Модифікований фактор vii

Даний винахід стосується нових способів лікування та нового використання модифікованих форм Фактора VII, які інгібують формування тромбів, підтримують або поліпшують прохідність судин, поліпшують місцевий кровотік у міокарді та модулюють пошкодження міокарду під час постішемічної реперфузії. Коагуляція крові є процесом, який складається зі складної взаємодії різних компонентів крові або факторів і який зрештою викликає утворення фібринового згустку. Взагалі, компонентами крові, що беруть участь у процесі, який отримав назву "каскаду" коагуляції, є проферменти або зимогени, ферментативно неактивні протеїни, які перетворюються на протеолітичні ферменти завдяки дії активатора, який сам є активованим фактором коагуляції. Фактори коагуляції, які були піддані такому перетворенню, які мають загальну назву "активні фактори" і позначаються додаванням малої літери "а" (наприклад, Фактор Vlla). Активований Фактор X ("Ха") є необхідним для перетворення протромбіну на тромбін, який після цього перетворює фібриноген на фібрин на остаточному етапі утворення фібринового згустку. Існ ують дві системи або два шляхи, які сприяють активації Фактора X. "Вн утрішній шлях" стосується реакцій, які ведуть до утворення тромбіну через використання факторів, присутніх лише у плазмі. У результаті серії опосередкованих протеазою активацій зрештою генерується Фактор ІХа, який разом з Фактором Villa розщеплює Фактор X на Ха. Такий самий протеоліз здійснюється Фактором Vlla та його кофактором, тканинним фактором, "зовнішнім шляхом" коагуляції крові. Тканинний фактор зв'язаний з мембраною протеїном, і він за звичайних умов не циркулює у плазмі. Однак, після розриву судини він може об'єднатися з Фактором Vlla для каталізу активації Фактора X або Фактора IX у присутності Са++ та фосфоліпіду (Nemerson and Gentry, Bioohem. 25:4020-4033 (1986)). Тоді як відносна роль двох шляхів коагуляції у гемостазі досі не з'ясована, в останні роки було виявлено, що Фактор VII та тканинний фактор відіграють ключову роль у регулюванні коагуляції крові. Фактор VII є залишковим глікопротеїном плазми, який циркулює у крові як одноланцюговий зимоген. Зимоген є каталітично неактивним (Williams et al., JL Biol. Chem. 264:7536-7543 (1989); Rao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6687-6691 (1988)). Одноланцюговий Фактор VII може бути перетворений на дволанцюговий Фактор Vlla за допомогою Фактора Ха, Фактора ХІІа, Фактора ІХа або тромбіну in vitro. Фактор Ха вважається основним фізіологічним активатором Фактора VII. Як і деякі інші протеїни плазми, задіяні у гемостазі, Фактор VII залежить від активності вітаміну К, що вимагається для д-карбоксилювання залишків глутамінових кислот зі складною структурою, які утворюють кластер на амінному кінці протеїну. Ці g-карбоксильовані глутамінові кислоти є необхідними для зв'язаної з металами взаємодії Фактора VII з фосфоліпідами. Перетворення зимогенного Фактора VII на активовану дволанцюгову молекулу відбувається через розщеплення внутрішнього пептидного зв'язку, розміщеного приблизно посередині молекули. У Факторі VII людини сайт активуючого розщеплення розміщується у Агд152-ІІе153 (Наgtn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416 (1986), Thim et al., Biochem. 27:7785-7793 (1988) (на обидві ці роботи авторами зроблено посилання). Бичачий Фактор VII активується через розщеплення аналогічного зв'язку Агд152-ІІе153 (Take ya et al., J. Biol. Chem. 263: 14868-14877,1988). У присутності тканинного фактора, фосфоліпідів та іонів кальцію дволанцюговий Фактор Vlla швидко активує Фактор X або Фактор IX шляхом обмеженого протеолізу. Нерідко виникає необхідність у вибірковому блокуванні каскаду коагуляції у пацієнта. Антикоагулянти, такі як гепарин, кумарин, похідні гепарину, похідні індандоліну або інші агенти можуть використовуватися, наприклад, під час діалізу нирок або для лікування глибокого венозного тромбозу, коагулопатії споживання (DIC) та інших розладів. Наприклад, лікування гепарином або екстракорпоральне лікування іонами цитрату (Патент США №4 500 309) може застосовуватися при діалізі для запобігання коагуляції в ході лікування. Гепарин використовується також для уникнення глибокого венозного тромбозу у пацієнтів, до яких застосовується хірур гічне втр учання. Лікування з застосуванням гепарину та інших антикоагулянтів може, однак, мати небажані побічні ефекти. Доступні антикоагулянти частіше діють у всьому організмі, ніж у якомусь конкретному місці коагуляції. Гепарин, наприклад, може викликати сильну кровотечу. Крім того, гепарин, який має період напіврозпаду приблизно 80 хвилин, швидко виводиться з крові, викликаючи необхідність його частого введення. Оскільки гепарин діє як кофактор для антитромбіну III (AT III), a AT III швидко вичерпується при лікуванні коагулопатії споживання, то нерідко буває важко підтримувати належну дозу гепарину, що викликає необхідність у постійному контролюванні рівнів AT III та гепарину. Гепарин є також неефективним при крайньому рівні вичерпання AT III. Крім того, тривале використання гепарину може також підвищити агрегацію тромбоцитів і знизити кількість тромбоцитів, а також пов'язане з розвитком остеопорозу. Похідні індандоліну також можуть мати токсичні побічні ефекти. Крім антикоагулянтів, коротко описаних вище, антикоагулюючу дію виявили кілька природних протеїнів. Наприклад, Ройтелінспергер (Reutelingsperger) (Патент США №4 736 018) виділив антикоагулянтні протеїни з бичачої аорти та пупкових артерій людини. У Макі та ін. (Maki et al.) (Патент США №4 732 891) описано антикоагулянтні протеїни, що походять з плаценти людини. До того ж, AT III було запропоновано як терапевтичний антикоагулянт (Schipper et al., Lance і 1 (8069): 854-856 (1978); Jordan, Патент США №4 386 025; Воск et al., Патент США №4 517 294). Проліферація клітин гладенького м'яза (SMC) у стінці судини є важливим чинником в пошкодженні судин при атеросклерозі після відновлення судин або у відповідь на інше пошкодження судини. Наприклад, лікування атеросклерозу часто включає прочищення заблокованих судин шляхом пластичної операції на судинах, ендартеректомію або відновлювальну атеректомію, або через обхідне судинне шунтування, хірургічні процедури, при яких атеросклеротичні бляшки стискаються або видаляються за допомогою катетеризації (пластичної операції на судинах), зішкрібаються зі стінки артерії за допомогою розрізу (ендартеректомії) або спрямовуються обхідним шляхом з застосуванням природних або синтетичних шунтів. У ході цих процедур видаляється ендотелій судин, порушується інтимальний шар, який розміщується під ним, що призводить до загибелі проміжних клітин гладенького м'яза. Після цього пошкодження відбувається проліферація проміжних клітин гладенького м'яза та їхня міграція до інтими (внутрішньої оболонки судин), що, як правило, трапляється у період від перших кількох тижнів до шести місяців після пошкодження і припиняється після утворення нового шару ендотелію. У людини ці пошкодження складаються з приблизно 20% клітин та 80% зовнішньоклітинної матриці. У приблизно 30% або більшої кількості пацієнтів, яких піддавали пластичній операції на судинах, ендартеректомії або обхідному шунтуванню, тромбоз та/або проліферація клітин гладенького м'язу у внутрішній оболонці судин викликає повторне закупорення судини, і реконструктивна операція зрештою виявляється безуспішною. Це закупорення судини внаслідок операції відоме як рестеноз. І досі існує потреба у поліпшених композиціях, які мають антикоагулюючу дію і які можуть бути призначені у відносно низьких дозах і не створюють небажаних побічних ефектів, пов'язаних з традиційними антикоагулянтними композиціями. Даний винахід задовольняє цю потребу забезпеченням антикоагулянтів, які діють у конкретних ділянках пошкодження, а також забезпечує інші переваги, пов'язані з цим. Молекули модифікованого Фактора VII використовуються, зокрема, для того, щоб призначати їх людині з метою лікування різних станів, пов'язаних із внутрішньосудинною коагуляцією. Наприклад, хоча глибокий венозний тромбоз та емболія легеневої артерії можуть виліковуватися традиційними. Незважаючи на використання численних форм механічного втручання, включаючи балонну ангіопластику, відновлювальну атеректомію, встановлення судинних стентів, лазерну терапію або ротоблатор, ефективність цих те хнологій залишається обмеженою через рестеноз, який становить приблизно 40% протягом 6 місяців після лікування. Вважається, що рестеноз є результатом складної взаємодії біологічних процесів, включаючи осадження тромбоцитів та утворення тромбів, вивільнення хемотактичного та мітогенного Факторів, а також міграцію та проліферацію клітин гладенького м'яза судин до внутрішньої оболонки судин розширеного артеріального сегменту. Інгібування накопичення тромбоцитів у ділянках механічного пошкодження може знизити ступінь рестенозу у людини. Терапевтичне використання моноклонального антитіла до тромбоциту Gpllb/llla може обмежити рівень рестенозу у людини (Califf et аl., N. Engl. J. Med.. 330:956-961 (1994)). Антитіло здатне зв'язувати Gpllb/llla - рецептор на поверхнях тромбоцитів і таким чином знижувати накопичення тромбоцитів. Ці дані дозволяють зробити висновок, що інгібування накопичення тромбоцитів на ділянці механічного пошкодження коронарних артерій людини є сприятливим для остаточного виліковування наслідків реакції, яка зазвичай трапляється. Якщо накопичення тромбоцитів трапляється на ділянках гострих пошкоджень судин, то утворення тромбіну на цих ділянках може зумовлювати активацію тромбоцитів та їхнє наступне накопичення. Як показано на поданих нижче прикладах, модифікований Фактор VII згідно з даним винаходом здатен зв'язувати тканинний фактор поверхні клітин. Наприклад, DEGR-Фактор Vlla зв'язує тканинний фактор поверхні клітин з еквівалентною або більш високою спорідненістю, ніж у природного Фактора Vlla. DEGRФактор Vlla, однак, не має ферментної активності, хоча й зв'язується з тканинним Фактором і діє як конкурентний антагоніст природного Фактора Vlla, таким чином інгібуючи наступні етапи зовнішнього шляху коагуляції, які ведуть до утворення тромбіну. Молекули модифікованого Фактора VII, які підтримують зв'язування тканинного фактора, інгібують накопичення тромбоцитів на ділянці пошкодження судини через блокування утворення тромбіну та наступне відкладення фібрину. Завдяки здатності DEGR-Фактора VII до блокування утворення тромбіну та обмеження відкладення тромбоцитів на ділянках гострого пошкодження судин молекули модифікованого Фактора VII, які підтримують зв'язувальну активність тканинного Фактора, але які не мають ферментної активності Фактора Vlla, можуть використовува тися для інгібування рестенозу судин. Композиції, які включають модифікований Фактор VII, використовуються, зокрема, для лікування пацієнтів, якщо вони входять до складу фармацевтичних композицій, і можуть бути призначені пацієнтам, що страждають від різних хвороб, з метою виліковування станів, пов'язаних із коагуляцією. Такі молекули модифікованого Фактора VII, які здатні зв'язувати тканинний фактор, але мають суттєво знижену здатність до каталізу активацію інших факторів у каскаді коагуляції, можуть мати довший період напіврозпаду плазми і, відповідно, довший період антикоагулюючої дії порівняно з іншими антикоагулянтами. Серед хвороб, для лікування яких показані ці композиції, - ті, які зазвичай лікуються антикоагулянтами, наприклад, глибокий венозний тромбоз, емболія легеневої артерії, удар, коагуляція споживання (DIC), відкладення фібрину у легенях та нирках, пов'язане з грам-негативною ендотоксемією (наявністю у крові ендотоксинів), та інфаркт міокарду. Композиції можуть використовуватися для інгібування рестенозу судин, який трапляється після механічного пошкодження судин, такого як пошкодження, викликане балонною ангіопластикою, ендартеректомією, відновлювальною атеректомією, установленням стентів, лазерною терапією або ротаболяцією, або трапляється як побічний ефект шунтування судин, встановлення стентів, обхідних шунтів або трансплантації органів. Композиції, таким чином, можуть використовуватися для інгібування осадження тромбоцитів та пов'язаних із цим розладів. Отже, спосіб інгібування коагуляції, рестенозу судин або відкладення тромбоцитів, включає, наприклад, призначення пацієнтові композиції, яка містить модифікований Фактор VII, такий як той, що має принаймні одну амінокислотну заміну у каталітичній тріаді Ser344, Asp242 Ta His 193, у кількості, достатній для ефективного інгібування коагуляції, рестенозу судин або осадження тромбоцитів. Ці способи також знаходять застосування при лікуванні гострого закупорення коронарної артерії у пацієнта (наприклад, при гострому інфаркті міокарду), що охоплює введення модифікованого Фактора VII, який включає DEGR-Фактор VII and FFR-Фактор VII, разом з активатором тканинного плазміногена або стрептокінази, і може прискорювати викликаний tPA тромболіз. Модифікований Фактор VII призначається перед, разом із або невдовзі після введення тромболітичного агенту, такого як активатор плазміногена. Міжнародна заявка № WO 92/15686 стосується модифікованого Фактора Vlla, полінуклеїнової кислоти та клітинних ліній ссавців для продукування модифікованого Фактора Vlla, а також композицій, які включають модифікований Фактор Vlla для інгібування коагуляції крові. Міжнародна заявка № WO 94/27631 стосується способів інгібування рестенозу судин, активності тканинного фактора та осадження тромбоцитів. Міжнародна заявка № WO 96/12800 стосується способу лікування гострого закупорювання коронарної артерії, що включає введення пацієнтові композиції, яка включає модифікований Фактор Vlla разом з тканинним активатором плазміногена або стрептокіназою. Даний винахід стосується способу інгібування утворення тромбів у пацієнта, який включає місцеве введення у ділянку судини, схильної до утворення тромбу, терапевтично ефективної дози композиції, яка включає Фактор VII, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, що суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора VII до активації Фактора плазми X або IX. Ділянка утворення тромбу може бути пов'язана з хірургічною операцією, мікрохірургією, пластичною операцією на судинах або травмою. Винахід також стосується способу підтримання або поліпшення у пацієнта прохідності судин, який включає місцеве введення у ділянку судини, схильної до зниження прохідності, терапевтично ефективної дози композиції, яка включає Фактор VII, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора VII до активації Фактора плазми X або IX. Ділянка утворення тромбу може бути пов'язана з хірургічною операцією, мікрохірургією, пластичною операцією на судинах або травмою. Винахід також стосується способу запобігання або мінімізації ураження міокарду, пов'язаного з постішемічною реперфузією пацієнта, включаючи введення пацієнтові композиції, яка включає фармакологічно прийнятний Фактор VII, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора VII до активації Фактора плазми X або IX. Винахід також стосується способу поліпшення у пацієнта регіонального кровотоку у міокарді під час постішемічної реперфузії, яка включає введення пацієнтові композиції, яка включає фармакологічно прийнятний Фактор VII, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора VII до активації Фактора плазми X або IX. В оптимальному варіанті втілення винаходу модифікація Фактора VII включає реакцію Фактора VII з інгібітором серинової протеази. Більшу перевагу віддають варіантові, у якому інгібітором протеази є органофосфорна сполука, сульфанілфторид, пептидний галометилкетон або азапептид. Ще більшу перевагу віддають варіантові, у якому інгібітором протеази є пептидний галометилкетон, вибраний з-поміж Дансил-PhePro-Arg хлорметилкетон, Дансил-Glu-Gly-Arg хлорметилкетон, Дансил-Phe-Phe-Arg хлорметилкетон та PhePhe-Arg хлорметилкетон, Phe-Phe-Arg хлорметилкетон є оптимальним. Винахід також стосується використання Фактора VII, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора VII до активації Фактора плазми X або IX, для виготовлення композиції для запобігання або мінімізації ураження міокарду, пов'язаного з постішемічною реперфузією. Винахід також стосується використання Фактора VII, що має у каталітичному центрі принаймні одну модифікацію, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора VII до активації Фактора плазми X або IX, для виготовлення композиції для поліпшення регіонального кровотоку у міокарді під час постішемічної реперфузії. Даний винахід пропонує способи та композиції для інгібування шкідливих процесів, пов'язаних з ішемічною реперфузією. Сильна ішемія тканини, органу або кінцівки може бути зумовлена зниженням кровотоку й може бути пов'язана з травмою, хірургічною операцією або зниженим кров'яним тиском. Одним з ускладнень, пов'язаних з сильною ішемією, є зростання тканинного фактора (TF) в артеріальній системі. Вважається, що ця підвищена експресія тканинного фактора стимулює прокоагулянтну реакцію, насамперед у капілярному руслі, таким чином ініціюючи та/або підтримуючи утворення внутрішньосудинного тромбу. Крім того, повторний синтез TF під час реперфузії серця після ішемії за допомогою ендотеліальних клітин у коронарних судинах може привести до зниження коронарного кровотоку під час реперфузії і, таким чином, впливає на долю ішемічного міокарду, який зрештою відмирає. Антигенна та прокоагулянтна активність TF зростає у атеректомічних зразках, отриманих від пацієнтів з нестабільною стенокардією, порівняно з пацієнтами зі стабільною стенокардією. Таким чином, вважається, що у цих пацієнтів виникнення нестабільної стенокардії може бути прискорене через дію TF у субендотеліальній тканині великої епікардіальної коронарної артерії в результаті пошкодження бляшок. Це зрештою сприяє утворенню внутрішньокоронарного тромбу з наступним абсолютним зниженням коронарного кровотоку. TF може також впливати на коронарний кровотік і іншим чином. Після реперфузії ішемічної тканини можуть утворюватися тромби, які можуть бути і закупорюючими, і не закупорюючими. Утворення тромбів в артеріальному руслі та відкладення тромбоцитів уздовж тромбу призводять до вторинного утворення ішемії у тканині. Потім утворення тромбів та присутність тромбоцитів можуть викликати утворення та вивільнення багатьох біоактивних факторів, включаючи й ті, що утворюються під час коагуляційного каскаду, такі як тромбін та Фактор X, а також фактори, що вивільнюються з активованих тромбоцитів. У свою чергу, ці фактори можуть викликати утворення додаткових факторів ендотеліальними клітинами та клітинами гладенького м'язу, що лежать під ними, або прилеглими моноцитами, такими як TNF-альфа та IL-1. Ці Фактори, у свою чергу, можуть активува ти ендотеліальні клітини, що веде до позитивної регуляції різних адгезивних молекул, пов'язаних зі зв'язуванням моноцитів та нейтрофілів. Як правило, ендотеліальні клітини, контактуючи з циркулюючою кров'ю, не виявляють помітної активності TF. За певних обставин ендотеліальні клітини можуть активно сприяти коагуляції через експресію TF-подібної прокоакулянтної активності. Зокрема, і екзогенно, і ендогенно утворені безкисневі радикали (OFR) можуть стимулювати ендотеліальні клітини у системі коронарних судин з метою синтезу та експресії значних кількостей TF. OFR є високореактивними видами молекул, які можуть атакувати різні компоненти клітин. Спалах утворення OFR відбувається після відновлення кровотоку після періоду ішемії, і ці зразки оксидантів можуть бути відповідальними за конкретні форми опосередкованого реперфузією пошкодження тканини, що супроводжує пероксидацію ліпідів та інші необоротні зміни компонентів клітин. OFR також значною мірою знижують активність інгібітора шляху тканинного Фактора (TFPI), протеїну Kunitz-типу, синтезованого ендотеліальними клітинами, який інгібує зовнішній шлях коагуляції. Цей подвійний ефект OFR (експресія TF ендотеліальними клітинами та зниження активності TFPI) може зсунути природні антикоагулюючі властивості нормального ендотелію у напрямку прокоагулянтного стану, сприяючи таким чином небажаній внутрішньосудинніи активації коагуляції. Отже, опосередкована OFR експресія TF у межах коронарної циркуляції призводить до значного зниження коронарного кровотоку під час постішемічної реперфузі. Ця опосередкована OFR експресія TF, що супроводжується активацією зовнішнього шляху коагуляції, має важливі наслідки, оскільки цей феномен впливає на патофізіологію постішемічної реперфузії, особливо у пацієнтів з гострим інфарктом міокарду, яких піддають коронарному тромболізу. Цей феномен непрохідності, тобто відсутність рівномірного кровопостачання мікросудин тканини, що зазнала ішемії, було вперше описано Кругом (Krug et al.), (Circ. Res. 1966; 19:57-62). Найважливішими чинниками, які можуть вплинути на долю ішемічного міокарду, вважаються кількість колатерального кровотоку під час ішемії, розмір площі ризику та потреба міокарду у кисні. В останні десятиріччя спостерігався інтенсивний інтерес до ідеї лікування пацієнтів з гострим інфарктом міокарду через реперфузію, включаючи коронарний тромболіз, первинну реконструкцію судин, або і те, й інше. Однак, жодне з досліджень не продемонструвало поліпшення у функціонуванні лівого шлуночка після реканалізації артерії, пов'язаної з інфарктом. У цей момент значна кількість пацієнтів виявляє стан "низької циркуляції" у коронарному колі обігу, пов'язаному з інфарктом. Цей стан пов'язаний з майже повною відсутністю поліпшення, принаймні стосовно морального стану. Вважається, що цей стан низької циркуляції спричинюється, принаймні частково, нездатністю крові знову заповнити усі судини міокарду, який зазнав ішемії. Тепер же несподівано виявилося, що FVllai впливає, у бік підвищення, на регіональний кровотік у міокарді під час реперфузії. Також несподівано виявилося, що FVllai викликає значне зниження у непрохідній ділянці. Зв'язування та переміщення моноцитів та нейтрофілів, вивільнення біоактивних сполук цими клітинами, включаючи утворення без кисневих радикалів, може посилити рівень активації ендотеліальних клітин та ступінь їхнього пошкодження. Зрештою, якщо цей каскад етапів відбувається без перешкод, це може призвести до систематичних ускладнень і може сприяти дисфункції багатьох органів. Через блокування тканинного фактора шляхом введення конкретного інгібітора для зв'язування тканинного фактора/Фактора VII (наприклад, FFR-FVIIa), а, отже, й блокування початку зовнішнього шляху коагуляції, можна запобігти початку каскаду етапів, таким чином модулюючи міру несприятливих етапів, пов'язаних з ішемією/реперфузією, наприклад, виключаючи або мінімізуючи ураження міокарду або некроз. Короткий опис Фігур Фіг.1 показує конструкцію експресійного вектора ДНК-послідовності Зег344®АІа-модифікованого Фактора VII. Серед застосованих символів: 0-1 - 0-1 послідовність одиниць карти аденовірусу 5; Ε - SV40 енхансер; MLP - головний останній промотор аденовірусу 2; SS - набір зрощених сайтів; р А - сигнал поліаденілювання SV40 в останньому положенні. Фіг.2 показує вплив болюсної ін'єкції DEGR-Фактора Vlla на утворення тромбу (осадження тромбоцитів) в аорті підданого ендартеректомії бабуїна порівняно з обробленим фізіологічним розчином контролем. Артерії вимірювали протягом 60 хвилин. DEGR-Фактор Vlla значно стримував розвиток багатих на тромбоцити тромбів у цього примата з гострим ураженням судин. Фіг.3 показує результати, отримані при інкубації клітин гладенького м'яза бабуїна з підвищенням концентрації FVIIa (відкритий бокс), або DEGR-FVIIa у присутності постійної кількості FVIIa (5 нМ) (закритий бокс). Відразу після цього визначали рівень активації FX з використанням хромогенного субстрату S-2222. Дані представлені як амідолітична активність у відсотках від активності, яка генерується у присутності лише 5 нМ FVIIa. Фіг.4 описує розмір площі внутрішньої оболонки судин бабуїна після ендартеректомії сонної артерії та лікування за допомогою DEGR-Фактора Vlla протягом 7 або 30 днів у порівнянні з контрольними тваринами. Фіг.5 показує співвідношення площі внутрішньої оболонки до суми площ внутрішньої (інтими) та середньої вистілок стегнової артерії бабуїна після здуття та лікування DEGR-Фактором Vlla, коли контрольна група включає 5 судин, при 7-денному лікуванні досліджували 11 судин, при 30-денному лікуванні досліджували 2 судини (п= кількість досліджених судин). Фіг.6 показує експериментальний протокол вимірювання розміру інфаркту (IS), непрохідності (NR), площі ризику (AR), протромбінового часу (РТ) та часу активованого часткового тромбопластину (аРТТ). Фіг.7 показує діаграму розміру інфаркту наприкінці періоду реперфузії (IS), виражені у відсотках площі ризику інфаркту в трьох гр упах пацієнтів, причому три групи пацієнтів складалися з тварин, яких лікували відповідно FFR-Фактором Vlla, Фактором Vlla та фізіологічним розчином. Кожна колонка представляє середній показник для восьми тварин ± SD. Фіг.8 показує діаграму площі непрохідності (NR) наприкінці періоду реперфузії, виражену у відсотках площі ризику інфаркту (тварини, яких лікували відповідно Фактором Vlla та фізіологічним розчином). Кожна колонка представляє середній показник для восьми тварин ± SD. Фіг.9 показує співвідношення між очікуваною непрохідністю, розрахованою (у відсотках від лівого шлуночка, LV) для кожної тварини за допомогою кількох лінійних рівнянь регресії та непрохідності, яка реально спостерігалася (як відсоток від LV). Фіг.10 показує діаграму регіонального кровотоку у міокарді (RMBF) для ішемічного міокарду, вимірюваного протягом 20 хв ішемії та через 10 хв та 2 год з початку реперфузії. Фіг.11 показує вплив FFR-Фактора Vlla та Фактора Vlla на протромбіновий час (РТ) та час активованого часткового тромбопластину (аРТТ). Опис конкретних варіантів втілення винаходу Модифікований Фактор VII може мати форму зимогена (тобто одноланцюгової молекули) або може бути розщеплений у сайті активації. Таким чином, поняття "модифікований фактор VII" включає молекули модифікованого Фактора VII та модифікованого Фактора Vlla, які зв'язують тканинний фактор та інгібують активацію Факторів IX до ІХа та Фактора X до Ха. Послідовність Фактора VII має принаймні одну амінокислотну модифікацію, причому модифікація вибирається така, що суттєво знижує здатність активованого Фактора каталізувати активацію Факторів плазми X або IX і, таким чином, є здатною до інгібування коагулятивної активності. Модифікований Фактор VII має активний сайт, модифікований принаймні однією амінокислотною заміною, і у цій модифікованій формі здатен на зв'язування тканинного Фактора. Композиції модифікованого Фактора VII, як правило, перебувають у практично чистій формі. В оптимальних варіантах Фактора VII людини та великої рогатої худоби залишок активного сайту Ser344 є модифікованим, заміненим на Gly, Met, Thr або, ще краще, Ala. Така заміна може бути здійснена окремо або разом із заміною(ами) в інших сайтах у каталітичній тріаді, яка включає His 193 та Asp242. Композиції модифікованого Фактора VII придатні для введення різним ссавцям, зокрема, людині, для інгібування каскаду коагуляції. Модифікований Фактор VII може бути введений пацієнтові разом з іншими антикоагулянтними сполуками або замість них.Як правило, призначені для введення людині фармацевтичні композиції включають модифікований протеїн Фактора VII людини та фармацевтично прийнятні носії та буфери. Фактор VII відіграє важливу роль у каскаді коагуляції, особливо у тому, що включає зовнішній шлях. Присутній у циркулюючій плазмі у вигляді неактивного одноланцюгового зимогенного протеїну, Фактор Vlla після активації, разом із тканинним Фактором та іонами кальцію, активує Фактор X до Ха і активує Фактор IX до Іха з можливістю утворення фібринового згустку. Протеїни Фактора VII мають каталітичний сайт, який є модифікованим для зниження каталітичної активності Фактора Vlla, тоді як молекула зберігає здатність до зв'язування тканинного фактора. Молекули модифікованого Фактора VII конкурують із природним Фактором VII та/або Vlla для зв'язування з тканинним фактором. В результаті цього стримується активація Факторів X та IX. Модифікований Фактор VII може бути кодований полінуклеотидною молекулою, яка включає дві функціонально з'єднані кодуючі послідовності області, що кодують, відповідно, пре-пропептид та gla-домен залежного від вітаміну К протеїну плазми та протеїн Фактора VII без gla-домену, у яких після експресії вищезгаданий полінуклеотид кодує молекулу модифікованого Фактора VII, яка не може значною мірою активувати Фактори плазми X або IX і здатна зв'язувати тканинний фактор. Молекула модифікованого Фактора VII, експресована цим полінуклеотидом, є біологічно активним антикоагулянтом, тобто здатна інгібувати каскад коагуляції, а, отже, й утворення фібринового осаду або тромбу. Для експресії модифікованого Фактора VII молекулу полінуклеотиду трансфектують у клітинні лінії ссавців, наприклад, у клітинні лінії ВНК, ВНК 570 або 293. Каталітична активність Фактора Vlla може бути інгібована хімічною дериватизацією каталітичного центру або тріади. Дериватизація може здійснюватися через реакцію Фактора VII з необоротним інгібітором, таким, як органофосфорна сполука, сульфонілфторид, пептидгалометилкетон або азапептид, або, наприклад, ацилюванням. Перевагу віддають пептидгалометилкетонам, які включають РРАСК (D-Phe-Pro-Arg хлорметилкетон: (див. Патент США №4 318 904, на який у тексті робиться посилання), D-Phe-Phe-Arg та PhePhe-Arg хлорметилкетон (FFR-cmk); та DEGRck (дансил-Glu-Gly-Arg хлорметилкетон). Каталітична активність Фактора Vlla може також інгібуватися шляхом заміни, введення або видалення амінокислот. В оптимальних варіантах амінокислотні заміни здійснюють в амінокислотній послідовності каталітичної тріади Фактора VII, визначеної нами як області, що містять амінокислоти, які беруть участь у каталітичному сайті Фактора VII. Заміни, введення або видалення у каталітичній тріаді здійснюються, як правило, в амінокислотах, які утворюють каталітичний сайт, або у сусідніх з ними. У протеїнах Фактора VII людини або великої рогатої худоби, амінокислотами, які утворюють каталітичну "тріаду", є Ser344, Asp242 та His 193 (ци фри нижнього індексу позначають позицію у послідовності). Каталітичні сайти у Факторі VII інших видів ссавців можуть бути визначені з застосуванням доступних на даний час способів, включаючи, серед інших, ізоляцію протеїну та аналіз амінокислотної послідовності. Каталітичні сайти можуть бути визначені також через зіставлення послідовності з послідовністю інших серинових протеаз, зокрема, хімотрипсину, активний сайт якого було визначено раніше (Sigler et аі, J. Мої. ВіоІ 35:143-164 (1968), робота, на яку нами робиться посилання), а, отже, й визначення на основі вищезгаданого зіставлення аналогічних залишків активного сайту. Заміни, введення або видалення амінокислот здійснюються для запобігання або інгібування активації Фактором Vlla Факторів X та/або ЇХ. Модифікований таким чином Фактор VII, однак, має зберігати здатність конкурувати з а утентичним Фактором VII та/або Фактором Vlla для зв'язування з тканинним Фактором у каскаді коагуляції. Така конкуренція може бути легко визначена, наприклад, через описаний нами аналіз коагуляції або аналіз конкурентного зв'язування з використанням лінії клітин, що має тканинний фактор поверхні клітин, наприклад, лінії клітин карциноми міхура людини J82 (Sakai et al. J. ВіоІ. Chem. 264: 9980-99S8 (1989), робота, на яку нами робиться посилання). Амінокислоти, які утворюють каталітичний сайт у Факторі VII, такі як Ser344, Asp242 та His 193 у Факторі VII людини або великої рогатої худоби, можуть бути або замінені, або видалені. У межах даного винаходу перевага віддається заміні лише однієї амінокислоти, що мінімізує, таким чином, ймовірність зростання антигенності молекули або інгібування її здатності до зв'язування тканинного фактора, однак можуть бути здійснені дві або кілька амінокислотних замін (замін, додавань або видалень) та комбінацій замін, додавань та видалень. В оптимальному варіанті втілення винаходу для Фактора VII людини та великої рогатої худоби Ser344 замінюється на Ala, але можуть бути замінені Gly, Met, Thr або інші амінокислоти. Перевагу віддають заміні Asp на Glu та His на Lys або Arg. Взагалі, заміни здійснюють для якомога меншого переривання третинної структури протеїну. Допомогти у виборі інших амінокислотних замін може модель Дейгоффа (Dayhoff et al., Atlas of Protein Structure 1978. Nat'l Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), на яку нами робиться посилання. Можна замінити залишок, як було описано вище, у каталітичному сайті відповідної послідовності Фактора VII людини, великої рогатої худоби або інших видів і протестувати отриманий в результаті протеїн на належний рівень інгібування каталітичної активності та описану нами антикоагулюючу активність. Для модифікованого Фактора VII каталітична активність суттєво знижується, як правило, і є меншою приблизно 5% від каталітичної активності природного Фактора VII відповідних видів, краще - меншою приблизно 1%. Модифікований Фактор VH може вироблятися шляхом використання технологій рекомбінантної ДНК. Взагалі, клоновану ДНК-послідовність природного Фактора VII видозмінюють для кодування потрібного протеїну. Після цього цю модифіковану послідовність вводять в експресійний вектор, який, у свою чергу, трансформують або трансфектують у клітини-хазяї. Як клітинам-хазяям, перевагу віддають вищим еукаріотним клітинам, зокрема, культивованим клітинам ссавців. Відомі повні нуклеотидні та амінокислотні послідовності для Фактора VII. Див. Патент США №4 784 950, на який нами робиться посилання і у якому описано клонування та експресію рекомбінантного Фактора VII людини. Послідовність Фактора VII великої рогатої худоби описано у роботі Такеуа et аІ., J.Biol, Chem, 263:14868-14872 (1988), на яку нами робиться посилання. Зміна амінокислотної послідовності може здійснюватися різними способами. Моди фікація ДНКпослідовності може бути у формі сайт-специфічного мутагенезу. Способи сайт-специфічного мутагенезу добре відомі спеціалістам і описуються, наприклад, Цоллером та Смітом (Zoller and Smith (DNA 3:479-488, 1984)). Таким чином, використовуючи н уклеотидні та амінокислотні послідовності Фактора VII, можна здійснювати зміни на вибір. Фактор VII, модифікований відповідним чином, включає протеїни, в яких амінний кінець (gla-домен) замінено на gla-домен одного з залежних від вітаміну К протеїнів плазми, Фактора IX, Фактора X, протромбіну, протеїну С, протеїну S або протеїну Z. Gla-домени залежних від вітаміну К протеїнів плазми характеризуються присутністю залишків гамма-карбоксиглутамінової кислоти і, як правило, мають довжину від приблизно ЗО до приблизно 40 амінокислот з С-кінцями, які відповідають позиціям межі екзон-інтрон у відповідних генах. Способи вироблення Фактора VII за допомогою гетерологічного gla-домену описано у Патенті США №4 784 950, на який нами робиться посилання. ДНК-послідовності для використання при виробленні модифікованого Фактора VII, як правило, кодують пре-пропептид на амінному кінці протеїну Фактора VII для належного посттрансляційного процесингу (наприклад, гамма-карбоксилювання залишків глутамінових кислот) та виділення з клітини-хазяїна. Препропептид може належати до Фактора VII або іншого залежного від вітаміну К протеїну плазми, такого як Фактор IX, Фактор X, протромбін, протеїн С або протеїн S. Як стане зрозуміло спеціалістам, існує можливість додаткових модифікацій в амінокислотній послідовності модифікованого Фактора VII причому ці модифікації не дуже послаблюють здатність протеїну діяти як антикоагулянт. Наприклад, Фактор VII, модифікований у каталітичній тріаді, може також бути модифікований в активаторному сайті розщеплення для інгібування перетворення зимогенного Фактора VII на його активовану дволанцюгову форму, як описується у загальній формі в Патенті США № 5 288 629, на який нами робиться посилання. Експресійні вектори для використання при експресії модифікованого Фактора Vlla включають промотор, здатний на спрямування транскрипції клонованого гена або кДНК. Перевагу при використанні у культивованих клітинах ссавців віддають вірусним промоторам та клітинним промоторам. Вірусні промотори включають SV40 промотор (Subramani et al., Мої. Cell. Biol. 1:854-864, 1981) та CMV промотор (Boshart et al., Сell 1141:521-530, 1985). Особливу перевагу серед вірусних промоторів віддають головному останньому промотору аденовірусу 2 (Kaufman and Sharp, Мої. Cell. Biol. 2:1304-1319. 1982). Клітинні промотори включають промотор каппа-гена миші (Bergman et al., Proc. Natl, 81:7041-7045, 1983) та VH промотор миші (Loh et al., CM 33:85-93, 1983). Особливу перевагу серед клітинних промоторів віддають металотіонеїн-І-промоторові миші (Palmiter et al., Science. 222:809-814, 1983). Експресійні вектори можуть також містити набір РНК-сплайсових сайтів, розташованих за промотором і перед інсерційним сайтом для самої послідовності Фактора VII. Оптимальні РНК-сплайсові сайти можуть бути отримані з генів аденовірусу та/або імуноглобуліну. В експресійних векторах також міститься сигнал поліаденілювання, який розміщується після інсерційного сайту. Сигнали поліаденілювання, яким віддають особливу перевагу, включають ранній або останній сигнал поліаденілювання з SV40 (Kaufman and Sharp, ibid.), сигнал поліаденілювання з Elb-ділянки аденовірусу 5, термінатора гена гормону росту людини (DeNoto et al. Nuc. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) або сигналу поліаденілювання з гена Фактора VII людини або гена Фактора VII великої рогатої худоби. Експресійні вектори можуть також включати некодуючу вірусн у лідерну послідовність, таку як потрійний лідер аденовірусу 2, розміщений між промотором та РНК сплайсовим сайтом; а також енхансерні послідовності, такі як SV40 енхансер. Клоновані ДНК-послідовності вводять у культивовані клітини ссавців, наприклад, шляхом опосередкованої фосфа том кальцію трансфекції (Wigfer et al., CM 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) або електропорації (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982). Для розпізнавання та відбору клітин, які експресують екзогенні ДНК, як правило, разом з потрібним геном або кДНК у клітини вводять ген, який забезпечує селектабельний фенотип (селектабельний маркер). Оптимальні селектабельні маркери включають гени, які забезпечують резистентність проти медикаментів, таких як неоміцин, гідроміцин та метотрексат. Селектабельним маркером може бути здатний до ампліфікації селектабельний маркер. Серед здатних до ампліфікації селектабельних маркерів перевагу віддають послідовності дигідрофолатредуктази (DHFR). Селектабельні маркери розглядаються Тіллі (Thilly) у роботі Mammalian CeΙΙ TechnoJngy Butterworth Publishers, Stoneham, MA, на яку нами робиться посилання. Вибір селектабельних маркерів серед спеціалістів вважається традиційною процедурою. Селектабельні маркери можуть бути введені у клітину на окремій плазміді водночас із потрібним геном, або ж вони можуть бути введені у ту саму плазміду. Якщо у тій самій плазміді селектабельний маркер та потрібний ген можуть бути під контролем різних промоторів або одного промотору, то таке розташування створює дицистронний сигнал. Послідовності цього типу відомі спеціалістам (наприклад, Патент США №4 713 339, виданий Левінсону та Сімонсену). Добрий результат дає також додавання ДНК, відомої як "носій ДНК," до суміші, яку вводять у клітини. Після забирання клітинами ДНК вони розвиваються у відповідному поживному середовищі, як правило, 12 дні, для того, що розпочати експресію потрібного гена. Вжитий нами термін "відповідне поживне середовище" означає середовище, яке містить поживні речовини та інші компоненти, необхідні для розвитку клітин та експресії гена модифікованого Фактора VII. Ці середовища, як правило, включають вуглецеву основу, азотну основу, основні амінокислоти, основні цукри, вітаміни, солі, фосфоліпіди, протеїни та фактори росту. Для створення гамма-карбоксильованого модифікованого Фактора VII середовище має містити вітамін К, краще - у концентрації приблизно від 0,1мг/мл до приблизно 5мг/мл. Після цього застосовується селекція препаратів з метою відбору для розвитку клітин, які експресують селектабельний маркер у стабільному режимі. Для клітин, які були трансфектовані з селектабельним маркером, що піддається ампліфікації, концентрація препарату може бути підвищена з метою відбору для збільшення числа копій клонованих послідовностей, збільшуючи таким чином рівні експресії. Клони стабільно трансфектованих клітин після цього відсортовують для експресії модифікованого Фактора VII. Оптимальні клітинні лінії ссавців включають лінії клітин COS-1 (АТСС CRL 1650), нирок новонародженого хом'яка (ВНК) та 293 (АТСС CRL 1573: Graham et аl, J.Gen. Vsrol. 36:59-72, 1977). Оптимальною клітинною лінією ВНК є клітинна лінія tk- ts13 ВНК (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110 1962, робота, на яку нами робиться посилання), далі - під назвою клітин ВНК 570. Клітинна лінія ВНК 570 була депонована в Американському зібранні типових культур (American Тип Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., RockviUe, MD 20852), під номером доступу АТСС CRL 10314. Клітинну лінію tk- ts13 ВНК також можна отримати в АТСС під номером доступу CRL 1632. Крім того, можуть використовуватися багато інши х клітинних ліній, включаючи Rat Hep І (Гепатоми щура; АТСС CRL 1600), Rat Hep II (Гепатоми щура; АТСС CRL 1548), ТСМК (АТСС CCL 139), легенів людини (АТСС НВ 8065), NCTC 1469 (АТСС CCL 9.1), СНО (АТСС CCL 61) та клітини DUKX (Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216-4220,1980). Технологія трансгенних тварин може бути застосована для вироблення модифікованого Фактора VII. Перевагу віддають виробленню протеїнів у молочних залозах самиці ссавця. Експресія у молочній залозі та наступне виділення потрібного протеїну у молоко дозволяє подолати багато труднощів, які трапляються при виділенні протеїнів з інших джерел. Молоко легко збирається, воно доступне у великих кількостях і має добрі біохімічні характеристики. Крім того, основні протеїни присутні у молоці у високих концентраціях (як правило, приблизно від 1 до 15г/л). З комерційної точки зору явну перевагу віддають використанню як хазяїв таких видів, які виробляють велику кількість молока. Водночас із використанням дрібних тварин, таких як миші та щури (і їм віддається перевага на принциповій стадії), перевагу віддають використанню домашніх тварин, включаючи, крім інших, свиней, кіз, овець та велику рогату худобу. Особливу перевагу віддають вівцям через такі чинники, як попередня історія трансгенезису цих видів, вироблення молока, низька ціна та доступність обладнання для отримання овечого молока. Див. Публікацію WIPO WO 88/00239 для порівняння чинників, які впливають на вибір видів-хазяїв. Взагалі, бажано вибирати молочні породи тварин-хазяїв, такі як східнофрисляндська вівця, або ж пізніше вводити молочне поголів'я шляхом розведення трансгенних ліній. У будь-якому разі, слід використовува ти тварин з добрим, надійним станом здоров'я. Для досягнення експресії у молочній залозі використовують транскрипційний промотор з гена протеїну молока. Гени протеїну молока включають гени, що кодують казеїни (див. Патент США №5 304 489, на який нами робиться посилання), бета-лактоглобулін, а-лактоальбумін, та кислотний протеїн сироватки. Перевагу віддають промоторові бета-лактоглобуліну (BLG). У випадку з геном овечого бета-лактоглобуліну, як правило, використовують ділянку принаймні з найближчих 406 п. н. 5' фланкуючої послідовності гена, хоча перевагу віддають більшим ділянкам 5' фланкуючої послідовності, приблизно до 5 т. п. н., наприклад, ДНК-сегмент ~4,25 т. п. н., який охоплює 5' фланкуючий промотор та некодуючу ділянку гена бета-лактоглобуліну. Див. Whitelaw et al., Biochem J. 286; 31-39 (1992), Підходящими є також подібні фрагменти промоторної ДНК з інших видів. Інші ділянки гена бета-лактоглобуліну можуть також бути введені у послідовності, як і геномні ділянки гена, що має бути експресований. Взагалі, серед спеціалістів вважається, що послідовності, у яких не вистачає інтронів, наприклад, слабо експресуються порівняно з тими, які містять такі ДНК-послідовності (див. Brinster et al., Proc. Natl. Acad. USA 85: 836-840 (1988); Palmiter et al. Proc Natl. Acad. Sd. USA 88: 478-482 (1991): Whitelaw et al, Трансгенний Res. 1:3-13 (1991); WO 89/01343; та WO 91/02318] на кожну з робіт нами робиться посилання). У цьому зв'язку перевагу там, де це можливо, віддають використанню геномних послідовностей, які містять усі або деякі з природних інтронів гена, що кодує потрібний протеїн або поліпептид, і таким чином, перевагу віддають включенню принаймні деяких інтронів, наприклад, з гена бета-лактоглобуліну. Однією з таких ділянок є сегмент ДНК, який забезпечує сплайсинг інтронів та поліаденілювання РНК з 3' некодуючої ділянки гена бета-лактоглобуліну вівці. Замінений на природні 3' некодуючі послідовності гена, цей сегмент бета-лактоглобуліну вівці може і підвищувати, й стабілізувати рівні експресії потрібного протеїну або поліпептиду. В інших варіантах ділянка, що оточує ATG ініціації послідовності модифікованого Фактора VII, замінюється на відповідні послідовності гена специфічного протеїну молока. Така заміна забезпечує передбачуване середовище для тканинно-специфічної ініціації для посилення експресії. Добре зарекомендувала себе повна заміна модифікованих пре-про- та 5' некодуючих послідовностей Фактора VII послідовності, наприклад, BLG-гена, хоча можуть бути замінені й менші ділянки. Для експресії модифікованого Фактора VII у трансгенних тварин сегмент ДНК, що кодує модифікований Фактор VII, функціонально з'єднується з додатковими сегментами ДНК, необхідними для експресії з метою вироблення експресійних одиниць. Такі додаткові сегменти включають вищезгаданий промотор, а також послідовності, які забезпечують термінацію транскрипції та поліаденілювання мРНК. Експресійні одиниці також включають сегмент ДНК, який кодує секреторну сигнальну послідовність, функціонально з'єднану з сегментом, що кодує модифікований Фактор VII. Секреторною сигнальною послідовністю може бути секреторна сигнальна послідовність природного Фактора VII або може бути послідовність іншого протеїну, такого як протеїн молока. Див., наприклад, von Heinje, Nuc. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); and Meade et al., Патент США №4 73 316, роботи, на які нами робиться посилання. Побудову експресійних одиниць для використання у трансгенних тваринах зручно здійснювати через введення послідовності модифікованого Фактора VII у плазмідний або фаговий вектор, що містить додаткові сегменти ДНК, хоча експресійна одиниця може бути побудована практично будь-якою послідовністю лігувань. Особливу перевагу віддають застосуванню вектора, що містить сегмент ДНК, який кодує протеїн молока, та заміні кодуючої послідовності протеїну молока на послідовність поліпептиду модифікованого Фактора VII, що створює злиття генів, яке включає послідовності, що контролюють експресію гена протеїну молока. У будьякому разі, клонування експресійних одиниць у плазмідах або інших векторах забезпечує ампліфікацію послідовності модифікованого Фактора VII. Ампліфікацію краще здійснювати у бактеріальних (наприклад, Е. соlі) клітинах-хазяях, щоб вектори, таким чином, включали джерело реплікації та селектабельний маркер, що функціонує у бактеріальних клітинах-хазяях. Експресійну одиницю після цього вводять у запліднені яйцеклітини (включаючи ембріони на ранній стадії) вибраних видів-хазяїв. Введення гетерологічної ДНК може здійснюватись одним з кількох шля хів, включаючи мікроін'єкцію (див., наприклад, Патент США №4 873 191), ретровірусну інфекцію (Jaenisch, Science 240: 14681474 (1988)) або сайт-спрямовану інтеграцію з використанням клітин первинної стеблинки зародку (ES) (розглянуто Bradley et al., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)). Після цього яйця імплантують у яйцеводи або матки псевдовагітних самиць і дають розвинутися до кінця. Потомство, що несе введену ДНК у лінії зародкових клітин, може передавати ДНК своєму потомству звичайним способом за Менделем, що забезпечувало розвиток трансгенного стада. Загальні процеси створення трансгенних тварин відомі спеціалістам. Див., наприклад, Hogan et al, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183 (1988): Wall et al, Biol.Reprod 32: 645-651 (1985); Buhler et al. Bio/Technologv 8: 140143 (1990): Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838 (1991): Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844-847 (1991): Wall et al.J. Biochem. 49: 113-120 (1992); Патенти США №№.4 873 191 та 4 873 316; Публікації WIPO WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; та GB 87/00458, роботи, на які нами робиться посилання. Способи введення чужорідних ДНК-послідовностей у ссавців та їхні зародкові клітини спочатку були розроблені на мишах. Див., наприклад, Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7360-7384 (1980); Gordon and Ruddle, Ssence. 214: 1244-1246 (1981); Palmiter and Brinster, CelI 41: 343-345 (1985): Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442 (1985); та Hogan et al. (ibid.). Ці способи були згодом пристосовані для використання з більшими тваринами, включаючи домашні види (див., наприклад, публікації WIPO WO 88/00239, WO 90/05188, та WO 92/11757; та Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183 (1988). Словом, найефективнішим шляхом, який застосовується на даний момент для отримання генерації трансгенних мишей або домашніх тварин, кілька сотень лінійних молекул потрібної ДНК вводять в один з пронуклеусів заплідненої яйцеклітини згідно з прийнятими способами. Може також бути застосоване введення ДНК у цитоплазму зиготи. Може бути застосоване також вироблення у трансгенних рослинах. Експресія може бути як загальною, так і орієнтованою на конкретний орган, такий як бульба. Див. Hiatt, Nature. 344:469-479 (1990); Edelbaum et al., J, Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221 (1990); та Публікацію Європейського патентного бюро ЕР 255 378. Модифікований Фактор VII може бути очищений за допомогою афінної хроматографії на колонці з антитілом антифактора VII. Особливу перевагу віддають використанню залежних від кальцію моноклональних антитіл, як описано у роботах Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097-11108, (1986) та Thim et al., Biochem. 27: 7785-7793, (1988), на які нами робиться посилання. Додаткове очищення може досягатися традиційними засобами хімічного очищення, такими як рідинна хроматографія з високою роздільною здатністю. Спеціалістам відомі й інші способи очищення, включаючи осадження цитратом барію, які можуть бути застосовані для очищення описаного нами нового модифікованого Фактора VII (див. Scopes, R, Protein Purification. Springer-Verlag, N.Y., 1982). Перевагу у фармацевтичному використанні віддають практично чистому модифікованому Факторові VII, що має гомогенність принаймні близько 90-95%, найкраще - 98-99% або більше. Очищений частково або до потрібної гомогенності, модифікований Фактор VII може після цього використовува тися терапевтично. Модифікований Фактор VII розщеплюють у його активаторному сайті для перетворення на його дволанцюгову форму. Активація може бути здійснена згідно з традиційними процедурами, такими як описана у роботах Osterud, et al., Biochemistry 11:2853-2857 (1972): Thomas, Патент США №4 456 591; Hednerand Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983); або Kisiel and Fujikawa, Behring Inst Mitt. 73:29-42 (1983), на які нами робиться посилання. Отриману в результаті молекулу після цього формулюють і вводять, як описано нижче. Композиції Сполуки, як правило, вводять приблизно за 24 години до втручання і на 7 або більше днів після нього. Введення для запобігання або мінімізації ураження міокарду може здійснюватися різними шляхами, які описані нами нижче. Сполуки можуть також бути введені локально у ділянки судин, схильні до утворення тромбів, наприклад, на ділянках анастомозу, або локально у ділянки судин, схильні до зниження прохідності. У профілактиці або лікуванні ураження міокарду доза модифікованого Фактора VII становить приблизно від 50мг до 500мг/день, краще - від 1мг до 200мг/день, найкраще - від 10мг до приблизно 175мг/день на 70кг маси пацієнта як дози насичення та підтримуючі дози, залежно від маси пацієнта та складності його стану. Фармацевтичні композиції для лікування пошкоджень міокарду призначені для парентерального введення для профілактичного та/або терапевтичного лікування. В оптимальному варіанті фармацевтичні композиції вводяться парентерально, тобто внутрішньовенно, підшкірно, або внутрішньом'язово. Композиції для парентерального введення включають розчин молекул модифікованого Фактора VII, розчинених у прийнятному носії, в оптимальному варіанті - водному носії. Можуть використовуватися різні водні носії, наприклад, вода, буферована вода, 0,4% фізіологічний розчин, 0,3% гліцин та ін. Молекули модифікованого Фактора VII також можуть бути формульовані у ліпосомні препарати для подачі або спрямування у пошкоджені ділянки. Ліпосомні препарати в цілому описуються, наприклад, у патентах США №№4 837 028, 4 501 728 та 4 975 282, на які нами робиться посилання. Композиції можуть бути стерилізовані традиційними, добре відомими способами стерилізації. Отримані в результаті водні розчини можуть бути запаковані для використання або відфільтровані в асептичних умовах і ліофілізовані, ліофілізований препарат поєднується зі стерильним водним розчином перед введенням. Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, необхідні для наближення до фізіологічних умов, такі як регулюючі рН та буферні агенти, агенти, що регулюють концентрацію агенти та ін., наприклад, ацетат натрію, лактат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію тощо. Концентрація модифікованого Фактора VII у цих формула х може бути дуже різною, тобто, від кількості менше 0,5%, частіше - не менше приблизно 1%, і до 15 або 20% за масою, і вибирається, насамперед, згідно з об'ємом рідини, в'язкістю та ін. залежно від конкретного вибраного режиму введення. Таким чином, типова фармацевтична композиція для внутрішньовенного введення може містити 250мл стерильного розчину Рингера та 10мг модифікованого Фактора VII. Конкретні способи приготування сполуки для парентерального введення є відомими або очевидними для спеціалістів і описуються більш детально, наприклад, у роботі Remington's Pharmaceutical 29 16th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1982), на яку нами робиться посилання. Композиції, що містять молекули модифікованого Фактора VII, можуть вводитися для профілактичного та/або терапевтичного лікування. При терапевтичному застосуванні композиції вводять пацієнтові, який вже страждає від хвороби, як описано вище, у кількості, достатній для лікування або принаймні часткового стримування хвороби або її ускладнень. Кількість, яка є адекватною для цього, визначається як "терапевтично ефективна доза." Кількості, ефективні для такого використання, залежать від тяжкості хвороби або пошкодження і маси та загального стану пацієнта, але, як правило, становлять приблизно від 0,05мг до приблизно 500мг модифікованого Фактора VII на день на 70кг маси пацієнта, причому найчастіше використовуються дози приблизно від 1,0мг до приблизно 200мг модифікованого Фактора VII на день. Слід пам'ятати, що матеріали згідно з даним винаходом взагалі можуть застосовуватися при серйозних захворюваннях або ураженнях, тобто у ситуаціях, які загрожують життю або містять таку потенційну загрозу. У таких випадках з метою зведення до мінімуму чужорідних речовин та загального браку імуногенності модифікованого Фактора VII людини у людей, є можливим і може бути бажано, щоб лікар вводив значно підвищену кількість цих композицій модифікованого Фактора VII. При профілактичному застосуванні композиції, що містять модифікований Фактор VII вводять пацієнтові, схильному до хвороби або який перебуває під загрозою хвороби або пошкодження, з метою підвищення антикоагуляційної здатності пацієнта. Така кількість визначається як "профілактично ефективна доза." У цьому разі точна кількість знову залежать від стану здоров'я пацієнта та його маси, але, як правило, становить приблизно від 0,05мг до приблизно 500мг на 70кг маси пацієнта, частіше - від приблизно 1,0мг до приблизно 200мг на 70кг маси тіла. Одноразове або багаторазове введення композицій може здійснюватися у дозах та у режимі, визначених лікарем. Для амбулаторних пацієнтів, які потребують щоденних підтримуючих доз, модифікований Фактор VII може вводитися шляхом безперервної інфузії з використанням, наприклад, переносної системи нагнітання. Локальне введення модифікованого Фактора VII, таке, як, наприклад, місцеве застосування модифікованого Фактора VII щодо ділянок судин, схильних до утворення тромбу, (наприклад, ділянок анастомозу) або щодо ділянок судин, схильних до зниження прохідності, може здійснюватися, наприклад, шляхом розпилення, перфузії, за допомогою подвійних катетерів-балонів, стентів, з'єднаних з судинними шунтами або стентами, гідрогелей, використовуваних для покриття катетерів-балонів, або іншими способами, які добре себе зарекомендували. У будь-якому разі, фармацевтичні розробки мають забезпечувати кількість модифікованого Фактора VII згідно з даним винаходом, достатню для ефективного лікування пацієнта. Поданими нижче прикладами винахід лише ілюстр ується, але не обмежується. ПРИКЛАДИ Приклад І Експресія Ser344®Ala344 Фактора VII Для одержання мутанта з активним сайтом Ser344®Ala344 Фактора VII плазміду FVII(565+2463)/pDX (Патент США №4 784 950, на який нами робиться посилання; депонована в Американському зібранні типових культур під номером доступу 40205) розщеплювали за допомогою Хbа І та Крn І і виділяли отриманий в результаті 0,6 т. п. н. фрагмент, що містив кодуючу ділянку для серину 344. Цей фрагмент клонували у Хbа І, розщеплену Крn І М13mр19, як показано на Фігурі. Цю обробку та наступні етапи, описані нижче, в цілому здійснювали згідно зі стандартними протоколами (як описано, наприклад, у роботі Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982), на яку нами робиться посилання). Мутагенез здійснювали на М13 матриці згідно з вищезгаданими способами Цоллера та Сміта (Zroller and Smith), використовуючи мутагенний олігонуклеотид ZC1656 (5' TGG GCC ТСС GGC GTC ССС СТТ 3’) та "універсальний" вторинний праймер ZC87 (5' ТСС CAG TC A CGA CGT 3'). Продукти реакції піддавали скринінгу, використовуючи кіназовану ZC1656. Позитивні бляшки збирали і приготовляли матричну ДНК, секвенували від Pst I-сайту 1077 до Крn І-сайту 1213. Аналіз послідовності підтвердив наявність потрібної мутації. Мутантний клон отримав номер 1656. Після цього будували експресійний вектор, використовуючи клон 1656. Мутагеновану послідовність виділяли з М13 вектору як ~0,14 т. п. н. Pst I-Kpn I-фрагмент. Цей фрагмент приєднували до 1,7 т. п. н. Hind IllXba І-фрагменту з FVII(565+2463)/pDX, до 0,5 т. п. н. Xba I-Pst І-фрагменту з FVII(565+2463)/pDX та 4,3 т. п. н. Крn I-Hind Ill-фрагменту з FVII(565+2463)/pDX, як показано на Фігурі. Присутність потрібної мутантної послідовності була підтверджена розщепленням мутантних та природних клонів за допомогою Pst І та введенням мутантного Фактора VII у Μ13 за допомогою Крn І та Xba І, приготуванням Саузерн-блотів розщепленої ДНК та зондування блотів радіоактивно міченим ZC1656. Клітинну лінію ВНК 570 з нирок новонароджених хом'яків (в Американському зібранні типових культур під номером доступу 10314) трансфікували двома ізолятами (під номерами 544 та 545) 1656-експресійного вектору. Клітини приготовляли шляхом розведення суцільного шару ВНК 570 клітин у 10см чашці у співвідношенні 1:10 у п'ять 10см чашок у неселективному середовищі (Модифіковане Дульбекко середовище Ігла [DMEM], що містить 10% сироватки плоду великої рогатої худоби та 1% PSN антибіотичної суміші [GIBCO Life Technologies, Gaithersburg, MD]). Через 24 години, коли клітини досягали утворення 20-30% суцільного шару, їх заново трансфікували одним з ізолятів експресійного вектору, що кодував мутацію у 1656, плазмідою р486 (яка включає 5 огі Аденовірусу, ен хансер SV40, головний останній промотор Аденовірусу 2, трьохкомпонентну лідерну послідовність Аденовірусу 2, 5' та 3' сайти сплайсингу, кДНК DHFRr та сигнал поліаденілювання SV40 у p ML-1 (Lusky та Botchan, Nature 293: 79-81, (1981)) та 10мг ДНК-носія (ДНК сперми лосося обробляли ультразвуком), як показано в Таблиці 1. Додавали ДНК до 15мл пробірки, тоді додавали 0,5мл 2Х Hepes (25г Hepes, 40г NaCI, 1,8г KCI, 0,75г Na2HPO4´2Η2Ο 5г декстрози розводили до 2,5л дистильованою водою та рН підводили до рН6,95-7,0) та пробірки змішували. ДНК в кожній пробірці осаджували додаванням 0,5мл 0,25Μ СаСІ2, в той час як повітря продували крізь розчин ДНК/Hepes пастеровскою піпеткою. Тоді пробірки перемішували ви хровими рухами, інкубували при кімнатній температурі протягом 15 хвилин і знову перемішували ви хровими рухами. Суміші ДНК потім додавали краплинами піпеткою у чашки з клітинами. Чашки піддавали круговим рухам й інкубували при 37°C протягом 4-6 годин. Після інкубації до кожної чашки додавали 2мл 20% гліцеролу, розведеному в Трис-фізіологічному розчині (0,375г KCI, 0,71г Na2HPO4 8,1г NaCI, 3,0г Трис-НСІ, 0,5г цукрози, розводили в загальному об'ємі 1 літру та рН підводили до рН7,9). Чашки перемішували ви хровими рухами та залишали при кімнатній температурі протягом двох хвилин. Потім середовище видаляли з чашок та замінювали з 2мл Трис-фізіологічного розчину. Чашки залишали при кімнатній температурі протягом 2 хвилин, потім Трис-фізіологічний розчин видаляли і замінювали з 10мл неселективного середовища. Чашки інкубували при 37°С протягом двох днів. Таблиця 1 Транс фекція* 544 Назва плазміди Клон 544 Клон 545 р486 Носій DMA 545 15mml 30мл 1,5мл 1,5мл 1,6мл 1,6мл 544 545 Контроль Контроль 15 мл 1,6мл 30мл 1,6мл * Використані концентрації ДНК складали: клон 544: 0,7мг/мл: клон 545: 0,3мг/мл; р486: 1,49мг/мл. За два дні інкубації клітини розводили в селекційному середовищі (DMEM, що містить 10% діалізованої сироватки плоду великої рогатої худоби, 1% суміш антибіотиків PSN та 150нМ метотрексату) й висаджували при розведеннях 1:100, 1:250 та 1:500 в максимальні чашки. Чашки інкубували при 37°С протягом одного тижня. За тиждень середовище змінювали та замінювали на селекційне середовище і чашки перевіряли на утворення колоній. Вісім днів по тому після утворення колоній дванадцять колоній випадково вибирали з чашок 1:500 розведення №544 та №545 трансфекційних чашок. Кожний клон висаджували в одну лунку 6-лункового планшету й вирощували в селекційному середовищі. За сім днів в лунках утворювався суцільний шар культури та кожний клон розподіляли у 10см чашки в селекційному середовищі. Вищеописані клони та контрольні клітини трансфікували для експресії Фактора VII дикого-типу, метаболічно міченого сумішшю для мічення протеїнів 35S-Метонін-Цистеіном (NEN DuPont Biotechnology Systems, Wilmington, DE). Клони вирощували та готували для експерименту з імпульсної міткою в селективному середовищі. Клітини промивали фізіологічним розчином з фосфатним буфером (Sigma, St. Louis, МО) та мітили протягом чотирьох годин в 20мКи/мл 35S-Метіонін-Цистеїні. За чотири години збирали супернатанти та клітини. Клітини лізували, головним чином, як описано у Lenk та Penman (Cell 16: 289-302, (1979)) і 400мл кожного лізату попередньо очищували 50мл staph A (Sigma, St. Louis, МО). Зразки метаболічно мічених клітин піддавали радіоімунопреципітації (RIP), інкубуючи спочатку зразки з 6мл поліклональної антисироватки до Фактора VII протягом чотирьох годин. До кожного зразка додавали шістдесят мікролітрів промитого протеїну стафілокока і зразки трясли протягом 1,5 години при 4°С. Зразки центрифугували і видаляли супернатант. Осади промивали двічі в 0,7Μ RIPA буфер (10мМ Трис, рН7,4, 1% деоксихолевої кислоти [Calbiochem Corp., La Jolla, CA], 1% Тритон Χ-100, 0,1% ДСН, 5мМ ЕДТА, 0,7 Μ NaCI) та один раз у 0,15Μ RIPA буфері (10мМ Трис, рН7,4, 1% деоксихолевої кислоти [Calbioehem Corp., La Jolla, CA], 1% Тритон X-100, 0,1 ДСН, 5мМ ЕДТА, 0,15Μ NaCI). До кожного зразка додавали 100мкл 1х ДСН барвника (50мМ Трис-НСІ, рН6,8, 100мМ дитіотреітол, 2% ДСН, 0,1% бромфенол синій, 10% гліцерол) і зразки кип'ятили протягом 5 хвилин, після чого центрифугували для видалення протеїну А. П'ятдесят мкл кожного зразка пропускали через 10% поліакриламідний гель. Результати показали, що 9 з 10 клонів секретували модифікований Фактор VII. Приклад ІІ Антикоагулянтна активність модифікованого Фактора VII Здатність протеїну модифікованого Фактора VII інгібувати згортання вимірювали у одноетапному тесті на згортання, використовуючи дикий тип Фактора VII як контроль. Рекомбінантні протеїни приготовляли, головним чином, як описано вище, з клітин, що культивували в середовищі, яке містило 5мг/мл вітаміну К. Різні кількості модифікованого Фактора VII (клон 544) або рекомбінантний дикий тип Фактора VII розводили в 50мМ Трис рН7,5, 0,1% БСА (бичачий сиворотковий альбумін) до 100мл. Суміші інкубували з 100мл плазми, дефіцитної на Фактор VII (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KS), і 200мл тромбопластину С (Dade, Miami, FL; містить тромбопластин мозку кролика та 11,8мМ Са++). Тест на згортання виконували з автоматичним таймером коагуляці (MLA Electra 800, Medical Laboratory Automation Inc., PleasantVllle, NY) і час згортання переводили у одиниці активності Фактора VII, використовуючи стандартну криву, побудовану з від 1:5 до 1:640 розведень зібраної за звичайних умов плазми людини (передбачається вміст однієї одиниці активності Фактора VII на мл; що приготовляли зливанням цитратної сироватки здорових донорів). При використанні цього тесту препарати модифікованого Фактора VII не мали коагулянтної активності, що можна було виявити. Таблиця 2 показує результати тесту в термінах згортання для контрольного (нетрансфікованого) ВНК середовища для клітин (+/- вітамін К), Фактора VII дикого типу та дво х ізолятів клітин, що експресували модифікований Фактор VII. Активність Фактора VII показана як зниження у часі згортання у порівнянні з контрольними зразками. Таблиця 2 Час Роззгортання ведення (сек.) 1:5 33,1 1:10 33,4 1:5 34,3 1:10 33,2 1:20 19,0 1,40 21,5 1:80 23,3 Зразок Контроль +К Контроль -К Дикий-тип Фактор VII Модифікований Фактор VII (№6) Модифікований Фактор VII (№10) 1:1 33,5 1:1 32,5 Для визначення впливу модифікованого Фактора VII на субстрати плазменого фактора препарати модифікованого Фактора VII та рекомбінантного Фактора VII дикого або природнього типу інкубували як з Фактором X або Фактором IX, і їх активацію визначали тестами на згортання або електрофорезом у поліакриламідному гелі. Приклад ІІІ Здатність модифікованого Фактора VII зв'язувати тканинний фактор Здатність модифікованого Фактора VII конкурува ти із Фактором VII дикого типу за тканинний фактор й інгібувати його активність згортати кров перевіряли одноетапним тестом на згортання в присутності обмеженої кількості тканинного фактора (тромбопластину). Час згортання визначали в тому ж одноетапному тесті, що описаний в Прикладі II. В експериментах по змішуванню використовували обмежену кількість тканинного фактора, постійну кількість Фактора VII дикого типу і підвищені кількості модифікованого Фактора VII. Інгібування прокоагулянтної активності Фактора Vll/Vlla було б видно як підвищення в часі згортання в тестах, що містили збільшені кількості модифікованого Фактора VII. Кількість активності Фактора VII в тестови х зразках підраховували як відсоток від стандартної кривої, що показувала активність Фактора VII в зібраній за звичайних умов плазмі. Стандартна крива активності Фактора VII була побудована, використовуючи послідовні розведення зібраної за звичайних умов плазми в фосфа тному буферному розчині (PBS), що змінювались від 1:5 до 1:640. Було припущено, що плазма за звичайних умов містить приблизно 500нг/мл Фактора VII, і це вважали одиницею активності. Для вимірювання часу згортання за допомогою автоматичного таймеру ML A Electra 800 використовували суміш 100мл плазми, дефіцитної на Фактор VII, 100мл розведення плазми та 200мл тромбопластину-С (Dade, Miami, FL.). Для побудови стандартної кривої результати наводили як відсоток активності (1:5=100% активність) від часу згортання в секундах. Тест вимагав, щоб середовище, яке містило дикий тип і модифікований Фактор VII, складалося з менше ніж одного відсотку сироватки. Розведення були зроблені в PBS так, щоб час згортання попадав вздовж стандартної кривої. Мінімальне розведення 1:2 було типовим. Кінцевий об'єм був 100 мл. Два різні модифіковані Фактори VII Ser344®Ala людини, позначені клони "№10" та "№6" тестували в експерименті. Результати, наведені нижче в Таблиці, показують, що як тільки кількість модифікованого Фактора VII підвищувалась, відсоток активності Фактора VІla знижувався. Таблиця 3 Результати тесту на змішування з Ser344 ->Ala Модифіковане (В4А1 (дикий тип) середовище використовували як 100% активність при 10мкл/реакцію) Ser344 ->Ala Клон № №10 №10 №10 №10 №10 №10(-К)§ №6 №6 №6 №6 №6 №6 ВНК контроль ВНКконтроль (-К) Модифіковане середовище кількість 10мкл 20мкл 30мкл 40мкл 50мкл 20мкл 10мкл 20мкл 30мкл 40мкл 50мкл 20мкл 0 0 В4А1 середовище кількість 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл ВНК контроль* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20мкл 20мкл Відсоток FVIIa активності 70 51 43 34 28 78 74 56 46 41 32 85 91 107 *Нетрансфіковане середовище § Для експресії модифікованого Фактора VII клітини вирощували в присутності вітаміну К, за винятком прикладів, позначених "(-К)" Ці експерименти показали, що модифікований Фактор VII, який має Ser344 ® Ala заміщення, конкурував дозозалежним чином з природнім Фактором VII та інгібував прокоагулянтну активність природного Фактора Vll/Vlla. Таким чином, можна зробити висновок, що Ser344®Ala модифікований Фактор VII людини конкурує з природним Фактором VІla людини, і, отже, інгібує активацію ФактораX та/або IX в плазмі людини. Приклад IV Реакція Фактора VII з РРАСК Рекомбінантний Фактор VII одержували з трансфікованих клітин нирок новонароджених хом'яків. Протеїн очищали та активували, як описано у Thim et al. (Biochemistry 27: 7785-7793, 1988), Brinkous et al. (Proc. Natl.Acad Sci. USA 86: 1382-1386, 1989) і Bjoern та Thim fRes. Disci. №269, 564, 1986), на які нами робиться посилання. Виділяли середовище для культивування клітин, фільтрували та розводили, щоб зменшити концентрацію солі. Середовище розводили, потім розподіляли на фракції аніон-обмінною хроматографією, використовуючи буфер для елюції, що містив СаСІ2. Фракцію Фактора VII виділяли та подалі очищали імунохроматографією, використовуючи кальцій-залежне моноклональне антитіло до Фактора VII. Додаткове очищення здійснювали, використовуючи аніон-обмінну хроматографію в два етапи, де Фактор VII елюювали, використовуючи СаСІ2 та NaCI, відповідно. Фактор Vlla виділяли в кінцевому елюаті. Рекомбінантний Фактор Vlla (1мМ) в 50мМ Трис-НСІ, 100мМ NaCI, 5мМ СаСІ2 рН7,4 інкубували з 20мМ РРаск (D-Фенілаланіл-Проліл-Аргініл Хлорметил кетон, Calbiochem, La Jolla, CA) протягом 5, 20 та 60 хвилин. Потім додавали буфер, що містив хромогенний субстрат S2288 (Н-D-ізолейцин-L-Проліл-L-Аргінін пнітроанілід; Kabi Vitrum AB, Moindal, Sweden), для одержання 2,5 разового розведення і кінцевої концентрації 0,3мМ S2288. Утворення п-нітроаніліну вимірювали і порівнювали з результатами, використовуючи чистий Фактор Vlla як контроль. Результати показали, що Фактор Vlla повністю інактивується через приблизно 60 хвилин в ци х реакційних умовах. Приклад V Утворення DEGR-Фактора Vlla Рекомбінантний Фактор Vlla людини готували, як описано в Прикладі IV. Рекомбінантний Фактор Vlla людини, в 10мМ гліциновому буфері, рН8,0, 10мМ СаСІ2) 50мМ NaCI розводили до концентрації 1,5мг/мл. До Фактора Vlla додавали 10 разовий молярний надлишок Дансил-L-Glu-Gly-Arg-Хлорметилкетону, DEGRck, (Caibiochem, La Jolla, CA 92037), який розчиняли дистильованою Н2О. За 2 години інкубації при 37°С другий 10 разовий молярний надлишок DEGRck додавали до суміші та інкубували протягом ще 2 годин при 37°С. Третій 10-разовий молярний надлишок DEGRck додавали до Фактора Vlla й інкубували протягом приблизно 16 годин при 4°С. Зразок DEGR-Фактора Vlla потім екстенсивно діалізували при 4°С проти фізіологічного розчину, що містив буфер Трис (0,05Μ Трис-НСІ, 0,1 Μ NaCI, рН7,5) для видалення будь-якого вільного DEGRck. Суміш кінцевого DEGR-Фактора Vlla тестували на присутність вільного DEGRck в тесті з Фактором Ха як хромогенним субстратом. Суміш DEGR-Фактора Vlla додавали до очищеного Фактора Ха людини разом з хромогенним субстратом S-2222. Цей субстрат розщеплюється специфічно Фактором Ха, але не Фактором Vlla. Незв'язаний DEGRck в суміші здатний зв'язуватись з Фактором Ха та, таким чином, інгібувати хромогенну активність Фактора Ха. Безпіковий DEGR-ck у суміші Фактора Ха утворює стандартну криву для визначення концентрації вільного DEGRck в розчині від інгібування хромогенної активності Фактора Ха. Аналіз суміші DEGR-Фактора Vlla показав, що співвідношення вільного DEGRck:DEGR-Фактора Vlla менше, ніж 0,5% після екстенсивного діалізу, таким чином запевняючи, що інгібування, яке спостерігається за допомогою DEGRФактора Vlla в різноманітних нижчеописаних тестових системах, відбувається не завдяки присутності вільного DEGRck. Приклад VI Утворення Фактора Ха на клітинах гладеньких м'язів щурів Клітини гладеньких м'язів судин аналізували на присутність тканинного фактора на поверхні клітин вимірюванням здатності клітин стимулювати перетворення Фактора X на Фактор Ха, використовуючи хромогенний субстрат, тобто специфічний для Фактора Ха. Клітини гладеньких м'язів судин щурів (Clowes et al., J. Clin. In vest. 93:644-651 (1994)) висаджували у 96лункові планшети для культивування (American Scientific Products, Chicago, II.) у кількості 8000 клітин на лунку в середовищі для вирощування (Таблиця 4). Таблиця 4 500мл Модифіковане Дульбекко середовище Ігла (D MEM) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.) 10% сироватка плоду великої рогатої худоби (H yclon, Logan, UT.) 1мМ піруват натрію (Irvine, Santa Ana, C A.) 0,29мг/мл L-глутамін (Hazelton, Lenexa, KS.) 1´PSN, (100X is 5мг/мл пеніцилін, 5мг/мл стрептоміцин, 10мг/мл неоміцин) (GIBCO-BRL. Gaithersburg, MD.) Після 48 годин інкубації при 37°С середовище замінювали середовищем без сироватки (Таблиця 5). Таблиця 5 250мл Модифіковане Дульбекко середовище Ігла (D MEM) 250мл Середовище Гама (Ham) F-12 (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) 1мМ піруват натрію 0,29мг/мл L-глутамїн 20мМ трансферин (JRH, Lenexa, KS.) 5мМ інсулін (GIBCO-BRL) 16нг селен (Aldrich, Milwaukee, Wl.) 1мг/мл бичачий сироватковий альбумін (Sigma, St. Louis, МО) Клітини інкубували 72 години при 37°С. Після інкубації або PDGF-BB (10нг/мл), або 10% сироватки плоду великої рогатої худоби додавали до клітин, щоб стимулюва ти експресію тканинного фактора (Taubman et al.. J. Clin. Invest. 91:547-552, 1993). Паралельний ряд клітин не отримував ні PDGF, ні сироватки для визначення власної активності нестимульованих клітин. Через 6 годин інкубації рекомбінантний Фактор Vlla людини додавали до клітин при кінцевій концентрації 10нМ. Один ряд клітин не мав Фактора Vlla, що додавали як негативний контроль. Клітини інкубували протягом 2 годин при 37°С та промивали буфером HEPES (10мМ HEPES, 137мМ NaCI, 4мМ КСІ, 5мМ СаСІ2, 11мМ глюкози, 0,1% БСА). Після промивання клітини інкубували протягом 5 хв з 50 мл на лунку 200 нМ очищеного Фактора X плазми людини в фізіологічному розчині, що містив Трис, з 5мМ СаСІ2. До кожної лунки додавали двадцять п'ять мкл 0,5Μ ЕДТА та 25мл 800мМ розчину хромогенного субстрату S-2222 (Kabi Pharmacia, Franklin, ОН). Чашки інкубували протягом 40хв при кімнатній температурі, тоді аналізували при 405нМ, використовуючи мікропланшетний аналізатор THERMOMAX (Molecular Devices, Menio Park, CA). Таблиця 6 показує підвищення поглинання лунок, в які додавали Фактор Vlla порівняно з контрольними лунками (Фактор Vlla не додавали). Підвищення поглинання є прямим вимірюванням концентрації Фактора Ха, що утворився в лунках, із наступним розщепленням хромогенного субстрату, який виділяє хромофор. Дані також показують, що рівень хромогенної активності в клітинах, на які діяли або PDGF-BB, або 10% сироваткою плоду великої рогатої худоби, ви ще, ніж у нестимульованих клітин. Таблиця 6 Тестовий зразок Контроль лише Фактор Vlla +PDGF-BB +10% FCS Оптична густина при 405нм 0,043 0,247 0,360 0,342 Ці результати чітко доводять існування Фактор Vlla-залежної активації Фактора X у Фактор Ха на поверхні клітини гладеньких м'язів судин. Приклад VII Інгібування хромогенної активності DEGR-Фактора Vlla на поверхні клітин Клітини гладеньких м'язів судин щурів висаджували у вищеописані 96-лункові планшети для культивування. Клітини культивували протягом 72 годин в середовищі без сироватки, як описано вище, та додавали 10% сироватку плоду великої рогатої худоби протягом 6 годин, щоб стимулювати експресію тканинного фактора. Після стимуляції до кожної лунки додавали лише буфер (контроль), 10нМ Фактора Vlla або 10нМ Фактора Vlla+100нМ DEGR-Фактора Vlla. Клітини інкубували протягом 2 годин при 37°С, тоді промивали буфером HEPES. Після промивання клітини інкубували протягом 5 хвилин 50мл 200нМ Фактор X на лунку в фізіологічному розчині, що містив Трис, з 5мМ СаСІ2. До кожної лунки додавали двадцять п'ять мкл 0,5Μ ЕДТА і 25мл хромогенного субстрату S-2222 (800мМ) (Kabi Pharmacia). Клітини інкубували при кімнатній температурі протягом 40 хвилин. Хромогенну активність аналізували при 405нМ, як описано вище. Таблиця 7 показує стимуляцію хромогенної активності в лунках з лише Фактором Vlla й інгібування стимуляції, коли DEGR-Фактор Vlla коінкубували з Фактором Vlla. Ці результати показують, що DEGR-Фактор Vlla діє як конкурентний антагоніст для Фактора Vlla, зв'язуючи таким чином та інгібуючи активацію Фактора X у Фактор Ха з наступним розщепленням хромогена S-2222. Таблиця 7 Тестовий зразок Контроль Фактор Vlla Фактор Vlla + DEGR-Фактор Vlla Оптична густина при 405нм 0,035 0,342 0,073 0,073 Приклад VII Дозозалежне інгібування DEGR-Фактором Vlla хромогенної активності на поверхні клітин гладеньких м'язів щурів Клітини гладеньких м'язів судин щурів висаджували у 96-лункові планшети для культивування по 4000 клітин на лунку в середовище для вирощування, що містило 1% сироватку плоду великої рогатої худоби (як в Таблиці 4 без 10% сироватки плоду великої рогатої худоби). За 5 днів середовище видаляли і додавали до клітин або лише підвищені концентрації Фактора Vlla, або 10нМ Фактора Vlla з підвищеними концентраціями DEGR-Фактора Vlla. Клітини інкубували з сумішами Фактора VII протягом 2 годин при 37°C Після інкубації, клітини промивали й інкубували з 50мл 200нМ Фактора X в Трис-фізіологічному розчині протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Кожна лунка містила 25мл 0,5Μ ЕДТА і 25мл 800мМ S-2222 (Kabi Pharmacia), який додавали до кожної лунки, і чашки інкубували протягом 40 хвилин при кімнатній температурі. Хромогенну активність аналізували при 405нМ в мікропланшетному аналізаторі, як описано вище. Таблиця 8 показує дозозалежне підвищення хромогенної активності з підвищенням кількості Фактора Vlla, що додавали до лунок. Коли суміш DEGR-Фактора Vlla з 100нМ Фактора Vlla додавали до клітин (Таблиця 9), відбувалося дозозалежне інгібування хромогенної активності. Молярне співвідношення 1:1 DEGR-Фактора Vlla : Фактора Vlla інгібувало приблизно 95% хромогенної активності. Ці дані свідчать, що в цьому експерименті DEGR-Фактор Vlla має значно вищу спорідненість до тканинного фактора клітинної поверхні, ніж природний Фактор Vlla на поверхні клітин гладеньких м'язів в культурі. Якщо DEGR-Фактор Vlla та Фактор Vlla мали однакову спорідненість щодо зв'язування тканинного фактора, тоді рівень інгібування, що спостерігався, коли дві молекули додавали до клітин в однаковому молярному співвідношенні, не був би таким високим. Таблиця 8 Концентрація Фактора Vlla Оптична густина при (нМ) 405нм 0,10 0,005 0,39 0,025 1,56 0,058 6,25 0,111 25.00 0,154 100,00 0,208 Таблиця 9 показує дозозалежне інгібування DEGR-Фактором Vlla хромогенної активності Фактора Ха на клітинах гладенького м'язу щурів. Підвищені концентрації DEGR-Фактора Vlla коінкубували з 100нМ Фактора Vlla, і хромогенну активність Фактора Ха визначали, використовуючи хромогенний субстрат S-2222. Таблиця 9 Концентрація Фактора Vlla Оптична густина при (нМ) 405 нм 0,10 0,208 0,39 0,176 1,56 0,116 6,25 0,073 25.00 0,026 100,00 0,014 ПРИКЛАД IX Інгібування утворення Фактора Ха DEGR-Фактором Vlla в тесті з розчинним тканинним фактором. Перетворення Фактора X на Фактор Ха, використовуючи очищений рекомбінантний розчинний тканинний фактор, встановлювали з використанням хромогенного тесту. Тканинний фактор експресували та очищали з Saccharomvces cerevisiae (Shigefnatsu et al. J. Biol. Chem. 267:21329-21337, 1992). Розчинний тканинний фактор очищав та характеризував Dr. W. Kisiei (UniversityNew Me xico). Готували реакційну суміш, що містить 65,9 мл розчинного тканинного фактора (2,2мМ), 29,0мл PCPS (1мМ, Sigma, St. Louis, МО), 29,5мл Фактора X людини (4,1мМ), 2,77мл буфера Ганка (Hank) (25мМ Трис, рН7,4, 150мМ NaCI, 2,7мМ KCI, 5мМ CaCI2, 0,1% БСА). До кожної лунки 96-лункової чашки для мікротитрування додавали 40мкл суміші тканинний фактор/Фактор X, 25мл Фактора Vlla, розведеного TBS, і 25мл DEGR-Фактора Vlla, розведеного TBS. Використовували контрольну суміш 40мл тканинного фактора/Фактор X; 25мл Фактора Vlla, розведеного TBS, і 25мл лише TBS. До реакційної суміші в лунках додавали 10мкл хромогенного субстрату S-2222 (4мМ) й інкубували при кімнатній температурі протягом 2-10 хвилин. Результати аналізували при 405нМ в мікропланшетному аналізаторі, як описано вище. Визначення стандартної кривої активації Фактора X Фактором Vlla проводили, використовуючи підви щені концентрації Фактора Vlla, що додавали у відсутності DEGR-Фактора Vlla. Результати, наведені в Таблиці 10, показують, що існує дозозалежне підвищення хромогенної активності з підвищенням кількості Фактора Vlla, що додавали до реакційної суміші. Одночасне додавання різних кількості DEGR-Фактора Vlla та 100нМ Фактора Vlla привело до дозозалежного зниження хромогенної активності (Таблиця 11). Ці дані показують, що DEGRФактор Vlla діє як конкурентний антагоніст природного Фактора Vlla, зв'язуючись з розчинним тканинним фактором, та таким чином інгібує утворення Фактора Ха, що вимірювали зниженням хромогенної активності по відношенню до хромогенного субстрату S-2222. Таблиця 10 Стимуляція хромогенної активності Фактора Ха підвищеними концентраціями Фактора Vlla, що додавали до розчинного тканинного фактора. Зміни в оптичній густині вимірювали, використовуючи хромогенний субстрат S-2222. Концентрація Фактора Оптична густина при 405 Vlla (нМ) нм 0,78 0,168 1,56 0,288 3,12 0,478 6,25 0,694 12,50 0,764 25.00 0,790 50,00 0,738 100,00 0,770 Таблиця 11 Вимірювали інгібування хромогенної активності Фактора Ха додаванням DEGR-Фактора Vlla до розчинного тканинного фактора у присутності природного Фактора Vlla. Зміни оптичної густини вимірювали, використовуючи хромогенний субстрат S-2222. Концентрація Фактора Оптична густина при 405 Vlla (нМ) нм 0 0,810 50 0,750 100 0,609 200 0,296 400 0,167 800 0,083 1600 0,055 Приклад Х Інгібування коагуляції DEGR-Фактором Vlla Стандартні тести на згортання для визначення впливу DEGR-Фактора Vlla на час згортання готували наступним чином: 100 мл плазми бабуїна за нормальних умов, зібраної за допомогою цитрату натрію як антикоагулянту, додавали до 100мл різних концентрацій DEGR-Фактора Vlla, розведеного TBS (20мМ Трис, рН7,4, 150мМ NaCI). Зразки змішували та короткочасно інкубували при 37°С. Зразки додавали до автоматичного таймера коагуляції Electra 800 (Medical Laboratories Automation, PleasantVllle, NY). Після інкубації до препаратів DEGR-Фактора Vlla додавали 200мл препарату тканинного фактора, що містив 25мМ СаСІ2. Препарат тканинного фактора готували як фізіологічний розчин екстракту мозку бабуїна з свіжемороженої тканини мозку та перевіряли його на здатність ініціювати коагуляцію плазми бабуїна. Відбирали концентрацію тканинного фактора, час згортання якого становив приблизно 40 секунд. Дані, наведені в Таблиці 12, показують дозозалежне підвищення часу згортання завдяки додаванню DEGR-Фактора Vlla. Доза 1мг/мл DEGR - Фактора Vlla плазми викликала значне підвищення часу згортання. Таблиця 12 Дозозалежне підвищення часу згортання завдяки DEGR-Фактора Vlla. DEGR-Фактор Vlla (мкг/мл плазми) 0 Час згортання (секунди) 40,7 0,5 1,0 2,5 5,0 10,0 46,2 50,8 64,5 108,1 158,4 Приклад XI Інгібування агрегації тромбоцтів DЕGR-фактор Vlla DEGR-Фактор Vlla аналізували на здатність інгібувати накопичення бляшок на ділянках артеріального тромбозу завдяки механічному пошкодженню у нелюдиноподібних приматів. Модель ендартеректомії аорти використовували у бабуїнів, головним чином як описано Lumsden et al. (Blood 81:1762-1770 (1993)). Видаляли сегмент аорти бабуїну довжиною 1-2см, вивертали та зішкрібали для видалення внутрішньої оболонки артерії та приблизно 50% серединної оболонки. Артерію вивертали знов у первинне положення, вставляли канюлі на обидва кінці і розміщували в екстракорпоральне відведення бабуїна, таким чином подаючи кров у механічно пошкоджену артерію бабуїна через відведення. Відразу ж перед відкриттям відведення до циркулюючої крові, мічені 111Індієм власні тромбоцити вводились тварині внутрішньовенною ін'єкцією. Рівень накопичення бляшок на ділянці пошкодженої артерії визначали в реальному часі зображенням гамма-камери. Оцінку інгібування агрегації тромбоцитів Фактором Vlla проводили, використовуючи болюсні ін'єкції DEGRФактора Vlla або контрольного фізіологічного розчину, що були зроблені відразу перед відкриттям відведення. Пошкоджені артерії вимірювали безперервно протягом 60 хвилин. Доза 0,005 мг/кг DEGR-Фактора Vlla інгібувала агрегацію тромбоцитів. При 1,0 мг/кг болюсної ін'єкції приблизно 90% агрегації тромбоцитів інгібувалося за 1 годину після введення ліків. Ці результати наведені в Фіг. 2. Ці дані показують, що інгібування тканинного фактора DEGR-Фактором Vlla може сильно інгібувати розвиток тромбів, збагачених на тромбоцити, в моделі гострого пошкодження судин у нелюдиноподібних приматів. ПРИКЛАД XII DEGR-FVIIa інгібує рестеноз судин після пластичної хірургії на судинах з використанням балону в атеросклеротичних кроликів Оцінювали здатність DEGR-FVIIa модулюва ти розвиток пошкоджень після пластичної операції на судинах з використанням балону в атеросклеротичних кроликів породи ново-зеландський білий (NZW). Ця тваринна модель була добре описана і виявилась гарною моделлю для оцінки дії антитромбічних сполук на розвиток пошкоджень судин (Gimple et al. Circulation 86:1536-1546 f1992) і Roaosta et al. Circulation 89:1262-1271 (1994)). Тваринну модель використовували для оцінки DEGR-FVIIa, головним чином як описано у Ragosta, ibid. У кроликів викликали анестезію внутрішньом'язовою ін'єкцією 5мг/кг ксилазину та 35мг/кг кетаміну. Проксимальні стегнові артерії розтинали зрізами нижче пахової зв'язки з проксимальними та дистальними лігатурами. У виділені сегменти вводили канюлі голками 27 розміру. Отвір пробивали голкою. Виділені сегменти промивали фізіологічним розчином для очищення від залишків крові та висушували продуванням повітря при швидкості 80мл/хв протягом 8 хвилин. Після висушування повітрям виділені сегменти знову промивали фізіологічним розчином та видаляли лігатури. Гемостаз підтримували неоклюзивним локальним тиском. Сегменти відмежовували металічними затискачами. На локальний спазм діяли локально 1% Ксилокаїном. За день після операції тварини переходили на дієту із 1% холестеролом та 6% арахісної олії протягом місяця перед пластичною операцією на судинах з використанням балону. Давали тіленол 10мг/кг орально для полегшення постопераційного болю протягом 3-5 днів. Амбіпен 1см 3 давали після хірургічної процедури протягом від 3 до 5 постопераційних днів. Тест на поширення ліків для тварин складався з першопочаткової болюсної ін'єкції безпосередньо перед пластичною операцією на судинах з використанням балону та потім безперервного систематичного промивання осмотичним насосом через внутрішню яремну вену. Термін промивання складав 3 дні. Контрольні тварини перед пластичною операцією на судинах з використанням балону отримували гепарин, 150 одиниць/кг IV болюсу, після чого промивали фізіологічним розчином. Тварини, на які діяли DEGR-FVIIa, отримували 1мг/кг болюсної ін'єкції, після чого промивали 50мг/кг/годину. Для розміщення осмотичних насосів для безперервного систематичного промивання викликали анестезію у тварини, як описано вище, і підтримували протягом процедури додатковими 1М ін'єкціями кетаміну та Ксилазину. Через серединний розріз шиї виділяли праву вн утрішню яремну вену гр убим розрізом та перев'язували дистальний кінець. Вводили силастичну пробірку (РЕ-160) у праву внутрішню яремну вену. Створювали підшкірний тунель для проходження силастичної пробірки. Цю пробірку зв'язували з осмотичним насосом. Осмотичний насос імплантували підшкірно в спину кроля. Виділяли праву звичайну сонну артерію грубим розрізом іперев'язували дистальний кінець. За допомогою скальпеля 5F пристрій вводу розміщували та просували до сполучення дуги аорти. Кров витягували протягом визначення гемостатичних параметрів, кількості ліків та холестеролу. Двадцять мг ксилокаїну вводились ін'єкцією внутрішньоартеріально. Контрольну аорто-стегнову ангіограму знімали через катетер 5F Berman, розміщений вище біфуркації аорти, використовуючи 3-4мл ренографіну, що вводився ін'єкцією протягом 3 секунд вручн у. Після видалення катетера Berman, 355,6мкм дріт вводили в низхідну аорту та розміщували ви ще біфуркації аорти. Із флюороскопічним проводом вводили приблизно підігнаний катетер для пластичної операції на судинах з використанням балону від 2,0 до 2,5мм, просували над дротом та розміщували крізь звуження. Балон накачували до 6 атмосфер протягом 60 секунд ручним насосом. Три накачування виконували з 60 секундними інтервалами між накачуваннями. Цю процедуру виконували в обох стегнових артеріях кожної тварини. Після розширення балону катетер для пластичної операції на судинах виймали та катетер Berman знову вводили у положення на 3см вище біфуркації аорти. Для зменшення спазму давали 20мг лідокаїну внутрішньоартеріально. Ангіограму після процедури знімали, як описано вище. Для підрахування справжнього діаметру 1см решітку розміщували на рівні стегнової артерії. Потім видаляли катетер. Праву сонну артерію перев'язували шовковою ниткою розміром 3-0 і рану зашивали пошарово. Амбіпен та ацетамінофен давали, як згадано вище. Час перетворення протромбіну та концентрацію DEGR-FVIIa в крові визначали при миттєвій преболюсній ін'єкції тестової сполуки, за 1 годину після болюсної ін'єкції й на 3 день наприкінці безперервного промивання. Одержували один або два мл цитратної плазми, визначали час перетворення протромбіну й кількість антигена. Стандартний тест на згортання використовували для визначення часу перетворення протромбіну в контролі та тваринах, які отримували DEGR-FVlia, таким чином. Двадцять п'ять мкл плазми тестових кролів, яку збирали з цитратом натрію як антикоагулянтом, додавали до 150мл TBS (20мМ Трис, рН7,4, 150мМ NaCI), зразки змішували і додавали до автоматичного таймеру коагуляції Electra 800 (Medical Laboratories Automation, PleasantVllle, NY). Після інкубації до препарату плазми додавали 200 мл препарату тромбопластину (Sigma Chemical), що містить 25мМ СаСІ2. Відбирали концентрацію тромбопластину, при якій час згортання становив приблизно 20 секунд в контрольній плазмі кроля. Тест ELISA (ферментативний імуносорбентний тест) використовували для визначення концентрації DEGR-FVlla в плазмі зразків контролю та кроликів, які отримували DEGR-FVlla, Тест включав перше розведення антитіла до моноклонального антитіла людини FVIIа (Dr. W. Kisiel, U.New Mexico) до 2,0мг/мл у 0,1Μ карбонатному буфері рН9,6 і додавання 100мл/лунку до 96-лункових планшетів. Потім планшети інкубували при 4°С протягом доби та згодом промивали дві години, використовуючи буфер для промивання (PBS, рН7,4, з 0,05% Tween 20). Блокування неспецифічних сайтів зв'язування досягали додаванням 200 мл блокуючого буферу на лунку (PBS, рН7,4, з 0,05% Tween 20 та 1% БСА), інкубували при 37°С протягом 2 годин, після чого промивали, використовуючи буфер для промивання. Після блокування додавали серії стандартних розведень DEGR-FVlla від 20-0,027 нг/мл разом з серіями розведень плазми тестових кролів (1:100 до 1:4000 у буфері для блокування) об'ємом 100мл/лунку. Неімунну плазму кроля використовували як негативний контроль. Чашки потім інкубували протягом 1 години при 37°С, після чого чотири рази промивали буфером для промивання. DEGR-FVlla виявляли додаванням 100 мл/лунку 1:1000 розведення антитіл кроля до моноклонального антитіла людини FVII (Dr. Kisiel, U. New Mexico) в буфері для блокування. Чашки інкубували протягом 1 години при 37°С, після чого п'ять разів промивали буфером для промивання. Специфічне зв'язування антитіла виявляли, використовуючи 100 мл/лунку 1:2000 розведення антитіл козла до кон'югату IgG антитіла кроля з пероксидазою (Tago, Inc.). Планшети інкубували протягом 1 години при 37°С й промивали шість годин буфером для промивання. Зрештою додавали 100мл розчину субстрату (0,42мг/мл о-фенілендіамін дигідрохлорид [OPD] в 0,2 Μ цитратному буфері, рН5.0, з 0,3%Н2О2). Після 1-3хв при кімнатній температурі кольорову реакцію зупиняли додаванням 100мл/лунку 1N H2SO 4 і планшети аналізували при 490нм на Мікропланшетному спектрофотометрі. Концентрацію DEGR-FVlla в плазмі зразків визначали порівнянням невідомих значень зі значеннями стандартної кривої DEGR-FVlla. Аналіз зразків плазми на час перетворення протромбіну і кількість антигена DEGR-FVlla наведено в Таблиці 13 та Таблиці 14, відповідно. Дані наведені по кожній окремій тварині. Таблиця 15 показує суму середнього часу згортання. В усіх випадках тварини, які отримували DEGR-FVlla, мали підвищений час перетворення протромбіну за 1 годину після введення болюсної ін'єкції, який повернувся до приблизно тих значень, що були до лікування за 3 дні. Аналіз кількості DEGR-FVlla антигена також показав високу кількість DEGR-FVlla в плазмі за 1 годину, що становила від 2-6мг/мл в плазмі, з набагато меншою кількістю за 3 дні. Кількості DEGR-FVlla вимірювали за 1 годину відповідно до передбачуваного підвищення часу перетворення протромбіну, який визначали додаванням нормальної плазми кроля до DEGR-FVlla in vitro, й визначенням часу перетворення протромбіну в тесті зі стандартними розведеннями тромбопластину. Таблиця 13 Вимірювання часу перетворення протромбіну Номер тварини 73 74 75 76 169 170 173 174 77 78 80 96 97 171 172 Ν/Α= Немає даних Лікування Контроль Контроль Контроль Контроль Контроль Контроль Контроль Контроль DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa Час згортання (секунди) Попереднє лікування 1 година 24,8 22,3 24,8 27,9 24,6 не визначено 22 не визначено 21,2 22,9 24,9 23,5 25,9 21 25 29,4 22,5 40,1 24,3 34 24,7 50 Ν/Α Ν/Α 23,6 33,3 20,6 45,8 23,5 41,6 3 дні 17,8 18,61 20,5 17,9 22 18,6 20,8 20,1 18,3 20,9 21,7 21 21,2 21,9 22,4 Таблиця 14 ELISA для виявлення PEGR-FVIIa в плазмі кролів Номер тварини 73 74 75 76 169 170 173 174 77 78 80 96 97 171 172 Лікування Контроль Контроль Контроль Контроль Контроль Контроль Контроль Контроль DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa DEGR-FVIIa Попереднє лікування 0 36 0 0 0 0 36 87 0 1 13 65 4 13 9 FVII ELISA (нг/мл) 1 година 13 14 Ν/Α Ν/Α 0 0 31 86 3,210 4,950 4,543 4,900 4,600 2,145 2,830 3 дні 0 4 9 14 1 0 0 160 102 7 661 117 502 212 228 Ν/Α= Немає даних Таблиця 15 Статистичне резюме часу згортання плазми Непарний t-Тест Χ Ступінь свободи 12 Група Підрахунок Контроль DEGR-Vlla Непарний t-Тест Χ Ступінь свободи 10 Група: 8 6 Підрахунок Контроль DEGR-Vlla Непарний t-Тест Χ Ступінь свободи 13 6 6 Група Підрахунок Контроль DEGR-Vlla 8 7 Непарне t-значення 1,12 Середнє Середньоквадратичне значення відхилення 24,15 1,64 23,2 1,48 Непарне t-значення -5,44 Середнє Середньоквадратичне значення відхилення 24,5 3,35 40,8 6,53 Непарне t-значення -2,04 Середнє Середньоквадратичне значення відхилення 19,54 1,53 21,06 1,53 PRE-BLEED Вірогідність. (2-tail): 0,2852 Середньоквадратична похибка 0,58 0,60 1 Нг POST ANGIO Вірогідність. (2-tail): 0,0003 Середньоквадратична похибка 1,37 2,67 3 Days POST ANGIO Вірогідність. (2-tail): 0,0622 Середньоквадратична похибка 0,54 0,50 За три тижні після пластичної операції на судинах ангіограму повторювали, як описано вище, через ліву сонну артерію безпосередньо перед забиттям. Через вертикальний нижній абдомінальний розріз виділяли дистальну аорту, проксимально перев'язували і вставляли канюлю для промивання вище біфуркації аорти. Дистальну аорту промивали 50л фізіологічного розчину, після чого фіксували in vi vo 500мл розчину Histochoice (AMRESCO, Solon, OH) вливанням протягом 15 хвилин під тиском 120мм ртутного стовпчика. Як тільки промивання починалось, тваринам надавали надвелику дозу нембуталу (3мл фенобарбіталу натрію IV, 65мг/мл). Вирізали білатеріально 5см сегменту стегнової артерії. Тканину зберігали в розчині Histochoice для світлової мікроскопії. Для визначення розвитку пошкоджень внутрішнього шару на ділянці, де проводили пластичну операцію на судинах з використанням балону, вирізані стегнові артерії різали на послідовні 3мм сегменти, занурювали в парафін, та нарізували зрізи з багаточисельних ділянок кожної артерії. Зрізи закріплювали на покривні скельця та скельця фарбували гематоксиліном, еозином та барвниками Van Giemson. Морфометричний аналіз виконували за допомогою Bioquant Program для одержання вимірів площі просвіту внутрішньої та середньої оболонки судин. Морфометричний аналіз зрізів тканин із пошкоджених артерій проводили, вимірюючи загальну площу просвіту; площу вн утрішньої оболонки судин визначали вимірюванням площі всередині внутрішнього еластичного шару, віднімаючи відповідну площу просвіту з кожного зрізу тканини; та площу середнього шару, яку визначали вимірюванням площі всередині зовнішнього еластичного шару, віднімаючи площу всередині внутрішнього еластичного шару. Вимірювання пошкоджень внутрішньої оболонки судин у стегновій артерії в контролі та у тварин, які отримували DEGR-FVIIa, показало, що існує значне зниження розміру внутрішньої оболонки судин у тварин, які отримували DEGR-FVIIa (Таблиця 16). Вимірювання середньої площі не показали значної різниці між двома групами. Таблиця 16 Вимірювання внутрішньої оболонки судин та середньої оболонки судин у кроликів, на яких проводилипластичну операцію на судинах з використанням балону Група Контроль DEGR-FVIIa Група Контроль DEGR-FVlia № Внутрішня оболонка судин (мм 2) Середньоквадратичне відхилення Вірогідність (2-tail) 13 0,819 0,414 0,0138 10 0,438 0,192 N Середня оболонка судин (мм 2) Середиьоквад ратичне відхилення Вірогідність (2-tail) 13 0,389 0,098 0,172 10 0,329 0,105 Дані ангіографічних вимірювань наведені в Таблиці 17 як середнє значення діаметру протоки (MLD) +/середньоквадратичне відхилення контролю та DEGR-FVIIa у тварин, які отримували його, протягом всіх трьох термінів; безпосередньо перед пластичною операцією на судинах, відразу після пластичної операції на судинах й за 21 день після пластичної операції на судинах. Не виявили значної різниці в MLD між контролем та тваринами, які отримували DEGR-FVIIa, при вимірюванні перед або відразу після пластичної операції на судинах. Значне підвищення в MLD спостерігали, однак, у тварин, які отримували DEGR-FVIIa, при вимірюванні за 21 день після пластичної операції на судинах. Таблиця 17 Вимірювання мінімального діаметру просвіту судини (MLD) Група Контроль DEGR-FVIIa N 13 10 Група Контроль DEGR-FVlia № 13 10 Група Контроль DEGR-FVUa № 13 10 Вимірювання MLD перед РТСА Середнє значення MLD Середньоквад ратичне відхилення 1,202 0,24 1,283 0,19 Вимірювання MLD після РТСА Середнє значення MLD Середньоквад ратичне відхилення 1,492 0,551 1,323 0,725 Вимірювання MLD за 21 день Середнє значення MLD Середньоквад ратичне відхилення 0,889 0,228 1,393 0,242 Вірогідність (2-tail) 0,3883 Вірогідність (2-tail) 0,5326 Вірогідність (2-tail) 0,0001 ПРИКЛАД XIII Інгібування DEGR-FVIIa утворення Факторз Ха на поверхні клітин Проводили хромогенний тест на поверхні клітин, головним чином як описано вище у Прикладі VIII, для вимірювання ефективності DEGR-FVIIa блокува ти FVIIa, зв'язуючись з тканинним фактором на поверхні клітин, та наступним перетворенням Фактора X на Фактор Ха на моношарі клітин гладенького м'язу бабуїна (SMCs). Цей спосіб є модифікацією тих, що описані Sakai et aL J. BiQ. Ghem. 264:9980-9988 (1989) та Wildgoose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:7290-7294 (1990). SMCs бабуїна одержували з Вашингтонського університету, Сієтл, штат Вашингтон, та культивували з експлантантів аорти. SMC бабуїна висаджували у 96лункові планшети для культивування при концентрації 8000 клітин/лунку в 200мл/лунку середовища для культивування DMEM, що містило 10% сироватку плоду великої рогатої худоби, і утримували в цьому середовищі протягом 4 днів при 37°С в 5% СО2. Під час тесту видаляли 110мл Середовища для культивування і додавали до лунок підвищені концентрації FVIIa або FVIIa разом з DEGR-FVIIa. Будували стандартну криву концентрації FVIIa від 5нМ до 0,04нМ. Для вимірювання інгібіторної активності DEGR-FVIIa щодо активності FVIIa, підви щені концентрації DEGR-FVIIa додавали до тестови х лунок у присутності постійної кількості FVIIa (5нМ). Як FVIIa, так і DEGR-FVIIa розводили буфером HEPES (10 мМ HEPES, 137мМ NaCI, 4мМ КСІ, 5мМ СаСІ2, 11 мМ глюкоза, 0,1% БСА) і до клітин додавали 10мл 10х маточних розчинів. Клітини інкубували з тестовими сполуками протягом 2 годин при 37°С. Потім промивали 3 години буфером HEPES. Потім додавали до кожної лунки п'ятдесят мкл 200 нМ розчину Фактора X в Трис-буфері (25мМ Трис, рН7,4, 150мМ NaCI, 2,7мМ КСІ, 5мМ СаСІ2, 0,1% БСА). За 4 хвилини при кімнатній температурі додавали 25мл 0,5Μ ЕДТА для зупинення перетворення Фактора X у Ха. Додавали двадцять п'ять мкл на лунку 0,8мМ S-2222 Фактор Ха-специфічного хромогенного субстрату в Трис буфері й аналізували поглинання при 405нМ за 60 хвилин в мікропланшетному аналізаторі Thermomax (Molecular Devices Corp., Menio Park, CA). Результати, наведені в Фіг.3, показують дозозалежне підвищення в амідолітичній активності для лунок, на які діяли FVIIa (білі квадрати). Підвищення поглинання є прямим вимірюванням Фактора Ха, що утворився в лунках, й наступного розщеплення хромогенного субстрату. Додавання підвищеної кількості DEGR-FVIIa з постійною кількістю FVIIa (5н М) показало дозозалежне зниження в амідолітичний активності з підвищеними кількостями DEGR-FVIIa (чорні квадрати). Рівне молярне співвідношення DEGR-FVIIa до FVIIa здатне інгібувати >90% хромогенної активності. Навіть при 10-разовому зменшенні кількості DEGR-FVIIa відбувається 40% інгібування хромогенної активності Фактора Ха. Ці результати підтверджують висновок, що DEGR-FVIIa є надзвичайно потенційним антагоністом активації Фактора X у Ха за допомогою FVIIa на поверхні інтактних клітинних моношарів SMC. Приклад XIV Вплив DEGR-Фактора Vlla на утворення тромбозу судин та утворення пошкоджень судин у бабуїнів DEGR-Фактор Vlla людини тестували на здатність інгібувати тканинний фактор (TF) та опосередковане активованим Фактором VII (FVIIa) утворення пошкоджень судин (VLF), що викликаються механічним пошкодженням судин у нелюдиноподібних приматів. Починаючи відразу перед створенням механічних пошкоджень судин у бабуїнів, DEGR-Фактор Vlla вводили внутрішньовенно протягом 7 днів (5 тварин) або 30 днів (1 тварина). Вимірювання утворення пошкодження судин виконували на 30 день. Результати 5 тварин, на які діяли DEGR-Фактором Vlla, порівнювали з одночасними результатами 5 контрольних тварин, яким вводили буфер. Вимірювання основних показників тварин проводили за: а) підрахунком тромбоцитів, нейтрофілів, моноцитів та еритроцитів; б) кількістю фібриногену плазми; в) рівнем активності факторів коагуляції плазми VII, Vlla, X та V, також як і кількістю антигена FVII; та г) основною кількістю антитіл зразків плазми до Фактора Vlla. При анестезії галотаном та стерильних операційних умовах, тварини, мічені власними тромбоцитами, що містили 111Індій, отримували внутрішньовенні промивання DEGR-FVIIa, використовуючи прикріплену систему для безперервного внутрішньовенного введення (першопочаткова болюсна ін'єкція 1мг/кг, після якої проводили безперервне внутрішньовенне промивання 50мг/кг/годину). Тваринам проводили хірургічну ендартеректомію сонних артерій, пластичну хір ургію бронхових артерій або стегнових артерій з використанням балонного катетера Фогарті (Fogarty). DEGR-FVIIa вводили протягом від 7 або 30 днів безперервними промиваннями через венозний катетер, використовуючи прикріплену систему. За тридцять днів після операції тварин піддавали анестезії галотаном та in situ промиванням під тиском з фіксацією протягом 30хв 4% параформальдегідом, що містить 0,1% глутарового альдегіду. Водночас сегменти судин (що містять попередньо пошкоджені місця) збирали, використовуючи способи по Harker et al., Circulation 83:41-44 (1991) та Hanson et al., Hypertension 18:1170-1176 (1991). Потім зразки фіксували in vitro (4% параформальдегідом, що містить 0,1% глутаровий альдегід), заморожували та обробляли під час аналізу ступеня морфометричних пошкоджень. Вивчали одинадцять нормальних статевозрілих бабуїнів (Paio anubis). Шість тварин отримували промивання DEGR-FVIIa (50мг/кг/годину) та ті п'ять, що залишились, були контрольними тваринами, що не отримували DEGR-FVIIa. Тварин виліковували від паразитів кишково-шлункового тракту та проводили обстеження на будь-які хвороби протягом трьох місяців перед використанням. Всі процедури схвалені Інститутом догляду за тваринами та комітетом з їх використання і відповідають процедурам та способам, зазначеним у провідних принципах NIH для догляду та використання лабораторних тварин, також як і діяльністю, спрямованою на добробут тварин, й подібними інституційними закладами. Процедури вторгнення виконувались при анестезії галотаном після індукції кетаміном (10мг/кг внутрішньом'язово) та валіумом (0,5мг/кг внутрішньовенно). Для наступної короткотривалої іммобілізації при виконанні експериментальних процедур після операції використовували гідрохлорид кетаміну (5-20мг/кг внутрішньом'язово). Ендартеректомію сонної артерії виконували через серединний розріз шиї, використовуючи спосіб по Hanson et al., Mypsriensioo 18:1170-1-176 (1991) та Krupski et al., Circulation 84:1749-1757 (1991), на який нами робиться посилання. Ендартеректомію використовували як модель пошкодження судин завдяки її клінічній доречності та тому, що було показано, що VLF, яка викликається ендартеректомією нормальних артерій, здатна відтворюватись. Кількома словами, звичайна сонна артерія, відділена від оточуючи х тканин від ключиці проксимально до біфуркації сонної артерії. Звичайну сонну артерію затискували, використовуючи травматичні затискувачі для судин, розміщені на кожному кінці відрізаної судини, за три хвилини після болюсної ін'єкції сульфату гепарину (100U/кг внутрішньовенно: Elkins-Simm Inc., Cherry Hill, NJ), й розрізали 1см проксимально до дистального стискача. Проксимальний сегмент артерії тоді вивертали навиворіт через зігнутий пінцет. Після того, як одержували максимальне вивертання, пару ниток для накладання швів, зміцнених поліпропіленом (розмір 7-0), розміщували на кожному боці проксимально та другу пару розміщували дистально у сегменті з відкритим просвітом. Потім виконували ендартеректомію, починаючи з 1см від розділеного вивернутого сегменту судини, і продовжували протягом 1см вимірюваної відстані. Ці процедури створювали механічне видалення нормальної внутрішньої оболонки судин та частково товщини серединної оболонки, використовуючи пінцет та хірургічний мікроскоп (збільшення у 32 рази). Після ендартерєктомії судину повертали до ЇЇ нормального положення і кінець кінцем анастомоз виконували поліпропіленовими нитками розміру 7-0 для накладання швів безперервно під 2,5-разовим збільшенням і зашивали рану пошарово. Для морфометричного аналізу VLF зрізи занурювали у парафін та фарбували компоненти сполучної тканини (колаген, еластін), і за допомогою гематоксиліну-еозину оцінювали, використовуючи Zeiss Photoscope, з'єднаний з системою аналізу зображення (Thomas Optical Measurement Systems, Columbus, GA), що складається з CCD фотокамери-мікроскопу високої роздільної здатності (580 lines), з'єднаної з монітором високої роздільної здатності (700 lines), комп'ютером з чіпом IBM 386, 80 MB з високою роздільною здатністю цифрової графіки для створення зображення та зберігання. Кількісний аналіз зображення виконували, використовуючи морфометричний програмний драйвер (Optimas, Bioscan, Inc., Edmonds, WA). Поперечні зрізи артерії аналізували за відношенням загальної площі проліферативних пошкоджень нового внутрішнього шару та відповідної площі серединного шару. Для статистичного аналізу робили порівняння між групами, використовуючи t-критерій Стьюдента (2-tailed) для парних та непарних даних. Результати показали, що площа внутрішнього шару значно знижена у тварин, які отримували DEGRФактор Vlla протягом семи днів та вивчались на 30 день порівняно з контрольними тваринами, які мали ті ж пошкодження судин, але не отримували DEGR-Фактора Vlla (Фіг.4). Однакові результати спостерігали у тварин, які отримували DEGR-Фактор Vlla протягом 30 днів, та перевірялися на 30 день. Попередні дослідження моделі ангіографії плечової артерії з використанням балону свідчили про відсутність істотної користі терапії DEGR-Фактора Vlla. Ця модель, проте, не створювалась у бабуїнів як протромбічна модель, в який тканинний фактор грає ключову роль. Дослідження пошкоджень стегнової артерії з використанням балону у бабуїнів не виявили статистично значної користі DEGR-Фактора Vlla порівняно з контролем, як показано на Фіг.5. Приклад XV Вплив DEGR-Фактора Vlla на викликаний tPA тромболіз Утворення тромбів коронарнарних судин під час гострого інфаркту міокарду насамперед опосередковується тканинним фактором (TF) в комплексі з Фактором Vlla через зовнішній шлях коагуляції. Визначали вплив додаткового каскаду інгібування коагуляції на різних етапах зовнішнього шляху на ефективність активатора тканинного плазміногена (ТРА) при тромболізі. Тридцяти шести собакам з електрично викликаним коронарним тромбом, підданим тромболізу tPA (1мг/кг за 20хв), надавали від 1 до 4 додаткових лікувань: 9 отримували антикоагулянтні пептиди кліща (ТАР), селективний інгібітор Фактора Ха при 30мг/кг/хвилину протягом 90 хвилин. Комплекс TF-Фактора Vlla інгібували інгібітором шляху рекомбінантного тканинного фактора (TFPI) (100-150мг/кг/хв протягом 90 хвилин) у 9 собак та DEGR Vlla (1-2мг/кг болюс), як конкурентним антагоністом активованого Фактора Vlla у 9 собак. Дев'ять собак отримували фізіологічний розчин як контроль. Собак обстежували протягом 120 хвилин після тромболізу на повторну непрохідність. Вплив цих агентів на ефективність тромболізу наведено нижче в Таблиці 18 (дані як середнє значення ±SD). 7 Таблиця 18 Фізіо- DEGRлогічний FVIIa TFPI розчин Час до повторної течії (хв) Тривалість повторної течії (хв) Зміни циклічного току повторна непрохідність ТАР 32±13 20±7* 21±6* 18±10* 62±45 70±48 91±35* 120 70% 89% 56% 0% 70% 78% 67% 0% * Значення, що відрізняються від контрольного фізіологічного розчину на рівні 0,05 значення. Ці дані показують, що зовнішній шлях інгібування або Фактором Ха, або блокадою TF-Фактора Vlla DEGF Vlla або TFPI, прискорюють tPA-викликаний тромболіз. Селективне інгібування Фактора Ха більш ефективно підтримувало розширений стан артерії після вдалої реперфузії. Приклад XVI Модифікований Фактор Vlla інгібує внутрішньосудинне утворення тромбу, не впливаючи на системну коагуляцію Для визначення того, чи є наслідком інгібування зв'язування Фактора VII з TF антитромбічні ефекти, зміни циклічного потоку (CFVs) завдяки зворотному утворенню тромбу були викликані розміщенням зовнішнього звужувача навколо пошкодженого ендотелію сонних артерій кроля (модель Фотса (Fotts)}. Потік крові сонної артерії вимірювали безперервно зондом Доплера (Doppler) для вимірювання потоку, який розміщували проксимально до звужувача. Після розташування звужувача навколо артерії, CFVs розвивалися з середнім значенням частоти 11±2 циклів/годину у 66 кроликів, де швидкість потоку крові сонної артерії в середньому становила 5±2% базових значень при найнижчому CFVs. Після того, як CFVs спостерігали протягом 30хв, тварини отримували промивання рекомбінантним Фактором Vlla (FVllai) людини з блокованим активним сайтом (Phe-Phe-Arg хлорметилкетон) (0,1мг/кг/хв протягом 10хв). Фактор Vllai повністю зупинив CFVs у 66 тварини (CFV частота=0 циклів/годину: р