Є ще 83 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб продукування поліпептиду у культурі клітин при великомасштабному виробництві, що включає кроки:

            забезпечення культури клітин, що включає:

            клітини ссавця, які містять ген, що кодує потрібний поліпептид, де ген експресується в умовах культивування клітини; та

            середовище, що містить глутамін, у якому сукупна кількість амінокислот на одиницю об'єму більша ніж приблизно 70 мМ, та молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2, і має характеристику середовища, вибрану з групи, що включає i) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості амінокислот становить менше ніж приблизно 0,2; ii) молярне співвідношення сукупної кількості неорганічних іонів до сукупної кількості амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; iii) об’єднана сукупна кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 16 мМ, та їх комбінацій;

            підтримання культури в початковій фазі росту при першому наборі умов культивування упродовж першого проміжку часу, достатнього для надання можливості вказаним клітинам репродукуватися до щільності життєздатних клітин в межах діапазону приблизно 20 %-80 % від максимальної можливої щільності життєздатних клітин, якщо вказана культура підтримувалась при першому наборі умов культивування;

            зміну принаймні однієї з умов культивування таким чином, щоб застосувати другий набір умов культивування;

            підтримання вказаної культури упродовж другого проміжку часу при другому наборі умов і упродовж другого проміжку часу таким чином, що поліпептид накопичується в клітинній культурі.

2. Спосіб продукування поліпептиду у культурі клітин при великомасштабному виробництві, що включає кроки:

            забезпечення культури клітин, що включає;

            клітини ссавця, які містять ген, що кодує потрібний поліпептид, де ген експресується в умовах культивування клітини; і

            середовище, що містить глутамін, у якому сукупна кількість амінокислот на одиницю об'єму більша ніж приблизно 70 мМ, та молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; і

            вказане середовище, має дві характеристики середовища, вибрані з групи, що включає i) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості амінокислот становить менше ніж приблизно 0,2; іі) молярне співвідношення сукупної кількості неорганічних іонів до сукупної кількості амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; ііі) об’єднана сукупна кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 16 мМ, та їх комбінацій;

            підтримання вказаної культури в початковій фазі росту при першому наборі умов культивування упродовж першого проміжку часу, достатнього для надання можливості вказаним клітинам репродукуватися до щільності життєздатних клітин в межах діапазону приблизно 20 %-80 % від максимальної можливої щільності життєздатних клітин, якщо вказана культура підтримувалась при першому наборі умов культивування;

            зміну принаймні однієї з умов культивування таким чином, щоб застосувати другий набір умов культивування;

            підтримання вказаної культури упродовж другого проміжку часу при другому наборі умов і упродовж другого проміжку часу таким чином, що поліпептид накопичується в клітинній культурі.

3. Спосіб за п. 1, в якому вказана умова культивування клітини у вказаній зміні принаймні одного кроку умов культивування вибирається із групи, що складається із: (i) температури, (ii) pН, (iii) осмоляльності, (iv) рівня хімічних індуктантів та їх комбінацій.

4. Спосіб за п. 1, у якому початкова концентрація глутаміну вказаного середовища становить менше ніж або дорівнює 10 мМ.

5. Спосіб за п. 1, у якому початкова концентрація глутаміну вказаного середовища становить менше ніж або дорівнює 4 мМ.

6. Спосіб за п. 1, у якому сумарна сукупна кількість глутаміну на одиницю об'єму вказаного середовища становить менше ніж або дорівнює 10 мМ.

7. Спосіб за п. 1, у якому сумарна сукупна кількість глутаміну на одиницю об'єму вказаного середовища становить менше ніж або дорівнює 4 мМ.

8. Спосіб за п. 1, у якому глутамін забезпечується тільки в початковому середовищі на початку культивування клітини.

9. Спосіб за п. 1, у якому початкова щільність вказаних клітин ссавців становить принаймні 2x105 клітин/мл.

10. Спосіб за п. 1, у якому початкова щільність вказаних клітин ссавців становить принаймні 2x106 клітин/мл.

11. Спосіб за п. 1, у якому крок забезпечення включає забезпечення принаймні приблизно 1000 л культури.

12. Спосіб за п. 1, у якому крок забезпечення включає забезпечення принаймні приблизно 10000 л культури.

13. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший набір умов включає перший температурний діапазон, що становить приблизно 30 - 42 градусів Цельсія.

14. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший набір умов включає перший температурний діапазон, що становить приблизно 37 градусів Цельсія.

15. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір умов включає другий температурний діапазон, що становить приблизно 25 - 41 градус Цельсія.

16. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір умов включає другий температурний діапазон, що становить приблизно 29 - 35 градусів Цельсія.

17. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір умов включає другий температурний діапазон, що становить приблизно 31 градусів Цельсія.

18. Спосіб за п. 1, що додатково включає другий крок змін слідом за першою вказаною зміною принаймні однієї з умов культивування, що включає зміну принаймні однієї з умов культивування таким чином, що застосувують третій набір умов до культури.

19. Спосіб за п. 18, у якому другий крок змін включає зміну принаймні однієї умови культивування, вибраної із групи, що складається із: (i) температури, (ii) pН, (iii) осмоляльності, (iv) рівня хімічних індуктантів та їх комбінацій.

20. Спосіб за п. 18, у якому вказаний третій набір умов включає третій температурний діапазон, що становить приблизно 27 - 37 градусів Цельсія.

21. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший проміжок часу становить від 1 до 7 днів.

22. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший проміжок часу становить приблизно 4 дні.

23. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший проміжок часу й вказаний другий проміжок часу сумарно становлять принаймні 5 днів.

24. Спосіб за п. 1, у якому в кроці підтримання вказаної культури упродовж другого проміжку часу, рівень лактату зменшується після того, як рівень лактату у культурі, досягає максимального рівня.

25. Спосіб за п. 1, у якому в кроці підтримання вказаної культури упродовж другого проміжку часу, рівень амонію зменшується після того, як рівень амонію в культурі, досягає максимального рівня.

26. Спосіб за п. 1, у якому вказана сумарна кількість вказаного виробленого поліпептиду є принаймні у 1,5 рази вищою ніж кількість поліпептиду, виробленого за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, у якому відсутні вказані характеристики середовища.

27. Спосіб за п. 1, у якому вказана сумарна кількість вказаного виробленого поліпептиду є принаймні у 2 рази вищою ніж кількість поліпептиду, виробленого за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, у якому відсутні вказані характеристики середовища.

28. Спосіб за п. 1, у якому вказана культура клітин забезпечується додатковими компонентами.

29. Спосіб за п. 28, у якому вказані додаткові компоненти постачаються при множинних інтервалах.

30. Спосіб за п. 28, у якому вказані додаткові компоненти вибирають із групи, що складається з гормонів і/або інших факторів росту, певних іонів (таких як натрію, хлориду, кальцію, магнію і фосфату), буферів, вітамінів, нуклеозидів або нуклеотидів, мікроелементів (неорганічних сполук, що зазвичай присутні у дуже низьких кінцевих концентраціях), амінокислот, ліпідів або глюкози чи інших джерел енергії.

31. Спосіб за п. 1, у якому середовище, включає глутамінвмісне середовище, у якому початкова концентрація амінокислот більша ніж приблизно 70 мМ, та молярне співвідношення початкової кількості глутаміну до початкової кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; та має характеристику середовища, вибрану з групи, що включає i) молярне співвідношення початкової кількості глутаміну до загальної початкової кількості амінокислот становить менше ніж приблизно 0,2; iі) молярне співвідношення початкової кількості неорганічних іонів до загальної початкової кількості амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; та ііі) об'єднана початкова концентрація глутаміну й початкова концентрація аспарагіну становить більше ніж приблизно 16 мМ; та їх комбінацій.

32. Спосіб за будь-яким з пп. 1-31, у якому поліпептид являє собою анти-GDF-8 або анти-LewY.

33. Спосіб за будь-яким із пп.1-2 або 31, у якому:

            рівні лактату є нижчими ніж ті рівні, що спостерігаються за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища;

            рівні амонію є нижчими ніж ті рівні, що спостерігаються за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища; і

            сукупна кількість виробленого поліпептиду є принаймні настільки ж високою, як та, що спостерігається за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища.

34. Спосіб за п. 33, у якому поліпептид являє собою анти-GDF-8 або анти-LewY.

35. Спосіб за п. 1, у якому вказана культура не забезпечена додатковими компонентами протягом продукування вказаного поліпептиду.

36. Спосіб за п. 1, у якому гліцилглутамін заміняється на глутамін у вказаній культурі.

37. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість гістидину, ізолейцину, лейцину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, триптофану та тирозину на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 25 мМ.

38. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість гістидину, ізолейцину, лейцину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, триптофану та тирозину на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 35 мМ.

39. Спосіб за п. 1, у якому вказане середовище має характеристику середовища, вибрану із групи, що складається з наступних характеристик:

            (i) сукупна загальна кількість гістидину на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 1,7 мМ;

            (ii) сукупна загальна кількість ізолейцину на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 3,5 мМ;

            (iii) сукупна загальна кількість лейцину на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 5,5 мМ;

            (iv) сукупна загальна кількість метіоніну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 2,0 мМ;

            (v) сукупна загальна кількість фенілаланіну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 2,5 мМ;

            (vi) сукупна загальна кількість проліну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 2,5 мМ;

            (vii) сукупна загальна кількість триптофану на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 1,0 мМ; та

            (viii) сукупна загальна кількість тирозину на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 2,0 мМ.

40. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість серину на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 10 мМ.

41. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість аспарагіну на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 8 мМ.

42. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість аспарагіну на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 12 мМ.

43. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість фосфору на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 5 мМ.

44. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість глутамату на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить менше ніж приблизно 1 мМ.

45. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість кальцію пантотенату на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 20 мг/л.

46. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість нікотинаміду на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 25 мг/л.

47. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість піридоксину й піридоксалю на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 35 мг/л.

48. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість рибофлавіну на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 2,0 мг/л.

49. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість тіаміну гідрохлориду на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 35 мг/л.

50. Спосіб продукування поліпептиду у культурі клітин при великомасштабному виробництві, що включає кроки:

            забезпечення культури клітин, що включає;

            клітини ссавця, які містять ген, що кодує потрібний поліпептид, де ген експресується за умов культивування клітини; і

            визначене середовище, що містить глутамін, у якому початкова кількість амінокислот більша ніж приблизно 70 мМ; та молярне співвідношення загальної кількості глутаміну до аспарагіну становить менше ніж приблизно 2, та має принаймні дві характеристики середовища, вибрані з групи, що включає i) молярне співвідношення загальної кількості глутаміну до загальної кількості амінокислот становить менше ніж приблизно 0,2; ii) молярне співвідношення загальної кількості неорганічних іонів до загальної кількості амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; ііі) об'єднана загальна кількость глутаміну й аспарагіну на одиницю об’єму становить більше ніж приблизно 16 мМ;

            підтримання вказаної культури в початковій фазі росту при першому наборі умов культивування упродовж першого проміжку часу, достатнього для надання можливості вказаним клітинам репродукуватися до щільності життєздатних клітин в межах діапазону приблизно 20 % - 80 % від максимально можливої щільності життєздатних клітин, якщо вказана культура підтримувалась при першому наборі умов культивування;

            зміну принаймні однієї з умов культивування таким чином, щоб застосувати другий набір умов культивування;

            підтримання вказаної культури упродовж другого проміжку часу при другому наборі умов і упродовж другого проміжку часу таким чином, що поліпептид накопичується в культурі клітин.

51. Спосіб за п. 50, у якому:

            рівні лактату є нижчими ніж ті рівні, що спостерігаються за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища;

            рівні амонію є нижчими ніж ті рівні, що спостерігаються за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища; і

            сукупна кількість виробленого поліпептиду є принаймні настільки ж високою, як та, що спостерігається за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища.

52. Спосіб за п. 50 або п. 51, у якому поліпептид являє собою анти-GDF-8 або анти-LewY.

Текст

1. Спосіб продукування поліпептиду у культурі клітин при великомасштабному виробництві, що включає кроки: забезпечення культури клітин, що включає: клітини ссавця, які містять ген, що кодує потрібний поліпептид, де ген експресується в умовах культивування клітини; та середовище, що містить глутамін, у якому сукупна кількість амінокислот на одиницю об'єму більша ніж приблизно 70 мМ, та молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2, і має характеристику середовища, вибрану з групи, що включає i) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості амінокислот становить менше ніж приблизно 0,2; ii) молярне співвідношення сукупної кількості неорганічних іонів до сукупної кількості амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; iii) об’єднана сукупна кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 16 мМ, та їх комбінацій; 2 (19) 1 3 якщо вказана культура підтримувалась при першому наборі умов культивування; зміну принаймні однієї з умов культивування таким чином, щоб застосувати другий набір умов культивування; підтримання вказаної культури упродовж другого проміжку часу при другому наборі умов і упродовж другого проміжку часу таким чином, що поліпептид накопичується в клітинній культурі. 3. Спосіб за п. 1, в якому вказана умова культивування клітини у вказаній зміні принаймні одного кроку умов культивування вибирається із групи, що складається із: (i) температури, (ii) pН, (iii) осмоляльності, (iv) рівня хімічних індуктантів та їх комбінацій. 4. Спосіб за п. 1, у якому початкова концентрація глутаміну вказаного середовища становить менше ніж або дорівнює 10 мМ. 5. Спосіб за п. 1, у якому початкова концентрація глутаміну вказаного середовища становить менше ніж або дорівнює 4 мМ. 6. Спосіб за п. 1, у якому сумарна сукупна кількість глутаміну на одиницю об'єму вказаного середовища становить менше ніж або дорівнює 10 мМ. 7. Спосіб за п. 1, у якому сумарна сукупна кількість глутаміну на одиницю об'єму вказаного середовища становить менше ніж або дорівнює 4 мМ. 8. Спосіб за п. 1, у якому глутамін забезпечується тільки в початковому середовищі на початку культивування клітини. 9. Спосіб за п. 1, у якому початкова щільність вказаних клітин ссавців становить принаймні 2x105 клітин/мл. 10. Спосіб за п. 1, у якому початкова щільність вказаних клітин ссавців становить принаймні 2x106 клітин/мл. 11. Спосіб за п. 1, у якому крок забезпечення включає забезпечення принаймні приблизно 1000л культури. 12. Спосіб за п. 1, у якому крок забезпечення включає забезпечення принаймні приблизно 10000л культури. 13. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший набір умов включає перший температурний діапазон, що становить приблизно 30 - 42 градусів Цельсія. 14. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший набір умов включає перший температурний діапазон, що становить приблизно 37 градусів Цельсія. 15. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір умов включає другий температурний діапазон, що становить приблизно 25 - 41 градус Цельсія. 16. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір умов включає другий температурний діапазон, що становить приблизно 29 - 35 градусів Цельсія. 17. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір умов включає другий температурний діапазон, що становить приблизно 31 градус Цельсія. 18. Спосіб за п. 1, що додатково включає другий крок змін слідом за першою вказаною зміною принаймні однієї з умов культивування, що включає зміну принаймні однієї з умов культивування таким чином, що застосовують третій набір умов до культури. 19. Спосіб за п. 18, у якому другий крок змін включає зміну принаймні однієї умови культивування, 93859 4 вибраної із групи, що складається із: (i) температури, (ii) pН, (iii) осмоляльності, (iv) рівня хімічних індуктантів та їх комбінацій. 20. Спосіб за п. 18, у якому вказаний третій набір умов включає третій температурний діапазон, що становить приблизно 27 - 37 градусів Цельсія. 21. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший проміжок часу становить від 1 до 7 днів. 22. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший проміжок часу становить приблизно 4 дні. 23. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший проміжок часу й вказаний другий проміжок часу сумарно становлять принаймні 5 днів. 24. Спосіб за п. 1, у якому в кроці підтримання вказаної культури упродовж другого проміжку часу, рівень лактату зменшується після того, як рівень лактату у культурі, досягає максимального рівня. 25. Спосіб за п. 1, у якому в кроці підтримання вказаної культури упродовж другого проміжку часу, рівень амонію зменшується після того, як рівень амонію в культурі, досягає максимального рівня. 26. Спосіб за п. 1, у якому вказана сумарна кількість вказаного виробленого поліпептиду є принаймні у 1,5 рази вищою ніж кількість поліпептиду, виробленого за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, у якому відсутні вказані характеристики середовища. 27. Спосіб за п. 1, у якому вказана сумарна кількість вказаного виробленого поліпептиду є принаймні у 2 рази вищою ніж кількість поліпептиду, виробленого за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, у якому відсутні вказані характеристики середовища. 28. Спосіб за п. 1, у якому вказана культура клітин забезпечується додатковими компонентами. 29. Спосіб за п. 28, у якому вказані додаткові компоненти постачаються при множинних інтервалах. 30. Спосіб за п. 28, у якому вказані додаткові компоненти вибирають із групи, що складається з гормонів і/або інших факторів росту, певних іонів (таких як натрію, хлориду, кальцію, магнію і фосфату), буферів, вітамінів, нуклеозидів або нуклеотидів, мікроелементів (неорганічних сполук, що зазвичай присутні у дуже низьких кінцевих концентраціях), амінокислот, ліпідів або глюкози чи інших джерел енергії. 31. Спосіб за п. 1, у якому середовище, включає глутамінвмісне середовище, у якому початкова концентрація амінокислот більша ніж приблизно 70 мМ, та молярне співвідношення початкової кількості глутаміну до початкової кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; та має характеристику середовища, вибрану з групи, що включає i) молярне співвідношення початкової кількості глутаміну до загальної початкової кількості амінокислот становить менше ніж приблизно 0,2; iі) молярне співвідношення початкової кількості неорганічних іонів до загальної початкової кількості амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; та ііі) об'єднана початкова концентрація глутаміну й початкова концентрація аспарагіну становить більше ніж приблизно 16 мМ; та їх комбінацій. 32. Спосіб за будь-яким з пп. 1-31, у якому поліпептид являє собою анти-GDF-8 або анти-LewY. 33. Спосіб за будь-яким із пп.1-2 або 31, у якому: 5 рівні лактату є нижчими ніж ті рівні, що спостерігаються за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища; рівні амонію є нижчими ніж ті рівні, що спостерігаються за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища; і сукупна кількість виробленого поліпептиду є принаймні настільки ж високою, як та, що спостерігається за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища. 34. Спосіб за п. 33, у якому поліпептид являє собою анти-GDF-8 або анти-LewY. 35. Спосіб за п. 1, у якому вказана культура не забезпечена додатковими компонентами протягом продукування вказаного поліпептиду. 36. Спосіб за п. 1, у якому гліцилглутамін заміняється на глутамін у вказаній культурі. 37. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість гістидину, ізолейцину, лейцину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, триптофану та тирозину на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 25 мМ. 38. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість гістидину, ізолейцину, лейцину, метіоніну, фенілаланіну, проліну, триптофану та тирозину на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 35 мМ. 39. Спосіб за п. 1, у якому вказане середовище має характеристику середовища, вибрану із групи, що складається з наступних характеристик: (i) сукупна загальна кількість гістидину на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 1,7 мМ; (ii) сукупна загальна кількість ізолейцину на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 3,5мМ; (iii) сукупна загальна кількість лейцину на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 5,5 мМ; (iv) сукупна загальна кількість метіоніну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 2,0 мМ; (v) сукупна загальна кількість фенілаланіну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 2,5 мМ; (vi) сукупна загальна кількість проліну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 2,5 мМ; (vii) сукупна загальна кількість триптофану на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 1,0мМ; та (viii) сукупна загальна кількість тирозину на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 2,0 мМ. 40. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість серину на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 10 мМ. 41. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість аспарагіну на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 8 мМ. 42. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість аспарагіну на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 12мМ. 43. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість фосфору на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 5 мМ. 93859 6 44. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість глутамату на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить менше ніж приблизно 1 мМ. 45. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість кальцію пантотенату на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 20 мг/л. 46. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість нікотинаміду на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 25мг/л. 47. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість піридоксину й піридоксалю на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 35 мг/л. 48. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість рибофлавіну на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 2,0мг/л. 49. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількість тіаміну гідрохлориду на одиницю об'єму у вказаному середовищі становить більше ніж приблизно 35 мг/л. 50. Спосіб продукування поліпептиду у культурі клітин при великомасштабному виробництві, що включає кроки: забезпечення культури клітин, що включає; клітини ссавця, які містять ген, що кодує потрібний поліпептид, де ген експресується за умов культивування клітини; і визначене середовище, що містить глутамін, у якому початкова кількість амінокислот більша ніж приблизно 70 мМ; та молярне співвідношення загальної кількості глутаміну до аспарагіну становить менше ніж приблизно 2, та має принаймні дві характеристики середовища, вибрані з групи, що включає i) молярне співвідношення загальної кількості глутаміну до загальної кількості амінокислот становить менше ніж приблизно 0,2; ii) молярне співвідношення загальної кількості неорганічних іонів до загальної кількості амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; ііі) об'єднана загальна кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об’єму становить більше ніж приблизно 16 мМ; підтримання вказаної культури в початковій фазі росту при першому наборі умов культивування упродовж першого проміжку часу, достатнього для надання можливості вказаним клітинам репродукуватися до щільності життєздатних клітин в межах діапазону приблизно 20 % - 80 % від максимально можливої щільності життєздатних клітин, якщо вказана культура підтримувалась при першому наборі умов культивування; зміну принаймні однієї з умов культивування таким чином, щоб застосувати другий набір умов культивування; підтримання вказаної культури упродовж другого проміжку часу при другому наборі умов і упродовж другого проміжку часу таким чином, що поліпептид накопичується в культурі клітин. 51. Спосіб за п. 50, у якому: рівні лактату є нижчими ніж ті рівні, що спостерігаються за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища; 7 93859 8 рівні амонію є нижчими ніж ті рівні, що спостерігаються за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища; і сукупна кількість виробленого поліпептиду є принаймні настільки ж високою, як та, що спостеріга ється за інших ідентичних умов в іншому ідентичному середовищі, що не має вказаної характеристики середовища. 52. Спосіб за п. 50 або п. 51, у якому поліпептид являє собою анти-GDF-8 або анти-LewY. Ця заявка заявляє пріоритет Патентних заявок США № 60/605 097, 60/604 941, і 60/605 074, всі з яких були подані 27 серпня 2004 року. Зміст кожної з цих заявок включено ангорами шляхом посилання у повному обсязі. Білки й поліпептиди набувають все більшого й більшого значення у якості терапевтичних засобів. У більшості випадків, терапевтичні білки й поліпептиди отримують в клітинній культурі, із клітин, які були створені й/або відібрані з метою продукування незвично високих рівнів певного білка або поліпептиду, що розглядається. Контроль і оптимізація умов клітинної культури є критично важливими для успішного комерційного виробництва білків і поліпептидів. Багато білків і поліпептидів, отриманих у клітинній культурі, продукуються в серійному або підживлювальному процесі, при якому клітини культивують упродовж певного періоду часу, а потім культуру завершують, й отриманий білок або поліпептид виділяють. На остаточну кількість і якість виробленого білка або поліпептиду можуть істотно впливати умови клітинної культури. Наприклад, традиційні процеси серійної й підживлювальної культури часто призводять до продукування відходів метаболізму, які негативно впливають на ріст, життєздатність клітин і виробництво або стабільність білка чи поліпептиду, що розглядається. У той час як було докладено зусиль для поліпшення виробництва білків і поліпептидів у процесах серійної й підживлювальної культури, залишається потреба в додаткових удосконаленнях. Крім того, значне зусилля було зроблене для розробки визначених середовищ (тобто, середовищ, зібраних із відомих індивідуальних компонентів, що не містять сироватки або інших побічних продуктів тваринного походження) для використання при культивуванні клітин, особливо клітин ссавців. Особливості росту клітини можуть бути зовсім різними у визначених середовищах на відміну від середовищ, отриманих із сироватки. Існує певна потреба в розробці удосконалених систем для продукування білків й поліпептидів за допомогою клітинної культури у визначених середовищах. Короткий опис винаходу Даний винахід пропонує удосконалену систему для великомасштабного виробництва білків і/або поліпептидів у клітинній культурі. Наприклад, даний винахід пропонує комерційні масштабні (наприклад, 500 л або більше) способи культивування, які використовують середовище, що характеризується однією або кількома нижчезазначеними особливостями: і) сукупна кількість амінокислот на одиницю об'єму більша ніж приблизно 70 мМ; іі) молярне співвідношення сукупної кілько сті глутаміну до сукупної кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості амінокислот в цілому становить менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідношення сукупної кількості неорганічних іонів до сукупної кількості амінокислот в цілому становить приблизно від 0,4 до 1; або ν) об'єднана сукупна кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 16 мМ. Звичайний спеціаліст у даній галузі зрозуміє, що термін "сукупний", який використовується вище, стосується сумарної кількості певного компоненту або компонентів, доданих упродовж клітинної культури, включаючи компоненти, що додаються на початку культури й компоненти, що додаються згодом. У певних варіантах втілення винаходу, яким надається перевага, бажано мінімізувати "підживлення" культури протягом довгого часу, таким чином, бажано максимально збільшити кількості, присутні спочатку. Звичайно, протягом культури компоненти середовища метаболізуються і, таким чином, культури з тими ж самими сукупними кількостями даних компонентів матимуть різні абсолютні рівні, якщо ці компоненти додаються в різний час (наприклад, всі присутні спочатку у порівнянні з деякими, що додаються шляхом підживлення). Відповідно до даного винаходу, використання такого середовища надає можливість отримувати високі рівні продукування білка й зменшує накопичення певних небажаних факторів, таких як амоній і/або лактат. Звичайний спеціаліст у даній галузі зрозуміє, що композиції середовищ відповідно до даного винаходу охоплюють визначені й невизначені середовища. У певних варіантах втілення даного винаходу, яким надається перевага, культуральне середовище - це визначене середовище, в якому склад середовища відомий й контролюється. У певних варіантах втілення даного винаходу, яким надається перевага, до способів культивування належать зміна культивування від першого набору умов культивування до другого набору умов культивування у такий спосіб, щоб досягнути метаболічного зсуву для клітин. У деяких варіантах втілення ця зміна виконується, коли культура досягла приблизно 20-80% її максимальної щільності клітин. У деяких варіантах втілення зміна включає зміну температури (або температурного діапазону), при якій підтримується культура. Альтернативно або додатково, даний винахід пропонує способи, пристосовані таким чином, щоб після досягнення піку, рівні лактату і/або амонію в культурі зменшувалися з часом. В інших варіантах втілення зміна включає зсув рН, осмолярності або 9 рівня хімічних індуктантів, таких як алканові кислоти або їх солі. До клітинних культур відповідно до даного винаходу можуть довільно додаватись поживні речовини й/або інші компоненти середовища, включаючи гормони й/або інші фактори росту, певні іони (такі як натрію, хлориду, кальцію, магнію і фосфату), буфери, вітаміни, нуклеозиди або нуклеотиди, мікроелементи (неорганічні сполуки, що зазвичай присутні у дуже низьких кінцевих концентраціях), амінокислоти, ліпіди або глюкозу чи інше джерело енергії. У певних варіантах втілення даного винаходу може бути вигідним доповнювати середовища хімічними індуктантами, такими як гексаметилен-біс(ацетамід) ("НМВА") і натрію бутират ("NaB"). Ці довільні добавки можуть додаватись на початку культивування або можуть додаватись в більш пізній період з метою поповнення вичерпаних поживних речовин або з іншої причини. Зазвичай, відповідно до даного винаходу бажано обирати початковий склад середовища таким чином, щоб мінімізувати підживлення. Відповідно до даного винаходу може проводитися моніторинг різних умов культивування, включаючи рН, щільність клітин, життєздатність клітин, рівні лактату, рівні амонію, осмолярність або титр поліпептиду чи білка, що експресується. Короткий опис фігур Фігура 1 показує порівняння Середовища 1 1 і Середовища 2 у колбах для струшування з використанням клітин анти-GDF-8. Фігура 2 показує ріст й життєздатність клітин анти-GDF-8 у Середовищі 1. Фігура 3 показує ріст клітин клітинних культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах культивування без підживлення глутаміном. Фігура 4 показує життєздатність клітин клітинних культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах культивування без підживлення глутаміном. Фігура 5 показує рівні амонію клітинних культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах культивування без підживлення глутаміном. Фігура 6 показує рівні лактату клітинних культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах культивування без підживлення глутаміном. Фігура 7 показує титр анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах культивування без підживлення глутаміном. Фігура 8 показує щільність клітин клітинних культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах підживлюваної культури з низьким рівнем глутаміну. Фігура 9 показує життєздатність клітин клітинних культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах підживлюваної культури з низьким рівнем глутаміну. Фігура 10 показує рівні амонію клітинних культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах підживлюваної культури з низьким рівнем глутаміну. Фігура 11 показує рівні лактату клітинних культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах підживлюваної культури з низьким рівнем глутаміну. 93859 10 Фігура 12 показує титр анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах підживлюваної культури з низьким рівнем глутаміну. Фігура 13 показує відповідь на дози заліза клітин анти-GDF-8 у Середовищі 1 і Середовищі 2. Фігура 14 показує щільність клітин культур з підживленням глутаматом і глутаміном. Фігура 15 показує життєздатність клітин культур з підживленням глутаматом і глутаміном. Фігура 16 показує титр анти-Льюїс Υ у культурах з підживленням глутаматом і глутаміном. Фігура 17 показує рівні лактату у культурах з підживленням глутаматом і глутаміном. Фігура 18 показує рівні амонію у культурах з підживленням глутаматом і глутаміном. Фігура 19 показує осмолярність культур з підживленням глутаматом і глутаміном. Фігура 20 показує щільність клітин анти-Льюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб для струшування, вирощених з використанням тих самих умов. Фігура 21 показує життєздатність клітин антиЛьюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб для струшування, вирощених з використанням тих самих умов. Фігура 22 показує середній титр культури антиЛьюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб для струшування, вирощених з використанням тих самих умов. Фігура 23 показує рівні амонію клітин антиЛьюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб для струшування, вирощених з використанням тих самих умов. Фігура 24 показує лопастний пристрій, що використовується у серійно-підживлюваних культурах. Фігура 25 показує ріст клітин анти-GDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 26 показує життєздатність клітин антиGDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 27 показує титр анти-GDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 28 показує рівні лактату культур антиGDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 29 показує рівні амонію культур антиGDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 30 показує ріст клітин анти-GDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 31 показує титр анти-GDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 32 показує рівні лактату культур антиGDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 33 показує рівні амонію культур антиGDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 34 показує ріст клітин анти-GDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що містить різні рівні глутаміну й аспарагіну. Фігура 35 показує життєздатність клітин антиGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що містить різні рівні глутаміну й аспарагіну. Фігура 36 показує рівні лактату культур антиGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що мстить різні рівні глутаміну й аспарагіну. 11 Фігура 37 показує рівні амонію культур антиGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що містить різні рівні глутаміну й аспарагіну. Фгура 38 показує рівні глутаміну культур антиGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що містить різні рівні глутаміну й аспарагіну. Фігура 39 показує титр анти-GDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що містить різні рівні глутаміну й аспарагіну. Фігура 40 показує осмолярність культур антиGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що містить різні рівні глутаміну й аспарагіну. Фігура 41 показує ріст клітин анти-GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспарагіну й цистеїну. Фігура 42 показує рівні лактату культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспарагіну й цистеїну. Фігура 43 показує рівні амонію культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспарагіну й цистеїну. Фігура 44 показує рівні глутаміну культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспарагіну й цистеїну. Фігура 45 показує рівні глутамату культур анти-GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспарагіну й цистеїну. Фігура 46 показує титр анти-GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспарагіну й цистеїну. Фігура 47 показує осмолярність культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспарагіну й цистеїну. Фігура 48 показує ріст клітин анти-GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні амінокислот і вітамінів. Фігура 49 показує рівні лактату культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні амінокислот і вітамінів. Фігура 50 показує рівні амонію культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні амінокислот і вітамінів. Фігура 51 показує рівні глутаміну культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні амінокислот і вітамінів. Фігура 52 показує титр анти-GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні амінокислот і вітамінів. Фігура 53 показує ріст клітин анти-GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні вітамінів, мікроелементів Ε і заліза. Фігура 54 показує рівні лактату культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні вітамінів, мікроелементів Ε і заліза. Фігура 55 показує рівні амонію культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні вітамінів, мікроелементів Ε і заліза. Фігура 56 показує титр анти-GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні вітамінів, мікроелементів Ε і заліза. Фігура 57 показує ріст клітин анти-GDF-8 у Середовищах 1, 3 і 9. Фігура 58 показує титр анти-GDF-8 у Середовищах 1, 3 і 9. 93859 12 Фігура 59 показує екстрапольовані титри антиGDF-8 для різних рівнів глутаміну окремо й сумарного об'єднаного глутаміну й аспарагіну. Фігура 60 показує ріст клітин анти-АБета за різних умов середовищ, що випробовуються. Фігура 61 показує життєздатність клітин антиАБета за різних умов середовищ, що випробовуються. Фігура 62 показує рівні лактату культур антиАБета за різних умов середовищ, що випробовуються. Фігура 63 показує рівні амонію культур антиАБета за різних умов середовищ, що випробовуються. Фігура 64 показує титр анти-АБета за різних умов середовищ, що випробовуються. Фігура 65 показує осмолярність культур антиАБета за різних умов середовищ, що випробовуються. Фігура 66 показує ріст клітин, що експресують TNFR-Ig за різних експериментальних умов. Фігура 67 показує життєздатність клітин, що експресують TNFR-Ig за різних експериментальних умов. Фігура 68 показує залишкову глюкозу в культурах клітин, що експресують TNFR-Ig за різних експериментальних умов. Фігура 69 показує рівні глутаміну в культурах клітин, що експресують TNFR-Ig за різних експериментальних умов. Фігура 70 показує концентрацію лактату в культурах клітин, що експресують TNFR-Ig за різних експериментальних умов. Фігура 71 показує рівні амонію в культурах клітин, що експресують TNFR-Ig за різних експериментальних умов. Фігура 72 показує відносний титр TNFR-Ig за різних експериментальних умов. Фігура 73 показує щільності клітин анти-GDF-8, вирощених в 6000 л і 1 л біореакторах. Фігура 74 показує титри анти-GDF-8 клітин, вирощених в 6000 л і 1 л біореакторах. Фігура 75 показує рівні лактату клітин антиGDF-8, вирощених в 6000 л і 1 л біореакторах. Фігура 76 показує рівні амонію клітин антиGDF-8, вирощених в 6000 л і 1 л біореакторах. Визначення "Близько", "Приблизно": вжиті авторами терміни "близько" і "приблизно", що застосовуються до однієї або кількох певних умов клітинної культури, стосуються діапазону значень, які є подібними до зазначеного еталонного значення для тієї умови або умов культури. У певних варіантах втілення термін "близько" стосується діапазону значень, які перебувають у межах 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 відсотка або менше зазначеного еталонного значення для тієї умови або умов культури. "Амінокислота": вжитий авторами термін "амінокислота" стосується будь-якої із двадцяти природних амінокислот, які зазвичай використовуються в утворенні поліпептидів, або аналогів чи похідних цих амінокислот. Амінокислоти відповідно до даного винаходу забезпечуються в середовищі до клітинних культур. Амінокислоти, що забезпе 13 чуються в середовищі, можуть пропонуватися у вигляді солі або у формі гідрату. "Антитіло": вжитий авторами термін "антитіло" стосується молекули імуноглобуліну або імунологічно активної частини молекули імуноглобуліну, такої як фрагменти Fab або F(ab')2, що містить одну або кілька антиген-зв'язуючих ділянок, які специфічно зв'язуються (імунореагують) з антигеном. Вжиті авторами терміни "моноклональні антитіла" і "склад моноклонального антитіла" стосуються клонової популяції молекул антитіл, які містять тільки один вид антиген-зв'язуючої ділянки, що має здатність імунореагувати зі специфічною антигенною детермінантою, тоді як терміни "поліклональні антитіла" і "склад поліклонального антитіла" стосуються популяції молекул антитіл, які містять різні види антиген-зв'язуючих ділянок, що мають здатність до взаємодії з певним антигеном. Визначення моноклональних антитіл включає клонові молекули, отримані за допомогою традиційних технологій, й молекули певної послідовності, отримані шляхом маніпуляції або мутації певних залишків, наприклад, гуманізовані антитіла. "Серійна культура": вжитий авторами термін "серійна культура" стосується способу культивування клітин, при якому всі компоненти, які будуть в остаточному підсумку використовуватися при культивуванні клітин, включаючи середовище (див. визначення "середовища" нижче), а також самі клітини, надаються на початку процесу культивування. Як правило, в деякий момент серійна культура припиняється, а клітини і/або компоненти в середовищі збираються й, довільно, очищуються. "Біореактор": вжитий авторами термін "біореактор" стосується будь-якого контейнера, що використовується для росту культури клітин ссавців. Біореактор може бути будь-якого розміру, що придатний для культивування клітин ссавців. Як правило, біореактор буде мати об'єм, що становить принаймні 1 літр і може бути об'ємом 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12,0000 літрів або більше, або будь-якого проміжного об'єму в цих межах. Внутрішні умови біореактора, включаючи, крім інших, рН і температуру, як правило, контролюють упродовж періоду культивування. Біореактор може складатися з будь-якого матеріалу, що є прийнятним для утримування культур клітин ссавців, суспендованих в середовищах за умов культивування відповідно до даного винаходу, включаючи скло, пластмасу або метал. Вжитий авторами термін "виробничий біореактор" стосується кінцевого біореактору, що використовується у виробництві поліпептиду або білка, що розглядається. Об'єм біореактора для великомасштабного виробництва клітинної культури, як правило, становить принаймні 500 літрів і може бути 1000, 2500, 5900, 8000, 10000, 12,0000 літрів або більше, або будь-якого проміжного об'єму в цих межах. Звичайний спеціаліст в даній галузі буде знати й зможе обрати прийнятні біореактори для використання в практичному втіленні даного винаходу. "Щільність клітин": вжитий авторами термін "щільність клітини" стосується кількості клітин, присутніх у даному об'ємі середовища. 93859 14 "Життєздатність клітин": вжитий авторами термін "життєздатність клітини" стосується здатності клітин у культурі виживати при даному наборі умов культивування або експериментальних змін. Вжитий авторами термін також стосується тієї частини клітин, які є живими в певний час по відношенню до загальної кількості клітин, живих й мертвих, у культурі на той момент часу. "Культура", "клітинна культура" і "культура клітин ссавців": ці вжиті авторами терміни стосуються популяції клітин ссавців, яка суспендована в середовищі (див. визначення "середовища" нижче) за умов, що підходять для виживання й/або росту клітинної популяції. Як буде очевидно для звичайних спеціалістів в даній галузі, ці вжиті авторами терміни можуть стосуватися комбінації, що містить популяцію клітин ссавців й середовище, у якому ця популяція суспендована. "Підживлювана культура": вжитий авторами термін "підживлювана культура" стосується способу культивування клітин, при якому до культури додаються додаткові компоненти в певний час після початку процесу культивування. До компонентів, що додаються, як правило, належать харчові добавки для клітин, які були вичерпані протягом процесу культивування. Підживлювана культура зазвичай в деякий момент припиняється, а клітини і/або компоненти в середовищі збираються й, довільно, очищуються. "Фрагмент": вжитий авторами термін "фрагмент" стосується поліпептидів і визначається як будь-яка дискретна частина даного поліпептиду, що є унікальною або характерною для цього поліпептиду. Вжитий авторами термін також стосується будь-якої дискретної частини даного поліпептиду, що зберігає принаймні частку активності повнорозмірного поліпептиду. Бажано, щоб частка збереженої активності становила принаймні 10% активності повнорозмірного поліпептиду. Більш бажано, щоб частка збереженої активності становила принаймні 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% або 90% активності повнорозмірного поліпептиду. Ще більш бажано, щоб частка збереженої активності становила принаймні 95%, 96%, 97%, 98% або 99% активності повнорозмірного поліпептиду. Найбільш бажано, щоб частка збереженої активності становила 100% активності повнорозмірного поліпептиду. Вжитий авторами термін також стосується будь-якої частини даного поліпептиду, що включає принаймні елемент встановленої послідовності, виявлений у повнорозмірному поліпептиді. Бажано, щоб елемент послідовності охоплював принаймні 4-5, більш бажано принаймні приблизно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 або більше амінокислот повнорозмірного поліпептиду. "Ген": вжитий авторами термін "ген" стосується будь-якої нуклеотидної послідовності, ДНК або РНК, принаймні деяка частина якої кодує дискретний кінцевий продукт, як правило, крім іншого, поліпептид, що функціонує в деякому аспекті клітинного метаболізму або розвитку. Вважається, що термін стосується не тільки кодуючої послідовності, що кодує поліпептид або інший дискретний кінцевий продукт, але може також охоплювати ділян 15 ки до і після кодуючої послідовності, які модулюють основний рівень експресії (див. визначення "генетичного контрольного елемента" нижче), а також проміжні послідовності ("інтрони") між індивідуальними кодуючими сегментами ("екзонами"). "Генетичний контрольний елемент": вжитий авторами термін "генетичний контрольний елемент" стосується будь-якого елементу послідовності, що модулює експресію гена, з яким він оперативно зв'язаний. Генетичні контрольні елементи можуть функціонувати шляхом збільшення або зменшення рівнів експресії й можуть бути розташовані до, у межах або після кодуючої послідовності. Генетичні контрольні елементи можуть діяти на будь-якій стадії генної експресії, регулюючи, наприклад, ініціацію, елонгацію або термінацію транскрипції, сплайсинг іРНК, редагування іРНК, стабільність іРНК, локалізацію іРНК в межах клітини, ініціацію, елонгацію або термінацію трансляції або будь-яку іншу стадію генної експресії. Генетичні контрольні елементи можуть функціонувати індивідуально або в комбінації один з одним. "Гібридома": вжитий авторами термін "гібридома" стосується клітини, створеної шляхом злиття умертвленої клітини, отриманої з імунологічного джерела, й клітини, що продукує антитіла. Отримана гібридома представляє собою умертвлену клітину, що продукує антитіла. Окремі клітини, що використовуються для створення гібридоми можуть походити з будь-якого ссавцевого джерела, включаючи, крім іншого, щура, свиню, кролика, вівцю, свиню, козу і людину. Термін також охоплює тріомні клітинні лінії, які отримують, коли потомство гетерогібридних мієломних злиттів, що є продуктом злиття між людськими клітинами й мишачої мієломної клітинної лінії, у подальшому зливається із плазмацитом. Крім того, вважається, що термін включає будь-яку умертвлену гібридну клітинну лінію, що продукує антитіла, таку як, наприклад, квадроми (див., наприклад, Mіstein et al., Nature, 537:3053 (1983)). "Інтегрована щільність життєздатних клітин": вжитий авторами термін "інтегрована щільність життєздатних клітин" стосується середньої щільності життєздатних клітин протягом культивування, помноженої на час перебігу культивування. Припускаючи, що кількість продукованого поліпептиду й/або білка пропорційна кількості життєздатних клітин, присутніх упродовж культивування, інтегрована щільність життєздатних клітини є корисним інструментом для оцінки кількості поліпептиду й/або білка, виробленого протягом культивування. "Середовище", "клітинне культуральне середовище", "культуральне середовище": ці вжиті авторами терміни стосуються розчину, що містить поживні речовини, які живлять зростаючі клітини ссавців. Як правило, ці розчини забезпечують незамінимі й замінимі амінокислоти, вітаміни, джерела енергії, ліпіди та мікроелементи, необхідні клітині для мінімального росту й/або виживання. Розчин може також містити компоненти, які збільшують ріст і/або виживання вище мінімального рівня, включаючи фактори росту й гормони. В оптимальному варіанті розчини готують у такий спосіб, що рН й концентрації солей є оптимальними 93859 16 для виживання та проліферації клітин. Середовище може також належати до "визначених середовищ" - середовищ без сироватки, що не містять жодних білків, гідролізатів або компонентів невідомого складу. Визначені середовища не містять компонентів тваринного походження, і всі компоненти мають відому хімічну структуру. "Відходи метаболізму": вжитий авторами термін "відходи метаболізму" стосується сполук, що продукуються клітинною культурою внаслідок нормальних або патологічних метаболічних процесів, які є до певної міри шкідливими для клітинної культури, особливо по відношенню до експресії або активності бажаного рекомбінантного поліпептиду або білка. Наприклад, відходи метаболізму можуть бути шкідливими для росту або життєздатності клітинної культури, можуть зменшувати кількість продукованого рекомбінантного поліпептиду або білка, можуть змінювати згортання, стабільність, глкозилювання або іншу посттрансляційну модифікацію експресованого поліпептиду або білка, чи можуть бути шкідливими для клітин і/або експресії чи активності рекомбінантного поліпептиду або білка у будь-який інший спосіб. До прикладів відходів метаболізму належать лактат, що виробляється внаслідок метаболізму глюкози, і амоній, що виробляється внаслідок метаболізму глутаміну. Одна мета даного винаходу полягає в сповільненні виробництва, зниженні або навіть усуненні відходів метаболізму в культурах клітин ссавців. "Осмолярність" і "осмоляльність": "осмоляльність" - міра осмотичного тиску розчинених часток у водному розчині. Частки включають іони й неіонізовані молекули. Осмоляльність виражається як концентрація осмотично активних часток (тобто, осмолі), розчинених в 1 кг розчину (1 мОсм/кг Н2О при 38°С відповідає осмотичному тиску, рівному 19 мм рт.ст). "Осмолярність", на відміну від цього, стосується кількості часток, розчинених в 1 літрі розчину. Вжите авторами скорочення "мОсм" означає "міліосмолі/кг розчину ". "Перфузійна культура": вжитий авторами термін "перфузійна культура" стосується способу культивування клітин, при якому до культури додаткові компоненти додаються безперервно або напівбезперервно після початку процесу культивування. Додані компоненти, як правило, включають поживні добавки для клітин, які були вичерпані протягом процесу культивування. Частина клітин і/або компонентів у середовищі, як правило, збирається на безперервній або напівбезперервній основі й, довільно, очищується. "Поліпептид": вжитий авторами термін "поліпептид" стосується послідовного ланцюга амінокислот, з'єднаних за допомогою пептидних зв'язків. Вжитий термін стосується амінокислотного ланцюга будь-якої довжини, але звичайний спеціаліст в даній галузі розумітиме, що термін не обмежується довгими ланцюгами й може стосуватися мінімального ланцюга, що включає дві амінокислоти, з'єднані разом за допомогою пептидного зв'язку. "Білок": вжитий авторами термін "білок" стосується одного або кількох поліпептидів, які функціонують як дискретна одиниця. Якщо окремий поліпептид є дискретною функціонуючою одиницею й 17 не потребує постійної фізичної асоціації з іншими поліпептидами для утворення дискретної функціонуючої одиниці, вжиті авторами терміни "поліпептид" і "білок" використовуються почергово. Якщо дискретна функціональна одиниця складається з більш ніж одного поліпептиду, які фізично асоціюються один з одним, вжитий авторами термін "білок" стосується кількох поліпептидів, які фізично з'єднані й функціонують разом як дискретна одиниця. "Рекомбінантно експресований поліпептид" і "рекомбінантний поліпептид": ці вжиті авторами терміни стосуються поліпептиду, експресованого із ссавцевої клітини-хазяїна, що була генетично створена для експресії цього поліпептиду. Рекомбінантно експресований поліпептид може бути ідентичним або подібним до поліпептидів, які зазвичай експресуються в ссавцевій клітині-хазяїні. Рекомбінантно експресований поліпептид може також бути стороннім для клітини-хазяїна, тобто гетерологічним до пептидів, що зазвичай експресуються в ссавцевій клітині-хазяїні. Альтернативно, рекомбінантно експресований поліпептид може бути химерним, оскільки частини поліпептиду містять амінокислотні послідовності, які є ідентичними або подібними до поліпептидів, що зазвичай експресуються в ссавцевій клітині-хазяїні, у той час як інші частини є сторонніми для клітинихазяїна. "Посів": вжитий авторами термін "посів" стосується процесу переносу клітинної культури в біореактор або інший контейнер. Клітини можуть попередньо розмножуватись в іншому біореакторі або контейнері. Альтернативно, клітини можуть бути заморожені й розморожені безпосередньо перед їх переносом в біореактор або контейнер. Термін стосується будь-якої кількості клітин, включаючи одну клітину. "Титр": вжитий авторами термін "титр" стосується загальної кількості рекомбінантно експресованого поліпептиду або білка, продукованого культурою клітин ссавців, розділеної на дану кількість об'єму середовища. Титр, як правило, виражається в одиницях міліграмів поліпептиду або білка на мілілітр середовища. Детальний опис певних переважних варіантів втілення Даний винахід пропонує удосконалені системи для виробництва білків і/або поліпептидів клітинною культурою. Зокрема, винахід пропонує системи, які мінімізують продукування одного або кількох продуктів метаболізму, шкідливих для росту, життєздатності клітин і/або виробництва або якості білка. В оптимальному варіанті втілення даного винаходу, клітинна культура є серійною або підживлювальною культурою. Інші певні варіанти втілення винаходу, яким надається перевага, докладно обговорюються нижче. Звичайні спеціалісти в даній галузі зрозуміють, однак, що різні модифікації до цих переважних варіантів втілення охоплюються обсягом представленої нижче формули винаходу. Формула винаходу та її рівноцінні варіанти, що визначають обсяг даного винаходу, не є й не повинні обмежуватись певними переваж 93859 18 ними варіантами втілення або цим описом певних переважних варіантів втілення. Поліпептиди Будь-який поліпептид, що може експресуватись в клітині-хазяїні, може бути вироблений відповідно до даного винаходу. Поліпептид може експресуватись із гена, що є ендогенним для клітини-хазяїна, або із гена, що введений в клітинухазяїна шляхом генної інженерії. Поліпептид може бути пептидом, що зустрічається в природі, або може, альтернативно, мати послідовність, що була створена або відібрана рукою людини. Створений генною інженерією поліпептид може бути зібраний із інших поліпептидних сегментів, які окремо зустрічаються в природі, або може включати один або кілька сегментів, які не зустрічаються в природі. Поліпептиди, які можуть, за бажанням, бути експресовані відповідно до даного винаходу, часто будуть відбиратися на підставі потрібної біологічної або хімічної активності. Наприклад, даний винахід може використовуватися для експресії будьякого фармацевтично або комерційно доцільного ферменту, рецептора, антитіла, гормону, регуляторного фактора, антигену, зв'язуючого агента і т.п. Антитіла З огляду на велику кількість антитіл, що використовуються у даний час або досліджуються у якості фармацевтичних або інших комерційних засобів, виробництво антитіл представляє особливий інтерес відповідно до даного винаходу. Антитіла - це білки, які мають здатність специфічно зв'язувати певний антиген. Відповідно до даного винаходу може використовуватися будь-яке антитіло, що може бути експресоване в клітині-хазяїні. В оптимальному варіанті втілення, антитіло, що експресується, є моноклональним антитілом. В іншому оптимальному варіанті втілення, моноклональне антитіло є химерним антитілом. Химерне антитіло містить амінокислотні фрагменти, які отримані з більш ніж одного організму. Молекули химерного антитіла можуть включати, наприклад, антиген-зв'язуючий домен із антитіла миші, щура або інших видів, з людськими константними ділянками. Описані різноманітні тактики для створення химерних антитіл. Див. наприклад, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., Патент США № 4816567; Boss et al., Патент США № 4816397; Tanaguchi et al., Публікація Європейського Патенту ЕР 171496; Публікація Європейського Патенту 0173494, Патент Великобританії GB 2177096В. В іншому оптимальному варіанті втілення, моноклональне антитіло є людським антитілом, отриманим, наприклад, за допомогою рибосомдисплейних або фаг-дисплейних бібліотек (див., наприклад, Winter et al., Патент США № 6291159 і Kawasaki, Патент США № 5658754), або використання ксенотрансплантатних видів, у яких нативні гени антитіла інактивовані й функціонально замінені людськими генами антитіла, при цьому залишаючи неушкодженими інші компоненти нативної 19 імунної системи (див., наприклад, Kucherlapati et al., Патент США № 6657103). В іншому оптимальному варіанті втілення, моноклональне антитіло є гуманізованим антитілом. Гуманізоване антитіло є химерним антитілом, в якому значна більшість амінокислотних залишків отримана з людських антитіл, у такий спосіб зводячи до мінімуму будь-яку потенційну імунну реакцію при переносі у людський суб'єкт. В гуманізованих антитілах амінокислотні залишки в ділянках, що визначають комплементарність, замінені, принаймні частково, залишками із не людських видів, які обумовлюють бажану антиген-специфічність або афінність. Такі змінені молекули імуноглобуліну можуть бути створені за допомогою будь-якого з декількох способів, відомих в даній галузі (наприклад, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol, 92, 316 (1982)), і бажано вироблені відповідно до положень РСТ Публікації WO92/06193 або ЕР 0239400, зміст кожної з яких включений авторами шляхом посилання). Гуманізовані антитіла можуть вироблятись комерційно, наприклад, Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Великобританія. Для ознайомлення з додатковою літературою, див. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), зміст кожного з них включений авторами шляхом посилання. В іншому оптимальному варіанті втілення, моноклональні, химерні або гуманізовані антитіла, описані вище, можуть містити амінокислотні залишки, які у природі не зустрічаються в жодному антитілі в жодних видах. Ці сторонні залишки можуть використовуватися, наприклад, для надання нової або модифікованої специфічності, афінності або ефекторної функції моноклональному, химерному або гуманізованому антитілу. В іншому оптимальному варіанті втілення, описані вище антитіла можуть бути кон'югованими із препаратами для системної фармакотерапії, такими як токсини, низькомолекулярні цитотоксичні препарати, модифікатори біологічної відповіді та радіонукліди (див. наприклад, Kunz et al., Кон'югати носійпохідне каліхеаміцину (Calicheamicin derivativecarrier conjugates), US20040082764 A1). В одному варіанті втілення антитіло є антитілом, що специфічно зв'язується із фрагментом Α амілоїдного білка-попередника або з іншими компонентами амілоїдної бляшки, і є корисним в боротьбі з накопиченням амілоїдних бляшок у мозку, що характерне для хвороби Альцгеймера. (див., наприклад, Патентна заявка США 60/636 684). В іншому варіанті втілення антитіла відповідно до даного винаходу спрямовані проти антигенів поверхні клітини, що експресуються на цільових клітинах і/або тканинах при проліферативних захворюваннях, таких як рак. В одному варіанті втілення антитіло є антитілом анти-Льюїс Υ lgG1. Льюїс Υ - це вуглеводневий антиген зі структурою Fucą12Gal14[Fucą13] GlcNac13R (Abe et al. (1983) J. Biol. Chem., 258 11793-11797). Антиген Льюїс Υ експресується на поверхні від 60% до 90% 93859 20 людських епітеліальних пухлин (включаючи пухлини молочної залози, товстої кишки, легені та передміхурової залози), принаймні 40% яких надекспресують цей антиген, і має обмежену експресію в нормальних тканинах. Для того, щоб спрямовуватися на Ley й ефективно націлюватися на пухлину, в ідеалі потрібне антитіло з винятковою специфічністю до антигену. Таким чином, бажано, щоб антитіла анти-Льюїс Υ відповідно до даного винаходу не реагували перехресно зі структурами типу 1 (тобто, лакто-серіями груп крові (Lea і Leb)) і, бажано, не зв'язували інші антигенні детермінанти типу 2 (тобто, неолактоструктуру), таку як структури Lex й В-типу 2. Прикладом оптимального антитіла анти-Льюїс Υ є створене hu3S193 (див. Патент США №№ 6310185; 6518415; 5874060, зміст яких включений авторами у повному обсязі). Гуманізоване антитіло hu3S193 (Attia, M.A., et al. 1787-1800) було отримане шляхом пересадки CDR від 3S193, яке є мишачим моноклональним антитілом, що утворюється проти клітини аденокарциноми з винятковою специфічністю до Ley (Litamura, K., 12957-12961). Hu3S193 не тільки зберігає специфічність 3S193 до Ley, але й також набуває здатності опосередковувати комплемент-залежну цитотоксичність (далі зазначається як CDC) і антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (далі зазначається як ADCC) (Attia, M.A., et al. 1787-1800). Це антитіло спрямовується на ксенотрансплантати, що експресують Ley, у голих мишах, як демонструється в дослідженнях біорозподілу з hu3S193, міченим 1251, 111Іn або 18F, а також іншими радіоактивними мітками, що потребують хелатуючого агента, типу 111Іn, 99mТс, або 90Y (Clark, et al. 48044811). В іншому варіанті втілення антитіло є одним з людських антитіл анти-GDF-8, названих Муо29, Муо28 та Муо22, іантитілами та антигензв'язуючими фрагментами, отриманими з них. Ці антитіла здатні зв'язувати зрілий GDF-8 з високою афінністю, інгібувати активність GDF-8 in vitro та in vivo, як продемонстровано, наприклад, шляхом інгібування зв'язування ActRIIB і випробувань генарепортера, і можуть інгібувати активність GDF-8, пов'язану з негативним регулюванням скелетном'язової маси й кісткової щільності. Див., наприклад, Veldman, et al., Патент США № 20040142382. Рецептори Інший клас поліпептидів, які продемонстрували свою ефективність у якості фармацевтичних й/або комерційних засобів, включає рецептори. Рецептори - це, як правило, трансмембранні глікопротеїни, які функціонують шляхом розпізнання позаклітинного сигнального ліганду. Рецептори, як правило, містять протеїнкіназний домен на додаток до домену, який розпізнає ліганд, що ініціює сигнальний шлях, фосфорилюючи цільові внутрішньоклітинні молекули після зв'язування ліганду, що призводить до змін, пов'язаних з розвитком або метаболізмом, усередині клітини. В одному варіанті втілення рецептори, що розглядаються, модифікуються таким чином, щоб вилучити у них трансмембранний й/або внутрішньоклітинний домен(и), замість якого може довільно бути прикріплений Ig 21 домен. В оптимальному варіанті втілення рецептори, що виробляються відповідно до даного винаходу, є рецепторними тирозинкіназами (RTK). Родина RTK включає рецептори, які є критичними для різних функцій численних типів клітин (див., наприклад, Yarden and Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990, зміст яких включений авторами шляхом посилання). До прикладів RTK, належать, крім інших, члени родини рецепторів фактора росту фібробластів (FGF - fibroblast growth factor), члени родини рецепторів епідермального фактора росту (EGF - epidermal growth factor), рецептор тромбоцитарного фактора росту (PDGF - platelet derived growth factor), тирозинкіназа з імуноглобулін- і EGF-гомологічними доменами-1 (ТІЕ-1) і рецептори ТІЕ-2 (Sato et al., Nature 376(6535):70-74 (1995), зміст якого включений авторами шляхом посилання) і c-Met рецептор, деякі з яких, як припускається, стимулюють ангіогенез, прямо або непрямо (Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol. 129:895898, 1995). До інших прикладів RTK належать ембріональна печінкова кіназа 1 (FLK-1 - fetal liver kinase 1) (іноді зазначається як рецептор, що містить кіназний домен-вставку (KDR - kinase insert domain-containing receptor) (Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991) або рецептор судинного ендотеліального клітинного фактора росту 2 (VEGFR-2 - vascular endothelial cell growth factor receptor 2)), fms-подібна тирозинкіназа 1 (Fit-1 fms-like tyrosine kinase-1) (DeVries et al. Science 255; 989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519524, 1990), іноді зазначається як рецептор судинного ендотеліального клітинного фактора росту 1 (VEGFR-1 - vascular endothelial cell growth factor receptor 1), нейропілін-1, ендоглін, ендозиалін і Axl, але не обмежуються ними. Звичайні спеціалісти в даній галузі знатимуть інші рецептори, які можуть оптимально бути експресовані відповідно до даного винаходу. У варіанті втілення, якому надається особлива перевага, відповідно до даного винаходу експресуються інгібітори фактору некрозу пухлини, у формі альфа й бета рецепторів фактора некрозу пухлини (TNFR-1; EP417 563, опублікований 20 березня 1991 року; і TNFR-2, ЕР 417 014 опублікований 20 березня 1991 року) (для огляду, див. Naismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7 (199596), зміст якого включений авторами шляхом посилання). Відповідно до одного варіанту втілення інгібітор фактору некрозу пухлини містить розчинний рецептор TNF і, бажано, TNFR-Ig. В одному варіанті втілення оптимальними інгібіторами TNF відповідно до даного винаходу є розчинні форми TNFRI і TNFRII, а також розчинні TNF-зв'язуючі білки, в іншому варіанті втілення злиття TNFR-Ig є TNFR:Fc, термін, що використовується авторами, стосується "'etanercept", що є димером двох молекул позаклітинної частини р75 TNF-.альфа. рецептора, кожна молекула складається з 235амінокислотної Fc частини субодиниці 1 людського IgG. Фактори росту та інші сигнальні молекули Інший клас поліпептидів, які показали свою ефективність у якості фармацевтичних й/або ко 93859 22 мерційних засобів, включає фактори росту та інші сигнальні молекули. Фактори росту - це, як правило, глікопротеїни, які секретуються клітинами й зв'язуються із та активують рецептори на інших клітинах, ініціюючи зміни, пов'язані з розвитком або метаболізмом, в рецепторній клітині. В одному варіанті втілення білок, що розглядається, є злитим поліпептидом ActRIIB, що містить позаклітинний домен рецептора ActRIIB і частину Fc антитіла (див., наприклад, Wolfman, et al., Злитий поліпептид ActRIIB та його використання (ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor), US2004/0223966 Α1). Β іншому варіанті втілення фактором росту може бути модифікований пропептид GDF-8 (см., наприклад, Wolfman, et al., Модифіковані та стабілізовані пропептиди GDF та їх використання (Modifed and stabilized GDF propeptides and uses thereof), US2003/0104406 A1). Альтернативно, білок, що розглядається, міг би бути білком, що містить домен фолістатину (див., наприклад, Hill, et al., GASP1: білок, що містить домен фолістатину (GASP1: a follistatin domain containing protein), US 2003/0162714 A1, Hill, et al., GASP1: білок, що містить домен фолістатину (GASP1: a follistatin domain containing protein). US 2005/0106154 A1, Hill, et al., Білки, що містять домен фолістатину (Follistatin domain containing proteins), US 2003/0180306 A1). До прикладів факторів росту ссавців й інших сигнальних молекул належать, крім інших, цитокіни; епідермальний фактор росту (EGF); тромбоцитарний фактор росту (PDGF); фактори росту фібробластів (FGF), такі як aFGF і bFGF; трансформуючі фактори росту (TGF), такі FGFальфа й TGF-бета, включаючи TGF-бета 1, TGFбета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4 або FGF-бета 5; інсуліноподібний фактор росту-І і -II (IGF-I і IGF-II); дec(1-3)-IGF-I (IGF-I мозку), білки, що зв'язують інсуліноподібні фактори росту; CD білки, такі як CD-3, CD-4, CD-8 і CD-19; еритропоетин; остеоіндуктивні фактори; імунотоксини; кістковий морфогенетичний білок (BMP - bone morphogenetic protein); інтерферон, такий як інтерферон-альфа, бета, і -гама; колонієстимулюючі фактори (CSF colony stimulating factors), наприклад, М-CSF, GMCSF і G-CSF; інтерлейкіни (TL), наприклад, від IL-1 до IL-10; фактор некрозу пухлини (TNF) альфа й бета; Α-ланцюг інсуліну; В-ланцюг інсуліну; проінсулін; фолікулостимулюючий гормон; кальцитонін; лютеїнізуючий гормон; глюкагон; коагулюючі фактори, такі як фактор VIIIC, фактор IX, тканинний фактор і фактор фон Віллебранда; антикоагулюючі фактори, такі як Білок С; передсердний натрійуретичний фактор; легеневий сурфактант; активатор плазміногена, такий як урокіназа або людський сечовий або тканинний активатор плазміногена (tPA); бомбезин; тромбін, гемопоетичний фактор росту; енкефаліназа; RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted регульований при активації звичайно Т-клітин, експресований і секретований); людський запальний білок макрофагів (МІР-1-альфа); мулеріанінгібуюча речовина; Α-ланцюг релаксину; В-ланцюг релаксину; прорелаксин; мишачий гонадотропінасоційований пептид; нейротрофічні фактори, такі 23 як кістковий нейротрофічний фактор (BDNF - bonederived neurotrophic factor), нейротрофін-3, -4, -5, або -6 (NT-3, NT-4, NT-5, або NT-6), або фактор росту нервів, такий як NGF-бета. Звичайні спеціалісти в даній галузі знатимуть інші фактори росту або сигнальні молекули, які можуть бути експресовані відповідно до даного винаходу. G-білок спряжені рецептори Інший клас поліпептидів, які показали свою ефективність у якості фармацевтичних й/або комерційних засобів, включає фактори росту та інші сигнальні молекули. G-білок спряжені рецептори (GPCR - G-protein coupled receptor) - це білки, які мають сім трансмембранних доменів. Після зв'язування ліганда із GPCR, всередині клітини трансдукується сигнал, що призводить до зміни біологічної або фізіологічної властивості клітини. GPCR, разом з G-білками та ефекторами (внутрішньоклітинними ферментами й каналами, які модулюються G-білками), є компонентами модульної сигнальної системи, що з'єднує стан внутрішньоклітинних вторинних мессенджерів із позаклітинними вхідними сигналами. Ці гени й генні продукти є потенційними збудниками захворювання. Певні дефекти в гені родопсину й гені рецептора вазопресину V2, як показано, спричинює різні форми аутосомальної домінантної й аутосомальної рецесивної пігментної дегенерації сітківки, нецукрового ниркового діабету. Ці рецептори мають критичне значення для центральної нервової системи і для периферійних фізіологічних процесів. Суперродина білків GPCR на даний час містить більш ніж 250 типів паралогів, рецепторів, які представляють варіанти, отримані шляхом дуплікації гену (або інших процесів), на противагу ортологам, тим же рецепторам від різних видів. Суперродина може бути розділена на п'ять родин: Родина І, рецептори, типовими представниками яких є родопсин і бета2-адренергічний рецептор, і на даний час представлена більш ніж 200 унікальними членами; Родина II, що нещодавно охарактеризована родиною рецепторів секретину/кальцитоніну/паратиреоїдного гормону; Родина III, родина метаботропного глутаматного рецептору в ссавців; Родина IV, родина сАМР рецепторів, важлива при хімотаксисі і розвитку D. discoideum; і Родина V, грибкові спряжені рецептори феромонів, такі як STE2. GPCR включають рецептори для біогенних амінів, для ліпідних медіаторів запалення, пептидних гормонів і сенсорних сигнальних медіаторів. GPCR стає активованим при зв'язуванні рецептором його позаклітинного ліганду. Конформаційні зміни в GPCR, які спричинені взаємодією лігандрецептор, впливають на зв'язуючу афінність Gбілка із внутрішньоклітинними доменами GPCR. Це дає GTP можливість зв'язуватись з G білком із підвищеною афінністю. Активація G білка за допомогою GTP призводить до взаємодії  субодиниці G білка з аденилатциклазою або іншими генераторами молекул вторинних мессенджерів. Ця взаємодія регулює активність аденилатциклази, а отже продукування молекули вторинного мессенджеру, сАМР. сАМР 93859 24 регулює фосфорилювання й активацію інших внутрішньоклітинних білків. Альтернативно, клітинні рівні інших молекул вторинних мессенджерів, таких як cGMP або ейкозиноїди, можуть підвищуватись або знижуватись активністю GPCR.  субодиниця G білка дезактивується шляхом гідролізу GTP за допомогою ОТРази, а , , і  субодиниці повторно асоціюють. Після цього гегеротримерний G білок відокремлюється від аденилатциклази або іншого генератора молекул вторинних мессенджерів. Активність GPCR може також регулюватися шляхом фосфорилювання внутрішньо- і позаклітинних доменів або петель. Глутаматні рецептори формують групу GPCR, які є важливими в нейротрансмісії. Глутамат є головним трансміттером в ЦНС і, як вважається, грає важливу роль в нейрональній пластичності, когнітивній функції, пам'яті, навчанні і при декількох неврологічних захворюваннях, таких як епілепсія, інсульт і нейродегенеративні порушення (Watson, S. and S. Arkinstall (1994) The G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, pp. 130-132). Ці ефекти глутамата опосередковуються двома різними класами рецепторів під назвою іонотропні і метаботропні. Іонотропні рецептори містять внутрішній катіонний канал й опосередковують швидкі збуджувальні дії глутамату. Метаботропні рецептори є модуляторними, збільшуючи мембранну збудливість нейронів шляхом інгібування кальцієзалежної калієвої провідності і шляхом інгібування та потенціювання збуджувальної передачі іонотропних рецепторів. Метаботропні рецептори класифікуються на п'ять підтипів, базуючись на фармакології агоніста й шляхах трансдукції сигналу, й широко розподіляються в тканинах головного мозку. Родина вазоактивних кишкових поліпептидів (VIP - vasoactive intestinal polypeptide), є групою споріднених поліпептидів, дії яких також опосередковуються GPCR. Ключовими членами цієї родини є безпосередньо VIP, секретин і фактор, що вивільняє гормон росту (GRF - growth hormone releasing factor). VIP має широкий спектр фізіологічної дії, включаючи розслаблення гладких м'язів, стимуляцію або інгібування секреції в різних тканинах, модуляцію різних видів активності імунних клітин та різні збуджувальні й інгібувальні види активності в ЦНС. Секретин стимулює секрецію ферментів та іонів у підшлунковій залозі й кишечнику й також є присутнім у маленьких кількостях в мозку. GRF є важливим нейроендокринним агентом, що регулює синтез і вивільнення гормону росту із передньої частки гіпофізу (Watson, S. and S. Arkinstall вище, pp. 278-283). Після зв'язування ліганда з GPCR, конформаційна зміна передається до G білка, що змушує субодиницю обміняти зв'язану молекулу GDP на молекулу GTP і відокремитись від -субодиниць. GTP-зв'язана форма -субодиниці, як правило, функціонує як ефектор-модулюючий залишок, призводячи до продукування вторинних мессенджерів, таких як циклічний AMP (наприклад, шляхом активації аденилатциклази), диацилгліцерину або фосфатів інозиту. Для людини відомо більш ніж 20 різних типів -субодиниць, які зв'язуються з 25 меншим об'єднанням  і -субодиниць. До прикладів ссавцевих G білків належать Gi, Go, Gq, Gs і Gt. G білки докладно описані в Lodish H. et al. Molecular Cell Biology, (Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995), зміст якої включений авторами шляхом посилання. GPCR є головною мішенню для дії й розробки препаратів. Фактично, рецептори призвели до розробки більш ніж половини відомих на даний час препаратів (Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14: 1516), і GPCR представляють найважливішу мішень для терапевтичного втручання, причому 30% препаратів, що клінічно призначаються, антагонізують або агонізують GPCR (Milligan, G. and Rees, S., (1999) TIPS, 20: 118-124). Це демонструє, що використання рецепторів такого типу у якості терапевтичних мішеней є добре встановленим, доведеним фактом. Взагалі, спеціалісти при практичному втіленні даного винаходу будуть обирати поліпептид, що їх цікавить, і знатимуть його точну амінокислотну послідовність. Способи відповідно до даного винаходу успішно застосовувались у виробництві різноманітних поліпептидів, включаючи, наприклад, людське моноклональне антитіло, спрямоване на фактор росту й диференціювання 8 (Приклади 1, 3, 4, 7-14), гуманізоване антитіло анти-Люїс Υ (Приклади 5 і 6), анти-АБета (Приклад 15) і димерний Fc-злитий білок рецептора фактора некрозу пухлини (Приклад 16), що свідчить про те, що даний винахід буде корисним для експресії цілого спектру різних поліпептидів і білків. Будь-який даний білок, що повинен бути експресований відповідно до даного винаходу, матиме свої власні особливі характеристики й може впливати на щільність або життєздатність культивованих клітин, і може бути експресований на більш низьких рівнях ніж інший поліпептид або білок, вирощений при ідентичних умовах культури. Звичайний спеціаліст в даній галузі матиме змогу відповідним чином модифікувати кроки й композиції даного винаходу з метою оптимізації клітинного росту й/або виробництва будь-якого даного поліпептиду або білка, що експресується. Генетичні контрольні елементи Як буде очевидно для звичайних спеціалістів в даній галузі, генетичні контрольні елементи можуть використовуватися з метою регулювання генної експресії поліпептиду або білка. Такі генетичні контрольні елементи повинні відбиратися на основі їх активності у відповідній клітині-хазяїні. Контрольні елементи можуть бути конститутивно активними або можуть бути індуцибельними за певних обставин. Індуцибельні контрольні елементи є особливо корисними у випадках, коли експресований білок є токсичим або іншим чином шкідливо впливає на ріст і/або життєздатність клітин. У таких випадках, регулювання експресії поліпептиду або білка через індуцибельні контрольні елементи може покращити життєздатність клітин, щільність клітини і/або сумарний вихід експресованого поліпептиду або білка. В даній галузі відома й доступна велика кількість контрольних елементів, корисних у практичному втіленні даного винаходу. 93859 26 Представники конститутивних ссавцевих промотерів, які можуть використовуватися відповідно до даного винаходу, включають, крім інших, промотер гіпоксантин фосфорибозилтрансферази (HPTR - hypoxanthine phosphoribosyl transferase), промотер аденозиндеамінази, промотер піруваткінази, промотер бета-актину, а також інші конститутивні промотери, відомі звичайним спеціалістам в даній галузі. Додатково, до вірусних промотерів, які, як показано, стимулюють конститутивну експресію кодуючих послідовностей в еукаріотичних клітинах, належать, наприклад, промотер мавп'ячого вірусу, промотери вірусу герпесу простого, промотери папіломавірусу, промотери аденовірусу, промотери вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), промотери вірусу саркоми Рауса, промотери цитомегаловірусу (ЦМВ), довгі термінальні повторення (LTR) вірусу мишачої лейкемії Молоні та інших ретровірусів, промотер тимідинкінази вірусу герпесу простого, а також інші вірусні промотери, відомі звичайним спеціалістам в даній галузі. Індуцибельні промотери запускають експресію оперативно зв'язаних кодуючих послідовностей в присутності індукуючого агенту й можуть також використовуватися відповідно до даного винаходу. Наприклад, у клітинах ссавців, металотіонеїновий промотер індукує транскрипцію низхідних кодуючих послідовностей у присутності певних іонів металу. Інші індуцибельні промотери будуть визнані й/або відомі звичайним спеціалістам в даній галузі. Зазвичай, генна послідовність експресії також включатиме 5'нетранскрибуючі і 5'нетранслюючі послідовності, пов'язані з ініціюванням транскрипції й трансляції, відповідно, такі як рамка ТАТА, кеппінг послідовність, послідовність СААТ і т.п. Для збільшення рівнів експресії поліпептидів або білків, які будуть експресуватися, можуть довільно використовуватися елементи-посилювачі. До прикладів елементів-посилювачів, які, як показано, функціонують в клітинах ссавців, належить SV40 ранній генний посилювач, як описано в Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761 і посилювач/промотер, отриманий із довгого термінального повторення (LTR) вірусу саркоми Рауса (RSV - Rous Sarcoma Virus), як описано в Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777 і людського цитомегаловірусу, як описано в Boshart et al., Cell (1985) 41:521. Системи для зв'язування контрольних елементів із кодуючими послідовностями відомі в даній галузі (загальні методи молекулярної біології та рекомбінантної ДНК описані в Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, зміст якого включений авторами шляхом посилання). Комерційні вектори, що підходять для вставки оптимальної кодуючої послідовності для експресії в різних клітинах ссавців за різних умов росту та індукції також добре відомі в даній галузі. Введення кодуючих послідовностей і відповідних контрольних елементів в клітини-хазяїни Способи, що підходять для введення в ссавцеві клітини-хазяїни нуклеїнових кислоти, достатніх для досягнення експресії поліпептидів або біл 27 ків, що розглядаються, відомі в даній галузі. Див., наприклад, Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117,060; and EP 117058, зміст кожного з яких включений авторами шляхом посилання. Для клітин ссавців, оптимальні способи трансформації включають спосіб осадження фосфатом кальцію Graham і van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978) або спосіб з ліпофектаміном (Gibco BRL) Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193). Загальні аспекти системних трансформацій ссавцевих клітинхазяїнів були описані Axel у Патенті США № 4399216, виданому 16 серпня 1983 року. Для ознайомлення з різними способами для трансформації ссавцевих клітин, див. Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990), і Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). До характерних прикладів прийнятних векторів для експресії поліпептидів або білків у клітинах ссавців належать, крім інших, pCDNA1; pCD, див. Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMClneo Poly-A, див. Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; і вектор бациловірусу, такий як рАС 373 або рАС 610. В оптимальних варіантах втілення, поліпептид або білок стійко трансфектується в клітинухазяїна. Однак, звичайний спеціаліст в даній галузі визнає, що даний винахід може використовуватися у випадку транзиторно або стійко трансфектованих клітин ссавців. Клітини Відповідно до даного винаходу може використовуватися будь-яка клітина ссавця або тип клітин, сприйнятливий до клітинної культури і до експресії поліпептидів. До прикладів клітин ссавців, які можуть використовуватися відповідно до існуючого винаходу, належать, крім інших, лінія мишачої мієломи BALB/c (NSO/1, ЕСАСС No: 85110503); людські ретинобласти (PER.C6 (CruCell, Leiden, Нідерланди)); лінія CV1 нирки мавпи, трансформована за допомогою SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); лінія людської ембріональної нирки (клітини 293 або 293, субклоновані для росту в суспензійній культурі, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клітини нирки дитинчат хом'яків (ВНK, АТСС CCL 10); клітини яєчника китайського хом'яка +/-DHFR (СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); клітини Сертолі миші (ТМ4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (CV1 АТСС CCL 70); клітини нирки африканської зеленої мавпи (VERO-76, АТСС CRL-1 587); клітини людського раку шийки матки (HeLa, АТСС CCL 2); клітини нирки собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клітини печінки щура Буффало (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клітини людської легені (W138, АТСС CCL 75); клітини людської печінки (Hep G2, НВ 8065); мишача пухлина молочної залози (MМТ 060562, АТСС CCL51); клітини ТРІ (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); клітини MRC 5; клітини FS4; і лінія людської гепатоаденоми (Hep G2). У варіанті втілення, якому надається особлива перевага, даний винахід використовується для культивування та експресії поліпептидів і білків із клітинних ліній СНО. 93859 28 Крім цього, відповідно до даного винаходу може використовуватися будь-яка кількість комерційно й некомерційно доступних клітинних лінії гібридоми, які експресують поліпептиди або білки. Спеціаліст, кваліфікований в даній галузі, добре розумітиме, що клітинні лінії гібридоми можуть мати різні вимоги щодо живлення й/або можуть потребувати різних умов культивування для оптимального росту й експресії поліпептиду або білка, і матиме змогу модифікувати умови, у разі необхідності. Як відзначено вище, у багатьох випадках клітини будуть відбиратися або створюватися для продукції високих рівнів білка або поліпептиду. Часто, клітини створюються генетично для продукції високих рівнів білка, наприклад, шляхом введення гена, що кодує білок або поліпептид, який розглядається, й/або за допомогою введення контрольних елементів, які регулюють експресію гена (ендогенного або введеного), що кодує поліпептид, який розглядається. Певні поліпептиди можуть шкідливо впливати на ріст клітини, життєздатність клітини або деякі інші характеристики клітин, що в остаточному підсумку до певної міри обмежує виробництво поліпептиду або білка, який розглядається. Навіть серед популяції клітин одного певного типу, створеного для експресії певного поліпептиду, існує варіабельність у межах клітинної популяції, таким чином, що певні індивідуальні клітини будуть рости краще й/або продукуватимуть більше поліпептиду, що розглядається. У певних оптимальних варіантах втілення даного винаходу, клітинна лінія відбирається практиком еміпіричним шляхом для здорового росту за певних умов, обраних для культивування клітин. У варіантах втілення, яким надається особлива перевага, індивідуальні клітини, створені для експресії певного поліпептиду обираються для великомасштабного виробництва, базуючись на рості клітин, кінцевій щільності клітин, відсотку життєздатності клітин, титрі експресованого поліпептиду або будь-якої їх комбінації чи будь-яких інших умовах, що вважаються практиком важливими. Фаза клітинної культури До типових процедур для продукування поліпептиду, що розглядається, належать серійні культури й підживлювані культури. Процеси серійної культури традиційно включають інокуляцію культури для великомасштабного виробництва посівною культурою з певною конкретною щільністю клітин, вирощування клітин за умов, що сприяють росту й життєздатності клітин, збір культури, коли клітини досягають зазначеної щільності клітин, і очищення експресованого поліпептиду. Процедури підживлюваної культури включають додатковий крок або кроки підживлення серійної культури за допомогою поживних речовин й інших компонентів, які споживаються упродовж росту клітин. Постійна й невирішена проблема, що стосується традиційних серійних й підживлюваних культур, полягає в утворенні відходів метаболізму, які чинять шкідливий вплив на ріст, життєздатність клітин і виробництво експресованих поліпептидів. Два продукти-відходи метаболізму, які чинять осо 29 бливо шкідливий вплив - це лактат і амоній, що утворюються внаслідок метаболізму глюкози та глутаміну, відповідно. Крім ферментативного продукування амонію внаслідок метаболізму глутаміну, амоній також накопичується в клітинних культурах внаслідок неметаболічного розщеплення, що відбувається з часом. Даний винахід пропонує поліпшений спосіб великомасштабного виробництва поліпептидів, що мінімізує шкідливі ефекти амонію й лактата шляхом сповільнення і навіть нівелювання накопичення цих відходів у клітинних культурах. Звичайний спеціаліст в даній галузі визнає, що даний винахід може використовуватися в будь-якій системі, у якій культивуються клітини, включаючи, крім інших, серійні, підживлювані й перфузійні системи. У певних оптимальних варіантах втілення даного винаходу, клітини вирощують в серійних або підживлюваних системах. Середовища Традиційні композиції середовищ, включаючи комерційно доступні середовища, такі як Хема F10 (Ham's F10, Sigma), середовище MEM (Minimal Essential Medium, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), і середовище Ігла в модифікації Дульбекко ([DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium], Sigma), містять в своєму складі відносно високі рівні глюкози й глутаміну в порівнянні з іншими амінокислотами. Ці компоненти, як вважалось, були потрібні в надлишку, оскільки вони є первинними метаболічними джерелами енергії для клітин. Однак, швидке споживання цих поживних речовин призводить до накопичення лактату й амонію, як описано вище. Додатково, високі початкові рівні глюкози й глутаміну, й подальше накопичення лактату й амонію зумовлюють високу осмолярність, стан, що сам по собі часто є шкідливим для росту, життєздатності клітин й виробництва поліпептидів. Даний винахід пропонує різні композиції середовищ, які, при використанні відповідно до інших кроків культивування, описаних авторами, мінімізують і навіть нівелюють накопичення лактату та амонію. Композиції середовищ даного винаходу, які, як показано, чинять сприятливий вплив на ріст й/або життєздатність клітин або на експресію поліпептиду чи білка, включають одну або кілька з нижченаведених характеристик: і) сукупна кількість амінокислот на одиницю об'єму більша ніж приблизно 70 мМ; іі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості амінокислот в цілому становить менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідношення сукупної кількості неорганічних іонів до сукупної кількості амінокислот в цілому становить приблизно від 0,4 до 1; або ν) об'єднана сукупна кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об'єму становить більше ніж приблизно 16 мМ. Звичайний спеціаліст у даній галузі зрозуміє, що термін "сукупний", який використовується вище, стосується сумарної кількості певного компоненту або компонентів, доданих упродовж клітинної культури, включаючи компоненти, що додаються на початку культури й компоненти, що додаються згодом. Звичайний спеціаліст у даній галузі зрозуміє, що 93859 30 композиції середовищ відповідно до даного винаходу охоплюють визначені й невизначені середовища. Традиційні композиції середовищ починаються з відносно низького рівня сумарної кількості амінокислот у порівнянні з композиціями середовищ даного винаходу. Наприклад, загальний вміст амінокислот традиційного середовища для клітинної культури, відомого як DME-F12 (суміш 50:50 середовища Ігла в модифікації Дульбекко й середовища Хема F12) становить 7,29 мМ, а загальний вміст амінокислот традиційного середовища для клітинної культури, відомого як RPMI-1640, становить 6,44 мМ (Див. наприклад, H.J. Morton, In Vitro, 6:89-108 (1970), R.G. Ham, Proc. Nat. Assoc. Sci. (USA), 53:288-293 (1965), G.E. Moore et al., J. Am. Medical Assn., 199:519-24 (1967), вміст кожного з яких включений авторами шляхом посилання). У певних варіантах втіленнях даного винаходу, концентрація амінокислот в культуральних середовищах бажано є більшою ніж приблизно 70 мМ. Ще більш бажано, композиції середовищ відповідно до даного винаходу містять концентрації амінокислот, більші ніж приблизно 70 мМ у вихідних середовищах. Показано, що у випадку, коли концентрації амінокислот вихідних середовищ перебувають у цьому діапазоні, щільність клітин й титр збільшуються протягом періоду росту культури (див. Приклад 13). Крім того, у певних варіантах втілення даного винаходу, молярне співвідношення глутаміну до аспарагіну в культуральних середовищах є зниженим у порівнянні з іншими комерційно й некомерційно доступними середовищами. Бажано, щоб молярне співвідношення глутаміну до аспарагіну в культуральних середовищах становило менше ніж приблизно два. Крім того, у певних варіантах втілення даного винаходу, молярне співвідношення глутаміну до сумарної кількості амінокислот у культуральних середовищах є зниженим у порівнянні з іншими комерційно й некомерційно доступними середовищами. Бажано, щоб молярне співвідношення глутаміну до сумарної кількості амінокислот у культуральних середовищах становило менше ніж приблизно 0,2. Цікавий і несподіваний результат зниження молярного співвідношення глутаміну до аспарагіну або до сумарної концентрації амінокислот у вихідних середовищах відповідно до даного винаходу полягав у тому, що на додаток до відзначеного зменшення в накопиченні амонію, також спостерігалося зменшення в накопиченні лактату. У певних варіантах втілення, накопичені рівні амонію й лактату не тільки нижчі ніж в контрольних культурах, але й дійсно фактично зменшуються після початкового накопичення (наприклад, див. Приклади 3 і 7). Boraston (Патент США № 5871999) описав культуральне середовище, у якому молярне співвідношення сумарної кількості неорганічних іонів до сумарної кількості амінокислот становить від 1 до 10. Boraston показав, що при забезпеченні культурального середовища, у якому молярне співвідношення сумарної кількості неорганічних іонів до 31 сумарної кількості амінокислот перебуває в цьому діапазоні, агрегація клітин СНО, вирощених у середовищі, зменшується. В іншому оптимальному варіанті втілення даного винаходу, молярне співвідношення сумарної кількості неорганічних іонів до сумарної кількості амінокислот у культуральному середовищі зменшене навіть ще більше, до приблизно від 0,4 до 1. Як показано в Прикладі 13, зменшення цього співвідношення від 1,75 до приблизно 0,7 призводить до помітного збільшення щільності клітин й виробництва експресованого поліпептиду або білка упродовж періоду росту культури. В іншому оптимальному варіанті втілення даного винаходу, культуральне середовище містить об'єднану концентрацію глутаміну і аспарагіну, що становить приблизно від 16 до 36 мМ. Як показано в Прикладі 14, Таблиці 22, у середовищ, які містять об'єднану сумарну концентрацію глутаміну та аспарагіну в межах цього діапазону, відзначаються вищі титри експресованого поліпептиду ніж у середовищ, які містять об'єднану сумарну кількість глутаміну і аспарагіну поза цим діапазоном. Звичайний спеціаліст в даній галузі матиме змогу обрати точну об'єднану концентрацію глутаміну і аспарагіну в межах цього діапазону з метою оптимізації росту й/або життєздатності клітин і збільшення до максимуму виробництва експресованого поліпептиду. Крім того, звичайний спеціаліст в даній галузі визнає, що будь-яка із вище зазначених умов може використовуватися або окремо або в різних комбінаціях одна з одною. Використовуючи композиції середовищ, яким властива одна, кілька або всі вищезгадані характеристики, звичайний спеціаліст в даній галузі матиме змогу оптимізувати ріст й/або життєздатність клітин і збільшити до максимуму виробництво експресованого поліпептиду. Кожна із цих композицій середовищ, розкритих в даному винаході, може, довільно, доповнюватись у міру необхідності гормонами й/або іншими факторами росту, певними іонами (такими, як натрій, хлорид, кальцій, магній і фосфат), буферами, вітамінами, нуклеозидами або нуклеотидами, мікроелементами (неорганічними сполуками, що зазвичай присутні у дуже низьких кінцевих концентраціях), амінокислотами, ліпідами, гідролізатами білка або глюкозою чи іншим джерелом енергії. У певних варіантах втілення даного винаходу доповнення середовищ хімічними індуктантами, такими як гексаметилен-біс(ацетамід) ("ГМБА") і натрію бутират ("NaB") може мати сприятливий ефект. Ці додаткові добавки можуть додаватися на початку культивування або можуть додаватися в більш пізній період часу з метою поповнення вичерпаних поживних речовин або з іншої причини. Звичайний спеціаліст в даній галузі знатиме будь-які бажані або необхідні добавки, які можуть бути включені в описані композиції середовищ. Підготовка культури клітин ссавців В даній галузі відомі різні способи підготовки клітин ссавців для виробництва білків або поліпептидів за допомогою серійної й підживлюваної культури. Як описано вище, нуклеїнова кислота, достатня для досягнення експресії (як правило 93859 32 вектор, що містить ген, який кодує поліпептид або білок, що розглядається, й будь-які оперативно зв'язані генетичні контрольні елементи) може бути введена в лінію клітин-хазяїнів за допомогою великої кількості добре відомих способів. Як правило, клітини підлягають скринінгу для визначення, які із клітин-хазяїнів фактично поглинули вектор і експресують поліпептид або білок, що розглядається. До традиційних способів виявлення певного поліпептиду або білка, що розглядається, експресованого клітинами ссавців належать, крім інших, імуногістохімія, імунопреципітація, проточна цитометрія, імунофлуоресцентна мікроскопія, SDSPAGE, метод імуноблотингу (Western blot), метод виявлення за допомогою імобілізованого ферменту (ELISA - enzyme-linked immunosorbentassay), методи високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), тести на біологічну активність й афінна хроматографія. Звичайний спеціаліст в даній галузі знатиме інші відповідні способи для виявлення експресованих поліпептидів або білків. У разі, якщо поліпептид або білок, що розглядається, експресують різні клітини-хазяїни, можуть використовуватися кілька або всі перелічені способи для визначення, яка із клітин експресує цей поліпептид або білок на найвищих рівнях. Як тільки клітину, що експресує поліпептид або білок, що розглядається, ідентифікували, клітину розмножують у культурі за допомогою будьякого із широкого спектру способів, добре відомих звичайному спеціалісту в даній галузі. Клітину, яка експресує поліпептид або білок, що розглядається, як правило, розмножують шляхом вирощування її при температурі й у середовищі, що є сприятливим для виживання, росту й життєздатності клітини. Початковий об'єм культури може бути будьяким, але часто меншим ніж об'єм культури виробничого біореактора, що використовується у кінцевому виробництві поліпептиду або білка, що розглядається, і часто клітини проходять кілька циклів у біореакторах зі збільшенням об'єму до посіву у виробничий біореактор. Клітинна культура може збовтуватися або струшуватися з метою збільшення насичення середовища киснем й дисперсії поживних речовин до клітин. Альтернативно або додатково, для збільшення й контролю насичення культури киснем можуть використовуватися спеціальні барботуючі пристрої, які є відомими в даній галузі. Відповідно до даного винаходу, звичайний спеціаліст в даній галузі розумітиме, що може бути вигідним контролювати або регулювати певні внутрішні умови біореактора, включаючи, крім інших, рН, температуру, насичення киснем і т.д. Початкова щільність клітин у виробничому біореакторі може обиратися звичайним спеціалістом в даній галузі. Відповідно до даного винаходу початкова щільність клітин у виробничому біореакторі може становити всього одну клітину на об'єм культури. В оптимальних варіантах втілення даного винаходу, початкові щільності клітин у виробничому біореакторі можуть коливатися від приблизно 2х102 життєздатних клітин на мл до приблизно 2х103, 2х104, 2х105, 2х106, 5х106 або 10х106 життєздатних клітин на мл і вище. 33 Початкові й проміжні клітинні культури можуть бути вирощені до будь-якої бажаної щільності перед посівом у наступний проміжний або кінцевий виробничий біореактор. Бажано, щоб більшість клітин залишалися живими до посіву, хоча не вимагається повна або майже повна життєздатність. В одному варіанті втілення даного винаходу, клітини можуть бути вилучені із супернатанта, наприклад, шляхом низькооборотного центрифугування. Може також бути бажаним промити вилучені клітини середовищем перед посівом у наступний біореактор з метою видалення будь-яких небажаних відходів метаболізму або компонентів середовища. Середовище може бути тим середовищем, у якому попередньо вирощувались клітини, або може бути іншим середовищим чи промивним розчином, обраним практичним виконавцем даного винаходу. Після цього клітини можуть бути розведені до відповідної щільності для посіву у виробничий біореактор. В оптимальному варіанті втілення даного винаходу, клітини розводять в тому ж самому середовищі, що буде використовуватися у виробничому біореакторі. Альтернативно, клітини можуть бути розведені в іншому середовищі або розчині, залежно від потреб і бажань практичного виконавця даного винаходу, або з метою пристосування до конкретних потреб безпосередньо клітин, наприклад, якщо вони повинні зберігатися упродовж короткого проміжку часу до посіву у виробничий біореактор. Початкова фаза росту Як тільки виробничий біореактор був засіяний в описаний вище спосіб, клітинну культуру підтримують в початковій фазі росту за умов, що сприяють виживанню, росту й життєздатності клітинної культури. Точні умови варіюють залежно від типу клітин, організму, з якого клітина була отримана, і природи та характеру поліпептиду або білка, що експресується. Відповідно до даного винаходу виробничий біореактор може бути будь-якого об'єму, що підходить для великомасштабного виробництва поліпептидів або білків. В оптимальному варіанті втілення об'єм виробничого біореактору становить принаймні 500 літрів. В інших оптимальних варіантах втілення об'єм виробничого біореактору становить 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 літрів або більше, чи має будь-який проміжний об'єм в цих межах. Звичайний спеціаліст в даній галузі знатиме й матиме змогу обрати підходящий біореактор для використання в практичному втіленні даного винаходу. Виробничий біореактор може бути сконструйований з будь-якого матеріалу, що є сприятливим для росту й життєздатності клітин, що не перешкоджає експресії або стабільності поліпептиду або білка, що експресується. Температура клітинної культури в початковій фазі росту буде обиратися на підставі насамперед діапазону температур, при яких клітинна культура залишається життєздатною. Наприклад, протягом початкової фази росту, клітини СНО добре ростуть при 37°С. Зазвичай, більшість клітин ссавців добре ростуть в межах діапазону приблизно від 25°С до 42°С. Бажано, щоб клітини ссавців добре росли в 93859 34 межах діапазону приблизно від 35°С до 40°С. Звичайні спеціалісти в даній галузі матимуть змогу обрати відповідну температуру або температури для вирощування клітин, залежно від потреб клітин і виробничих вимог практичного виконавця. В одному варіанті втілення даного винаходу температура початкової фази росту підтримується як єдина, постійна температура. В іншому варіанті втілення температура початкової фази росту підтримується в межах діапазону температур. Наприклад, протягом початкової фази росту температура може стійко збільшуватись або зменшуватись. Альтернативно, упродовж початкової фази росту температура може збільшуватись або зменшуватись дискретними кількостями в різні проміжки часу. Звичайний спеціаліст в даній галузі матиме змогу визначити доцільність застосування однієї або кількох температур і стійкого чи дискретного характеру зміни температури. Протягом початкової фази росту клітини можуть вирощуватися упродовж довшого або коротшого проміжку часу, залежно від потреб практика й потреб безпосередньо клітин. В одному варіанті втілення клітини вирощують упродовж періоду часу, який є достатнім для досягнення щільності життєздатних клітин, що є встановленим відсотком від максимальної щільності життєздатних клітин, якої б клітини врешті-решт досягли, якщо б їм надали можливість рости без втручань. Наприклад, клітини можуть бути вирощені упродовж періоду часу, достатнього для досягнення бажаної щільності життєздатних клітин, що становить 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 99 відсотків від максимальної щільності життєздатних клітин. В іншому варіанті втілення клітинам надають можливість рости упродовж певного проміжку часу. Наприклад, залежно від початкової концентрації клітинної культури, температури, при якій вирощуються клітини і властивого клітинам темпу росту, клітини можуть вирощуватися упродовж 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше днів. У деяких випадках, клітинам можна надати можливість рости протягом місяця або більше. Клітини б вирощувались упродовж 0 днів у виробничому біореакторі, якби їхній ріст у біореакторі для посіву, при температурі початкової фази росту, був достатній для того, щоб щільність життєздатних клітини у виробничому біореакторі під час його інокуляції уже була на рівні бажаного відсотка від максимальної щільності життєздатних клітин. Практичний виконавець даного винаходу матиме змогу обрати тривалість початкової фази росту залежно від вимог виробництва поліпептиду або білка й потреб безпосередньо клітин. Клітинну культуру можна збовтувати або струшувати протягом початкової фази культивування з метою збільшення насичення киснем й дисперсії поживних речовин до клітин. Відповідно до даного винаходу звичайний спеціаліст в даній галузі розумітиме, що може бути вигідним контролювати або регулювати певні внутрішні умови біореактора протягом початкової фази росту, включаючи, крім інших, рН, температуру, насичення 35 киснем і т.д. Наприклад, рН можна контролювати шляхом додавання відповідної кількості кислоти або основи, а насичення киснем можна контролювати за допомогою барботуючих пристроїв, які є відомими в даній галузі. Заміна умов культивування Відповідно до тактики даного винаходу, наприкінці початкової фази росту може бути замінена принаймні одна з умов культивування для того, щоб застосувати другий набір умов культивування, і відбувся метаболічний зсув у культурі. Накопичення інгібіторних метаболітів, особливо лактату й амонію, інгібує ріст. Метаболічний зсув, що досягається шляхом, наприклад, зміни в температурі, рН, осмоляльності або рівня хімічного індуктанта клітинної культури, може характеризуватися зниженням співвідношення певної швидкості продукування лактату до певної швидкості споживання глюкози. В одному необмежуючому варіанті втілення умови культивування замінюють шляхом заміни температури культивування. Однак, як відомо у даній галузі, заміна температури не є єдиним механізмом, через який можна досягнути відповідного метаболічного зсуву. Наприклад, такий метаболічний зсув може також бути досягнутий шляхом заміни інших умов культивування, включаючи, крім інших, рН, осмоляльність і рівні натрію бутирату. Як обговорювалося вище, вибір часу заміни культури буде визначатися практичним виконавцем даного винаходу, базуючись на вимогах виробництва поліпептиду або білка чи потребах безпосередньо клітин. При заміні температури культивування температурна заміна може бути відносно поступовою. Наприклад, здійснення зміни температури може займати кілька годин або днів. Альтернативно, температурна заміна може бути відносно різкою. Наприклад, зміна температури може завершитися через менше ніж кілька годин. З огляду на відповідне виробництво й контрольне устаткування, таке як застосовується в якості стандартного в комерційному великомасштабному виробництві поліпептидів або білків, зміна температури може звершитися навіть упродовж менш ніж години. Температура клітинної культури в наступній фазі росту буде обиратися на підставі насамперед діапазону температур, при яких клітинна культура залишається життєздатною й експресує рекомбінантні поліпептиди або білки на комерційно прийнятних рівнях. Зазвичай, більшість клітин ссавців залишаються життєздатними й експресують рекомбінантні поліпептиди або білки на комерційно прийнятних рівнях в межах діапазону приблизно від 25°С до 42°С. Бажано, щоб клітини ссавців залишалися життєздатними й експресували рекомбінантні поліпептиди або білки на комерційно прийнятних рівнях в межах діапазону приблизно від 25°С до 35°С. Звичайні спеціалісти в даній галузі матимуть змогу обрати відповідну температуру або температури для вирощування клітин, залежно від потреб клітин і виробничих вимог практичного виконавця. В одному варіанті втілення даного винаходу температура наступної фази росту підтримується як єдина, постійна температура. В іншому варіанті 93859 36 втілення температура наступної фази росту підтримується в межах діапазону температур. Наприклад, протягом наступної фази росту температура може стійко збільшуватись або зменшуватись. Альтернативно, упродовж наступної фази росту температура може збільшуватись або зменшуватись дискретними кількостями в різні проміжки часу. Звичайний спеціаліст в даній галузі розумітиме, що багаторазові дискретні заміни температур охоплюються в даному варіанті втілення. Наприклад, температура може бути замінена один раз, клітини підтримуються при цій температурі або температурному діапазоні упродовж певного проміжку часу, після якого температура може бути замінена знову - на вищу або нижчу температуру. Температура культури після кожної дискретної заміни може бути постійною або може підтримуватися в межах певного діапазону температур. У Прикладі 16 показані дані, що демонструють ефективність використання двох послідовних змін температур, хоча для звичайних спеціалістів в даній галузі буде зрозуміло, що відповідно до даного винаходу, можуть використовуватися три або більше послідовних змін температур з метою збільшення життєздатності чи щільності клітин і/або збільшення експресії рекомбінантних поліпептидів або білків. Температура або температурні діапазони клітинної культури після кожної послідовної зміни температури можуть бути вищими або нижчими ніж температура (и) або температурний діапазон (и) перед заміною. В оптимальному варіанті втілення даного винаходу, кожна послідовна температура або температурний діапазон є нижчими ніж попередня температура або температурний діапазон. Наступна фаза виробництва Відповідно до даного винаходу, як тільки умови клітинної культивування були замінені як обговорювалося вище, клітинну культуру підтримують упродовж наступної фази виробництва при другому наборі умов культивування, що сприяють виживанню й життєздатності клітинної культури й підходять для експресії бажаного поліпептиду або білка на комерційно прийнятних рівнях. Як обговорювалося вище, культивування може бути замінене шляхом заміни однієї або кількох з низки умов культивування, включаючи, крім інших, температуру, рН, осмоляльність і рівні натрію бутирату. В одному варіанті втілення замінюється температура культивування. Відповідно до цього варіанту втілення упродовж наступної фази виробництва, культуру підтримують при температурі або температурному діапазоні, що є нижчим ніж температура або температурний діапазон початкової фази росту. Наприклад, протягом наступної фази виробництва, клітини СНО добре експресують рекомбінантні поліпептиди й білки в межах діапазону від 25°С до 35°С. Як обговорювалося вище, можуть використовуватися багаторазові дискретні зміни температури з метою збільшення щільності або життєздатності клітин чи збільшення експресії рекомбінантного поліпептиду або білка. Відповідно до даного винаходу, клітини можуть підтримуватися в наступній фазі виробництва до досягнення бажаної щільності клітини або титру 37 виробництва. В одному варіанті втілення клітини підтримують в наступній фазі виробництва до досягнення максимального титру до рекомбінантного поліпептиду або білка. В інших варіантах втілення культура може бути зібрана до цього часу, залежно від виробничих вимог практичного виконавця або потреб безпосередньо клітин. Наприклад, клітини можуть підтримуватися упродовж періоду часу, достатнього для досягнення щільності життєздатних клітин, що становить 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 99 відсотків від максимальної щільності життєздатних клітин. У деяких випадках, може бути бажаним надати можливість щільності життєздатних клітин досягати максимуму, а потім надати можливість щільності життєздатних клітин зменшитися до деякого рівня перед збором урожаю культури. У надзвичайному прикладі, може бути бажаним надати можливість щільності життєздатних клітини наблизитися або досягти нуля перед збором урожаю культури. В іншому варіанті втілення даного винаходу, клітинам надають можливість рости упродовж певного проміжку часу протягом наступної фази виробництва. Наприклад, залежно від концентрації клітинної культури на початку наступної фази росту, температури, при якій вирощуються клітини і властивого клітинам темпу росту, клітини можуть вирощуватися упродовж 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше днів. У деяких випадках, клітинам можна надати можливість рости протягом місяця або більше. Практичний виконавець даного винаходу матиме змогу обрати тривалість наступної фази виробництва залежно від вимог виробництва поліпептиду або білка й потреб безпосередньо клітин. У певних випадках, може бути вигідно або необхідно постачати клітинну культуру протягом наступної фази виробництва поживними речовинами або іншими компонентами середовища, які були вичерпані або метаболізовані клітинами. Наприклад, могло б бути вигідним постачати клітинну культуру поживними речовинами або іншими компонентами середовища, які, як виявилось під час моніторингу клітинної культури, були вичерпані (див. розділ 'Моніторинг умов культивування' нижче). Альтернативно або додатково, може бути вигідно або необхідно підживлювати клітинну культуру перед наступною фазою виробництва. У якості прикладів, крім іншого, може бути вигідно або необхідно постачати клітинну культуру гормонами й/або іншими факторами росту, певними іонами (такими як натрію, хлориду, кальцію, магнію і фосфату), буферами, вітамінами, нуклеозидами або нуклеотидами, мікроелементами (неорганічними сполуками, що зазвичай присутні у дуже низьких кінцевих концентраціях), амінокислотами, ліпідами або глюкозою чи іншим джерелом енергії. Ц додаткові компоненти можуть всі додаватись до клітинної культури одночасно, або їх можна постачати клітинній культурі в серії додавань. В одному варіанті втілення даного винаходу додаткові компоненти постачаються клітинній культурі в різні проміжки часу в пропорційних кількостях. В іншому варіанті втілення може бути бажано надати 93859 38 тільки певну кількість додаткових компонентів спочатку, і постачати компоненти, що залишаються, пізніше. У ще одному варіанті втілення даного винаходу, клітинна культура постійно підживлюється цими додатковими компонентами. Відповідно до даного винаходу, повний об'єм, що додається до клітинної культури повинен, оптимально, підтримуватися на мінімальному рівні. Наприклад, повний об'єм середовища або розчину, що містить додаткові компоненти, які додаються до клітинної культури може становити 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50% об'єму клітинної культури до постачання додаткових компонентів. Клітинну культуру можна збовтувати або струшувати протягом наступної фази виробництва з метою збільшення насичення киснем й дисперсії поживних речовин до клітин. Відповідно до даного винаходу звичайний спеціаліст в даній галузі розумітиме, що може бути вигідним контролювати або регулювати певні внутрішні умови біореактора протягом наступної фази росту, включаючи, крім інших, рН, температуру, насичення киснем і т.д. Наприклад, рН можна контролювати шляхом додавання відповідної кількості кислоти або основи, а насичення киснем можна контролювати за допомогою барботуючих пристроїв, які є відомими в даній галузі. Контроль умов культивування У певних варіантах втілення даного винаходу практик може виявити, що вигідно або необхідно проводити періодичний моніторинг певних умов вирощування клітинної культури. Моніторинг умов культивування клітин дозволяє практикові визначати, чи продукує клітинна культура рекомбінантний поліпептид або білок на субоптимальних рівнях або, чи збирається культура входити в субоптимальну фазу продукування. Щоб проводити моніторинг певних умов культивування клітин, буде необхідно відбирати невеликі аліквоти культури для аналізу. Звичайний спеціаліст в даній галузі розумітиме, що існує потенційна можливість, що такий відбір може бути джерелом контамінації клітинної культури, і вживатиме відповідних заходів з метою мінімізації ризику такої контамінації. У якості прикладів, крім іншого, може бути вигідно або необхідно проводити моніторинг температури, рН, щільності клітин, життєздатності клітин, інтегрованої щільності життєздатних клітин, рівнів лактату, рівнів амонію, осмолярності або титру поліпептиду або білка, що експресується. В даній галузі відомі численні способи, що дозволять звичайному спеціалісту в даній галузі визначати ці умови. Наприклад, щільність клітини може вимірюватись за допомогою гемацитометра, лічильника Coulter або дослідження щільності клітин (CEDEX). Щільність життєздатних клітин може бути визначена шляхом фарбування зразка культури трипаном синім. Оскільки тільки мертві клітини поглинають трипан синій, щільність життєздатних клітин може бути визначена шляхом підрахунку загальної кількості клітин, поділу кількості клітин, які поглинули барвник на загальну кількість клітин і взяття зворотного дробу. Для визначення рівнів 39 лактату, амонію або експресованого поліпептиду чи білка може використовуватися ВЕРХ. Альтернативно, рівень експресованого поліпептиду або білка може бути визначений за допомогою стандартних методів молекулярної біології, таких як фарбування coomassie гелів SDS-PAGE, метод імуноблотингу (Western blotting), тест Бредфорда, тест Лоурі, тест Бюрета і УФ адсобція. Може також бути вигідно або необхідно проводити моніторинг посттрансляційних модифікацій експресованого поліпептиду або білка, включаючи фосфорилювання й глікозилювання. Виділення експресованого поліпептиду Зазвичай, як правило, буде бажано виділяти й/або очищувати білки або поліпептиди, що експресуються відповідно до даного винаходу. В оптимальному варіанті втілення, експресований поліпептид або білок секретується у середовище, і, таким чином, наприклад, шляхом центрифугування або фільтрування, можуть бути вилучені клітини й інші тверді частки, як перший крок у процесі очищення. Цей варіант втілення особливо корисний при використанні відповідно до даного винаходу, тому що способи й композиції, описані авторами, призводять до збільшення життєздатності клітин. Внаслідок цього, менше клітин вмирає протягом процесу культивування, і у середовище вивільняється менше протеолітичних ферментів, що потенційно можуть зменшувати вихід експресованого поліпептиду або білка. Альтернативно, експресований поліпептид або білок зв'язується із поверхнею клітини-хазяїна. У цьому варіанті втілення, середовище видаляється, а клітини- хазяїни, що експресують поліпептид або білок, розщеплюються як перший крок у процесі очищення. Лізис ссавцевих клітин-хазяїнів можна досягти за допомогою низки засобів, добре відомих звичайним спеціалістам в даній галузі, включаючи фізичне руйнування скляними кульками і дію високих рН. Поліпептид або білок можуть бути виділені й очищені стандартними способами, включаючи, крім інших, хроматографію (наприклад, іоннообмінну, афінну, ексклюзійну і гідроксиапатитну хроматографію), гель-фільтрацію, центрифугування або різницю в розчинності, осадження етанолом, або за допомогою будь-яких інших наявних способів для очищення білків (Див., наприклад, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; and Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997, зміст всіх з них включений авторами шляхом посилання). Для імуноафінної хроматографії, зокрема, білок може бути виділений шляхом зв'язування його з афінною колонкою, що містить антитіла, які були утворені проти цього білка й прикріплені до стаціонарної фази. Альтернативно, таги афінності, такі як послідовність оболонки вірусу грипу, полігістидин або глутатіон-8трансфераза можуть бути приєднані до білка за допомогою стандартних рекомбінантних способів, 93859 40 щоб надати можливість для легкого очищення пропусканням через відповідну афінну колонку. Інгібітори протеази, такі як фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ), лейпептин, пепстатин або апротинін можуть додаватись на будь-яких або на всіх стадіях з метою зменшення або нівелювання деградації поліпептиду або білка упродовж процесу очищення. Особливо бажано застосовувати інгібітори протеази, коли необхідно розщепити клітини для виділення й очищення експресованого поліпептиду або білка. Звичайний спеціаліст в даній галузі оцінить, що точна техніка очищення буде варіювати залежно від природи поліпептиду або білка, що підлягає очистці, природи клітин, із яких ескспресується поліпептид або білок, і складу середовища, у якому були вирощені клітини. Фармацевтичні композиції В певних оптимальних варіантах втілення винаходу, вироблені поліпептиди або білки будуть мати фармакологічну активність і будуть корисними для приготування фрмацевтичних препаратів. Сполуки відповідно до винаходу, що описані вище, можна вводити суб'єктові або можна спочатку приготувати у лікарській формі для доставляння будьяким доступним шляхом, включаючи, крім інших, парентеральний (наприклад, внутрішньовенний), внутрішньошкірний, підшкірний, пероральний, назальний, бронхіальний, офтальмічний, трансдермальний (місцевий), трансмукозальний, ректальний і вагінальний шляхи. Фармацевтичні композиції відповідно до винаходу, як правило, включають очищений поліпептид або білок, експресований із клітинної лінії ссавців, агент для доставляння (тобто, катіонний полімер, пептидний молекулярний транспортер, поверхнево-активна речовина, і т.д., як описано вище) у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм. Вжитий авторами термін "фармацевтично прийнятний носій" включає розчинники, дисперсійні середовища, покриття, протибактеріальні та протигрибкові засоби, ізотонічні агенти і засоби для затримки всмоктування, і т.п., сумісні з фармацевтичним введенням. В композиції можуть також бути включені додаткові активні сполуки. Фармацевтичну композицію готують у вигляді лікарської форми таким чином, щоб вона була сумісною з наміченим шляхом введення. Розчини або суспензії, що використовуються для парентерального, внутрішньошкірного або підшкірного застосування можуть включати нижченаведені компоненти: стерильний розчинник, такий як вода для ін'єкцій, фізіологічний розчин, фіксовані олії, поліетиленгліколі, гліцерин, пропіленгліколь або інші синтетичні розчинники; протибактеріальні засоби, такі як бензиловий спирт або метилпарабени; антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота або натрію дисульфіт; хелатуючі агенти, такі як етилендиамінтетраоцтова кислота; буфери, такі як ацетати, цитрати або фосфати і засоби для коригування тонічності, такі як натрію хлорид або декстроза. рН може бути відкоригований за допомогою кислот або основ, таких як натрію гідроксид або хлористоводнева кислота. Препарати для парентерального застосування можуть бути розфасовані в ампули, одноразові шприци або флакони 41 з кількома дозами, виготовлені зі скла або пластмаси. До фармацевтичних композицій, що підходять для ін'єкційного використання, як правило, належать стерильні водні розчини (у випадку водорозчинних речовин) або дисперсії й стерильні порошки для екстемпорального приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсії. У випадку внутрішньовенного введення прийнятні носії включають фізіологічний розчин, бактеріостатичну воду, Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ) або фосфатний буферний розчин (PBS). У всіх випадках, композиція повинна бути стерильною і повинна бути рідкою до того ступеня, щоб легко вводитися шприцем. Оптимальні фармацевтичні композиції є стабільними за умов виготовлення й зберігання й повинні оберігатися від контамінації мікроорганізмами, такими як бактерії та гриби. Зазвичай, відповідний носій може бути розчинником або дисперсійним середовищем, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь, і т.п.) та їх прийнятними сумішами. Належна текучість може підтримуватися, наприклад, за допомогою покриття, такого як лецитин, шляхом підтримування необхідного розміру часток у випадку дисперсії й шляхом використання поверхневоактивних речовин. Запобігання контамінації мікроорганізмами можна досягнути за допомогою різних протибактеріальних й протигрибкових засобів, наприклад, парабенів, хлорбутанолу, фенолу, аскорбінової кислоти, тимерозалу, і т.п. У багатьох випадках, буде бажаним включити в композицію ізотонічні агенти, наприклад, цукор, багатоатомні спирти, такі як манітол, сорбітол або натрію хлорид. Пролонгованої адсорбції ін'єкційних композицій можна досягти шляхом включенням до її складу агента, що затримує всмоктування, наприклад, алюмінію моностеарату і желатину. Стерильні ін'єкційні розчини можуть готуватися шляхом введення очищеного поліпептиду або білка у необхідній кількості у відповідний розчинник з одним або комбінацією перелічених вище компонентів, у разі потреби, після чого проводиться фільтрована стерилізація. Зазвичай, дисперсії готують шляхом введення очищеного поліпептиду або білка, що експресується із клітинної лінії ссавців, в стерильний носій, що містить основне дисперсійне середовище й інші необхідні компоненти із перелічених вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів до оптимальних способів приготування належать вакуумне висушування й сушіння сублімацією, що дає можливість отримати порошок активного компонента плюс будь-який додатковий бажаний компонент із попередньо стерильно-відфільтрованого розчину. Пероральні композиції, зазвичай, включають інертний розчинник або харчовий носій. Для перорального терапевтичного введення очищений поліпептид або білок можуть бути поєднані з допоміжними речовинами й використовуватися у вигляді таблеток, драже або капсул, наприклад, желатинових капсул. Пероральні композиції можуть також бути приготовані з використанням рідкого носія 93859 42 для застосування у вигляді рідини для полоскання рота. У якості складової частини композиції можуть бути включені фармацевтично сумісні агенти зв'язування і/або допоміжні матеріали. Таблетки, пігулки, капсули, драже й т.п. можуть містити будьякий з нижченаведених компонентів або сполук подібної природи: зв'язуючий засіб, такий як мікрокристалічна целюлоза, трагакантова камідь або желатин; наповнювач, такий як крохмаль або лактоза, дезінтегруючий агент, такий як альгінова кислота, Примогель (Primogel) або зерновий крохмаль; любрикант, такий як магнію стеарат або Sterotes; глідант, такий як колоїдний кремнію діоксид; підсолоджувач, такий як сахароза або сахарин; або ароматизатор, такий як м'ята, метилсаліцилат або помаранчевий ароматизатор. У композиціях для перорального введення можуть вигідно застосовуватись засоби для поліпшення стабільності усередині шлунково-кишкового тракту й/або збільшення всмоктування. Для введення шляхом інгаляції композиції відповідно до винаходу, що містять очищений поліпептид або білок, експресований із клітинної лінії ссавців й агента для доставляння, в оптимальному варіанті доставляються у вигляді аерозолю з упаковок під тиском або розпилювача, з застосуванням прийнятного витискувача, наприклад, газу, такого як вуглекислий газ, або розпилювача. Даний винахід, зокрема, охоплює доставляння сполук, використовуючи назальний спрей, інгалятор або інше пряме доставляння до верхніх й/або нижніх дихальних шляхів. Внутрішньоназальне введення ДНК вакцин, спрямованих проти вірусів грипу, як було показано, індукує відповіді CD8 Τ клітин, що вказує на те, що принаймні деякі клітини в дихальних шляхах можуть поглинати ДНК при доставлянні цим шляхом, і агенти для доставляння відповідно до винаходу збільшать клітинне поглинання. Відповідно до певних варіантів втілення винаходу композиції, що містять очищений поліпептид, експресований із клітинної лінії ссавців й агент для доставляння, готуються у вигляді великих пористих часток для аерозольного введення. Системне введення може також здійснюватися трансмукозальним або трансдермальним шляхом. Для трансмукозального або трансдермального введення у композиції використовуються проникаючі засоби у відповідності із бар'єром, через який необхідно проникнути. Такі проникаючі засоби є загальновідомими в даній галузі, і включають, наприклад, для трансмукозального введення, детергенти, жовчні солі і похідні фусидової кислоти. Трансмукозального введення можна досягнути за допомогою назальних спреїв або супозиторіїв. Для трансдермального введення, очищений поліпептид або білок і агенти для доставляння готують у вигляді мазей, бальзамів, гелей або кремів, які є загальновідомими в даній галузі. Композиції можуть також бути приготовані у формі супозиторіїв (наприклад, зі звичайними основами для супозиторіїв, такими як какаомасло й інші гліцериди) або утримуючих клізм для ректального застосування. В одному варіанті втілення композиції готують з носіями, які захистять поліпептид або білок від 43 швидкого виведення з організму, такі як лікарські форми з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати й мікроінкапсульовані системи для доставляння. Можуть використовуватися біологічно сумісні полімери, що розкладаються мікроорганізмами, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоестери і полімолочна кислота. Способи для підготовки таких лікарських форм будуть очевидні для спеціаліста, кваліфікованого в даній галузі. Матеріали можуть також бути отримані комерційно від Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Ліпосомальні суспензії (включаючи ліпосоми, спрямовані на інфіковані клітини з моноклональними антитілами до вірусних антигенів) можуть також використовуватися у якості фармацевтично прийнятних носіїв. Вони можуть бути приготовлені відповідно до способів, відомих спеціалістам, кваліфікованим у даній галузі, наприклад, як описано в Патенті США № 4522811. Вигідно готувати пероральні або парентеральні композиції у формі одиниці дозування для простоти введення й однорідності дозування. Термін «форма одиниці дозування», вжитий авторами, стосується фізично дискретних одиниць, які відповідають одиничним дозуванням для суб'єкта, що підлягає лікуванню; кожна одиниця, що містить попередньо визначену кількість активного поліпептиду або білка в кількості, з розрахунку для досягнення бажаного терапевтичного ефекту у комбінації з необхідним фармацевтичним носієм. Поліпептид або білок, експресований відповідно до даного винаходу можна вводити в різні інтервали і упродовж різних проміжків часу, як потрібно, наприклад, один раз на тиждень упродовж приблизно від 1 до 10 тижнів, від 2 до 8 тижнів, приблизно від 3 до 7 тижнів, приблизно 4, 5, або 6 тижнів, і т.д. Кваліфікований спеціаліст оцінить, що певні фактори можуть впливати на дозування й вибір часу, що необхідні для ефективного лікування суб'єкта, включаючи, крім інших, ступінь тяжкості хвороби або розладу, попереднє лікування, загальний стан здоров'я й/або вік суб'єкта та інші наявні хвороби. Зазвичай, лікування суб'єкта за допомогою поліпептиду або білку, як описано авторами, може включати окреме лікування або, у багатьох випадках, може включати низку схем лікування. Крім того зрозуміло, що відповідні дози можуть залежати від сили дії поліпептиду або білка й можуть бути довільно пристосовані до конкретного реципієнта, наприклад, шляхом введення доз, що збільшуються, до досягнення попередньо встановленої бажаної відповіді. Вважається, що певний рівень дози для будь-якого конкретного тваринного суб'єкта може залежати від різних факторів, включаючи активність певного поліпептиду або білка, що застосовується, вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і раціон харчування суб'єкта, час введення, шлях введення, швидкість екскреції, будь-яку комбінацію препаратів і ступінь експресії або активності, що буде змодульована. Даний винахід включає використання композицій відповідно до винаходу для лікування не 93859 44 свійських тварин. Відповідно, дози й способи введення можуть бути відібрані відповідно до відомих принципів ветеринарної фармакології й медицини. Керівні принципи можна знайти, наприклад, в Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8th edition, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001. Фармацевтичні композиції відповідно до винаходу можуть бути включені в контейнер, пакування або розподіляючий пристрій разом з інструкціями для застосування. Представлений вище опис є пояснювальним і жодним чином не обмежує обсяг винаходу. Альтернативні методи й матеріали для втілення винаходу, а також додаткові заявки будуть очевидними до спеціаліста в даній галузі, і призначені для включення у межах супровідної формули винаходу. Приклади Приклад 1: Удосконалене середовище 1 для підживлюваного процесу анти-GDF-8 Традиційні підживлювані процеси для культивування клітинних ліній мають кілька недоліків, включаючи час і зусилля, необхідні для введення підживлень і потребу в спеціальному устаткуванні у великомасштабних біореакторах. Мета полягала у розробці серійних середовищ для виробництва білків, що розглядаються, у великомасштабних біореакторах, що потребує мінімального підживлення. Матеріали й методи Штами й середовища: клітини яєчника китайського хом'яка ("СНО"), були модифіковані генною інженерією для експресії моноклонального антитіла проти фактора росту й диференціювання 8 ("анти-GDF-8 клітини") (див. Veldman et al., Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses Therefor, US20040142382 A1). Клітини анти-GDF-8 використовувалися для випробування нових серійних середовищ. Середовище 1 і Середовище 2 порівнювали на їхні здатності підтримувати високу щільність й життєздатність клітин. Композиції цих середовищ, а також Середовища 3 перелічені в Таблиці 1. Середовища готують шляхом додавання всіх компонентів, за винятком FeSO4·7H2O. Після цього середовища доводять до рН 7.25, фіксують осмолярність і після цього додають FeSO4·7H2O. Умови культивування: Для експериментів в колбах, клітини анти-GDF-8 вирощували у колбах струшування й пропускали три рази. Для експериментів в біореакторі клітини анти-GDF-8 вирощували упродовж 12 днів, щодня постачали 2% за об'ємом 20Х середовища для підживлення Середовища 4 (Таблиця 3) або 3% за об'ємом 16Х Середовища 4 (Таблиця 4) після дня 5. Протягом перших 4 днів клітини вирощували при 37°С. На день 5 температуру замінили на 31°С. Аналіз зразків: Щоденні зразки відбирали із культур і аналізували на рівні амінокислот, вітамінів, заліза, фосфату, глюкози й глутаміну. 45 93859 46 47 93859 48 49 Результати й висновки Фігура 1 показує, що темп росту клітин антиGDF-8 був подібний і в Середовищі 1, і в Середовищі 2 в експериментах у колбах. Фігура 2 показує, що в біореакторах, Середовище 1 показало істотне збільшення кінцевої щільності й життєздатності клітин у порівнянні з Середовищем 3. Кінцевий титр також значно збільшився, від 551 мг/л для платформного процесу до 976 мг/л із Середовищем 1 (дані не показані). Температура була замінена із 37°С на 31°С у день 5. Через несподіваний високий ріст клітин, культури підживлювали щодня після дня 5 або за допомогою 2% за об'ємом 20Х Середовища 4 або за допомогою 3% за об'ємом 16Х Середовища 4. Таким чином, це не справжній серійний експеримент, як спочатку планувалося. Аспарагін і тіамін додавались в середовища для підживлення, починаючи з дня 10. При розробці концентрованих серійних середовищ потрібно розглянути кілька можливих проблем. По-перше, концентровані поживні речовини могли б виявитися токсичними для клітин. У середовищах, розроблених у цьому Прикладі, всі поживні речовини й компоненти, як визначено, були нижче меж токсичності (дані не показані). По-друге, концентровані серійні середовища обов'язково мають більш високу осмолярність ніж неконцентровані середовища, що як показано, чинить шкідливий вплив на ріст й життєздатність клітин. Цю проблему можна усунути шляхом зниження кількості NaCl у початкових середовищах. Крім того, концентровані серійні середовища міс 93859 50 тять недостатні рівні глюкози для підтримки росту упродовж усього періоду культивування. Таким чином, культури постачали щодня після дня 5 підживленням у вигляді глюкози. По-третє, інсулін і глутамін сприйнятливі до деградації протягом 12-денного періоду культивування. Таким чином, культура постачалась цими компонентами на додаток до глюкози. Нарешті, залізо осаджується із розчину, що містить високі концентрації фосфату при високому рН. Цю проблему можна усунути шляхом додавання заліза наприкінці процесу приготування середовища, після коригування рН до відповідного рівня. Приклад 2: Розробка концентрованого середовища для підживлення (Середовища 5) для клітин анти-GDF-8 у підживлюваному процесі. У Прикладі 1 був розроблений серійний процес для культивування клітин анти-GDF-8 з використанням Середовища 1. Через високу щільність клітин, що спостерігалася протягом процесу, було визначено, що постачання поживними речовинами на додаток до глюкози й глутаміну, все ще є вигідним. Однак, підживлення серії за допомогою 8Х середовища для підживлення Середовища 4 призвело б до надмірного розведення культури. Щоб обійти цю проблему, були розроблені більше концентровані середовища для підживлення. Матеріали й методи та результати В Таблиці 2 зазначається склад Середовища 4А-1, Середовища 4В, Мікроелементи В і Мікроелементи D, що використовуються у композиціях Таблиць 3-7. 51 93859 52 53 20X Середовище 4. Перші концентровані середовища були розроблені як 20ХСередовище 4. Композиція сере 93859 54 довищ для 20Х Середовища 4 надається в Таблиці 3. 55 Композиція середовищ складається з 3 частин: І, II, III. Перша частина - концентрована версія 8ХСередовища 4 з індивідуальними компонентами Середовища 4В, окрім фолієвої кислоти через проблеми з розчинністю цього вітаміну. Друга частина - вихідний розчин заліза, Мікроелементи D і кислотний цистеїн, для уникнення можливого осадження заліза при додаванні в частину І. Частина III - вихідний розчин фолієвої кислоти. Частина І додається 2% за об'ємом щодня, починаючи з дня 5, а частини II й III додаються один раз у день 5 разом з частиною І. 93859 56 Кінцеве значення рН середовищ для підживлення було доведене до 7.0, а осмолярність становила приблизно 1064 мОсм. 2% підживлення призведе до зростання глюкози на 2г/л, глутаміну на 2 мМ і осмолярності на 14 мОсм для культури. 2. 16X Середовище 4. Для зменшення зростання осмолярності середовища для підживлення змінили із 20Х Середовища 4 (2% за об'ємом щодня) до 16ХСередовища 4 (3% за об'ємом щодня). Композиція середовищ для 16Х Середовища 4 надається в Таблиці 4. 57 У цьому модифікованому 16Х Середовищі 4 також усунули глюкозу з метою подальшого зменшення осмолярності і надання певної гнучкості підживлення глюкозою. Сумарна осмолярність середовищ для підживлення тепер становить 295 мОсм. 3. 16Х Середовище 4. 93859 58 В композицію 16Х Середовища 4 були внесені зміни. В підживлення додавали вихідний розчин заліза, що призвело до добавки 0,45 мкМ з кожним підживленням. Крім цього, знову додали глюкозу, щоб надавати 1,5 г/л з кожним підживленням. Композиція середовищ для цього модифікованого 16Х Середовища 4 надається в Таблиці 5. 59 4. 16X Середовище 4. У цьому випадку, середовища для підживлення (16Х Середовище 4) були зроблені в комбінованих середовищах замість 3 окремих підживлень як в останніх кількох серіях. Були проведені тести, щоб гарантувати, що фолієва 93859 60 кислота може бути розчинена при необхідній концентрації й, що ні залізо, ні фолієва кислота не випадуть в осад з розчину після зберігання або при 4°С, або при кімнатній температурі упродовж 6 днів. Композиція середовищ для комбінованого 16Х Середовища 4 надається в Таблиці 6.

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Production of polypeptides

Автори англійською

DRAPEAU DENIS, Luan, Yen-Tung, Merser James, Wang, Wenge, LASKO DANIEL

Назва патенту російською

Производство полипептидов

Автори російською

Драпо Дени, Луан Йен-Тунг, Mepcep Джеймс P., Ванг Венг, ЛЕСКО Дениэл P.

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/85, C12N 5/00, C12P 21/02

Мітки: поліпептидів, виробництво

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/91-93859-virobnictvo-polipeptidiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Виробництво поліпептидів</a>

Подібні патенти