини та креатиніну, яка має два потенціометричних біосенсори на основі амоній-чутливих перетворювачів, на один з яких нанесена мембрана на основі креатиніндеімінази, селективна до креатиніну, на другий перетворювач нанесена мембрана на основі уреази, селективна до сечовини, а вказані біосенсори призначені для підключення до потенціометричної стаціонарної установки [2]. Однак, описана біосенсорна система, не є портативною, потребує складної попередньої підготовки проби, що витікає у значні затрати часу. Крім того біосенсори на основі звичайної уреази характеризуються вузьким лінійним діапазоном, відповідно аналізовану пробу необхідно розводити в багато разів, що призводить до появи похибок у вимірюваннях. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створення такої портативної потенціометричної біосенсорної системи для одночасного визначення концентрації сечовини та креатиніну, яка б дозволила без попередньої підготовки проби, більш швидко та більш точно визначати сечовину та креатинін. Поставлена задача вирішується запропонованою портативною потенціометричною біосенсорною системою для одночасного визначення концентрацій сечовини та креатиніну, що складається з двох потенціометричних біосенсорів, перший з яких має два рН-чутливих польових транзистора, на один з яких нанесена робоча мембрана на основі рекомбінантної уреази, селективна до сечовини, на другий нанесена референтна мембрана, другий біосенсор, також має два рН-чутливих польових транзистори, на один з яких нанесена робоча мембрана, селективна до креатиніну, на другий нанесена референтна мембрана, а вказані біосенсори призначені для підключення до аналого-цифрового іонно-сенсорного вимірювача параметрів рідких середовищ, а виходи цього приладу підключені до відповідних входів комп'ютера. Використання в роботі рН-чутливих польових транзисторів (рН-ПТ), дозволило проводити аналіз біозразків без попередньої обробки проби. Використання портативного приладу дало можливість розробити портативну біосенсорну систему. Крім того, біосенсор на основі рекомбінантної уреази характеризується широким лінійним діапазоном роботи, що збільшує точність аналізу. В основі роботи біосенсорної системи для одночасного визначення концентрації сечовини та креатиніну лежать дві ферментативні реакції, що протікають у відповідних ферментативних мембранах і реєструються рН-чутливими польовими транзисторами відповідних біосенсорів: Креатинін  H2O  H         N  метилгідан тоїн  NH   4 Креатиніндеіміназа (1) 45 Рекомбінан тна у реаза  Сечовина  2H2O  H          2NH   HCO 3  4 50 55 (2) В ході протікання реакцій (1 та 2) змінюється концентрація протонів (відповідно має місце локальна зміна рН розчину в мембранах). Це дозволяє використовувати рН-чутливі польові транзистори в якості перетворювачів. Суть корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де: на фіг. 1 показано схематичний вигляд потенціометричних біосенсорів для визначення сечовини та креатиніну; на фіг. 2 показано блок-схему портативної потенціометричної біосенсорної системи для визначення концентрації сечовини та креатиніну; на фіг. 3 показано відгуки потенціометричних біосенсорної системи на додавання субстратів; 2 UA 78180 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на фіг. 4 наведено графік залежності величини відгуку портативної потенціометричної біосенсорної системи для одночасного визначення концентрації сечовини та креатиніну від концентрації сечовини. на фіг. 5 наведено графік залежності величини відгуку портативної потенціометричної біосенсорної системи для одночасного визначення концентрації сечовини та креатиніну від концентрації креатиніну. Пропонована портативна потенціометрична біосенсорна система для одночасного визначення концентрації сечовини та креатиніну складається з двох потенціометричних біосенсорів 1, 2 (Фіг. 1) на основі перетворювачів на основі рН-ПТ. Перший потенціометричний біосенсор 1 має два рН-ПТ (зигзагоподібні області затворів) - 3, 4. На 3-й нанесено робочу мембрану з рекомбінантною уреазою селективною до сечовини, а на 4-й - референтну мембрану з сироватковим альбуміном бика. Другий потенціометричний біосенсор 2 також має два рН-ПТ (зигзагоподібні області затворів) - 5, 6, на 5 нанесено робочу мембрану з креатиніндеіміназою селективною до креатиніну та на 6 - референтну мембрану з сироватковим альбуміном бика. Зигзагоподібна геометрія затворних областей транзисторів має відношення довжини каналу до його ширини рівним 100, що забезпечує достатній рівень крутизни + перехідної характеристики. р -дифузійні шини (7) з контактами до стоку і витоку кожного з транзисторів виведені на край чипу, як і виводи до вбудованих мікроелектродів порівняння - 8. В центрі транзисторів розташовані контакти до n-підкладок - 9. Алюмінієві контактні площини до усіх транзисторних виходів, виведені на край кожного з чипів - 10. Вказана портативна потенціометрична біосенсорна система для одночасного визначення концентрації сечовини та креатиніну 11 /БС/ (Фіг. 2) підключена до відповідних входів аналого-цифрового іонносенсорного вимірювача параметрів рідких середовищ 12 /АВ/, розробленого та виготовленого в Інституті фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України [17], що працює по схемі прямого вимірювання струму в каналі польового транзистора з активним навантаженням. Виходи приладу 12 /АВ/ підключені до відповідних входів блоку живлення 13 /БЖ/ та комп'ютера 14/ПК/. Пропонована портативна потенціометрична біосенсорна система для одночасного визначення концентрації сечовини та креатиніну працювала наступним чином. Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Для створення гелю для ферментної мембрани першого біосенсора (чутливого до сечовини) готували розчин з вмістом 10 % рекомбінантної уреази, 10 % сироваткового альбуміну бика (БСА), 10 % гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,4. Гель для ферментної мембрани другого біосенсора (чутливого до креатиніну) робили таким же чином, але замість рекомбінантної уреази додавали 10 % креатиніндеімінази, 0,2 % ДЕАЕ-декстрану та 2 % лактітолу. До складу гелів додавався гліцерин з метою стабілізації ферментів при іммобілізації та запобігання передчасному підсиханню розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, сироватковий альбумін бика, ДЕАЕ-декстран та лактітол в складі ферментних мембран відігравали роль стабілізуючих агентів для ферментів. Гель для створення референтної мембрани для обох біосенсорів був ідентичним і готувався з вмістом 20 % сироваткового альбуміну бика (БСА), 10 % гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,4. Далі, на робочі поверхні транзисторів, обох сенсорів наносили приготовлені заздалегідь гелі і вносили в пари глутарового альдегіду (ГА) на 20-40 хвилин. Таким чином, ферментна мембрана, нанесена на робочу область першого біосенсора складалась з 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): 5-15 рекомбінантна уреаза, 5-15 БСА, 5-15 гліцерин, Ферментна мембрана, нанесена на робочу область другого біосенсора складалась з 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): 5-15 креатиніндеіміназа, 5-15 БСА, 5-15 гліцерин, 1-2,5 лактітол, 0,1-0,3 ДЕАЕ-декстран. Ідентичні референтні мембрани наносились на робочі області обох біосенсорів, і складались з 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): 5-15 БСА, 5-15 гліцерин, 3 UA 78180 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Співвідношення компонентів біоселективних мембран біосенсорної системи було отримано експериментально. Його підібрали для покращення аналітичних характеристик біосенсорів, таких як селективність, чутливість, операційна стабільність та ін. Після іммобілізації в парах ГА обидва біосенсори висушували 15 хвилин на повітрі за кімнатної температури. Перед початком роботи для видалення надлишку глутарового альдегіду біосенсори відмивали протягом 30 хвилин у буфері, в якому і проводились подальші досліди. Біосенсорну систему заздалегідь під'єднану до портативного потенціометричного приладу поміщали до вимірювальної комірки 1,5 мл, заповненої 5 мМ фосфатним буфером, рН 7,4, та витримували декілька хвилин для отримання стабільних базових ліній. Потім додавали певну аліквоту модельного розчину сечовини, отримували сигнал біосенсора на основі рекомбінантної уреази. Далі додавали певну аліквоту модельного розчину креатиніну, отримували сигнал другого біосенсора на основі креатиніндеімінази. Сигнали від обох біосенсорів автоматично оброблялися комп'ютером і виводилися у графічному вигляді. Графічне зображення відгуків біосенсорної системи на додавання сечовини та креатиніну наведено на фіг. 3. Приклад аналізу вмісту сечовини та креатиніну в розчині. Визначення концентрації сечовини та креатиніну проводили в 5 мМ калій-фосфатному буферному розчині, рН 7,4 при кімнатній температурі. Використовувалась робоча комірка відкритого типу об'ємом 1,5 мл з інтенсивним перемішуванням. Перед початком роботи датчики з іммобілізованими мембранами деякий час (приблизно 20-30 хв.) відмивали від надлишків незв'язаного ГА до стабілізації базової лінії. Концентрацію субстратів змінювали, додаючи певні аліквоти вихідних концентрованих розчинів сечовини та креатиніну. Після отримання кожного відгуку обидва біосенсори відмивали від продукту, змінюючи робочий буфер мінімум 3 рази кожні 2 хв. Шляхом додавання різної кількості модельних розчинів сечовини та креатиніну було побудовано калібрувальні криві для визначення концентрації сечовини (Фіг.4) та для визначення креатиніну (Фіг. 5). Визначення концентрації сечовини в аналізованих зразках діалізату та крові здійснюють за калібрувальною кривою. Додають аліквоту проби до вимірювальної комірки, та отримують відгуки обома біосенсорами. Далі за калібрувальними кривими вираховують концентрацію сечовини та креатиніну в невідомій пробі. Час аналізу запропонованою портативною потенціометричною біосенсорною системою для одночасного визначення концентрації сечовини та креатиніну складав 10 хвилин, що порівняно з відомою біосенсорною системою для визначення концентрації сечовини та креатиніну [2], приблизно, в 10 разів швидше. Джерела інформації:: 1. В. Premanode, C. Toumazou, A novel, low power biosensor for real time monitoring of creatinine and urea in peritoneal dialysis // Sensor and Actuators B.-2007. - Vol. 120. - P. 732-735. 2. A. Radomska, R. Koncki, K. Pyrzynska, S. Glab, Bionanalytical system for control of hemodialysis treatment based on potentiometric biosensor for urea and creatinine // Analytica Chimica Acta.-2004. - Vol. 523. - P. 193-200. 3. R. Koncki, Analytical aspects of hemodialysis // Trends in Analytical Chemistry.-2008. - Vol. 27. - № 4. - P. 304-314. 4. T.T. Березов, Б.Φ., Коровин, Биологическая химия. - М: Медицина, 1998. - С. 448-451. 5. G. Dhawan, G. Sumana, B.D. Malhotra, Recent development in urea biosensors // Biochemical Engineering Journal. - 2009.- Vol. 44. - P. 42-52. 6. R. Koncki, Recent development in potentiometric biosensors for biomedical analysis // Analytica Chimica Acta. - 2007. - Vol. 599. - P. 7-15. 7. M. Czauderna, J. Kowalczyk, Simple, selective, and sensitive measurement of urea in body fluids of mammals by reversed-phase ultra-fast liquid chromatography // Czech J. Anim. Sci.-2012. Vol. 57. - № 1. - P. 19-27. 8. J.-C. Chen, A.S. Kumar, H.-H. Chung, S.-H. Chien, M.-C. Kuo, J.-M. Zen, An enzymeless electrochemical sensor for the selective determination of creatinine in human urine // Sensor and Actuators B. - 2006. - Vol. 115. - P. 473-480. 9. P.C. Pandey, A.P. Mishra, Novel potentiometric sensing of creatinine // Sensor and Actuators B.-2004. - Vol. 99. - P. 230-235. 10. A.P. Soldatkin, J. Montoriol, W. Sant, С Martelet, N. Jaffrezic-Renault, Creatinine sensitive biosensor based on ISFETs and creatinine deiminase immobilised in BSA membrane // Talanta.2002. - Vol. 58. - P. 351-357. 11. M. Jurkiewicz, S. Alegret, J. Almirall, M. Garcia, E. Fabregas, Development of a biparametric bioanalyser for creatinine and urea. Validation of the determination of biochemical parameters associated with hemodialysis // Analyst. - 1998. - Vol. 123. - P. 1321-1327. 4 UA 78180 U 5 10 15 12. M. Jaffe, Uber den Niederschlag, welchen Pikrinsaure in normalen Harn erzeugt. und iiber eine neue Reaction and Kreatinins // Z. Physiol. Chem.-1886. - Vol. 10. - P. 391-400. 13. http://www.terramedica.spb.ru/ld42007/slepushiva.htm 14. P.K. Jaynes, R.D. Feld, G.F. Johnson, An enzymatic reaction-rate assay for serum creatinine with a centrifugal analyzer // Clin. Chem.-1982. - Vol. 28. - P. 114-117. 15. Μ. Gutierrez, S. Alegret, Μ. del Valle, Bioelectronic tongue for the simultaneous determination of urea, creatinine and alkaline ions in clinical samples // Biosensor and Bioelectronics.-2008. - Vol. 23. - P. 795-802. 16. I. Grabowska, M. Sajnoga, M. Juchniewicz, M. Chudy, A. Dybko, Z. Brzozka, Microfluidic system with electrochemical and optical detection // Microelectronic Engineering.-2007.-Vol. 84.-P. 1741-1743. 17. О.Л.Кукла, О.С. Павлюченко, О.В. Бушма, Ю.В. Голтвянський, СВ. Дзядевич, О.П. Солдаткін, Патент України на корисну модель "Аналого-цифровий іонно-сенсорний вимірювач параметрів рідких середовищ", UA №48359 МПК GO1N27/26, 27/27, заявл.26.10.2009, опубл. 10.03.2010, Бюл. №5. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Портативна потенціометрична біосенсорна система для одночасного визначення концентрацій сечовини та креатиніну, що складається з двох потенціометричних біосенсорів, перший з яких має два рН-чутливих польових транзистора, на один з яких нанесена робоча мембрана на основі рекомбінантної уреази, селективна до сечовини, на другий нанесена референтна мембрана, другий біосенсор, також має два рН-чутливих польових транзистора, на один з яких нанесена робоча мембрана, селективна до креатиніну, на другий нанесена референтна мембрана, а вказані біосенсори призначені для підключення до аналого-цифрового іонносенсорного вимірювача параметрів рідких середовищ, а виходи цього приладу підключені до відповідних входів комп'ютера. 5 UA 78180 U 6 UA 78180 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7