Спосіб культивування цирковірусу ссавця

1. Спосіб культивування цирковірусу ссавця, який включає: a) одержання клітин ссавця, що експресують функціональний білок E1 аденовірусу ссавця, причому 2 (19) 1 3 82647 4 16. Рекомбінантна клітина ссавця за п. 15, де за36. Спосіб за п. 35, де зазначеним цирковірусом значеною функцією E1 аденовірусу є функція E1 ссавця є цирковірус свиней. аденовірусу людини. 37. Спосіб за п. 36, де зазначеним цирковірусом 17. Рекомбінантна клітина ссавця за п. 15, де засвиней є цирковірус свиней типу 2. значеною функцією E1 аденовірусу є функція E1 38. Спосіб за п. 36, де зазначеним цирковірусом аденовірусу свиней. свиней є цирковірус свиней типу 1. 18. Рекомбінантна клітина ссавця за п. 15, де за39. Спосіб за п. 35, де зазначена клітина ссавця значена клітина походить від свині. походить від свині. 19. Рекомбінантна клітина ссавця за п. 15, де за40. Спосіб за п. 39, де зазначеною клітиною ссавця значеною клітиною є клітина сітківки свині. є клітина сітківки свині. 20. Рекомбінантна клітина ссавця за п. 15, де клі41. Спосіб за п. 35, де зазначеним функціональтина ссавця, що експресує функціональний білок ним білком Е1 аденовірусу ссавця є функціональE1 аденовірусу ссавця, є стабільно трансформоний білок Е1 аденовірусу людини. ваною послідовністю гена E1 аденовірусу ссавця. 42. Спосіб за п. 35, де зазначеним функціональ21. Рекомбінантна клітина ссавця за п. 20, де заним білком Е1 аденовірусу ссавця є функціональзначеною послідовністю гена E1 є послідовність ний білок Е1 аденовірусу свині. гена E1 аденовірусу людини. 43. Спосіб за п. 35, де зазначена клітина ссавця, 22. Рекомбінантна клітина ссавця за п. 20, де защо експресує функціональний білок E1 аденовірузначена послідовність гена E1 аденовірусу ссавця су ссавця, стабільно трансформована послідовнісє гетерологічною стосовно зазначеної клітини ссатю гена E1 аденовірусу ссавця. вця. 44. Спосіб за п. 43, де зазначеною послідовністю 23. Спосіб одержання рекомбінантної клітини ссагена E1 є послідовність гена E1 аденовірусу людивця, що містить функцію E1 аденовірусу ссавця і ни. геном цирковірусу свиней, який передбачає стадії: 45. Спосіб за п. 43, де зазначена послідовність а) одержання клітини ссавця, що експресує функгена E1 аденовірусу ссавця є гетерологічною стоціональний білок E1 аденовірусу ссавця, і b) ввесовно зазначеної клітини ссавця. дення зазначеного геному цирковірусу свиней чи 46. Спосіб за п. 35, де зазначеним функціональйого частини, здатної реплікуватися, до цієї клітиним білком E1 є функціональний білок E1А та/або ни ссавця. E1В. 24. Спосіб за п. 23, який додатково включає стадію 47. Спосіб за п. 36, де зазначений цирковірус свикультивування зазначеної клітини ссавця в умоней містить химерну нуклеотидну послідовність. вах, придатних для реплікації зазначеного цирко48. Спосіб одержання рекомбінантної клітини ссавірусу свиней. вця, що включає введення геному цирковірусу 25. Спосіб за п. 24, який додатково включає стадію ссавця чи його частини, здатної до реплікації, до видобування зазначеного цирковірусу із зазначеклітини ссавця, що експресує функціональний біних культивованих клітин. лок E1 аденовірусу ссавця, де клітина є пермісив26. Спосіб за п. 23, де зазначений цирковірус свиною для реплікації цирковірусу ссавця. ней є цирковірусом свиней типу 2. 49. Спосіб одержання рекомбінантної клітини сса27. Спосіб за п. 23, де зазначений цирковірус свивця, що включає введення області гена E1 аденоней є цирковірусом свиней типу 1. вірусу ссавця до клітини ссавця, що містить геном 28. Спосіб за п. 23, де зазначені клітини ссавця цирковірусу ссавця чи його частини, здатної до походять від свині. реплікації, де клітина є пермісивною для реплікації 29. Спосіб за п. 28, де зазначені клітини ссавця є цирковірусу ссавця. клітинами сітківки свині. 50. Спосіб за п. 48 чи 49, що додатково включає 30. Спосіб за п. 23, де зазначеною функцією E1 стадію культивування зазначеної рекомбінатної аденовірусу є функція E1 аденовірусу людини. клітини ссавця в умовах, придатних для реплікації 31. Спосіб за п. 23, де зазначеною функцією E1 зазначеного цирковірусу свиней. аденовірусу є функція E1 аденовірусу свиней. 51. Спосіб за п. 50, що додатково включає стадію 32. Спосіб за п. 23, де зазначений цирковірус свивидобування зазначеного цирковірусу із зазначеней містить химерну нуклеотидну послідовність. ної культивованої клітини. 33. Спосіб за п. 23, де зазначена клітина ссавця, 52. Спосіб за п. 48 чи 49, де зазначеним цирковіщо містить функцію E1 аденовірусу ссавця, є старусом є цирковірус свиней. більно трансформованою послідовністю гена E1 53. Спосіб за п.52, де зазначеним цирковірусом аденовірусу ссавця. свиней є цирковірус свиней типу 1 чи цирковірус 34. Спосіб за п. 23, де зазначена послідовність свиней типу 2. гена E1 аденовірусу ссавця є гетерологічною сто54. Спосіб за п. 48 чи 49, де зазначена клітина совно зазначеної клітини ссавця. ссавця походять від свині. 35. Спосіб реплікації цирковірусу ссавця, який 55. Спосіб за п. 54, де зазначеною клітиною ссавця включає культивування клітини ссавця, яка містить є клітина сітківки свині. геном цирковірусу ссавця чи його частину, здатну 56. Спосіб за п. 48 чи 49, де зазначеним функціодо реплікації в умовах, придатних для реплікації нальним білком Е1 аденовірусу ссавця є функціозазначеного цирковірусу ссавця, де клітина ссавця нальний білок Е1 аденовірусу людини. експресує функціональний білок Е1 аденовірусу 57. Спосіб за п. 48 чи 49, де зазначеним функціоссавця і є пермісивною для реплікації цирковірусу нальним білком Е1 аденовірусу ссавця є функціоссавця, та при необхідності видобування зазначенальний білок Е1 аденовірусу свині. ного цирковірусу ссавця із культивованої клітини. 5 82647 6 58. Спосіб за п. 48 чи 49, де зазначений цирковірус 66. Спосіб за п. 62, де зазначена клітина ссавця містить химерну нуклеотидну послідовність. походить від свині. 59. Спосіб за п. 48 чи 49, де зазначена клітина 67. Спосіб за п. 66, де зазначеною клітиною ссавця ссавця стабільно трансформована послідовністю є клітина сітківки свині. гена E1 аденовірусу сса вця. 68. Спосіб за п. 62, де зазначеним функціональ60. Спосіб за п. 48 чи 49, де зазначена послідовним білком Е1 аденовірусу ссавця є функціональність гена E1 аденовірусу ссавця є гетерологічною ний білок Е1 аденовірусу людини. стосовно зазначеної клітини ссавця. 69. Спосіб за п. 62, де зазначеним функціональ61. Спосіб за п. 48 чи 49, де зазначеним функціоним білком Е1 аденовірусу ссавця є функціональнальним білком E1 є функціональний білок E1А ний білок Е1 аденовірусу свині. та/або E1В. 70. Спосіб за п. 62, де зазначена клітина ссавця 62. Спосіб експресії геному цирковірусу ссавця чи стабільно трансформована послідовністю гена E1 його частини, що включає культивування клітини аденовірусу ссавця. ссавця, що містить геном цирковірусу ссавця чи 71. Спосіб за п. 70, де зазначеною послідовністю його частину, в умовах, сприятливих для експресії гена E1 є послідовність гена E1 аденовірусу людизазначеного геному цирковірусу ссавця чи його ни. частини, де клітина ссавця експресує функціона72. Спосіб за п. 70, де зазначена послідовність льний білок Е1 аденовірусу ссавця, і при необхідгена E1 аденовірусу ссавця є гетерологічною стоності видобування зазначеного цирковірусу чи совно зазначеної клітини ссавця. його частини із культивованої клітини. 73. Спосіб за п. 23 чи 62, де зазначеним функціо63. Спосіб за п. 62, де зазначеним цирковірусом нальним білком E1 є функціональний білок E1А ссавця є цирковірус свиней. та/або E1В. 64. Спосіб за п. 63, де зазначеним цирковірусом 74. Спосіб за п. 62, де зазначений цирковірус свисвиней є цирковірус свиней типу 2. ней містить химерну нуклеотидну послідовність. 65. Спосіб за п. 63, де зазначеним цирковірусом свиней є цирковірус свиней типу 1. Даний винахід відноситься до області цирковірусів і забезпечує композиції та способи для культивування цирковірусів, зокрема, цирковірусу свиней. Зокрема, даний винахід відноситься до способів культивування цирковірусу свиней у клітинах ссавців, що експресують функцію гена Е1 аденовірусу ссавців. Віруси сімейства Circoviridae, знайдені у ряді видів рослин та тварин і звичайно називані цирковірусами, характеризуються круглими віріонами, які не мають оболонки, із середнім діаметром 1723,5нм, що містять кільцеву одноланцюгову дезоксирибонуклеїнову кислоту (олДНК). олДНК геному цирковірусів є найкоротшим з відомих вірусних ДНК-репліконів. Як розкрито у WO 99/459566, щонайменше шість вірусів, відповідно до Шостого звіту Міжнародного комітету з таксономії вірусів, ідентифіковані як члени цього сімейства [Lukert, P.O. et al. 1995, The Circoviridae, pp. 166-168. У: F.A.Murphy, et al. (eds) Virus Taxonomy, Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Arch Virol.10 Suppl.]. До вірусів тварин, включених у дане сімейство, відносяться цирковірус анемії курчат (chicken anemia virus, CAV), вірус захворювання дзьоба і пір'я (beak and feather disease virus, BFDV), цирковірус свиней (porcine circovirus, PCV) та цирковірус голубів (pigeon circovirus). PCV був спочатку виділений з культур клітин нирок свиней. PCV реплікується у клітинному ядрі й утворює великі внутрішньоядерні тільця включення. Див. Murphy et al. [1999, Circoviridae p.357-361, Veterinary Virology, 3rd ed., Academic Press, San Diego]. На даний момент відомі два типи PCV: PCV типу 1 (PC V1) та PCV типу 2 (PC V2). PC V1, ізольований як стійкий кон тамінаит безперервної клітинної лінії нирок свині РК-15 (АТСС CCL31), не викликає детектованого цитопатичного ефекту в культурі клітин і не викликає клінічного захворювання свиней при експериментальному інфікуванні [див. Allan G., 1995, Vet. Microbiol. 44: 49-64; Tisher, I. et al., 1982, Nature 295: 64-66 та Tisher, I. et al., 1986, Arch. Virol. 91: 271-276]. PCV2, на відміну від PC V1, тісно асоційований із синдромом післявідлучного мультисистемного виснаження у відлучених поросят (PMWS) [див. Allan G. et al., 1998, Europe J. Vet. Diagn. Investig. 10: 3-10; Ellis, J. et al., 1998, Can. Vet. J. 39: 44-51 та Morozov, I. et al., 1998, J. Clin. Microbiol. 36: 2535-2541]. Нуклеотидні послідовності для PCV1 описані в роботі Mankertz.A. et al. [1997, J. Virol. 71: 2562-2566], а нуклеотидні послідовності для PCV2 описані в роботах Hamel, A.L., et al. [1998, J. Virol. 72: 5262-5267]; Mankertz, Α. et al.[2000, Virus Res. 66: 65-77] та Meehan, B.M. et al. [1998, J. Gen. Virol. 79: 2171-2179]. Штами PCV2 описані у WO 00/01409 і були депоновані Європейською колекцією клітинних культур Центра прикладної мікробіології та досліджень [European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingdom]: номер доступу V97100219, номер доступу V9700218, номер доступ у V97100217, номер доступу V98011608 і номер доступу 98011609. PCV2 також описується у WO 00/77216. В опублікованих на даний момент дослідженнях з PCV2 використовувалися або гомогенат тканини, або культивований вірус, одержаний з польових ізолятів. Tisher et al. [1987, Arch Virol. 96:39-57] повідомляють, що при обробці D 7 82647 8 глюкозаміном відбувається стимуляція вступу кліми гена Е1 аденовірусу ссавців. В інших втіленнях тин нирок свиней у S-фаз у клітинного циклу. Одпослідовність гена Е1 аденовірусу ссавців є ге тенак, обробка клітин D-глюкозаміном повинна прорологічною стосовно зазначеної клітини ссавця. водитися обережно, тому що D-глюкозамін є Даний винахід також забезпечує способи одетоксичним для культур клітин [див. Allan G. et al., ржання рекомбінантних клітин ссавців, що експре2000, J. Vet. Diagn. Investig. 12:3-14]. Залишається сують функцію Е1 аденовірусу ссавців і містять потреба у способах культивування цирковірусу, геном цирковірусу ссавців, які передбачають статакого, наприклад, як PCV1 і PCV2, та інших цирдії: а) одержання клітини ссавця, що v експресує ковірусів, які дозволять одержувати чистий циркофункцію Е1 аденовірусу ссавців; і Ь) введення вірус. Такі способи будуть корисні, зокрема, для геному зазначеного цирковірусу ссавців чи його одержання антигенів PCV2 як вакцини проти частини, здатної до реплікації, у зазначену клітину PMWS. Даний винахід націлений на задоволення ссавця. У додаткових втіленнях спосіб включає цієї потреби. додаткову стадію культивування рекомбінантної Усі патенти і публікації включені до даного клітини ссавця в умовах, придатних для реплікації опису в їхньому повному виді за посиланням. зазначеного цирковірусу ссавців. У наступних втіДаний винахід забезпечує способи культивуленнях спосіб включає видобування зазначеного вання цирковірусів ссавців, які включають: а) одецирковірусу із зазначених культивованих клітин. У ржання клітин ссавців, що експресують функцію деяких втіленнях цирковірус ссавця є цирковіругена Е1 аденовірусу ссавців, причому зазначені сом свиней, таким як, наприклад, цирковірус свиклітини є пермісивними для реплікації цирковірусу ней 1 (PCV1) чи цирковірус свиней 2 (PCV2). В ссавців; b) введення зазначеного геному цирковіінших втіленнях цирковірус свиней містить хімерну русу ссавців чи його здатної реплікуватися частинуклеотидну послідовність. У наступних втіленнях ни до зазначених клітин; і с) культивування зазнаклітини ссавця походять від свині. У наступних чених клітин ссавців в умовах, придатних для втіленнях клітини ссавця є клітинами сітківки свині. реплікації зазначеного цирковірусу ссавців. У додаткових втіленнях функція Е1 аденовірусу є У деяких втіленнях цей спосіб додатково функцією Е1 аденовірусу людини чи функцією Е1 включає видобування зазначеного цирковірусу із аденовірусу свиней. В інших додаткових втіленнях зазначених культивованих клітин. клітина ссавця, що експресує функцію Е1 аденовіВ деяких втіленнях цирковірусом ссавців є цирусу ссавців, є стабільно трансформованою послірковірус свиней, такий як, наприклад, цирковірус довністю гена Е1 аденовірусу ссавців. В інших свиней 1 (PCV1) чи цирковірус свиней 2 (PCV2). У втіленнях послідовність гена Е1 аденовірусу ссавдодаткових втіленнях цирковірус свиней містить ців є гетерологічною стосовно зазначеної клітини хімерну нуклеотидну послідовність. В інших втіссавця. леннях клітини ссавця походять від свині. В інших На фігурах 1А-1В показані характеристика і додаткових втіленнях клітини ссавця є клітинами титрування вірусу PCV2, одержаного шляхом сітківки свині. трансфекції та екстракції ДНК з інфікованих клітин В інших втіленнях функція Е1 аденовірусу ссаVIDO R1 за способом Хірта. (А) ПЛР із викорисвців є функцією Е1 аденовірусу людини. В інших танням РСV2-специфічних праймерів та ДНК з втіленнях функція Е1 аденовірусу ссавців є функРСV2-інфікованих клітин (доріжка 1) і псевдоінфіцією Е1 аденовірусу свиней. У наступних додаткокованих клітин (доріжка 2). Як контроль використових втіленнях функція Е1 є функцією Е1А та/або вували плазміду, що містить геном PCV2 (доріжка Е1В. В інших додаткових втіленнях клітина ссавця, 3). Маркер молекулярних розмірів ДНК (1-kb DNA що експресує функцію Е1 аденовірусу ссавця, є ladder) фірми GIBCO BRL наносили на доріжку М. стабільно трансформованою послідовністю гена (В) Вірусні ДНК із клітин, інфікованих PCV2 (доріжЕ1 аденовірусу ссавців. В інших втіленнях посліки 1, 3 і 5) та псевдоінфікованих клітин (доріжки 2, довність гена Е1 аденовірусу сса вців є ге терологі4 і 6) були гідролізовані рестриктазами Ncol і StuI чною стосовно зазначеної клітини ссавця. (доріжки 1 і 2), EcoRl і Stul (доріжки 3 і 4), EcoRI і Даний винахід забезпечує рекомбінантні клітиEcoRV (доріжки 5 і 6). Маркер молекулярних розни ссавців, що експресують функцію Е1 аденовірумірів ДНК (1-kb-plus DNA ladder) фірми GIBCO BRL су ссавців, і містять геном цирковірусу ссавців чи наносили на доріжку Μ. його частину, здатну реплікуватися, причому заФігури 2А-2В показують титр ування PCV2 значені клітини є пермісивними для реплікації зашляхом імунопероксидазного забарвлювання. Чезначеного цирковірусу ссавців. У деяких варіантах рез 72год. після інфекції псевдоінфіковані (А) чи цирковірусом ссавців є цирковірус свиней, такий інфіковані вірусом PCV2 (В) клітини VIDO R1 інкуяк, наприклад, цирковірус свиней 1 (PCV1) чи цирбували з кролячими анти-ОРС2 поліклональними ковірус свиней 2 (PCV2). У додаткових втіленнях антитілами і біотинільованим вторинним антитіцирковірус свиней містить хімерну нуклеотидну лом. Після внесення комплексу авідину та біотиніпослідовність. У деяких втіленнях функція Е1 адельованої пероксидази хрону моношар проявляли новірусу є функцією Е1 аденовірусу людини. В діамінобензидинтетрахлоридом (DAB). Одна темінших втіленнях функція Е1 аденовірусу є . функна клітина відповідала інфікуванню одиничною цією Е1 аденовірусу свиней. В інши х втіленнях вірусною частинкою. клітина ссавця походить від свині. У наступних Фігури 3 А-3С показують нуклеотидну послідододаткових втіленнях клітина ссавця є клітиною вність (А) та амінокислотні послідовності ORF1 (В) сітківки свині. У додаткових втіленнях клітина ссаі ORF2 (3) цирковірусу свиней 2, описані в вця, що експресує функцію Е1 аденовірусу ссавGenbank (реєстраційний номер AF086834). ців, є стабільно трансформованою послідовностя 9 82647 10 Даний винахід відноситься до композицій і а також GenBank AF086834, AF086835 і AF086836. способів для культивування цирковірусів ссавців, Порівняння опублікованих нуклеотидних послідовзокрема, цирковірусу свиней. Даний винахід осноностей PCV1 і PCV2 виявляє їх