Поліпептид ожиріння (варіанти), відповідні нуклеїнові кислоти (варіанти) та фармацевтична композиція

1. Полипептид ожирения (OB), имеющий от около 145 до около 167 аминокислот аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или 6 , способный модулировать вес тела животного. 2. Полипептид ожирения (ОВ) по п. 1, дополнительно имеющий одну или более химических групп, связанных с ним. 3. Полипептид ожирения (ОВ) по любому из пп. 1 или 2, выбранный из группы, включающей полипептиды: 2 (19) 1 3 70911 4 (б) полипептиды в соответствии с п. (а), имеющие 13. Человеческий аналог полипептида ОВ по люметионин в положении 21, или имеющие глицинбому из пп. 11 или 12, выбранный из группы, серин-гистидин-метиониновую последовательвключающей полипептиды: ность SEQ ID NО: 38 в положениях 18-21, или (а) имеющие делецию остатков в положениях 1-21 имеющие метионин-глицин-серин-серин-гистидиндля получения зрелого полипептида и гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин(б) полипептиды в соответствии с п. (а), имеющие серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролинметионин в положении 21 или имеющие глицинаргинин-глицин-серин-гистидин-метиониновую серин-гистидин-метиониновую последовательпоследовательность (SEQ ID NO:98) в положениях ность SEQ ID NO: 38 в положениях 18-21, или 1-21 или имеющие лейцин-глутаминовая кислотаимеющие метионин-глицин-серин-серин-гистидинлизин-аргинин-глутаминовая кислота-аланингистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидинглутаминовая кислота-аланиновую последовасерин-серин-глицин-лейцин-валин-пролинтельность (SEQ ID NO: 26) в положениях 14-21, аргинин-глицин-серин-гистидин-метиониновую или имеющие глутаминовая кислота-аланинпоследовательность (SEQ ID NO:98) в положениях глутаминовая кислота-аланиновую последова1-21, или имеющие лейцин-глутаминовая кислотательность (SEQ ID NO: 27) в положениях 18-21, лизин-аргинин-глутаминовая кислота-аланинили имеющие лейцин-глутаминовая кислотаглутаминовая кислота-аланиновую последовализин-аргининовую последовательность (SEQ ID тельность (SEQ ID NO: 26) в положениях 14-21, NO: 28) в положениях 18-21, или имеющие метиоили имеющие глутаминовая кислота-аланиннин-глицин-серин-серин-гистидин-гистидинглутаминовая кислота-аланиновую последовагистидин-гистидин-гистидин-гистидин-серинтельность (SEQ ID NO: 27) в положениях 18-21, серин-глицин-лейцин-валин-пролин-аргининили имеющие лейцин-глутаминовая кислотаглицин-серин-пролиновую последовательность лизин-аргининовую последовательность (SEQ ID (SEQ ID NO:99) в положениях 2-21, или имеющие NO: 28) в положениях 18-21 или имеющие метиоглицин-серин-пролиновую последовательность в нин-глицин-серин-серин-гистидин-гистидинположениях 18-21. гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-серин8. Иммуногенный фрагмент полипептида ОВ, высерин-глицин-лейцин-валин-пролин-аргининбранный из группы, включающей: Val-Pro-Ile-Glnглицин-серин-пролиновую последовательность Lys-Val-Gln-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ (SEQ ID NO:99) в положениях 2-21 или имеющие ID N0:18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Metглицин-серин-пролиновую последовательность в Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Serположениях 18-21. Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro14. Человеческий аналог полипептида ОВ по люGlu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO :20) и бому из пп. 9 или 10, выбранный из группы, вклюSer-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Glnчающей полипептиды: Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO: 21). (а) имеющие делецию остатков в положениях 1-21 9 . Человеческий аналог полипептида OB, вклюдля получения зрелого полипептида и чающий аминокислотную последовательность (б) полипептиды в соответствии с (а), имеющие SEQ ID NO: 4або SEQ ID NO: 6, в которой, по метионин в положении 21 или имеющие глицинкрайней мере, одна аминокислота, выбранная из серин-гистидин-метиониновую последовательгруппы, включающей аминокислоты 53, 56, 71,85, ность SEQ ID NО: 38 в положениях 18-21 или 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, имеющие метионин-глицин-серин-серин-гистидин129, 132, 139, 157, 159, 163 И 166 (в соответствии гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидинс нумерацией последовательности SEQ ID NO:4), серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролинзаменена на другую аминокислоту. аргинин-глицин-серин-гистидин-метиониновую 10. Человеческий аналог полипептида OВ по п. 9, последовательность (SEQ ID NO:98) в положев котором замена осуществлена на дивергентную ниях 1-21. аминокислоту мышиного полипептида OВ с 15. Человеческий аналог полипептида по любому последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID из пп. 9 или 10, выбранный из группы, включаюNO: 5. щей полипептиды: 11. Человеческий аналог полипептида OB по п. 9, (а) имеющие делецию остатков в положениях 1-21 в котором замена осуществлена на аланин. для получения зрелого полипептида и 12. Человеческий аналог полипептида OВ по п. 9, (б) полипептиды в соответствии с п. (а), имеющие выбранный из группы, содержащей полипептиды, лейцин-глутаминовая кислота-лизин-аргининв которых: глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая ки(а) остаток серина в положении 53 заменен глицислота-аланиновую последовательность (SEQ ID ном, аланином, валином, цистеином, метионином NO: 26) в положениях 14-21 или имеющие глутаили треонином, миновая кислота-аланин-глутаминовая кислота(б) остаток серина в положении 98 заменен глициаланиновую последовательность (SEQ ID NO: 27) ном, аланином, валином, цистеином, метионином в положениях 18-21, или имеющие лейцинили треонином и глутаминовая кислота-лизин-аргининовую после(в) остаток аргинина в положении 92 заменен асдовательность (SEQ ID NO: 28) в положениях 18парагином, лизином, гистидином, глутамином, 21, или имеющие метионин-глицин-серин-серинглутаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой, гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидинсерином, треонином, метионином или цистеином. гистидин-серин-серин-глицин-лейцин-валинпролин-аргинин-глицин-серин-пролиновую последовательность (SEQ ID NO:99) в положениях 2-21, 5 70911 6 или имеющие глицин-серин-пролиновую последо(в) остатки 1-21 и 54-167 делетированы, вательность в положениях 18-21. (г) остатки 1-60 и 117-167 делетированы, 16. Аналог человеческого полипептида ожирения (д) остатки 1-60 делетированы, (ОВ), включающий аминокислотную последова(е) остатки 1-53 делетированы, тельность SEQ ID NO: 4 или 6, выбранный из груп(ж) аналог в соответствии с (а), в котором остатки пы, включающей полипептиды, в которых: 1-21 делетированы, и (а) по крайней мере, один остаток аспарагиновой (з) аналог в соответствии с (а)-(ж), имеющий Nкислоты заменен глутаминовой кислотой, концевую кислоту или аминокислотную последо(б) по крайней мере, один остаток изолейцина вательность, выбранную из группы, включающей: заменен лейцином, (1) метионин, (в) по крайней мере, один остаток глицина или (2) глицин-серин-гистидин-метиониновую послевалина заменен аланином, довательность (SEQ ID N0: 38), (г) по крайней мере, один остаток аргинина заме(3) метионин-глицин-серин-серин-гистидиннен гистидином, гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидин(д) по крайней мере, один остаток тирозина или серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролинфенилаланина заменены триптофаном, аргинин-глицин-серин-гистидин-метиониновую (е) по крайней мере, один остаток в положениях последовательность (SEQ ID NO: 98), 121-128 ( в соответствии с нумерацией последо(4) лейцин-глутаминовая кислота -лизин-аргининвательности SEQ ID NO:4) заменен глицином или глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая киаланином и слота-аланиновую последовательность (SEQ ID (ж) по крайней мере, один остаток в положениях NO: 26), 54-60 или 118-166 (в соответствии с нумерацией (5) глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая последовательности SEQ ID NO: 4) заменен лизикислота-аланиновую последовательность (SEQ ID ном, глутаминовой кислотой, цистеином или проNO: 27), лином. (6) лейцин-глутаминовая кислота-лизин17. Аналог человеческого полипептида ожирения аргининовую последовательность (SEQ ID NO: (ОВ) по п. 16, выбранный из группы, включающей 28), полипептиды: (7) метионин-глицин-серин-серин-гистидин(а) имеющие делецию остатков в положениях 1-21 гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидиндля получения зрелого полипептида и гистидин-серин-серин-лейцин-валин-пролин(б) полипептиды в соответствии с п. (а), имеющие аргинин-глицин-серин-пролиновую последоваметионин в положении 21 или имеющие глицинтельность (SEQ ID NO: 99) и серин-гистидин-метиониновую последователь(8) глицин-серин-пролиновую последовательность SEQ ID NO: 38 в положениях 18-21, или ность. имеющие метионин-глицин-серин-серин-гистидин19. Изолированная молекула нуклеиновой кислогистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гистидинты, кодирующая полипептид ОВ по любому из пп. серин-серин-глицин-лейцин-валин-пролин1-4 или 6-18. аргинин-глицин-серин-гистидин-метиониновую 20. Изолированная молекула нуклеиновой кислопоследовательность (SEQ ID NO:98) в положениях ты, кодирующая полипептид ОВ по п. 5 или 8. 1-21, или имеющие лейцин-глутаминовая кислота21. Молекула ДНК, предназначенная для осущелизин-аргинин-глутаминовая кислота-аланинствления экспрессии полипептида OВ, обладаюглутаминовая кислота-аланиновую последоващего биологической активностью, модулирующей тельность (SEQ ID NO: 26) в положениях 14-21, вес тела животных, выбранная из группы, вклюили имеющие глутаминовая кислота-аланинчающей: глутаминовая кислота-аланиновую последова(а) ДНК-молекулу, представленную последовательность (SEQ ID NO: 27) в положениях 18-21, тельностью SEQ ID NOS: 3, или имеющие лейцин-глутаминовая кислота(б) ДНК-молекулы, гибридизируемые с ДНКлизин-аргининовую последовательность (SEQ ID молекулой, определенной согласно (а), и NO: 28) в положениях 18-21, или имеющие метио(в) ДНК-молекулы, направляющие экспрессию нин-глицин-серин-серин-гистидин-гистидинаминокислотной последовательности, кодируемые гистидин-гистидин-гистидин-гистидин-серинкакой-либо из упомянутых ДНК-молекул. серин-глицин-лейцин-валин-пролин-аргинин22. Молекула нуклеиновой кислоты с выявляемой глицин-серин-пролиновую последовательность меткой, способная к гибридизации с молекулой (SEQ ID NO:99) в положениях 2-21, или имеющие нуклеиновой кислоты по п.19. глицин-серин-пролиновую последовательность в 23. Молекула нуклеиновой кислоты с выявляемой положениях 18-21. меткой, способная к гибридизации с молекулой 18. Рекомбинантный полипептид, представляюнуклеиновой кислоты по п.20. щий собой человеческий усеченный аналог поли24. Молекула нуклеиновой кислоты с выявляемой пептида OВ, включающий аминокислотную послеметкой, способная к гибридизации с молекулой довательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, нуклеиновой кислоты по п.21. выбранный из группы, включающей полипептиды 25. Моноклональное антитело, специфическое по (в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 4 ), в отношению к полипептиду ОВ по любому из пп.1, которых: 2, 6, 9-12, 16 или 18, или его связывающий анти(а) по крайней мере, один остаток в положениях ген фрагмент. 121-128 делетирован, 26. Антитело или его связывающий антиген фрагб) остатки 1-116 делетированы, мент по п. 25, меченое выявляемой меткой. 7 70911 8 27. Моноклональное антитело, специфическое по (в) молекулу ДНК, кодирующую полипептид ОВ по отношению к полипептиду ОВ по п.5 или 8, или его п.21 и связывающий антиген фрагмент. (г) молекулу ДНК, кодирующую полипептид ОВ по 28. Антитело или его связывающий антиген фрагп.21, функционально связанную с последовательмент по п.27, меченое выявляемой меткой. ностью, контролирующей экспрессию. 29. Вектор, содержащий молекулу ДНК, выбран30. Фармацевтическая композиция для снижения ную из гр уппы, включающей: веса тела млекопитающего, содержащая активное (а) молекулу н уклеиновой кислоты, кодирующую вещество и фармацевтически приемлемый носиполипептид ОВ по п.19, тель, отличающаяся тем, что в качестве активно(б) молекулу н уклеиновой кислоты, кодирующую го вещества содержит полипептид ОВ по любому полипептид ОВ по п.19, функционально связанную из пп.1, 2, 6, 9-12, 16 или 18 в эффективном колис последовательностью, контролирующей эксчестве. прессию, Настоящее изобретение в целом относится к контролированию веса млекопитающих, включая животных и человека, и более конкретно, к реагентам, которые идентифицированы здесь как модуляторы веса, а также к диагностическому и терапевтическому применению модуляторов. Предпосылки создания изобретения уровень техники Ожирение рассматривается как избыток жировых отложений по отношению к мышечной массе тела и связано со многими важными физиологическими и медицинскими нарушениями, в том числе гипертензией, повышенным содержанием липидов в крови, диабетом типа II или инсулиннезависимым сахарным диабетом (NIDDM). В США NIDDM страдают 6-10млн. человек, включая 18% населения в возрасте около 65 лет (Harris et al., Int. J. Obes., 11:275-283 (1987)). Примерно 45% мужчин и 70% женщин, больных NIDDM, страдают от ожирения, и тяжесть их заболевания существенно снижается или элиминируется при уменьшении веса (Harris, Diabetes Care, 14 (3): 639-648 (1991)). Как описано ниже, и NIDDM, и ожирение строго наследуются, несмотря на то, что гены предрасположенности к данным заболеваниям ещё не идентифицированы. Молекулярногенетические процессы, лежащие в основе указанных метаболических нарушений, составляют важную, плохо изученную проблему. Ассимиляция, запасание и использование энергии питательных ве ществ образуют сложную гомеостатическую систему, обеспечивающую выживание многоклеточных организмов. Среди наземных млекопитающих запасание в жировой ткани больших количеств метаболического «топлива» в форме триглицеридов является критическим фактором выживания в условиях нехватки пищи. Необходимость поддержания определённого уровня запасов энергии без постоянных изменений размеров и формы тела требует достижения заданного равновесия между потреблением и расходом энергии. Однако, молекулярные механизмы, регулирующие энергетический баланс, остаются неизученными. Получение молекул, которые передают информацию о питательных компонентах и контролируют энергетический баланс, является ключевым моментом понимания механизмов регулирования веса тела, столь важных для развития заболеваний и поддержания здоровья. Степень ожирения индивидуума в значительной степени генетически детерменирована. Изучение соответствия веса тела и ожирения у монозиготных и дизиготных, близнецов и их биологических родителей позволяет предположить, что степень наследования ожирения (0.40.8) превышает соответствующие величины для други х нарушений, в развитие которых (как считается общепринятым) вовлечён значимый генетический компонент, например шизофрении, алкоголизма и атеросклероза (StunKard et al, N. Engl J. Med., 322: 1483-1487 (1990)). Сообщалось также о семейном сходстве в уровнях расходования энергии (Bogardus et al., Diabetes, 35: 1-5 (1986)). Генетический анализ в географически ограниченных популяциях позволяет высказать предположение, что относительно небольшое количество генов может обусловливать 35-50% вариации состава тела (Moll et al., Am. J. Hum. Genet, 49: 1243-1255 (1991)). Однако, ни один из генов, ответственных за ожирение в популяции в целом, не картирован в каком-либо хромосомальном локусе. Модели ожирения на грызунах включают семь явных мутаций в отдельных генах. Наиболее изученными у мышей мутациями, связанными с ожирением, являются мутации в оb (ожирение)- и db (диабет)-генах. При функционріровании на одном генетическом фоне гены ob и db приводят к возникновению метаболически и поведенчески неразличимых фенотипов, позволяя предположить, что указанные гены могут функционировать сходным физиологическим путём (Coleman et al., Diabetologia, 14: 141-148, 1978). Мыши, гомозиготные по двум мутациям, отличаются гиперфагичностью и гипометаболизмом, что приводит к фенотипу ожирения, выявляемому в возрасте одного месяца. Вес этих животных стабилизируется на уровне 60-70г (в сравнении с 30-35г у контрольных животных). Ob и db животные обнаруживают огромное число других гормональных и метаболических нарушений, которые определенным образом мешают выявить первичный дефект, обусловленный мутацией (Bray et al, Am. J. Gin. Nutr., 50: 891-902 (1989)). Каждая из моделей ожирения на грызунах характеризуется изменениями углеводного 9 70911 10 метаболизма, напоминающими диабет типа II у Краткое описание изобретения человека. В некоторых случаях тяжесть диабета В соответствии с настоящим изобретением частично зависит от фона, свойственного данной проблема контроля ожирения и содержания жира линии мышей (Leiter, Endocrinology, 124: 912-922 у животных, особенно у млекопитающих, решает(1989)). Как у ob, так и у db конгенных мышей ся посредством получения полипептидов ожиреC57BL/Ks развивается тяжёлый диабет с некрозом ния (ОВ) и молекул нуклеиновых кислот, кодиb-клеток и атрофией островков, что приводит к рующих указанные полипептиды. Настоящее относительной инсулинопении. В противоположизобретение относится в первую очередь к выденость этому ob и db конгенные мыши C57BL/6J ленным полипептидам, полезным для модуляции, характеризуются транзиторном инсулинт. е. контроля и регулирования веса тела и ожиреустойчивым диабетом, который полностью комния, а также к нуклеиновым кислотам, кодируюпенсируется гипертрофией b-клеток, свойственной щим указанные полипептиды, которые не только диабету типа II человека. обеспечивают возможность получения рекомбиФенотип ob и db мышей при сопоставлении с нантных полипептидов ОВ, но и сами по себе моожирением у человека проявляется иным обрагут использоваться для модуляции веса тела. зом, чем развитие диабета. Мутантные мыши едят Полипептиды ожирения (ОВ), согласно набольше и тратят меньше энергии, чем контрольстоящему изобретению имеющие примерно от 145 ные животные (так же, как и люди, страдающие до около 167 аминокислот, способны к модуляции ожирением). Такой фенотип практически совпадавеса тела животных, в особенности млекопитаюет с фенотипом животных с нарушениями вентрощи х, и включают аллельные варианты или аналомедиального гипоталамуса. Это позволяет предги, в том числе фрагменты, обладающие сходной положить, что обе мутации способны биологической активностью. Полипептиды могут взаимодействовать со способностью надлежащим быть получены рекомбинантным путём или в реобразом объединять или отвечать на информазультате химического синтеза. Предпочтительные цию о питательных компонентах в пределах ценполипептиды ОВ включают соединения, имеющие тральной нервной системы. В поддержку этой гиаминокислотные последовательности SEQ ID потезы свидетельствуют результаты NOS: 2, 4, 5 или 6 или их аллельные варианты или экспериментов по парабиозу (Coleman, аналоги, в том числе фрагменты. Diabetologia, 9: 294-298 (1973)), из которых следуИмуногенные фрагменты полипептидов О В ет, что ob мыши дефектны по циркулирующему в согласно данному изобретению включают: Va1крови фактору насыщения, a db мыши устойчивы к Pro-I1e-G1n-Lys-Va1-G1n-Asp-Asp-Thr-LHS-Thrвоздействиям ob фактора (возможно за счёт деLeu-I1e-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-I1eфекта ob-рецептора). Указанные эксперименты Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-G1n-Thr-Leu-A1a позволяют заключить, что ожирение у мутантных (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-G1nмышей может являться результатом различных Thr-Ser-G1y-Leu-G1n-Lys-Pro-G1u-Ser-Leu-Asp дефектов в афферентной петле и/или интегриро(SEQ ID NO: 20); и Ser-Arg-Leu-G1n-G1y-Ser-Leuванном центре механизма обратной связи, конG1n-Asp-ne-Leu-G1n-G1n-Leu-Asp-Va1-Ser-Proтролирующем состав тела. G1u-Cys (SEQ ID NO: 21). Аналоги полипегггида При использовании молекулярных и классичеОВ человека имеют аминокислотные последоваских генетических маркеров, ob и db гены картительности SEQ ID NOS: 4 и 6 при том, что одна рованы на проксимальной хромосоме 6 и средней или более аминокислот в положениях 53, 56, 71, хромосоме 4 соответственно (Bahary et al., Proc. 85, 89, 92, 95, 98, ПО, 118, 121, 122, 126, 127, 128, Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8642-8646 (1990); Fried129, 132, 157, 159, 163 и 166 (в соответствии с man et al, Genomics, 11: 1054-1062 (1991)). В обоих нумерацией последовательности SEQ ID NO: 4) случаях мутации картированы в участках мышинозамещены другими аминокислотами, такими как го генома, аналогичных таковым человека, позводивергентные аминокислоты полипептида ОВ ляя предположить, что если существуют человемыши в соответствии с SEQ ID NO: 2 или аланин. ческие аналоги ob и db, они с большей Указанные аналоги также включают следующие: вероятностью будут картированы на хромосомах (а) остаток серина в положении 53 замещён на человека 7q и 1р соответственно. Дефекты гена глицерин, аланин, валин, цистеин, метионин или db могут приводить к ожирению других видов млетреонин; (б) остаток серина в положении 98 замекопитающих: в генетических сращиваниях между щён на глицин, аланин, валин, цистеин, метионин крысами Zucker /a/fa и крысами Brown Norway +/+ или треонин; и (в) остаток аргинина в положении мутация fa (хромосома 5 крысы) фланкирована 92 замещён на аспарагин, лизин, гастидин, глутатем же самым локусом, который фланкирует dbмин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислотек мыши (Truett et al, Proc. Natl Acad. Set USA, 88: ту, серии, треонин, метионин или цистеин. Аналог 7806-7809 (1991)). полипептида ОВ в соответствии с изобретением Поскольку многочисленные факторы влияют предпочтительно на 83% и более гомологичен по на вес тела, практически невозможно предсказать, аминокислотной последовательности полипегггикакие факторы и, что более важно, какие гомеоду ОВ с аминокислотной последовательностью статические механизмы в первую очередь опреSEQ ID NO: 2, 4, 5 или 6. Дополнительные аналоги деляют вес тела. Таким образом, принципиальная полипегттида ОВ человека в соответствии с данпроблема, лежащая в основе настоящего изобреным изобретением имеют аминокислотные послетения, связана с получением модуляторов веса довательности SEQ ID NOS: 4 и 6 при том, что: (а) тела, которые обеспечивают контроль ожирения и один или более остатков аспарагиновой кислоты содержания жира у млекопитающих. замещены глутаминовой кислотой; (б) один или 11 70911 12 более остатков изолейцина замещены лейцином; NO: 6 и факультативно содержащие (пэгирован(в) один или более остатков глицина или валина ный) метионин в положении 21. замещены аланином; (г) один или более остатков Выделенные молекулы нуклеиновых кислот, аргинина замещены на гистидин; (д) один или бополученные согласно настоящему изобретению, лее остатков тирозина или фенилаланина замекодируют полипептид ОВ, аллелъный вариант или щены на триптофан; (е) один или более остатков в аналог, в том числе фрагменты, как описано выположениях 121-128 (в соответствии с н умерацией ше. Особо важные ДНК-молекулы для использопоследовательности SEQ ID NO: 4) замещены на вания с целью обеспечения безопасной экспресглицин или аланин и (ж) один или более остатков сии полипептида О В обладают биологической в положениях 54-60 или 118-166 (в соответствии с активностью, модулирующей вес тела млекопипоследовательностью SEQ ID NO: 4) замещены на тающи х, и выбраны из группы, включающей: (а) лизин, глутаминовую кислоту, цистеин или пролин. ДНК- молекулы с последовательностями SEQ ID Предпочтительные усечённые аналоги полипепNO: 1 и 3 или их фрагменты, (б) ДНК-молекулы, тидов ОВ человека, согласно настоящему изобреспособные гибридизоваться с ДНК-молекулами, тению, включают следующие соединения (в соотопределёнными в (а) или с их фрагментами и (в) ветствии с нумерацией последовательности SEQ ДНК-молекулы, определяющие экспрессию амиID NO: 4): (а) один или более остатков в положенокислотной последовательности, кодируемую ниях 121-128 делегированы; (б) остатки 1-116 делюбой из указанных выше ДНК-молекул. Примелетированы; (в) остатки 1-21 и 54-167 делегироварами таких молекул служат геномные ДНКны; (в) остатки 1-21 и 54-167 делетированы; (г) молекулы с последовательностями SEQ ID NOS: остатки 1-60 и 117-167 делетированы; (д) остатки 22 и 24. Предпочтительные ДНК-молекулы, со1-60 делетированы; (е) остатки 1-53 делетировагласно настоящему изобретению, кодируют полины и (ж) аналог в соответствии с (а) при том, что пептид, имеющий следующую аминокислотную остатки 1-21 делетированы. Полипептиды ОВ и последовательность: (a) SEQ ID NO: 2, (б) аминоаналоги полипептида ob, полученые согласно накислоты 22-167 последовательности SEQ ID NO: стоящему изобретению, утратившие 21 аминокис2, (в) SEQ ID NO: 4, (г) аминокислоты 22-167 полоту сигнальной последовательности (например, следовательности SEQ ID NO: 4, (д) SEQ ID NO: 5, аминокислоты 1-21 последовательности SEQ ID (е) аминокислоты 22-166 последовательности NO: 4), могут иметь N-концевую аминокислоту или SEQ ID NO: 5, (ж) SEQ ID NO: 6 и (з) аминокислоаминокислотную последовательность, такую как ты 22-166 последовательности SEQ ID NO: 6. (1) метионин, (2) глицин-серин-гистидинКроме того, указанные ДНК-молекулы кодируют метиониновую последовательность (SEQ ID NO: полипептиды, имеющие N-концевую аминокислоту 38), (3) метионин-глицин-серин-серин-гистидинили аминокислотную последовательность, привегистидин-гистидин-гистидин-гистидин-гиcтидиндённую ранее. Например, предпочтительная ДНКсерин-серин-глицин-лейцин-валин-пролинмолекула имеет последовательность, представаргинин-глицин-серин-гистидин-метиониновую ленную как белок-кодирующая последовательпоследовательность (SEQ ID NO: 98), (4) лейцинность SEQ ID NO: 3, и , в особенности, последоваглутаминовая кислота-лизин-аргининтельность, кодирующая аминокислоты 22-167. глутаминовая кислота-аланин-глутаминовая киКроме того, изобретение относится к нуклеислота-аланиновую последовательность (SEQ ID новым кислотам с выявляемой меткой, которые NO: 26), (5) глутаминовая кислота-аланингибридизуются с заявленными нуклеиновыми киглутаминовая кислота-аланиновую последоваслотами. Такие нуклеиновые кислоты, в частнотельность (SEQ ID NO: 27), (6) лейцинсти, гибридизуются с некодирующим участком глутаминовая кислота-лизин-аргининовую посленуклеиновой кислоты ОВ, выбранным из группы, довательность (SEQ ID NO: 28), (7) мeтиoнинвключающей интрон, 5'-некодирующий участок и глицин-cepин-ceрин-гиcтидин-гиcтидин-гиcтидин3'-некодирующий участок. гистидин-гистидин-гистидин-серин-серин-глицинНастоящее изобретение также относится к лейцин-валин-пролин-аргинин-глицин-серинолигонуклеотидным праймерам для амплификапролиновую последовательность (SEQ ID NO: 99) ции геномной ДНК человека, кодирующей полии (8) глицин-серин-пролиновую последовательпептид ob, например, олигонуклеотидам 29-32 ность. последовательности SEQ ID NOS: 29. Производные полипептида ОВ в соответствии Заявленные согласно настоящему изобретес изобретением имеют одну или более прикрепнию векторы содержат ДНК-молекулу, полученную лённых химических групп, включая водорастворив соответствии с изобретением, как описано вымые полимеры, такие как полиэтиленгликоль. ше, и, предпочтительно, представляют собой векПроизводные, полученные с помощью полиэтиторы экспрессии, включающие ДНК-молекулу, ленгликоля, могут быть моно-, ди-, три- или тетрафункционально связанную с последовательнопэгированными, например, монопэгированы на Nстью, контролирующей экспрессию. Одноклеточконцевом участке. ные клетки-хозяева в соответствии с изобретениПредпочтительные монопэгированные на Nем трансформированы или трансфицированы концевом участке производные полипептидов оb, ДНК-молекулами или векторами, описанными высогласно настоящему изобретению, включают ше. Предпочтительные клетки-хозяева включают полипептиды ОВ, содержащие аминокислотные бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих, клетки остатки 22-167 последовательности SEQ ID N0: 4 растений, клетки насекомых и клетки человека в или остатки 22-166 последовательности SEQ ID культуре тканей. Например, такие клетки-хозяева 13 70911 14 выбирают из группы, включающей Е. Coli, вии со способом, описанным выше, и (б) оценку Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, дрожжи, количества образовавшихся реакционных комСНО-, Rl.l-, B-W-, L-M-, COS I-, COS 7-, BSC1-, плексов, которое соответствует уровню полипепBSC40-, BMT10- и БЭ-клегки. Предпочтительными тида ОВ в биологическом образце. Когда выявлядрожжевыми хозяевами являются Saccharomyces, ют или диагностируют заболевание, Pichia, Candida, Hansenula u Torulopsis. Объектом ассоциированное с повышенным или пониженным изобретения являются также клетки млекопитаюуровнем полипептида ОВ в соответствии с изощи х, содержащие ДНК-последовательность, кодибретением, оценку уровня проводят, как описано рующую полипептид ob, и модифицированные in выше, и выявленное значение сравнивают со знаvitro для облегчения повышенной экспрессии почением уровня полипептида ОВ у здоровых индилипептида ob путём гомологичной рекомбинации, видуумов или же у данного индивидуума в более при которой происходит встраивание регуляторраннее время. Увеличение уровня полипептида ной последовательности экспрессии в функциоОВ по сравнению с нормальным или предшестнальной близости от последовательности, кодивующим уровнем свидетельствует о наличии зарующей полипептид ob. Регуляторная болевания, ассоциированного с повышенным последовательность экспрессии может быть соотуровнем полипептида ОВ, а снижение уровня поветствующей последовательности для полипеплипептида ОВ по сравнению с нормальным свидетида ob или нет и способна замещать мутантную тельствует о наличии заболевания, ассоциирорегуляторную последовательность полипептида ванного с пониженным уровнем полипептида ОВ. ob в клетке. Соответственно, в объём изобретения включены Настоящее изобретение относится также к способы мониторинга in vitro терапевтического способам получения полипептида ob, включаюлечения заболевания млекопитающего, ассоциищим: (а) культивирование клетки, описанной вырованного с повышенным или пониженным уровше, в условиях, обеспечивающих экспрессию понем полипептида ОВ, предусматривающие оценку липептида ob, и (б) выделение уровня полипептида ОВ (как описано выше) в сеэкспрессированного полипептида. Указанная прории биологических образцов, полученных в разцедура может сопровождаться следующими сталичные временные точки от млекопитающего, диями: (в) хроматографией полипептида на Niподвергающегося указанному терапевтическому хелатирующей колонке и (г) очисткой полипептида лечению. путём гель-фильтрации. В предпочтительном ваПолученные согласно настоящему изобретерианте осуществления изобретения после стадии нию фармацевтические композиции содержат по(в) и перед стадией (г) осуществляют хроматолипептид ОВ, описанный выше, и фармацевтичеграфию полипептида ob на сильной катионообски приемлемый носитель, и используются при менной колонке. осуществлении терапевтических способов для Настоящее изобретение относится также к снижения веса тела животного. Дополнительные меченным и немеченным моноклональным и пофармацевтические композиции, полученные соликлональным антителам, специфическим к заявгласно настоящему изобретению для использоваленным полипептидам ob, и бессмертным клеточния при осуществлении терапевтических способов ным линиям, продуцирующим моноклонные с целью увеличения веса тела животного, содерантитела в соответствии с изобретением. Получежат антагонист полипептида ОВ, предпочтительно ние антител, согласно настоящему изобретению, выбранный из группы, включающей: антитело, включает следующие стадии: (а) конъюгацию покоторое связывается с полипептидом О В и нейлипептида ob с белком-носителем, (б) иммунизатрализует его активность, фрагмент полипептида цию животного-хозяина конъюгатом «фрагмент ob, который связывается с рецептором полипепполипегггида оо/белок-носитель», полученным на тида ОВ, но не активирует его, и небольшую мостадии (а) и смешанным с адъювантом, и (в) вылекулу-антагонист полипептида ОВ. Кроме того, деление антитела из иммунизированного животизобретение относится к соответствующим косменого-хозяина. тическим композициям, улучшающим внешний вид Изобретение относится к способам определетела, для снижения или увеличения веса тела ния присутствия полипептида ОВ в образце, индивидуума, которые используются при осущевключающим: (а) контактирование образца, предствлении косметических процедур, улучшающих почтительно содержащего полипептид ОВ, с антивнешний вид тела индивидуума. Такие косметичетелом (предпочтительно связанным с твёрдой ские композиции используются в количественной подложкой), которое специфически связывается с дозе, достаточной для моделирования веса тела полипептидом О В в усло виях, обеспечивающих индивидуума до заданного уровня. образование реакционных комплексов, содержаИзобретение также относится к применению щи х антитело и полипептид ОВ, и (б) выявление молекул нуклеиновых кислот, полученных согласобразования реакционных комплексов, содержано настоящему изобретению, а также молекул щи х антитело и полипептид ob, в образце при том, антисмысловых нуклеиновых кислот, способных что выявление образования реакционных комгибридизоваться с нуклеиновой кислотой, кодиплексов свидетельствует о присутствии полирующей заявленный полипептид ОВ, для припептида ОВ в образце. Соответственно, изобретеготовления медикамента, модифицирующего ние относится к способам оценки in vitro уровня вес тела животного (например, для генной тераполипептида ОВ в биологическом образце, вклюпии). Кроме того, изобретение относится к примечающим: (а) выявление образования реакционных нению полипептида ОВ или соответствующего комплексов в биологическом образце в соответстантагониста для получения медикамента, моди 15 70911 16 фицирующего вес тела животного. Полученные ные ДНК-молекулы или клонированные гены могут таким образом медикаменты могут использоватьиметь нуклеотидные последовательности или мося для модификации веса тела млекопитающего в гут быть комплементарны ДНК-кодирующими попроцессе лечения заболевания, выбранного из следовательностям, приведенным на Фигуре 1А-Е группы, включающей диабет, высокое кровяное (SEQ ID NO: 1) и Фигуре 2А и В (SEQ ID NO: 3). В давление и повышенный уровень холестерина. частности, такие ДНК-молекулы могут быть молеТакая модификация является частью комбинирокулами кДНК или геномными ДНК, выделенными ванной терапии данного заболевания с помощью из хромосом. Нуклеиновые кислоты, полученные в соответствующи х лекарственных препаратов. Укасоответствии с изобретением, могут также соотзанные выше медикаменты могут быть примениветствова ть 5'- и 3'-фланкирующим последовамы в терапевтических способах внутривенным, тельностям ДНК и интронным ДНКвнутриартериальным, интраперитонеальным, последовательностям. В связи с этим настоящее внутримышечным, подкожным, назальным, оральизобретение относится также к идентификации ным или пульмональным путём. нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную Приведённые в настоящем описании сведепоследовательность, выбранную из группы, вклюния показывают, что полипептиды ОВ, полученчающей последовательности на Фигуре 1А-Е ные согласно данному изобретению, именно в (SEQ ID NO: 1) и Фигуре 2 А и В (SEQ ID NO: 3), а такой форме первоначально секретируются из также их варианты, полученные с учётом вырожадипоцитов млекопитающих и функционируют по денности генетического кода, аллельные вариантипу гормонов. ты и подобные им родственные молекулы. Приведённые примеры показывают, что полиВ соответствии с настоящим изобретением пептид ОВ, альтернативно обозначенный «лептимолекулы нуклеиновой кислоты могут быть ДНК и ном» циркулирует в плазме крови мыши, крысы и РНК, в том числе их синтетические варианты, человека. Лептин отсутствуе т в плазме крови мыимеющие фосфат или аналог фосфата, например, шей оb/оb и обнаруживается в десятикратных тиофосфатные связи. При этом указанные молеконцентрациях в плазме крови db/db-мышш и в кулы могут быть как одноцепочечные, так и двухдвадцатикратных концентрациях в плазме крови цепочечные. крыс fa/fa. Более того, ежедневные инъекции реИзобретение также относится к молекулам комбинантного лептина существенно уменьшают нуклеиновой кислоты, используемым в качестве массу тела оb/оb-мышъ% в значительной степени молекулярных проб или праймеров для амплифивлияют на вес тела мышей дикого типа и не окакации с помощью полимеразной цепной реакции зывают эффекта на мышей db/db. (PCR), т. е. к природным или синтетическим олиКроме того, полипептид ob одного вида жигонуклеотидам, имеющим последовательность, вотного биологически активен в организме животсоответствующую участку последовательностей, ного другого вида. В особенности, полипептид ОВ приведённых на Фигуре, 1А -Е (SEQ ID NO: 1), активен в организме мышей. Фигуре 2А и В (SEQ ID NO: 3) и Фигуре 20А -С В первую очередь, модуляторы, заявленные (SEQ ID NO: 22), или 5'- и 3'-фланкирующим посогласно настоящему изобретению, включают следовательностям кодирующи х последовательмолекулы нуклеиновых кислот, в том числе моленостей или интронным последовательностям гекулы рекомбинантных ДНК (например, кДНК, или номной ДНК. В частности, изобретение относится вектора, содержащего кДНК, или выделенной гек молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей по номной ДНК) или клонированные гены (т. е. выдекрайней мере около 10 нуклеотидов, при том, что ленные геномные ДНК) или их варианты, полученпоследовательность молекулы нуклеиновой киные на основе вырожденности генетического кода, слоты соответствует н уклеотидной последовакоторые кодируют полипептиды, являющиеся мотельности из того же количества нуклеотидов в дуляторами контроля веса тела, как описано ниже, нуклеотидных последовательностях, представили консервативные варианты или фрагменты ленных на Фигуре 1А-Е (SEQ ID NO: 1), Фигуре 2А таких полипептидов, в особенности фрагменты и В (SEQ ID NO: 3) и Фигуре 20А-С (SEQ ID NO: полипептидов, утративши х сигнальный пептид 22) или последовательности, комплементарной (альтернативно называемых здесь зрелыми полиуказанным. Более предпочтительно, последовапептидами ОВ). Указанные полипептиды имеют тельность молекулы нуклеиновой кислоты имеет аминокислотные последовательности, приведенпо крайней мере J5 нуклеотидов. Наиболее предные на Фигуре 1А-Е (SEQ ID NO: 2), Фигуре 3 (SEQ почтительно, последовательность нуклеиновой ID NO: 4), Фигуре 5 (SEQ ID NO: 5) и Фигуре 6 кислоты имеет по крайней мере 20 нуклеотидов. В (SEQ ID NO: 6). В особом варианте осуществлеодном варианте осуществления изобретения, кония изобретения получают аминокислотные погда олигонуклеотид используется в качестве проследовательности для оb-полипептидов человека бы, он содержит выявляемую метку, например и мыши. Оба полипептида обнаруживаются в радаонуклидную (такую, как 32Р) или ферментную. форме, утратившей глутамин в положении 49, что Далее изобретение относится к клонирующеможет являться следствием аномального сплайму вектору, содержащему заявленные нуклеиносинга мРНК. Полипептиды ОВ различных видов вые кислоты, кодирующие полипептид ob, а также животных могут обладать высокой степенью гомок вектору экспрессии, активному в клетках бактелогии. Как показано на Фигуре 4, полипептиды ОВ рий, насекомых или млекопитающих, содержащечеловека и мыши обладают более чем 80%-ной му заявленные нуклеиновые кислоты, а также к гомологией. вектору экспрессии, активному в клетках бактерий, Молекулы нуклеиновых кислот, рекомбинантнасекомых или млекопитающих, содержащему 17 70911 18 заявленные нуклеиновые кислоты, кодирующие NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6), их консерваполипептид ob, функционально связанные с потивные варианты, активные фрагменты и родстследовательностью, контролирующей экспрессию. венные небольшие молекулы могут быть получеСоответственно, изобретение относится к клеткены для непосредственного применения с хозяину, например, бактериальной, дрожжевой, терапевтическими целями для редукции или конклетке насекомых или млекопитающих, трансфитроля избытка жира или веса тела. Антитела и цированной или трансформированной подходядругие антагонисты указанных белков, например, щим вектором экспрессии, а также к применению их фрагментов, могут быть получены и сходным указанных выше конструктов для получения модуобразом применены для достижения обратного ляторов согласно изобретению. эффекта. В связи с этим изобретение относится к Изобретение также относится к антителам, кофармацевтическим композициям, содержащим торые связываются с полипептидом ob. Такие анзаявленный полипептид ОВ или, альтернативно, титела могут быть получены к полипептиду полего антагонист в смеси с фармацевтически приной длины или его антигенным фрагментам. В емлемым носителем или наполнителем. одном случае такие антитела ингибируют функКроме того, полученный согласно изобретециональную активность полипептида ob. В другом нию полипептид ОВ может быть использован для случае антитела могут использоваться для опреобеспечения косхметических эффектов, наприделения уровня циркулирующего полипептида ob мер, улучшения внесшего вида тела за счёт рев плазме крови или сыворотке. Кроме того, антидукции жировых отложений. Полипептид ОВ мотела, специфичные по отношению к какому-либо жет использоваться независимо или в участк у полипептида ОВ. в частности, моноклокомплексе с другими косметическими методиками, нальные антитела, могут использоваться в каченапример хирургическими, для достижения жестве «стр уктурных» проб данного полипептида. лаемых результатов. Все описанные выше соединения могут расДиагностические применения указанных нуксматриваться как модуляторы веса тела и содерлеотидов и соответствующи х пептидов также поджания жира и, таким образом, могут использоразумевают использование нуклеиновых кислот ваться различным образом, как указано выше. В для идентификации возможных мутаций или алчастности, изобретение может найти диагностичелельных вариантов указанных соединений с цеские и терапевтические применения, а также ислью расширения набора активных нуклеотидных пользоваться в сельском хозяйстве. В основе тамолекул, полезных в диагностике и терапии. В ких применений лежит использование описанных частности, гомозиготные и гетерозиготные мутавыше модуляторов, в том числе молекул нуклеиции нуклеотидов могут быть идентифицированы в новых кислот и пептидов. Более того, модуляция количественном отношении и более точно свидевеса тела подразумевает применение специфичетельствовать о каком-либо нарушении, выявляя ских терапевтических подходов таким образом, возможную степень риска индивидуумов, связанчто ожирение или наоборот, кахексия, отражаюную с ожирением. Более точно, гетерозиготные щие нежелательные в организме нарушения, момутации в настоящее время рассматриваются как гут быть скорригированы применением одного или ассоциированные со слабой или средней степеболее модуляторов, полученных согласно нанью ожирения, в то время как гомозиготные мутастоящему изобретению. ции ассоциированы с более выраженным и тяжёТаким образом, изобретение относится к сполым ожирением. Соответствующее ДНКсобу модулирования веса тела млекопитающих, тестирование может быть осуществлено при исвключающему контролирование экспрессии белка, пользовании вышеуказанных соединений в качекодируемого нуклеиновой кислотой, имеющей стве маркеров уровня для получения точного долнуклеотидную последовательность, выбранную из говременного прогноза определённых тенденций, группы, включающей последовательность, приветак чтобы оказались возможным предсказать издённую на Фигуре 1А-Е (SEQ ID NO: 1), Фигуре 2А менения в питании и други х индивидуальных прии В (SEQ ID NO: 3), а также их аллельные варианвычках индивидуума или характер непосредстты и варианты, полученные на основе вырожденвенного терапевтического вмешательства для ности генетического кода. Такой контроль может устранения заданных нарушений. оказаться эффективным путём введения заявленДиагностическое применение настоящего изоных нуклеотидов при генной терапии в жировые бретения включает способы определения присутклетки больного или какого-либо хозяина для конствия и уровня заявленных модуляторов в клеточтроля или редукции ожирения. В противоположных образцах или биологических экстрактах (или ность этому, получение и применение антагониобразцах), полученных от соответствующи х индистов данных нуклеотидов, например, видуумов, так что может быть установлено содерантисмысловых молекул, может оказаться полезжание в таких тестируемых образцах нуклеиновых ным для устранения нарушений, включающих изкислот (геномной ДНК или мРНК) и/или белка. быточную потерю веса, например, нервозной аноПринимая во внимание, что увеличенная активрексии, рака или СПИДа, в отношении которых ность нуклеиновой кислоты и наличие соответстпроводится лечение. Указанные антагонисты мовующего белка отражает способность организма гут быть введены сходным образом с нуклеотидаингибировать ожирение, врач, анализирующий ми непосредственно в жировые клетки для достиполученные результаты такого рода исследований жения заданных изменений. больного, страдающего ожирением, будет иметь Соответственно, белки, определённые с повозможность заключить, что причиной ожирения мощью Фигур 1А-Е, 3, 5 и 6 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID скорее является дисфункция, а не наличие или 19 70911 20 повышенная активность нуклеиновой кислоты, полученных согласно данному изобретению, у полученной согласно данному изобретению. В млекопитающих. противоположность этому, пониженные уровни Ещё одним объектом изобретения является нуклеиновой кислоты и/или экспрессируемого способ воздействия на млекопитающих для конбелка позволяют предположить, что такие уровни троля веса тела и содержания жира и/или способ могут быть повышены для лечения данного типа лечения некоторых патофизиологических состояожирения, и необходимо применить соответстний, для которых аномальный вес тела (повышенвующую терапевтическую систему. ный или пониженный) является характерным Кроме того, нуклеотиды, представленные на признаком. Фиг.1А-Е и 2А и В, относятся к кДНК, которая, как Объектом изобретения также являются геневкратце указано выше, используется для опредетические конструкции для использования в генноления соответствующей РНК. Сходным образом, терапевтических методиках и/или фармацевтичерекомбинантные белки, соответствующие полиские композиции для соответствующи х терапевтипептидам на Фиг.1А-Е и 3, получают и надлежаческих методик, которые содержат или основаны щим образом метят для использования, наприна одном или более модуляторе, связывающем мер, в радиоиммунологических анализах с целью агенте или реагенте, способном контролировать определения содержания полипептида ОВ в образование модуляторов или же имитировать плазме крови или же с целью определения соили противодействовать их активности. держания уровня ОВ-рецептора в тканях, скажем Другие объекты и преимущества настоящего в тканях гипоталамуса. Далее, изобретение отноизобретения для специалиста в данной области сится не только к идентификации нуклеотидов и исследований очевидным образом следуют из соответствующи х белков, но и к выявлению реприведённого описания, которое подкрепляется цепторов данных соединений. В данным контекссылками на соответствующие фигуры. сте, полипептиды, представленные на Фиг.1А-Е, 3, Краткое описание фигур 5 и/или 6, могут быть получены и использованы Фигура 1 (А-Е). Приведена нуклеотидная подля скрининга соответствующей экспрессионной следовательность (SEQ ID NO: 1) и выведенная библиотеки для выделения активных рецепторов. на её основе аминокислотная последовательность Затем рецепторы могут быть клонированы и сами (SEQ ID NO: 2), соответствующая кДНК ОВ мыши. по себе или в комплексе с лигандом использованы 39 оснований лидерной последовательности на 5'для отбора небольших молекул, способных проконцевом участке соединены с предсказанными являть сходную активность по отношению к 167 аминокислотами открытой рамки считывания модуляторам. и примерно 3,7 κδ-нетранслируемой последоваИзобретение также относится к фармацевтительностью на 3'-конпевом участке. (В предварическим композициям, содержащим некоторые из тельно поданной заявке серии № 08/347,563 от указанных модуляторов, предпочтительно поли30.11.94 и заявке серии № 08/438, 431 от 10.05.95 пептиды с последовательностями, представлендополнительные 58 оснований 5'-некодирующей ными SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и последовательности были определены как артеSEQ ID NO: 6, а также соответствующие антитела, факт клонирования. Данный артефакт не затрагинебольшие молекулы агонистов и антагонистов вал кодирующий район, 39 оснований 5'или активные фрагменты, находящиеся в форме, некодирующего участка, показанного здесь на пригодной для различных способов введения при ФИГУРЕ 1, и 3'-некодирующий участка гена). Понеобходимой терапии. Такие рецепторы могут казано в целом около 2500 оснований 3'включать фармацевтически приемлемые носитенетранслируемой последовательности. Анализ ли или другие адъюванты и быть использованы в предсказанной белковой последовательности при эффективной дозе, которая определяется спеиспользовании компьютерной программы SigSeq циалистом в каждом конкретном случае. выявляет присутствие сигнальной последоваВ соответствии с изложенным, наиболее важтельности (подчеркнута). Микрогетерогеннось ным объектом настоящего изобретения являются кДНК проявляется таким образом, что примерно модуляторы веса тела, полученные в очищенной 70% кДНК имеет глутаминовьгй кодон в положеформе, которые обладают определёнными харакнии 49 и 30% кДНК не имеет такого кодона (см. теристиками и свойствами, позволяющими конФиг.5 и 6, ниже). Эта аминокислота подчёркнута, тролировать и изменять степень ожирения и сопоскольку представляет собой аргининовый кодержания жира у млекопитающих. дон, подвергшийся мутации у оb/оb мышей Другие объекты настоящего изобретения отC57BL/GJ (1J мыши). носятся к способам определения и выявления Фигура 2. (А и В). Показана нуклеотидная помодуляторов контроля веса, как здесь указано, с следовательность (SEQ ID NO: 3) кДНК OB челоцелью эффективной диагностики и мониторинга века. Нуклеотиды пронумерованы с 1 до 701 патологических состояний, когда вариации в уровсо стартовым участком в нуклеотидном положене таких модуляторов являются или могут быть нии 46 и терминаторным нуклеотидом в полопрогнозом на будущее. жении 550. Объектом изобретения также являются споФигура 3. Показана полная предсказанная соб и соответствующая аналитическая система аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: для скрининга соединений, например, лекарст4) гена ОВ человека, соответствующая нуклеовенных препаратов, реагентов и т. д., которые тидной последовательности Фиг. 2А и В. Аминообладают потенциальной возможностью имитирокислоты пронумерованы с 1 до 167. Сайт отщепвать или ингибировать активность модуляторов, ления сигнальной последовательности 21 70911 22 расположен после аминокислоты 21 (Ala) так, что Фигура 8. Показана фотография, полученная зрелый белок представлен аминокислотами 22 при окрашивании бромистым этидием 192 незави(Va1)-167 (Cys). симых изолятов в эксперименте по «захвату» четФигура 4. Сравниваются предсказанные амивёртого экзона, который был амплифицирован с нокислотные последовательности мыши (SEQ ID помощью PCR и охарактеризован. NO: 2) и человека (SEQ 1D NO: 4). Предсказанная Фигура 9. Показана фотография, полученная аминокислотная последовательность ОВ человека при окрашивании бромистым этидием PCRобладает высокой гомологией с мышиной. Конамплифицированных клонов, предположительно сервативные участки обозначены пунктиром, а несущи х ob. Каждый из 7 клонов, в которых не неконсервативные - звёздочкой. Вариабельный обнаруживалось артефакта, повторно амплифииглутаминовый кодон подчёркнут, это положение ировали с помощью PCR и подвергали электрононсенс-мутации в последовательности мышей форезу в геле 1%-ной агарозы в ТВЕ и окрашивалинии C57BL/6J ob/оb (1J). На аминокислотном ли бромистым этидием. Маркеры размера (не уровне отмечается 83%-ная идентичность, необозначенная номером самая левая линия) являсмотря на то, что только 8 замещений обнаружено ется коммерчески доступными («шаг» составляет между валином в положении кодона 22 («немед1 kb). Линия 1-клон 1D12, содержащий «последоленное» положение downstream по отношению к вательность HIV». Линия 2-клон 1F1, клон за пресигнальной последовательности) и цистеином в делами ob-участка. Линия 3-клон 1Н3. Линия 4положении 117. клон 2В2, который идентичен 1F1. Линия 5-клон Фигура 5. Показана полноразмерная амино2G7, который содержит ob экзон. Линия 6-клон кислотная последовательность (SEQ ID NO: 5), 2G11, который идентичен 1F1. Линия 7-клон 2Н1, соответствующая гену ОВ мыши, показанному на который не содержит вставки. Фиг.3, но утратившая глутамин в положении 49. Фигура 10. Показана последовательность клоАминокислоты пронумерованы с 1 до 166. Сайт на 2G7 (SEQ ID NO: 7), которая содержит экзон, отщепления сигнальной последовательности раскодирующий участок гена ОВ. Последовательноположен после аминокислоты 21 (A1a) (и, следости праймеров, которые использовались для амвательно, до делетированного глутамина в полоплификации данного экзона, на фигуре обведены жении 49) так, что зрелый белок представлен в рамки (SEQ ID NO: 8 и 9). аминокислотами 22 (Va1)-166 (Cys). Фигура 11. (А). Обратно-транскрипционный Фигура 6. Показана полноразмерная предскаPCR-анализ мРНК различных тканей той же самой занная аминокислотная последовательность (SEQ мыши с праймерами 2G7 и актиновыми праймеID NO: 6), соответствующая гену ОВ человека, рами. PT-PCR-реакции проводили при использопоказанному на Фиг. 4, но утратившая глутамин в вании 100нг тотальной РНК, которую транскрибиположении 49. Аминокислоты пронумерованы с 1 ровали для образования первой цепи кДНК с до 166. Сайт отщепления сигнальной последовапомощью праймера oligo dT. PCR-амгшификацию тельности расположен после аминокислоты 21 проводили в течение 35 циклов. В каждом цикле (A1a) (и, следовательно, до делегированного глуосуществляли денатурацию при 94°С в течение тамина в положении 49) так, что зрелый белок 1сек; гибридизацию при 55°С в течение 1сек; удпредставлен аминокислотой 22 (Va1)-166 (Cys). линение цепи при 72°С в течение 2сек и самоудФигура 7. (А). Физическая карта расположения линение при 72°С в течение 1сек. RT-PCRob в хромосоме мыши и YAC- и Ρ1-клонирующие продукты разгоняли в 2%-ном геле низкоплавкой карты. «М» и «Ν» означают рестрикционные сайты агарозы в буфере 1хТВЕ. (В). Нозерн-блот мРНК для эндонуклеаз Мul І и Not I. Ци фры соответстиз различных органов мыши, полученный с помовуют индивидуальным животным, рекомбинантщью пробы 2G7, меченной в PCR. Десять мкг обным по области ob при подсчёте 1606 мейозов. щей РНК из каждой ткани подвергали электрофоMet, Рах-4, D6R ск 39, D6R ск 13 и Сра обозначают резу в агарозном геле с формальдегидом. Пробу положения области ob, которые связываются с гибридизовали при 65°С в системе Rapid Hybe ДНК-пробами. YACs изолировали с помощью D6R (Amersham). Авторадиографические сигналы явно ск 13 и Рах-4 в качестве проб и концы восстанаввыявлялись через 1 час экспонирования; показаливали при использовании PCR (vectorette PCR) ны результаты эксперимента через 24ч после экси/или пдазмиды «спасения» концов и в свою очепонирования. редь использовали для выделения новых YACs. Фигура 12. (А). Приведены результаты окра(В). Результирующий набор YAC. Одна из YACs, a шивания бромистым этидием РНК из жировых именно Y902A0925, является химерной. Каждая из клеток (белая жировая ткань) каждой из указанных проб, которая использовалась для генотипировалиний мышей, подвергнутой RT-PCR-реакции. ния рекомбинантных животных, заключена в скобОбщую РНК (100нг) для каждого образца подверки. (6) соответствует YAC 107; (5) соответствует гали обратной транскрипции с помощью олиго dT М16(+) (или М16(р LUS)); (4) соответствует adu(+); и обратной транскриптазы и полученные одноце(3) соответствуе т aad(p ICL); (2) соответствует почечные кДНК амплифицировали в PCR с прай53(р ICL); и (1) соответствует 53(+). (С). Р1-набор мерами 2G7 (нижние полосы) или актиновыми из бактериофаговых клонов Р1 изолировали с праймерами (верхние полосы). Как 2G7, так и акпомощью селективных проб на основе концов тивные праймеры включали в одну и ту же реакYAC. Ген ob изолировали из Ρ1-клона с помощью цию PCR. Продукты разгоняли в 1%-ном геле агадистальной конпевой пробы YAC YB6S2F12 (конрозы в ТВЕ. (В). Нозерн-анализ, соответствующий цевая проба (4)) (альтернативно здесь обознача(А). Десять мкг РНК жировых клеток (белая жироется как adu(+)). вая ткань) каждой линии животных обрабатывали 23 70911 24 меченной в PCR пробой 2G7, как на Фиг.11В (см. отдельно полученной из колонии SM/Ckc-+Dac выше). Обнаруживали явное примерно 20-кратное ob21/ob21. увеличение уровня 2G7 мРНК во фракции РНК из Фигура 16. Саузерн-блот расщеплённой ЕсоRI белой жировой ткани мышей C57BL/6J оb/оb (лигеномной ДНК перечисленных линий животных ния 1J) по сравнению с изученными животными. В при использовании кДНК ОВ в качестве пробы (т. RT-PCR и Нозерн-экспериментах не выявлялось е. zoo-блот). Гибридизационные сигналы выявлясигнала в 2G7 РНК из клеток мышей SM/CKcлись в каждом образце, полученном от позвоноч+Dacob21/ob21 (2J) даже после 2-недельной экспоного, даже после гибридизации в умеренно сильзиции. Показаны результаты 24-часовой экспозиных условиях. ДНК кошки в данном эксперименте ции. Тот же самый фильтр гибридизовали с актибыла слабо деградированной. Рестрикцированную новой пробой (нижний участок панели). ДНК разгоняли в геле 1%-ной агарозы в ТВЕ и Пример 13. Нозерн-анализ дополнительных 2J переносили на мембрану для взаимодействия с животных и контрольных животных, который свипробами. Фильтр гибридизуют при 65°С и дважды детельствует об отсутствии оb мРНК у 2Jотмывают 2xSSC/0.2% SDS при 65°С в течение животных. Нозерн-анализ показан на Фиг.11 и 12. двадцати минут и экспонируют 3 дня с плёнкой В этом случае контрольная РНК представляет (Kodak/Rochester, Ν. Υ.) Χ-ОМАТ. собой ар 2, специфический транскрипт жировых Фигура 17. Показан участок клонирующего клеток. Не обнаруживалось существенных разливектора экспрессии рЕТ-15b (Novagen) (SEQ ID чий в плотности ар 2-полос. NO: 11 и 12). Пример 14. Сравниваются ДНКФигура 18. Показаны результаты исследовапоследовательность C57BL/6J (норма) и C57BL/6J ния элюата с Ni-колонки (His-связываюшая смола) оb/оb (1J) мышей в области точечной мутации, для рекомбинантного зрелого ob мыши, слитого с приводящей к встраиванию стоп-кодона незрелой His-меткой (А) и зрелого ОВ человека, слитого с последовательности (нонсенс-мутация) в кДНК His-меткой (В). Бактерии трансформировали векторами рЕТМ9 и рЕТН14 соответственно. При инмутантной линии. Оb/оb мыши имеют С ® Тдукции 1мМ IPTG в оптимальных условиях трансмутацию, которая «заменяет» аргининовый остаформированные бактерии способны ток в положении 105. Показана данная замена, как продуцировать 100-300мкг/мл слитого белка ОВ, в следует из результатов автоматического секвенипервую очередь в тельцах включения. Тельца рования ДНК. RT-PCR осуществляют при испольвключения солюбилизировали 6М гуанидин-НС1 зовании РНК жировых клеток обеих линий мышей или мочевиной, и белок слияния (содержащийся в (+/+ и ob/ob) с помощью праймеров 5' и 3'супернатанте) наслаивали на His-связываюшую нетранслируемых участков. Продукты PCRсмолу Ni-колонки в 10мл 1х связьюающего буфера реакции очищали гель-электрофорезом и непос мочевиной. Колонку элюировали ступенчато 5средственным образом секвенировали вручную и мл аликвотами 20mМ, 60mМ и 300mМ имидазола с помощью автоматического секвенсера Applied и окончательно очищающим буфером. Затем алиBiosystems, Inc. 373A при использовании праймеквоты анализировали на присутствие полипептида ров, соответствующи х обеим цепям кодирующей слияния ОВ в 15%-ном акриламидном геле. Кажпоследовательности. дая линия содержит эквивалент 100мкл бактериФигура 15. (А). Саузерн-блот геномной ДНК ального экстракта. каждой указанной линии мышей. Примерно 5мкг Фигура 19. (A). In vitro трансляция РНК ОВ. ДНК (геномной ДНК печени, почек или селезёнки) кДНК ОВ человека субклонировали в векторе расщепляли указанными ферментами рестрикции. pGEM. Плазмиду линеаризовали и синтезировали Затем ДНК подвергали электрофорезу в 1%-ном (+) цепь РНК с помощью Sp6-полимеразы. Синтеагарозном геле в ТВЕ и обрабатывали меченной в зированную in vitro РНК транслировали в присутPCR пробой 2G7. Рестрикционное расщепление ствии или в отсутствие микросомальных медлбран Bgl II связано с увеличением размера примерно поджелудочной железы собаки. После in vitro до 9 kb (наибольший размер) Bgl II-фрагмента трансляции обнаруживали примерно 18кДаДНК SM/Ckc-+Dac ob21/ob21 (2J). RFLPs не выявляпервичный трансляционный продукт. Добавление ются ни с какими рестрикционным ферментом. микросомальных мембран в реакционную смесь Предварительное рестрикционное картирование приводило к появлению второго продукта трансгеномной ДНК показывает, что полиморфный Bgl ляции примерно на 2кДа меньше, чем первый И-сайт расположен в положении upstream (припродукт трансляции. Размер трансляционного мерно 7kb) по отношению к транскрипционному продукта РНК интерлейкина 1 а, утратившей кодиначальному сайту. Ни один из других исследованрующую область сигнальной последовательности, ных ферментов не «выходил за рамки» стартового не изменялся при добавлении микросомальных сайта мРНК. (В). Сегрегация Bgl II полиморфизма мембран. Эти данные свидетельствуют о налив линии SM/Ckc-+Dac ob21 /ob21. Шесть мышей с чии функциональной сигнальной последовательожирением и пять не страдающих ожирением, ности. (В). In vitro трансляция в присутствии и в потомков одной и той же генерации коизогенотсутствие протеиназы К. Обработка протеиназой ных животных SM/Ckc-+Dac ob21/ob21 (2J), генотиприводит к полному протеолизу 18-кДа первого пировали путем подсчёта Bgl II полиморфизма, продукта трансляции, в то время как на 16-кДа как показано на Фиг.(А). Все животные с фенотипроцессированную форму протеиназа не действупическим ожирением были гомозиготными по ет. Пермеабилизация микросом 0.1%-ным ТРИбульшей аллели полиморфного Bgl IIТОНОМ-Х100 придаёт данной форме чувствифрагмента. ДНК в контрольной «линии» получательность к протеиназе. Приведённые результаты ли из неродственной мыши SM/Ckc-+Dac+/+, 25 70911 26 свидетельствуют о том, что продукт транслироиммуноочишенными анти-ОВ антителами, конъювался в просвете микросомы. гирванными с гранулами сефарозы 4В. ИммуноФигура 20. (А-Е). Последовательность гена ОВ преципитат разделяли в 15%-ном SDS-PAGEчеловека (SEQ ID NO: 22 и 24). (F). С хематическое геле, переносили и подвергали Вестерн-блоттингу строение гена ОВ мыши. (G). Схематическое с анти-ОВ антителами. Белок мигрировал в обласстроение гена ОВ человека. На Фиг.(F) и (G) подти мол. массы около 16кДа, так же, как и зрелый чёркнуты стартовые и стоп-кодоны. Нет свидебелок ob мыши, экспрессированный в дрожжевых тельства в пользу гомологии первого интрона гена клетках. Белок отсутствовал в плазме крови мымыши и первого интрона гена человека, однако шей C57BL/6J ob/ob и обнаруживался в десятиэто не исключается. кратном количестве в плазме крови мышей Фигура 21. Схематическое изображение одной C57BLB/Ks db/db по сравнению с животными дикоиз методик клонирования для достижения рекомго типа. Предполагается, что db мыши отличаются бинантной экспрессии ОВ в дрожжах Pichia. (А). сверхпродукцией белка ОВ, обладая вторичной Экспрессионный вектор ОВ с сигнальной послеустойчивостью к его эффектам. (В). Увеличенные довательностью а-спаривающего, фактора. (В). уровни ОВ у ожиревших крыс. Крысы ожирели Схематическое изображение структуры рекомбивследствие рецессивной мутации в хромосоме 5. нантного белка слияния, включающего аминоГенетические данные позволяют предположить кисллотную последовательность SEQ ID NO: 26 с наличие дефекта в том же самом гене, который показанными Xho 1-сайтом и предполагаемыми мутировал у db мышей. Плазму крови ожиревших сайтами расщепления КЕХ-2 и STE-13 и Nкрыс и не страдающих ожирением одного помёта концевыми добавочными аминокислотами, распоиммунопреципитировали и исследовали в Весложенными после КЕХ-2 (SEQ ID NO: 27). (С). терн-блоттинге. У мутантных животных выявляли Альтернативная стратегия для получения зрелого двадцатикратное увеличение циркулирующего ОВ включает получение конструкта с аминокисуровня полипептида ОВ. (С). Количество ОВ белка лотной последовательностью, соответствующей в плазме крови мыши. Увеличенное количество сайту расщепления Xho I и сайту расщепления рекомбинантного мышиного белка добавляли к КЕХ-2, в положении немедленного upstream по 100 1 плазмы мышей ob и иммунопреципитировасравнению с последовательностью зрелого полили. Интенсивность сигнала на Вестерн-блотах пептида (SEQ ID NO: 28). сравнивали с таковой в 100 1 плазмы мышей диФигура 22. Альтернативная экспрессионная кого типа. Линейное увеличение интенсивности стратегия при использовании Pichia. (А). Вектор сигнала наблюдалось с увеличением количества экспрессии слитого ОВ с His-меткой, заимстворекомбинантного белка, показывая, что иммунованный из экспрессионной системы рЕТ, под конпреципитация осуществлялась в условиях избыттролем сигнальной последовательности ака антител. Сходные сигналы наблюдались в обспаривания фактора (SEQ ID NO: 33). (В). Схемаразце плазмы от животных дикого типа и в тическое изображение структуры рекомбинантного образце с 2нг рекомбинантного белка, выявляя белка слияния ОВ, содержащего His-метку, котоциркулирующий уровень в плазме крови мыши в рый включает сигнальную последовательность размере около 20нг/мл. (D). О В белок в экстракпоследовательности а-спаривающего фактора, тах жировой ткани. Цитоплазматические экстракты предполагаемые сайты расщепления КЕХ-2 и жировой ткани мышей получали от животных db и STE-13, His-метку и сайт расщепления тромбином, дикого типа. Вестерн-блоты показывают увеликоторый приводит к получению ОВ с тремя доченные уровни белка 16кДа в экстрактах, полуполнительными N-концевыми аминокислотными ченных от мышей db. остатками. Фигура 25. Показаны вариации уровней цирФигура 23. (А). Анализ с помощью PAGE экскулирующего белка ОВ в плазме крови человека. прессии ОВ мыши (в микрогетерогенной форме, т. (А). Вестерн-блоты плазмы крови человека. Обе. содержащего и несодержащего Gin 49) в разцы плазмы получали от шести добровольцев, трансформированных клетках дрожжей Pichia. не страдающих ожирением. Иммунопреципитация Ожидаемая полоса размером около 16кДа визуаи Вестерн-блоттинг выявляли наличие иммунорелизируется в культуральной жидкости трансфорактивного белка 16кДа, идентичного по размеру мированных дрожжевых клеток (вторая и третья рекомбинантному белку человека в 146 аминокислинии), но не в культуральной жидкости нетранслот, который экспрессируется в клетках дрожжей. формированных дрожжевых клеток (первая лиВ каждом из шести образцов выявляются различния). (В). PAGE-анализ частично очищенного (на ные уровни белка. (В). ELISA (иммуноанализ со карбоксильной целлюлозе) полипептида О В (сласвязанным ферментом) ob человека. Панели для бая ионообменная колонка). На фракциях 3 и 4, микротитрования покрывали иммуноочишенными полученных с колонки, хорошо видна полоса разантителами к ОВ человека. Известные количества мером около 16кДа. Фракции элюируют 250мМ рекомбинантного белка добавляли к панелям и NaC1. Линия 1-нанесённый образец; линия 2выявляли с помощью иммуноочищенных биотинипрохождение потока; линии 3-5-фракции, элюиролированных антител к ob. Для получения станванные 250мМ NaC1. дартной кривой откладывали поглощение при Фигура 24. Показана циркуляция белка ОВ в 414нм против известных концентраций ОВ. Полуплазме крови мыши. (А). Иммунопреципитатьі из ченная стандартная кривая показывает, что метод крови мыши 0,5мл плазмы крови мыши предспособен выявить 1нг/мл или более белка ОВ чеварительно осветляли на неконъюгированной ловека. (С). Количество О В белка в плазме крови сефарозе и инкубировали в течение ночи с человека. ELISA осуществляли при использовании 27 70911 28 100 1 плазмы крови от шести добровольцев, не осуществлять эффективную очистку с помощью страдающих ожирением, и стандартов, применяеАффинной Хроматографии с Иммобилизованным мых при исследовании панели В. Уровни ОВ белМеталлом (IMAC). Рекомбинантный бактериалька варьировали от 2нг/мл в НР1 до 15нг/мл в НР6. ный белок первоначально выделяли из нераствоУказанные, данные коррелируют с результатами римой мембранной фракции после лизиса бактеВестерн-блоттинга панели А. рий. Мембранную фракцию солюбилизировали с Фигура 26. Показано образование внутримопомощью гуанидинхлорида и наслаивали на лекулярных и межмолекулярных дисульфидных ІМАС-колонку. Белок элюировали ступенчато увесвязей в белке ОВ. (А). Вестерн-блоттинг в восличивающимися концентрациями имидазола (как станавливающих и невосстанавливающих условипоказано на Фигуре). Восстанавливали структуру ях. Вестерн-блоттинг плазмы крови человека и элюированного белка и обрабатывали тромбином мыши повторно осуществляли с добавлением и для удаления His-tag, как описано ниже. Конечный без добавления восстанавливающих агентов к выход растворимого белка составлял 45нг/мл бакобразцу буфера. Когда b-меркаптоэтанол исклютериальной культуры. чали из образца буфера, иммунопреципитаты из Фигура 28. Показано биологическое действие плазмы крови db мигрировали в области явно выбелка ОВ. Временной курс потребления пищи (параженной мол. массы 16кДа и 32кДа. Добавление нели А-С) и параметры веса тела (панели D-F). b-меркаптоэтанола к буферу приводило к исчезГруппы из десяти животных получали ежедневные новению подвижности в области 32кДа (см. перитонеальные инъекции белка ОВ в дозе Фиг.24). Указанный результат воспроизводился, 5мг/кг/день (закрашенные квадраты), ежедневные когда белок мыши экспрессировался в клетках инъекции PBS (закрашенные кружки) или не полудрожжей Pichia pastoris. В этом случае белок мычали инъекций (закрашенные треугольники). «Обши мигрировал в положении димера. В восстаработанные» группы включали мышей C57B1/6J навливающих условиях очищенный рекомбинантob/ob (панели А и D), мышей db/db C57B1/Ks (паный белок мыши мигрировал в области явной мол. нели В и Ε) и мышей CBA/J+/+ (панели С и F). Помассы 16кДа, свидетельствуя о том, что молекутребление пиши регистрировали ежедневно, а вес лярная форма 32кДа образуется в результате тела определяли с интервалом в 3-4 дня. (Шкала формирования одной или двух межмолекулярных веса тела мышей дикого типа в граммах отличаетдисульфидных связей. Белок человека, экспресся от таковой мышей ob и db). Потребление пищи сируемый in vivo и в клетках дрожжей Pichia мышами ob, получавшими белок, уменьшалось pastoris, мигрирует в области мол. массы 16кДа после первой инъекции и стабилизировалось покак в восстанавливающи х, так и в невосстанавлисле четвёртого дня на уровне около 40%, как видвающи х условиях (результаты не показаны). (В). но на схеме, соответствующей данной группе (поБелок человека, экспрессированный в дрожжах, лучавшей инъекции) (р