Кондуктометрична біосенсорна система для визначення концентрації мальтози у розчині

Кондуктометрична біосенсорна система для визначення концентрації мальтози у розчині, що містить кондуктометричну установку та два кондуктометричні біосенсори, кожен з яких складається з перетворювача на основі двох ідентичних пар 3 необхідність у досить складній попередній підготовці проб для аналізу. Інші методи, такі як поляриметрія та рефрактометрія, є простими і швидкими, але менш точними та селективними. На противагу їм біосенсори є більш зручними, точними, селективними, швидкими та дешевими приладами. Створення біосенсорів для визначення мальтози може спростити та покращити систему моніторингу вмісту мальтози в харчових продуктах та в медичній діагностиці. На сьогодні існує ряд лабораторних прототипів біосенсорів для визначення мальтози [3-14] з різними іммобілізованими на поверхню електродів ферментами: амілоглюкозидаза та глюкозооксидаза [3-5]; амілоглюкозидаза, мутаротаза, глюкозооксидаза та пероксидаза [6]; a-глюкозидаза та глюкозооксидаза [3, 7-9]; α-глюкозидаза, мутаротаза та глюкозооксидаза [10]; α-глюкозидаза, глюкозодегідрогеназа [9, 11]; α-глюкозидаза та глюкокіназа [12]. Розроблені електрохімічні мальтозні біосенсори мають різні робочі характеристики в залежності від співвідношення тих чи інших ферментів, медіаторів, стабілізуючих агентів в складі біоселективної мембрани, типу перетворювачів та методу іммобілізації ферментативної мембрани на поверхні електродів. Наприклад, в роботі [5] автори повідомляють про створення амперометричної сенсорної системи на основі вуглецевих електродів для одночасного визначення в розчині мальтози та глюкози. Мальтоза визначалась за допомогою двох ферментів - амілоглюкозидази та глюкозооксидази, а глюкоза за допомогою лише глюкозооксидази. В даній роботі в якості медіатора використовували 1,1¢-фериціанідметанол. Для створення зовнішньої мембрани готували розчин з 3,5% гідроксиетилцелюлозою та 3% поліетиленгліколем. Оптимум рН роботи сенсорної системи становив 4,8. Лінійний діапазон роботи сенсорів зберігався до 40мМ глюкози та 20мМ мальтози. Ферментні електроди не втрачали активність протягом чотирьох місяців зберігання у сухому стані при 4°С. В іншій роботі [10] автори повідомляють про створення амперометричного біосенсора для визначення мальтози, за допомогою якого автори визначають в зразку активність α-амілази, що гідролізує крохмаль до мальтози. При створенні біоселективної мембрани сенсора для визначення мальтози проводили іммобілізацію глюкозооксидази, мутаротази та α-глюкозидази з желатином та БСА на поверхні електродів за допомогою глутарового альдегіду. Розроблений біосенсор характеризувався лінійною залежністю величини відгуку від концентрації мальтози у діапазоні 0,1-3мМ. Час відгуку складав 30 секунд. У роботі [7] автори повідомляють про розробку амперометричного ферментного сенсора для визначення вмісту мальтози в культуральній рідині. Даний біосенсор розроблявся для дослідження процесів ферментації, які супроводжуються зміною концентрації мальтози. У цій роботі було розглянуто вплив α-глюкозидази та амілоглюкозидази на ефективність перетворення мальтози на глюкозу. Автори зазначають, що амілоглюкозидаза виявилася більш ефективною, і тому для визначення 43335 4 мальтози використали суміш амілоглюкозидази та глюкозооксидази. Авторами встановлено, що за допомогою створеного сенсора вміст мальтози в різних зразках культуральної рідини можна визначати в межах 0,2-4мм. В роботі [3] є повідомлення про створення амперометричного мультибіосенсора для визначення декількох вуглеводів (мальтози, лактози, сахарози та глюкози). В статті [12] розповідається про розробку потенціометричних біосенсорів для одночасного визначення сахарози, мальтози та глюкози в розчині на основі термостабільних ферментів. Отже, на сьогоднішній день більшість розроблених біосенсорів для визначення мальтози є амперометричними [5, 9, 10, 12]. Але, порівняно з кондуктометричними біосенсорами для визначення мальтози, вони мають ряд недоліків. Перш за все, це вимірювання з використанням високого потенціалу, що призводить до похибок завдяки присутності у розчинах інших електроокислюючих компонентів, таких, наприклад, як аскорбінова кислота. По-друге - необхідність в технологічно складному та дорогому електроді порівняння. Потретє - необхідність роботи з високою напругою, що призводить до фарадеївських процесів на електродах. До того ж, амперометричні біосенсори, як правило, є більш дорогими порівняно з кондуктометричними. В цілому, порівняно з іншими електрохімічними біосенсорами, кондуктометричні біосенсори є достатньо простими, зручними, точними та їх використання може дозволити вирішити ряд важливих науково-дослідних та виробничих задач [15, 16]. На сьогоднішній день кондуктометричний біосенсор для селективного визначення мальтози ще не був розроблений. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створення кондуктометричної біосенсорної системи для визначення концентрації мальтози у розчині, яка б дозволила селективно та більш точно визначати мальтозу у досліджуваних зразках. Поставлена задача вирішується за рахунок застосування двох кондуктометричних біосенсорів, перший з яких призначений для визначення глюкози, а другий - для сумарного визначення мальтози і глюкози. Поставлена задача вирішується запропонованою кондуктометричною біосенсорною системою для визначення концентрації мальтози у розчині, що містить кондуктометричну установку та два кондуктометричні біосенсори, кожен з яких складається з перетворювача на основі двох ідентичних нар планарних електродів, при цьому у кожного кондуктометричного біосенсора на першу пару електродів нанесена ферментна мембрана, а на другу пару електродів нанесена мембрана порівняння, один із кондуктометричних біосенсорів забезпечений ферментною мембраною на основі глюкозооксидази, чутливою до глюкози, а другий кондуктометричний біосенсор забезпечений ферментною мембраною, що складається з ферментної системи a-глюкозидаза-мутаротазаглюкозооксидаза та призначений для сумарного 5 визначення мальтози і глюкози, при цьому виходи двох кондуктометричних біосенсорів підключені до відповідних входів кондуктометричної установки. В основі роботи кондуктометричної біосенсорної системи для визначення мальтози лежить наступний каскад ферментативних реакцій: (α-гпюкозидаза, Е. С 3.2.1.20) мальтоза + H2О→α-D-глюкоза+α-D-глюкоза (1) (мутаротаза, Е. С. 5.1.3.3) α-D-глюкоза→β-Dглюкоза (2) (глюкозооксидаза, Е. С. 1.1.3.4) β-D-глюкоза + О2→D-глюконолактон + Н2О2 (3) ß залишок кислоти D-глюконова кислота + Н2О + Н+ (4), α-Глюкозидаза, мутаротаза та глюкозооксидаза поетапно розщеплюють мальтозу до перекису водню та D-глюконолактону. Глюконолактон, в свою чергу, спонтанно гідролізується до глюконової кислоти, яка дисоціює на залишок кислоти і протон, при цьому змінюється провідність розчину, яку і можна реєструвати за допомогою кондуктометричного перетворювача [17]. Співвідношення ферментів в складі ферментної мембрани було отримано експериментально з урахуванням активності кожного з ферментів. Суть корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де: на Фіг.1 схематично показано блок-схему пропонованої кондуктометричної біосенсорної системи; на Фіг.2 показано кондуктометричні біосенсори для визначення мальтози та глюкози; на Фіг.3 показано калібрувальний графік залежності зміни провідності від концентрації глюкози та мальтози; на Фіг.4 показано відтворюваність сигналу мальтозного біосенсора на внесення 0.25мм мальтози у розчин. Вимірювання проводились у 5мм фосфатному буфері, рН 6,5. Кондуктометрична біосенсорна система для визначення концентрації мальтози у розчині складається з кондутометричної установки, що включає генератор змінного струму 1, робочу комірку для досліджуваного розчину 2, опори навантаження 3, диференційний підсилювач 4, фазочутливий нановольтметр 5, реєструючий прилад 6. Система включає також два кондуктометричних біосенсори 7 і 8, кожен з яких складається з двох ідентичних пар планарних електродів 9, 10, 11, 12 та 13, 14, 15, 16 (фіг.2), відповідно, та, при цьому у першого кондуктометричного біосенсора на першу пару електродів 9, 10 нанесена ферментна мембрана 17, що складається з ферментної системи αглюкозидаза-мутаротаза-глюкозооксидаза, чутливої до мальтози та глюкози, а у другого біосенсора на першу пару електродів 13, 14 нанесена відповідно ферментна мембрана 18 на основі глюкозооксидази, чутливої тільки до глюкози, у обох кондуктометричних біосенсорів на другу пару електродів 11, 12 та 15, 16 нанесені мембрани порівняння 19 і 20 відповідно. При цьому виходи кондуктометричних біосенсорів підключені до відповідних входів кондуктометричної установки, яка підключена до джерела живлення. 43335 6 У якості кондуктомстричної установки може бути використана установка, відома з джерела [18]. Іммобілізацію ферментів в складі ферментної мембрани на поверхні електродів проводили за допомогою глутарового альдегіду. Для створення гелю для ферментної мембрани глюкозного біосенсора готували розчин з вмістом 7% глюкозооксидази, 13% БСА, 20% гліцерину у 20мМ фосфатному буфері, рН 7,5. Гель для мембрани порівняння робили таким же чином, але замість наважки ферментів брали 20% БСА. До складу гелю додавався гліцерин для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасному підсиханню розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, БСА в складі ферментної мембрани відігравав роль стабілізуючого агенту для ферментів. Перед нанесенням на поверхню електродів приготовлені гелі (для ферментної мембрани та мембрани порівняння) змішували з 1% водним розчином глутарового альдегіду у співвідношенні 1:1. В свою чергу, для створення гелю для ферментної мембрани мальтозного біосенсора готували розчин з вмістом 5% a-глюкозидаза, 5,5% мутаротази, 5% ГОД, 4% БСА, 20% гліцерину у 20мМ фосфатному буфері, рН 7,5. Гель для мембрани порівняння робили таким же чином, але замість наважки ферментів брали 20% БСА. Обидва розчини були з однаковим вмістом білка. Перед нанесенням на поверхню електродів приготовлені гелі (для ферментної мембрани та мембрани порівняння) змішували з 1% водним розчином ГЛ у співвідношенні 1:1. Після нанесення мембрани на поверхню електродів глюкозний та мальтозний біосенсори висушували 30-50 хвилин у повітрі при кімнатній температурі. Вимірювання при використанні кондуктометричних перетворювачів у складі кондуктометричних біосенсорів для реєстрації перебігу ферментативних процесів проводилися за схемою, представленою на Фіг.1. З низькочастотного генератору сигналів (ГС-112.1) 1 подавалася змінна напруга 10 мВ з частотою f=100кГц на гребінчасті електроди 10, 11 та 14, 15 кондуктометричних біосенсорів 7 і 8 відповідно, які знаходились в комірці з розчином, що досліджувався. На пари електродів 9, 10 та 13, 14 були нанесені ферментні мембрани 17, 18 відповідно, а на інші пари електродів 11, 12 та 15, 16 - мембрани порівняння 19, 20 відповідно. В схемі використовувалися опори навантаження RH = 1 кОм, які були підключені до електродів 9, 12 та 13, 16. Вихідні сигнали знімалися з відповідних опорів навантаження і поступали на диференційний препідсилювач 4 типу Unipan-233-б (Польща). Звідти диференційний сигнал надходив до селективного нановольтметру 5 типу Unipan-233 (Польща), який ми і реєстрували самореєструючим пристроєм 6. Оскільки мальтозний кондуктометричний біосенсор дає відгук і на глюкозу і на мальтозу, для визначення саме мальтози необхідним була наявність також глюкозного кондуктометричного біосенсору. У зв'язку з цим вимірювання мальтози в зразках необхідно було проводити в два етапи. Спочатку отримували сигнал глюкозного кондук 7 43335 тометричного біосенсору на глюкозу, а потім сумарний сигнал мальтозного кондуктометричного біосенсору на мальтозу та глюкозу в досліджувальному розчині. Після визначення різниці між сигналами двох цих ферментних біосенсорів (глюкозного та мальтозного) по калібрувальній кривій (Фіг.3) отримували концентрацію мальтози в досліджувальному розчині. Одними із найважливіших показників роботи кондуктометричних біосенсорів є селективність. Для перевірки селективності мальтозного кондуктометричного біосенсору було проведено ряд дослідів, в яких вивчалась реакція кондуктометричного біосенсору для визначення мальтози на вміст інтерферуючих речовин: Вимірювання проводилися в 5мМ фосфатному буферному розчині, рН 6,5. У комірку вносили інтерферуючі речовини в концентрації 0,5мМ (Таблиця 1), при цьому за 100% було обрано відгуки мальтозного кондуктометричного біосенсору на 0,5мМ мальтози. В цілому, запропонована кондуктометрична біосенсорна система виявилася селективною до ряду інтерферуючих речовин, тому і може бути в подальшому використана для роботи з реальними зразками. Таблиця 1 Селективність біосенсору для визначення мальтози 0,5мМ субстанції Мальтоза Глюкоза Сахароза Фруктоза α-Лактоза β-Лактоза Манноза Відносний відгук мальтозного біосенсора (%) 100 139 4 0 0 0 0 Також було проведено ряд дослідів по вивченню операційної стабільності кондуктометричного біосенсору для визначення мальтози (Фіг.4). Вимірювання проводилися в 5мМ фосфатному буфері, рН 6,5. Мальтозний біосенсор характеризувався високою відтворюваністю сигналу. Таким чином, зважаючи на наведені вище результати, пропонований спосіб дозволив селективно та більш точно визначати мальтозу у досліджуваних зразках за рахунок застосування двох кондуктометричних біосенсорів, перший з яких призначений для визначення глюкози, а другий для сумарного визначення мальтози і глюкози, та використання трьох ферментів (α-глюкозидазамутаротаза-глюкозооксидаза) в складі ферментної мембрани другого кондуктометричного біосенсора для селективного визначення концентрації мальтози в розчині. Список літератури: 1. Обуховский Э.А. Производство мальтозной патоки // Пищепромиздат, Москва -1959. 2. David A., Bender. A. Dictionary of Food and Nutrition// Oxford University Press, - 2005. 3. Filipiak M., Fludra K., Gosciminska E. Enzymatic membranes for determination of some 8 disacchrides by means of oxygen electrode // Biosensors and Bioelectronics. - 1996. - 4. - P. 355364. 4. Shinichiro Gondo, Chulsoon Kim, Satoshi Hirata, Michio Morishila. Studies on dynamic behavior of the biosensor based on immobilized glucoamylaseglucose oxidase membrane // Biosensors and Bioelectronics. - 1997. -12,-№5. - P. 395-401. 5. Ge F., Zhang X.E., Zhang .P., Zhang X.M. Simultaneous determination of maltose and glucose using a screen-printed electrode system // Antonie Van Leeuwenhoek. - 1997. -71,4.-Р.-345-351. 6. Menzel C, Lerch Т., Scheper Т., Schtigerl K. Development of biosensors based on an electrolyte isolator semiconductor (ElS)-capacitor structure and their application for process monitoring. Part I. Development of the biosensors and their characterization // Analytica Chimica Acta. - 317, 1-3. - P. 259-264. 7. Vdradi M, Adanyi N.. Nagy G., Rezessy-Szabo J. Studying the bienzyme reaction with amperometric detection for measuring maltose // Biochimie. - 1980. - 62, 8-9. - P. 587-593. 8. Toshiaki Mori, Toshiaki Motonaga, Yoshio Okahata. Cast films of lipid-coated enzymes as selective sensors for disaccharides // Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. - 1999. - 146. - P. 387-395. 9. Kullick Т., Beyer M., Henning./., Lerch Т., Quack R., Zeitz A., Hitzmann В., Scheper Т., Schtigerl K. Application of enzyme field-effect transistor sensor arrays as detectors in a flowinjection system for simultaneous monitoring of medium components. Part I. Preparation and calibration // Analytica Chimica Acta. - 1994. - 296. P. 263-269. 10. Ludmila Zajoncova, Milan Jilek, Veronika Beranovd, Pavel Pec. A biosensor for the determination of amylase activity// Biosensors and Bioelectronics. - 2004. - 20. - P. 240-245. 11. Kullick Т., Bock U., Schubert J., Scheper Т., Schtigerl K. Application of enzyme-field effect transistor sensor arrays as detectors in a flowinjection analysis system for simultaneous monitoring of medium components. Part II. Monitoring of cultivation processes // Analytica Chimica Acta. 1995. - 300. - P. 25-31. 12. Kazuhito Aoki, Hidekazu Uchida, Teruaki Katsube, Yoshihiro Ishimaru, Takeaki Iida. Integration of bienzymatic disaccharide sensors for simultaneous determination of disaccharides by means of light addressable potentiometric sensoiV/Analytica Chimica Acta. - 2002. - 471. - P. 3-12. 13. Tessema M., Ruzgas Т., Gorton L, Ikeda T. Flow injection amperometric determination of glucose and some other low molecular weight saccharides based on oligosaccharide dehydrogenase mediated by benzoquinone systems // Analytica Chimica Acta. 1995. -310.-P. 161-171. 14. Changqing Sun, Xiaoyuan Zhang, Dan Jiang, Qian Gao, Hongding Xu, Yipeng Sun, Xi Zhang, Jiacong Shen. Electrocatalytic oxidation of carbohydrates at a molecular deposition film electrode based on water-soluble cobalt phthalocyanine and its application to flow-through 9 detection // Journal of Electroanalytical Chemistry. 411, 1 2. - P. 73-78. 15. Дзядевич СВ., Солдаткіи О.П. Кондуктометричний метод у ферментативному каталізі. // Укр. Біохим. Журн.-1994.-66, №4. 16. Дзядевич С В. Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування // Біополімери і клітина. - 2005. - 21, №2 - С. 91-106. 43335 10 17. Дзядевич С.В., Шульга А.А., Пацковскип СВ., Архипова В.Н., Солдаткип А.П., Стриха В.И. Тонкопленочный кондуктометрический датчик для ферментных биосенсоров // Электрохимия.- 1994.30, №8.- С. 982-987. 18. Пешкова В.М. О.Я. Саяпіна, О.О. Солдаткін, О.Л. Кукла, СВ. Дзядевич Ферментний кондуктометричний біосенсор для визначення лактози // Біотехнологія. - 2009, №4 - С... (у друці) 11 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 43335 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601