Кондуктометрична біосенсорна система для визначення цукрози

1. Кондуктометрична біосенсорна система для визначення цукрози, що містить два біосенсори, перший з яких має дві пари кондуктометричних електродів, на одну з яких нанесена робоча мембрана, селективна до глюкози, на другу пару кондуктометричних електродів нанесена референтна 3 18949 зи. Детектування в цьому випадку також базувалось на поглинанні кисню. Але всі ці біосенсори є амперометричними датчиками, які крім деяких переваг, мають і ряд суттєвих недоліків. Перш за все, це вимірювання з використанням високого потенціалу, що призводить до похибок через присутність у зразках інших електроактивних речовин, таких, наприклад, як аскорбінова кислота. Інтерферуючий струм може бути зменшено завдяки використанню додаткових мембран [13, 14], але це не завжди вирішує проблему і до того ж ускладнює процес виготовлення таких систем. В той же час, досить перспективним є кондуктометричний метод, який ще не використовували для вимірювання цукрози. Кондуктометричні методи аналізу є достатньо простими, зручними, точними та дозволяють вирішити ряд важливих науково-дослідних та виробничих задач [15]. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створення кондуктометричної біосенсорної системи для визначення цукрози, яка б дозволила підвищити точність визначення цукру за рахунок створення умов для селективної оцінки вмісту глюкози та цукрози у досліджуваному зразку. Поставлена задача вирішується запропонованою кондуктометричною біосенсорною системою для визначення цукрози, що містить два біосенсори, перший з яких має дві пари кондуктометричних електродів, на одну з яких нанесена робоча мембрана, селективна до глюкози, на другу пару кондуктометричних електродів нанесена референтна мембрана, та другий біосенсор, що має дві пари електродів, на одну з яких нанесена робоча мембрана для сумарного визначення цукрози і глюкози, на другу пару електродів нанесена референтна мембрана, а вказані біосенсори призначені для підключення до кондуктометричної установки. Особливістю запропонованої кондуктометричної біосенсорної системи для визначення цукрози є і те, що робоча мембрана другого біосенсора складається з двох паралельних шарів, один з яких виготовлений на основі глюкозооксидази, а другий - на основі інвертази та мутаротази, а референтна мембрана складається з двох шарів, кожний з яких виготовлений на основі сироваткового альбуміну бика. В основі роботи кондуктометричної біосенсорної системи для визначення цукрози (два шари мембрани) лежить наступний каскад ферментативних реакцій: INV Цукроза Н2О D фруктоза D глюкоза , MUT D глюкоза D глюкоза , GOD D глюкоза O2 D глюконолак тон Н2О2 D глюконова кислота Н2О залишок кислоти (1) (2) (3) (4) Н , ( 4) , де INV - інвертаза, MUT - мутаротаза, GOD глюкозооксидаза. 4 Інвертаза та мутаротаза, що утворюють другий шар мембрани, поетапно розщіплюють цукрозу до -D-глюкози, а глюкозооксидаза, що утворює перший шар мембрани, розщеплює її до перекису водню та D-глюконолактону. Глюконолактон, в свою чергу, спонтанно гідролізується до глюконової кислоти, яка дисоціює на залишок кислоти і протон, при цьому змінюється провідність розчину, яку і можна реєструвати за допомогою кондуктометричного перетворювача [16]. Співвідношення компонентів (ферментів) було отримано експериментальнo. Його підібрали для покращення аналітичних характеристик біосенсора: таких як селективність, чутливість, операційна стабільність та інші. Суть корисної моделі пояснюється за допомогою схематичних креслень, де на Фіг.1 показано схематичний вигляд біосенсорів для визначення цукрози, на Фіг.2 блок-схема кондуктометричної біосенсорної системи; а на Фіг.3 показано графіки залежності зміни провідності від концентрації глюкози (а) та цукрози (б). Вимірювання проводились у 10мМ фосфатному буфері, рН7,2. Кондуктометрична біосенсорна система для визначення цукрози містить два біосенсори, перший з яких складається з двох пар електродів 1 і 2, на одну з яких 1 нанесена робоча мембрана 3, на другу пару електродів 2 нанесена референтна мембрана 4, а також другий біосенсор, що складається з двох пар електродів 5 і 6, на одну з яких 5 нанесена робоча мембрана, утворена з двох шарів 7 та 8, на другу пару електродів 6 нанесена референтна мембрана з двох шарів 9 і 10, а згадані пари електродів 1, 2, 5, 6 підключені до кондуктометричної установки. Кондуктометрична установка містить блок 11/РБ/ для взаємного вираховування сигналів біосенсорів (див. Фіг.2), низькочастотний генератор сигналів 12/ГС/ (типу Г3-118 /Україна/), входи якого підключені до відповідних електродів кондуктометричної системи 1, 2, 5, 6. Виходи ГС 12 підключені до входів відповідних фазочутливих нановольтметрів 13/HВ/. Виходи НВ 13 підключені до блоку для взаємного вираховування сигналів біосенсорів кондуктометричної вимірювальної установки 11/РБ/. При цьому входи НВ 13 через диференційні підсилювачі 14/ДП/ підключені до відповідних пар електродів біосенсорів, які розташовані у вимірювальній комірці 15. Окрім того, установка забезпечена опорами навантаження 16, призначеними для зйому сигналу для роботи селективних нановольтметрів 13/НВ/. Пропонована кондуктометрична біосенсорна система для визначення цукрози працює так. На робочу поверхню однієї пари електродів 1 першого кондуктометричного біосенсора наносять робочу мембрану 3, яка вноситься в пари глутарового альдегіду (ГА) на 20-30 хвилин. Суміш, з якої формується робоча мембрана 3 складається з 20мМ фосфатного буфера, рН7,2, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас.%): - 4,5-5,5 глюкозооксидаза (ГОД), - 4,5-5,5 сироватковий альбумін бика (БСА), - 8-12 гліцерин. На другу пару електродів 2 наносять референтну мембрану 4, яка вноситься в пари ГА на 20 5 30 хвилин та складається з 20мМ фосфатного буфера, рН7,2, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас.%): - 9-11 БСА, - 8-12 гліцерин. На першу пару електродів 5 другого біосенсора кондуктометричної біосенсорної системи для визначення цукрози наносили робочу мембрану, яка складається з двох шарів 7 і 8, перший з яких 7 (об'єм 100нл) вноситься в пари ГА на 20-30 хвилин. Цей шар формується з 20мМ фосфатного буфера, рН7,2, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас.%): - 4,5-5,5 глюкозооксидаза (ГОД), - 4,5-5,5 сироватковий альбумін бика (БСА), - 8-12 гліцерин. Після нанесення першого шару 7, його висушують на повітрі 20-30 хвилин і наносять другий шар 8 робочої мембрани (250нл), що формується з 10мМ фосфатного буфера, рН7,2, та наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас.%): - 4-6 інвертаза, - 1,5-3 мутаротази, - 5-10 гліцерин, - 0,5-1,5 ГА. На другу пару електродів 6 нанесено референтну мембрану, яка має два шари, перший з яких 9 (100нл) вноситься в пари глутарового альдегіду (ГА) на 20-30 хвилин, цей шар формується з 20мМ фосфатного буфера, рН7,2, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас.%): - 9-11 БСА, - 8-12 гліцерин. Другий шар 10 референтної мембрани (250нл), наносять після висушування першого шару, і який формується з 10мМ фосфатного буфера, рН7,2, та наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас.%): - 5-10 БСА, - 5-10 гліцерин, - 0,5-1,5 ГА. З ГС 12 на електроди біосенсорів (диференційні пари) обох біосенсорів - 1, 2, 5, 6, які знаходяться в комірці 15 з розчином, що досліджується, подається змінна напруга з частотою 100кГц та амплітудою 10мВ. При цьому із згадaних електродів отримують сигнали, які знімаються з опорів навантаження 16 (Rh=1кOм) та надходять через диференційні підсилювачі 14 (типу Unipan-233-6 (Польша)) до селективних нановольтметрів 13 (типу Unipan-233 (Польша)). Після нановольтметрів 13 ці сигнали подаються до блоку для взаємного вираховування сигналів 11 біосенсорів кондуктометричної вимірювальної установки, в якому відбувається перерахування даних та отримання сигналу, який відповідає вмісту цукрози у досліджуваному розчині. В ході експериментів вимірювали залежність амплітуд вихідних сигналів від концентрацій субстратів в розчині. Пропоновану систему використовували так. Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Створювали глюкозні біосенсори: виготовляли робочу мембрану 3. Для цього готували розчин з вмістом 5% глюкозооксидази (ГОД), 5% БСА та 10% гліцерину у 20мМ фосфатному буфері, 18949 6 рН7,2. Референтну мембрану 4 виготовляли таким же чином, але замість наважки ферментів брали 10% БСА. Гліцерин у складі мембран 3 та 4 використовувався для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасного підсихання розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, БСА в складі робочої мембрани 3 відігравав роль стабілізуючого агенту для ферментів. Краплю суміші ГОД-БСА (100нл) наносили на одну частину чутливої поверхні перетворювача 1, а на іншу 2 - розчин БСА без ферменту (це був датчик порівняння). Для іммобілізації мембран датчики розміщували в атмосфері насичених парів глутарового альдегіду (ГА) на 20-30хв. і потім підсушували на повітрі й відмивали від надлишку ГА у буферному розчині протягом 10-20хв. Таким чином отримували біосенсори, з електродами 5 і 6, для визначення глюкози, які в свою чергу були ще й початковим етапом для створення біосенсора для визначення цукрози. Для створення робочої мембрани 8 цукрозного біосенсора 2 готували розчин з вмістом 9% інвертази, 4% мутаротази, 10% гліцерину, у 20мМ фосфатному буфері, рН7,2. Розчин для референтної мембрани 10 робили таким же чином, але замість наважки ферментів брали 13% БСА. Обидві мембрани мали однаковий вміст білку. Перед нанесенням зміщували рівні об'єми наведених розчинів з 2% водним розчином ГА. Суміш з інвертазою та мутаротазою наносили на електродну пару 5 з ГОД (як описано вище), а референтну суміш - на іншу електродну пару 6 з БСА глюкозного біосенсора. Нанесення проводили за допомогою мікропіпетки Eppendorf (загальною ємністю 0,1-2,5мкл), що становило приблизно (200-250нл) кожного розчину на одну пару електродів. Потім біосенсори висушували 2 години на повітрі при кімнатній температурі. Перед початком роботи для видалення надлишку глутарового альдегіда сенсор відмивали у буфері, в якому і проводились подальші досліди. Приклад аналізу цукрози в соку. Спочатку отримували залежності величин відгуків глюкозного біосенсору 1 та цукрозного біосенсору 2 на різні концентрації глюкози та цукрози одержували калібрувальні графіки (Фіг.3). Для перевірки роботи пропонованої кондуктометричної біосенсорної системи з реальними зразками, вибрали яблучний сік. За допомогою глюкозного біосенсору 1 отримували сигнал на внесення до комірки аліквоти соку (2мкл). В залежності від величини сигналу по калібрувальному графіку глюкозного біосенсору 1 (Фіг.3,а) на глюкозу отримували концентрацію глюкози в соку (G1=94мМ). В той же час за допомогою цукрозного біосенсора 2, також, отримували сигнал (по аналогії з глюкозним біосенсором 1) на внесення тієї ж аліквоти соку (2мкл). Оскільки біосенсор 2 для визначення цукрози реагує як на глюкозу, так і на цукрозу, то сигнал дорівнює сумі двох сигналів: на глюкозу та на цукрозу. При відніманні сигналу, отриманого на глюкозному біосенсорі 1, від сигналу, отриманого на цукрозному біосенсорі 2, отримували значення, яке відповідає сигналу цукрозного біосенсора 2 лише на цукрозу, що присутня в соку. Далі по калі 7 18949 брувальному графіку цукрозного біосенсору 2 на цукрозу (Фіг.3,б), в залежності від величини сигналу, визначали концентрацію цукрози в соках (Z=39мM). Контрольний метод. Для перевірки отриманих даних проводився контрольний метод з використанням глюкозного біосенсора 1. Для цього в сік додавали фермент інвертазу, яка каталізує розщеплення цукрози на глюкозу та фруктозу. При розщепленні однієї молекули цукрози утворювалася одна молекула глюкози та одна молекула фруктози. Цій суміші давали вистоятися біля двох годин для спонтанного перетворення -D-глюкози в -D-глюкозу. Потім за допомогою глюкозного біосенсора 1 на внесення 2мкл соку з доданою в нього інвертазою отримували сигнал. По калібрувальному графіку глюкозного біосенсору 1 (Фіг.3,а) отримували значення концентрації глюкози в соку з інвертазою (S=134мМ). Перевірка S=G1+Z (134мМ 39мМ+94мМ). 8 З прикладу видно, що пропонована кондуктометрична біосенсорна система є придатною, дозволяє отримувати результати з високим ступенем достовірності, проводити кількісний аналіз цукрози і глюкози в соках та в інших розчинах. Також для проведення робіт з реальними зразками, необхідно знати, чи є пропонована кондуктометрична біосенсорна система селективною до інтерферуючих речовин, тому було проведено перевірку її селективності. Було виконано ряд дослідів, в яких вивчалася реакція цукрозного та глюкозного біосенсорів 1 та 2 на інтерферуючі частинки. Дослідження проводились в 10мМ фосфатному буфері, рН7,0. У комірку 15 вносили 1мМ можливих інтерферуючих розчинів (Таблиця 1), при цьому за 100% було обрано відгуки глюкозного 1 та цукрозного 2 біосенсорів на 1мМ глюкози та цукрози відповідно. Пропонована кондуктометрична біосенсорна система виявилась селективною до ряду інтерферуючих речовин, а тому може бути використана для роботи з реальними зразками. Таблиця 1 Селективність кондуктометричної біосенсорної системи 1мМ субстанції Цукроза Мальтоза Лактоза Глюкоза Фруктоза Сорбіт Рамноза Манніт Арабіноза Аскорбінова кислота Крохмаль Целюлоза Відносний відгук цукрозного сенсора (%) 100 10 0 101 0 0 0 0 0 0 0 0 Список літератури: 1. D.R. Schmid, F. Scheller. Biosensors. Application in medicine, environmental protection and process control. Weinheim: VCH, 1990. 2. J.C.Y. Tsao. New by-products from molasses // Sugar у Azucar.-1964.-59 (9).- P.98-99. 3. H. Schiweck. Zusammensetzung von Zuckerrobenmelassen // Zuckerindustrie.- 1994.-119 (4).-P.272-282. 4. K. Thielecke. Zur Zusammensetzung von Rubenmelassen // Branntweinwirtschaft.-1987.-127 (13).-P.193-195. 5. В. Herbreteau, M. Lafosse, L. Morin-Allory, M. Dreux. Automatic sugar analysis in the beet industry. Part I // High Res. Chromatogr.-1990.-13.- P.239-243. 6. S.V. Vercelotti, M.A. Clarke. Comparison of modern and traditional methods of sugar analysis // Int. Sugar. J.-1994.- 96 (1151).- P.437-445. 7. J.L. Lima Filho, P.C. Pandey, H.H. Weetall. An amperometric flow injection analysis enzyme sensor for sucrose using a tetracyanoquinodimethane modifies graphite paste electrode // Biosensors Bioelectronics. -1996. -11.- P.719-723. Відносний відгук глюкозного сенсора (%) 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 8. Filipiak M, Fludra К, Gosciminska E. Enzymatic membranes for determination of some disaccharides by means of an oxygen electrode. Biosens Bioelectron.1996;11 (4):355-64. 9. Gouda M.D, Kumar M.A, Thakur M.S, Karanth N.G. Enhancement of operational stability of an enzyme biosensor for glucose and sucrose using protein based stabilizing agents. Biosens Bioelectron. 2002 Jun;17(6-7):503-507. 10. Guemas Y, Boujtita M, el Murr N. Biosensor for determination of glucose and sucrose in fruit juices by flow injection analysis. Appl Biochem Biotechnol. 2000 Nov-Dec; 89(2-3):171-81. 11. S.O. Enfors. // Enzym. Microbiol. Technol.1981. - 3.- P.29. 12. A. Barlikova, J. Svorc, S. Miertus. // Anal. Chim. Acta. -1991.- 247.- P.83. 13. Л.В.Шкотова, А.П.Солдаткин, С.В.Дзядевич, Адаптация амперометрического биосенсора для анализа глюкозы в винах // УБЖ. 2004. Т.76 №3 с.114-121. 14. P.J.H.J. van Os, A. Bull, W.P. van Bennekom. // Anal. Chim. Acta.-1995.- 305.- P.18. 9 18949 15. Дзядевич С.В. Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування // Біополімери і клітина. - 2005. – Т.21. - №2 - с.91106. Комп’ютерна верстка М. Ломалова 10 16. Дзядевич С.В., Шульга А.А., Пацковский С.В., Архипова В.Н., Солдаткин А.П., Стриха В.И. Тонкопленочные кондуктометрические датчики для ферментативных биосенсоров // Электрохимия. 1994. том 30.8. с.982-987. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601