Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання
Формула / Реферат
1. Гуманізоване антитіло, яке зв'язується з VLQELNVTV (SEQ ID NO: 45) при зв'язуванні з рецептором HLA-A2,
вказане антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить CDR, що складаються з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 3, 60 і 5, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить CDR, що складаються з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 8, 9 і 10, відповідно.
2. Антитіло за п. 1, в якому вказане антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 16, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що складається з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 19 або 20.
3. Антитіло за п. 2, в якому вказане антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що складається з послідовності SEQ ID NO: 16, і константну ділянку важкого ланцюга, яка являє собою константну ділянку важкого ланцюга гамма-1 людини, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що складається з послідовності SEQ ID NO: 19, і константну ділянку легкого ланцюга, яка являє собою константну ділянку легкого ланцюга каппа людини.
4. Антитіло за п. 2, в якому вказане антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що складається з послідовності SEQ ID NO: 16, і константну ділянку важкого ланцюга, яка являє собою константну ділянку важкого ланцюга гамма-1 людини, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що складається з послідовності SEQ ID NO: 20, і константну ділянку легкого ланцюга, яка являє собою константну ділянку легкого ланцюга каппа людини.
5. Антитіло за будь-яким з пп. 1-4, в якому антитіло є виділеним або очищеним.
6. Антитіло за будь-яким з пп. 1-5, в якому зазначене антитіло злите з пептидом, що не є пептидом антитіла, або поліпептидним сегментом.
7. Антитіло за будь-яким з пп. 1-6, яке приєднане до діагностичного реагенту, вибраного з групи, яка складається з флуорофору, хромофору, барвника, радіоактивного ізотопу, хемілюмінесцентної молекули, парамагнітного іона або реагенту спінової пастки, або яке приєднане до терапевтичного засобу, вибраного з групи, яка складається з цитокіну, хіміотерапевтичного засобу, радіотерапевтичного засобу, гормону, фрагмента Fc антитіла, агоніста TLR, CpG-вмісної молекули або імунної ко-стимуляторної молекули.
8. Нуклеїнова кислота, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла за п. 1 або 2.
9. Нуклеїнова кислота, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла за п. 1 або 2.
10. Вектор експресії, що містить нуклеїнову кислоту за п. 8 і/або 9.
11. Клітина-хазяїн, де нуклеїнова кислота, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла за п. 2, і нуклеїнова кислота, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла за п. 2, введені в клітину-хазяїна.
12. Клітина-хазяїн, де нуклеїнова кислота, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла за п. 3, і нуклеїнова кислота, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла за п. 3, введені в клітину-хазяїна.
13. Спосіб одержання гуманізованого антитіла, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 11 в умовах, що підтримують експресію гуманізованого антитіла, яке зв'язується з VLQELNVTV (SEQ ID NO: 45) при зв'язуванні з рецептором HLA-A2.
14. Спосіб отримання гуманізованого антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 12 в умовах, що підтримують експресію гуманізованого антитіла, яке зв'язується з VLQELNVTV (SEQ ID NO: 45) при зв'язуванні з рецептором НLA-A2.
15. Гуманізоване антитіло, отримане способом за п. 13, яке зв'язується з VLQELNVTV (SEQ ID NO: 45) при зв'язуванні з рецептором HLA-A2.
16. Гуманізоване антитіло, отримане способом за п. 14, яке зв'язується з VLQELNVTV (SEQ ID NO: 45) при зв'язуванні з рецептором HLA-A2.
17. Антитіло за п. 15 або 16, яке приєднане до діагностичного реагенту, вибраного з групи, що складається з флуорофору, хромофору, барвника, радіоактивного ізотопу, хемілюмінесцентний молекули, парамагнітного іона або реагенту спінової пастки, або яке приєднано до терапевтичного засобу, вибраного з групи, що складається з цитокіну, хіміотерапевтичного засобу, радіотерапевтичного засобу, гормону, фрагмента Fc антитіла, агоніста TLR, CpG-вмісної молекули або імунної ко-стимуляторної молекули.
18. Антитіло за будь-яким з пп. 1-7 або 15-17 для застосування в способі лікування індивіда зі злоякісним новоутворенням, що включає введення антитіла вказаному індивіду.
19. Антитіло за п. 18, де вказане злоякісне новоутворення вибране з групи, яка складається з пухлини голови і шиї, мозку, стравоходу, молочної залози, легенів, печінки, селезінки, шлунка, тонкої кишки, товстої кишки, прямої кишки, яєчників, матки, шийки матки, простати, яєчок, шкіри, або де злоякісне новоутворення являє собою злоякісне захворювання крові, вибране з групи, яка складається з лейкозу або лімфоми.
20. Антитіло за п. 18 або 19, де вказане злоякісне новоутворення є рецидивним або метастатичним.
Текст
Реферат: Винахід стосується гуманізованого антитіла, яке зв’язується з VLQELNVTV (SEQ ID NO: 45) при зв’язуванні з рецептором HLA-A2, нуклеїнової кислоти, клітини-хазяїна, вектора, способу одержання та застосування вказаного антитіла для діагностики і лікування злоякісних пухлин і імунно-споріднених захворювань. UA 114108 C2 (12) UA 114108 C2 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За даною заявкою вимагається пріоритет попередньої заявки США із серійним № 61/669967, поданої 10 липня 2012 року, і 61/702916, поданої 19 вересня 2012 року, повний зміст яких включений в даний опис як посилання. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Винахід був здійснений за підтримки Уряду грантом номер P50 CA100632, присудженим Національним інститутом раку/Національним інститутом здоров'я. Уряд має певні права на даний винахід. 1. Галузь техніки винаходу Даний винахід загалом стосується галузі злоякісних пухлин і імунотерапії. Зокрема, винахід стосується імунодіагностичних і імунотерапевтичних антитіл для лікування і профілактики злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання. 2. Опис передумов винаходу Імунну систему довгий час безпосередньо пов'язують з регулюванням раку; при цьому, свідчення про конкретні й ефективні імунні реакції при злоякісних пухлинах у людини є недостатнім. При хронічному мієлогенному лейкозі (CML) ні алогенна трансплантація кісткового мозку (BMT), ні терапія інтерфероном-α2b (IFN-α2b) не приводили до повної ремісії, але механізм контролю захворювання невідомий і може включати імунні протилейкозні відповіді. На підставі даних рівня техніки вважається, що лімфоцити відіграють важливу роль в опосередкуванні протилейкозного ефекту. Дослідження показали, що інфузії алогенних донорських лімфоцитів (DLI) були використані для лікування рецидиву мієлобластного лейкозу після алогенної BMT (Giralt and Kolb, 1996; Kolb and Holler, 1997; Kolb et al., 1995; Kolb et al., 1996; Antin, 1993). Трансфузія лімфоцитів від вихідного донора кісткового мозку (BM) індукує як гематологічні, так і цитогенетичні відповіді приблизно у 70-80 % пацієнтів із хронічним мієлоцитарним лейкозом (CML) при хронічній формі (CP) (Kolb et al., 1996, Kolb and Holler, 1997). Ремісії після DLI при AML (гострий мієлобластний лейкоз), як правило, не такі тривалі, як ремісії, одержані при хронічній формі CML, що може відображати швидку кінетику пухлинного росту, що випереджає кінетику розвитку імунної відповіді. Крім того, більшість пацієнтів з мієлоїдними формами лейкозу вмирають від хвороби, якщо не проходять лікування алогенною трансплантацією кісткового мозку, при якому пов'язаний з ним ефект "трансплантат проти лейкозу" (GVL) виліковує пацієнтів. Однак, реакція "трансплантант проти хазяїна" (GVHD) і пов'язана з трансплантатом токсичність обмежує таке лікування. Вважається, що GVL може бути відділений від GHVD і націлювання імунної відповіді на пов'язані з лейкозом антигени дозволить передавати пацієнтам GVL без GHVD. Таким чином, якщо визначити більше антигенів (тобто антигени лейкозу або антигени інших видів злоякісних пухлин) і якщо одержати більшу кількість найбільш ефективних антигенспецифічних цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL), то це дозволило б розробити лейкозспецифічну терапію, терапію, специфічну для раку молочної залози й ін., використовуючи антигени як мішені для вакцин або для генерування специфічних Т-клітин для використання в адоптивній імунотерапії. PR1, HLAA2.1-рестриктований нонамер, одержаний із протеїнази 3 (P3) і еластази, був ідентифікований як асоційований з лейкозом антиген (Molldrem et al., 2000; Molldrem et al., 1996; Molldrem et al., 1997; Molldrem et al., 1999; Molldrem et al., 2003, кожний з яких включений у даний опис як посилання в повному обсязі). Висновок про те, що PR1 являє собою пов'язаний з лейкозом антиген, був незалежно підтверджений Burchert et al. (2002) і Scheibenbogen et al. (2002). CTL, специфічних для PR1, знищують клітини AML, CML і MDS, але не нормальні клітини кісткового мозку. У дійсній фазі I/II дослідження вакцини пептид PR1 вводили пацієнтам з AML, CML і MDS, і PR1-специфічний CTL-імунітет був викликаний у 47 % пацієнтів і клінічні відповіді спостерігалися у 26 %. Таким чином, цей антиген представляє інтерес як база для подальшого дослідження протиракових імунних відповідей, а також для розробки нових терапевтичних засобів. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Таким чином, даний винахід стосується виділеного й очищеного антитіла, яке зв'язується з VLQELNVTV (SEQ ID NO:45) у випадку зв'язування з рецептором HLA-A2, зазначене антитіло має CDR важкого ланцюга, включаючи SEQ ID NО:3, 60 і 5, і CDR легкого ланцюга, включаючи SEQ ID NО:8, 9 і 10. Антитіло може являти собою антитіло миші, одноланцюжкове антитіло, біспецифічне антитіло, злите з пептидним або поліпептидним сегментом, відмінним від пептидного або поліпептидного сегмента антитіла, зв'язаним з діагностичним реагентом (наприклад, флуорофором, хромофором, барвником, радіоактивним ізотопом, хемілюмінесцентною молекулою, парамагнітним іоном або реагентом спінової пастки), зв'язаним з терапевтичним реагентом (наприклад, цитокіном, хіміотерапевтичним засобом, 1 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 радіотерапевтичним засобом, гормоном, Fc-фрагментом антитіла, агоністом TLR, CpG-вмісною молекулою або імунною костимуляторною молекулою), гуманізованим антитілом або комбінацією перерахованого вище. Біспецифічне антитіло може мати, на доповнення до афінності зв'язування з SEQ ID NO:45, афінність зв'язування з B-клітинами (CD19, CD20), NKклітинами, фагоцитами (CD16) або моноцитами (CD14). Зокрема, гуманізоване антитіло може мати послідовності легкого ланцюга/важкого ланцюга SEQ ID NО:40 і 38 або SEQ ID NO:42 і 38 і SEQ ID NO:42 і 44. В іншому варіанті здійснення винахід стосується нуклеїнової кислоти, що кодує CDR легкого ланцюга, кодовані SEQ ID NO:8, 9 і 10. Нуклеїнова кислота може кодувати SEQ ID NO:7 або SEQ ID NO:14 або може кодувати SEQ ID NO:25 і SEQ ID NO:27. Нуклеїнова кислота може додатково містити промоторну послідовність, розташовану в 5'-напрямку від нуклеїнової кислоти, що кодує CDR легкого ланцюга, наприклад промоторну послідовність, активну в клітинах еукаріот або клітинах прокаріот. Нуклеїнова кислота може бути розташована в реплікованому векторі, такому як вірусний вектор або вектор, відмінний від вірусного вектора. Нуклеїнова кислота може додатково містити кодуючі лінкер сегменти, де зазначені кодуючі лінкер сегменти розташовуються між зазначеними сегментами, що кодують CDR, такими як сегменти, що кодують мотив спіраль-петля-спіраль. У ще одному варіанті здійснення винахід стосується штучного антитіла, яке містить кодуючий важкий ланцюг сегмент, який містить CDR, що містять послідовності SEQ ID NO:3, 60 і 5; і яке містить кодуючий легкий ланцюг сегмент, який містить CDR, що містять послідовності SEQ ID NO:8, 9 і 10. CDR можуть бути з'єднані синтетичними лінкерами. Важкий ланцюг може бути злитий з пептидним або поліпептидним сегментом, відмінним від пептидного або поліпептидного сегмента антитіла. Антитіло може бути з'єднане з діагностичним реагентом, таким як флуорофор, хромофор, барвник, радіоактивний ізотоп, хемілюмінесцентна молекула, парамагнітний іон або реагент спінової пастки. Антитіло може бути з'єднане з терапевтичним реагентом, таким як цитокін, токсин, хіміотерапевтичний засіб, радіотерапевтичний засіб, гормон, Fc-фрагмент антитіла, еластаза нейтрофілів, протеїназа 3, агоніст TLR, CpG-вмісна молекула або імунна костимуляторна молекула. Легкий ланцюг може містити SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:25 і SEQ ID NO:27, і/або важкий ланцюг містить SEQ ID NO:38 або SEQ ID NO:44. У ще одному варіанті здійснення винахід стосується способу одержання антитіла, який включає (a) введення в клітину-хазяїна (і) послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг, що містить CDR з послідовностями SEQ ID NO:3, 60 і 5, і (ii) послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує легкий ланцюг, що містить CDR з послідовностями SEQ ID NO:8, 9 і 10; і (b) культивування зазначеної клітини-хазяїна в умовах, підтримуючих експресію зазначених легких і важких ланцюгів. Спосіб може додатково включати виділення зазначеного антитіла. Спосіб може додатково включати стадію з'єднання зазначеного антитіла з діагностичним або терапевтичним засобом. У додатковому варіанті здійснення винахід стосується способу детекції патологічних клітин у зразку, що передбачувано містить патологічні клітини, який включає приведення зазначеного зразка в контакт з антитілом або штучним антитілом, як описано вище. Антитіло або штучне антитіло може бути кон'юговане з діагностичним засобом (наприклад, флуорофором, хромофором, барвником, радіоактивним ізотопом, хемілюмінесцентною молекулою, парамагнітним іоном або реагентом для спінової пастки). Антитіло або штучне антитіло може бути детектоване з використанням вторинної зв'язувальної речовини, такої як антитіло проти Fc-рецептора. Зразок може являти собою (a) пухлину тканини голови і шиї, мозку, стравоходу, молочної залози, легень, печінки, селезінки, шлунка, тонкої кишки, товстої кишки, прямої кишки, яєчників, матки, шийки матки, простати, яєчок або шкірної тканини, або (b) рідину, таку як кров, лімфа, сеча, аспірат кісткового мозку або аспірат соска. Зразок може бути взятий з резекції основи пухлини. Спосіб може додатково включати прийняття лікувального рішення на основі наявності, відсутності або ступеня детекції, наприклад рішення про лікування зазначеного індивідуума пептидною вакциною на основі PR-1. Спосіб дозволяє проводити детекцію первинних злоякісних клітин, метастатичних злоякісних клітин або мієлоїдних диспластичних клітин. У додатковому варіанті здійснення винахід стосується способу лікування індивідуума, що має злоякісну пухлину, який включає введення зазначеному індивідууму антитіла або штучного антитіла, як описано вище. Антитіло або штучне антитіло може бути кон'юговане з терапевтичним засобом. Злоякісна пухлина може являти собою солідну пухлину, таку як пухлина голови і шиї, пухлина головного мозку, пухлина стравоходу, пухлина молочної залози, пухлина легені, пухлина печінки, пухлина селезінки, пухлина шлунка, пухлина тонкого 2 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кишечнику, пухлина товстої кишки, пухлина прямої кишки, пухлина яєчника, пухлини матки, пухлина шийки матки, пухлина передміхурової залози, пухлина яєчка або пухлина шкіри. Злоякісна пухлина може являти собою рак крові, такий як лейкемія або лімфома. Терапевтичний засіб може являти собою цитокін, хіміотерапевтичний засіб, радіотерапевтичний засіб, гормон, Fc-фрагмент антитіла, агоніст TLR, CpG-вмісну молекулу або імунну костимуляторну молекулу. Спосіб може додатково включати проведення у зазначеного індивідуума додаткової протипухлинної терапії, такої як генна терапія, хіміотерапія, променева терапія, гормональна терапія, токсинотерапія або хірургія. Антитіло або штучне антитіло можна вводити зазначеному індивідууму більше одного разу. Злоякісна пухлина може являти собою рецидивуючий або метастатичний рак. Антитіло можна вводити зазначеному індивідууму більше одного разу. У ще одному додатковому варіанті здійснення винахід стосується способу лікування індивідуума, що страждає на аутоімунне захворювання, який включає введення зазначеному індивідууму антитіла або штучного антитіла, як описано вище. Аутоімунне захворювання може являти собою гранулематоз Вегенера, синдром Черга-Стросса або системний васкуліт невеликих судин. Антитіло або штучне антитіло може бути кон'юговане з терапевтичним засобом, таким як токсин або індукуючий апоптоз засіб. Спосіб може додатково включати проведення у зазначеного індивідуума другої антиаутоімунної терапії. Друга антиаутоімунна терапія може являти собою терапію протизапальними засобами. Антитіло можна вводити зазначеному індивідууму більше одного разу. Крім того, винахід стосується способу індукції комплемент-опосередкованої цитотоксичності HLA-A2 злоякісні клітини, який включає приведення зазначеної злоякісної клітини в контакт з антитілом або штучним антитілом, як описано вище. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується способу детекції патологічних клітин у зразку, що передбачувано містить патологічні клітини, який включає приведення зазначеного зразка в контакт з антитілом або штучним антитілом, як описано вище. Антитіло або штучне антитіло може бути кон'юговане з діагностичним засобом (таким як флуорофор, хромофор, барвник, радіоактивний ізотоп, хемілюмінесцентна молекула, парамагнітний іон або реагент спінової пастки). Детекцію антитіла або штучного антитіла можна проводити з використанням вторинної зв'язувальної речовини, такої як антитіло проти Fc-рецептора. Зразок може являти собою (a) пухлину тканини голови і шиї, мозку, стравоходу, молочної залози, легень, печінки, селезінки, шлунка, тонкої кишки, товстої кишки, прямої кишки, яєчника, матки, шийки матки, простати, яєчка або шкірної тканини, або (b) рідину, таку як кров, лімфа, сеча, аспірат кісткового мозку або аспірат соска. Зразок може бути узятий з резекції основи пухлини. Спосіб може додатково включати прийняття лікувального рішення на основі наявності, відсутності або ступеня детекції, наприклад рішення про лікування зазначеного пацієнта пептидною вакциною на основі PR-1. Спосіб дозволяє проводити детекцію первинних злоякісних клітин, метастатичних злоякісних клітин або мієлоїдних диспластичних клітин. У ще одному варіанті здійснення винахід стосується способу лікування індивідуума, що має злоякісну пухлину, який включає введення зазначеному індивідууму антитіла або штучного антитіла, як описано вище. Антитіло або штучне антитіло може бути кон'юговане з терапевтичним засобом, таким цитокін, хіміотерапевтичний засіб, радіотерапевтичний засіб, гормон, Fc-фрагмент антитіла, агоніст TLR, CpG-вмісна молекула або імунна костимуляторна молекула. Злоякісна пухлина може являти собою солідну пухлину, таку як пухлина голови і шиї, пухлина головного мозку, пухлина стравоходу, пухлина молочної залози, пухлина легені, пухлина печінки, пухлина селезінки, пухлина шлунка, пухлина тонкого кишечнику, пухлина товстої кишки, пухлина прямої кишки, пухлина яєчника, пухлина матки, пухлина шийки матки, пухлина передміхурової залози, пухлина яєчка або пухлина шкіри. Крім того, злоякісна пухлина може являти собою рак крові, такий як лейкемія або лімфома. Злоякісна пухлина може бути рецидивуючим або метастатичним раком. Спосіб може додатково включати проведення у зазначеного індивідуума другої антиракової терапії, такої як генна терапія, хіміотерапія, променева терапія, гормональна терапія, токсинотерапія або хірургія. Антитіло або штучне антитіло можна вводити зазначеному індивідууму більше одного разу. У додатковому варіанті здійснення винахід стосується способу лікування індивідуума, що страждає на аутоімунне захворювання, який включає введення зазначеному індивідууму антитіла або штучного антитіла, як описано вище. Аутоімунне захворювання може являти собою гранулематоз Вегенера, синдром Чарга-Стросса або системний васкуліт невеликих судин. Антитіло або штучне антитіло може бути кон'юговане з терапевтичним засобом, таким як токсин або індукуючий апоптоз засіб. Спосіб може додатково включати проведення у 3 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зазначеного індивідуума другої антиаутоімунної терапії, такої як терапія протизапальними засобами. Антитіло можна вводити зазначеному індивідууму більше одного разу. Додаткові способи включають: (і) лікування індивідуума з мієлоїдним диспластичним захворюванням, що включає введення зазначеному індивідууму антитіла або штучного антитіла, описаного вище; і (ii) індукування комплемент-опосередкованої цитотоксичності злоякісної клітини HLA-A2, що включає приведення зазначеної злоякісної клітини в контакт з антитілом або штучним антитілом, описаним вище. Hu1-8F4 і Hu2-8F4 належать до Hu8F4-1 і Hu8F4-2, відповідно. Крім того, термін "Hu8F4" у даному документі стосується, як правило, обох гуманізованих форм 8F4 (Hu8F4-1 і Hu8F4-2). Інші об'єкти й ознаки даного винаходу стануть очевидні з наступного докладного опису. Варто розуміти, однак, що докладний опис і конкретні приклади, при указанні переважних варіантів здійснення винаходу, наведені як ілюстрація, оскільки різні зміни і модифікації без відхилення від суті й обсягу винаходу стануть очевидними для фахівця в даній галузі з цього докладного опису. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Наступні креслення складають частину даного опису і включені для додаткової демонстрації певних аспектів даного винаходу. Винахід можна краще зрозуміти при звертанні до одного або декількох з цих креслень у сполученні з докладним описом конкретних варіантів здійснення, представлених у даному документі. Фіг. 1. Специфічність 8F4 до PR1/HLA-A2. ELISA з рекомбінантним пептидом/мономерами HLA-A2, навантаженими PR1 або аналогами PR1 з модифікованими окремими амінокислотами. Для визначення положень амінокислот у PR1-послідовності, які необхідні для оптимального 8F4-зв'язування, мономери HLA-A2 навантажували пептидами, що містять заміни аланіну в PR1 (ALA1-ALA9), що покриває ямки планшета для мікротитрування в зростаючих концентраціях. Ямки потім інкубували з 8F4 у фіксованій концентрації або контрольним антитілом bb7.2 (HLAA*0201 алелеспецифічне мишаче моноклональне антитіло Ig2a). Зв'язування визначали способом ELISA з використанням кон'югованих з пероксидазою козячих антимишачих антитіл. 8F4 зв'язувалося з HLA-A2, навантаженим PR1 і більшістю PR1-аналогів, значно менше зв'язувалося з аналогом ALA1 (заміна аланіну на валін у положенні 1 пептиду) і не зв'язувалося з контрольним пептидом pp65/HLA-A2. Контрольне антитіло bb7.2 зв'язувалося однаково добре з PR1- і pp65-навантаженим HLA-A2. Фіг. 2. Афінність моноклонального антитіла 8F4 до PR1/HLA-A2. Вимірювання афінності зв'язування пептид/HLA-A2 з антитілами 8F4 і bb7.2 проводили за допомогою поверхневого плазмонного резонансу з використанням BIAcore 3000. Тестовані антитіла захоплювалися покритими антимишачими антитілами поверхнями. Аналіт, пептид/HLA-A2, розбавляли до 100 нМ і тестували в двох повторностях на зв'язування з покритими антитілами поверхнями. Аналіз проводили при 25С з використанням PBS з 0,005 % Tween-20, 0,1 мг/мл BSA, рН 7,4, як робочого буфера. Для одержання афінності зв'язування експериментальні дані були узгоджені з кінетичною моделлю першого порядку (показано оранжевими лініями на Фігурах) і надалі визначали KD для 8F4 і bb7.2. Фіг. 3. Специфічність 8F4 до HLA-A2+AML. Багатопараметрична проточна цитометрія лейкемії і нормальних PBMC з 8F4 і антитілами клітинної поверхні. PBMC з AML-пацієнтів і здорових донорів стробували на живих клітинах за допомогою aqua і потім забарвлювали 8F4 (кон'югованим з ALEXA Fluor 647), bb7.2 (кон'югованим з FITC) і антитілами поверхневого фенотипу для CD13 і CD33, і аналізували способом проточної цитометрії. Використовували наступну стратегію стробування: aqua-живі клітини аналізували на експресію CD13 і CD33, і подвійні позитивні клітини аналізували на експресію PR1/HLA-A2 (8F4) і загальну HLA-A2експресію (bb7.2). Негативний квадрант стробування був установлений за допомогою HLA-A2негативних AML контрольних клітин. Фіг. 4A-B. Антитіло 8F4 індукує комплементзалежну цитотоксичність (CDC) AML. Клітини5 мішені промивали і ресуспендували в 10-RPMI/HEPES до концентрації 510 клітин/мл. Двадцять мікролітрів (мкл) антитіл і 100 мкл клітин змішували і підігрівали до 37 °C у 96-ямкових планшетах, потім 20 мкл охолодженого в льоду стандартного кролячого комплементу (Cedarlane, Онтаріо, Канада) додавали і інкубували при 37 °C протягом 90 хв. Цитотоксичність визначали за допомогою Cyto-Tox Glo Cytotoxicity Assay (Promega). Антитілоспецифічну CDC (AB-CDC) розраховували як: AB-CDC = ((LC+AB-LС-AB)/(Lmax-Ls))100 %, де LC+AB являє собою лізис клітини-мішені в присутності комплементу плюс антитіло; LT+С являє собою лізис у присутності тільки комплементу; Lspont і Lmax вимірювали до і після додавання цитотоксичного засобу дигітоніну до клітин, відповідно до інструкцій виробника. (Фіг. 4А) Інкубація з 20 мкг 8F4 індукувала комплементзалежну цитотоксичність РВМС і лейкаферезних (LP) клітин, взятих від 4 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 HLA-A2+AML пацієнтів, але не лізувала контрольні зразки РВМС від HLA-A2-негативних AML або РВМС від HLA-A2+ нормального донора. (Фіг. 4B) 8F4-опосередкований лізис HLA-A2+AML був залежним від дози антитіла, у той час як ізотипічне контрольне антитіло (Ig2a миші проти KLH) і внутрішньовенний імуноглобулін людини (комерційних IVIG) показали відсутність лізису AML. Фіг. 5. Специфічність 8F4 до AML, але не до нормальних РВМС. Поверхневе забарвлення AML, РВМС і T2-клітин на PR1 і HLA-A2. Клітини забарвлювали антитілом анти-PR1/HLA-A2 (8F4)-alexa-647 (червоний) і анти-HLA-A2-FITC кон'югованим (зелений), фіксували 1 % параформальдегідом, а потім вивчали за допомогою конфокальної мікроскопії. T2-клітини піддавали імпульсу PR1-пептидом (20 мкг/мл) як позитивним контролем і CMV пептидом pp65 (20 мкг/мл) як негативним контрольним пептидом. Експресія PR1/HLA-A2 видна на поверхні клітин AML і підданих PR1-імпульсу T2-клітин, але не на поверхні HLA-A2+ РВМС або підданих pp65-імпульсу T2-клітин. DAPI синій був використаний для ядерного забарвлення. Фіг. 6. Антитіл 8F4 запобігає приживленню AML у in vivo моделі. Первинні HLA-A2+ лейкозні 6 клітини (10 ) відмивали, ресуспендували в PBS (100 мкл), змішували з 8F4 або контрольним ізотипічним антитілом (20 мкг) і внутрішньовенно ін'єктували в 200 сГр-опромінених HLA-A2+ трансгенних NOD/SCID мишей. Через два тижні мишей забивали, розтинали і тканини гомогенізували й аналізували на наявність лейкозних клітин способом проточної цитометрії за допомогою маркерів клітинної поверхні людини і миші. Наведені результати проточної цитометрії клітин, виділених з кісткового мозку (BM) миші. Контрольні (PBS-оброблені) і експериментальні тварини, що одержали клітини AML плюс 8F4 (AML+ антитіло 8F4), не демонстрували ніяких клітин лейкозу людини у ВМ. На відміну від цього тварини, що одержували клітини AML плюс контрольне антитіло (AML+ ізотипічний контроль), продемонстрували наявність клітин CD33+CD45+ людини в кістковому мозку, з таким же фенотипом, що і AML, що вводяться. Фіг. 7. Стратегія імунізації для одержання антитіла анти-PR1/HLA-A2. Схематичне зображення молекули МНС класу I. Клас МНС складається з важкого ланцюга і ланцюга β2 мікроглобуліну. Пептидний антиген зв'язується з канавкою МНС-I, що фланкована α1 і α2 спіральними доменами ланцюга. Фіг. 8A-B. Антитіло 8F4 запобігає приживленню AML людин у HLA-A2 Tg 6 ксенотрансплантатної моделі. Первинні HLA-A2+AML клітини (10 ) відмивали, ресуспендували в PBS (250 мкл), змішували з 20 мкг 8F4 або контрольного ізотипічного антитіла і внутрішньовенно вводили в сублетально опромінених (200 сГр) HLA-A2 Tg NOD/SCID мишей. У призначений час периферичну кров, кістковий мозок і тканини аналізували на наявність лейкозу за допомогою гістохімії (Фіг. 8А) і проточної цитометрії (Фіг. 8B). Опромінених мишей без передачі AML і з попередньо переданими AML клітинами використовували як негативний і позитивний контролі, відповідно. (Фіг. 8А) AML-інфільтрація в тканинах експериментальних мишей після ін'єкції клітин AML плюс 8F4 (у лівій панелі), ін'єкція клітин AML плюс контрольне ізотипічне антитіло (iso, центральна панель) і контрольні миші без передачі AML (права панель). (Фіг. 8B) Клітини AML (показана препередача, ліва панель) не детектувалися у кістковому мозку (дві верхні панелі) і периферичної крові (дві нижні панелі) контрольних і експериментальних 8F4-мишей без передачі. Миші, що одержували клітини AML, змішані з ізотипічним відповідним контрольним антитілом (iso), показали приживлення AML1 і AML5 через два або чотири тижні після передачі AML. Розширена панель, що включає специфічний маркер клітин миші (mCD45), 3-6 маркерів людини (CD45, CD13, CD33, CD34, CD38, HLA-DR) і Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen), використовували для проточного цитометричного аналізу приживлення AML. Усі зображення демонструють життєздатні клітини mCD45. Фіг. 9A-C. 8F4 індукує тимчасову (21 день) нейтропенію у HLA-A2 трансгенних NOD/SCID через експресію консервативної PR1-послідовності на HLA-A2-експресуючих гемопоетичних клітинах миші. HLA-A2 Tg NOD/SCID мишам ін'єктували 200 мкг (10 мг/кг) 8F4 або ізотипічного контрольного Ab. Ці тварини, як було показано, представляють ендогенний PR1. Через дев'ять днів клітини кісткового мозку збирали й забарвлювали mAb, направленими на антигени миші (B220-PE, Gr-1-PB, CD11b-APC, F4/80-PE-Cy7, CD3-FITC і LIVE/DEAD Fixable Aqua), і досліджували способом проточної цитометрії. (Фіг. 9А) Зниження гранулоцитів було очевидним у розсіяних профілях кісткового мозку (ліва панель). Gr-1lo незрілі нейтрофіли були присутні, але Gr-1hi зрілі нейтрофіли були менш численними в кістковому мозку 8F4-оброблених мишей (центральні панелі). Крім того, моноцити (SSClo CD11b+; нижнє праве вікно правої панелі) були знижені у 8F4-оброблених тварин. (Фіг. 9B) Внутрішньовенна ін'єкція 8F4 (5 мг/кг) індукувала тимчасове зниження абсолютного числа циркулюючих зрілих гранулоцитів, макрофагів і моноцитів у HLA-A2 Tg NOD/SCID мишей. Через три тижні після лікування вся популяція 5 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зберігається. Вікна, показані на фіг. 9A, були використані для визначення частоти кожного типу клітин як відсотка живих клітин. Величини помилки являли собою стандартні відхилення n=2 тварин на групу. Показаний один характерний експеримент із трьох. (Фіг. 9C) Ніяких значних патологічних змін не спостерігалося в печінці, легенях, селезінці, нирках, серці або мозку HLAA2 Tg NOD/SCID мишей через 7 днів після ін'єкцій 200 мкг (10 мг/кг) 8F4. Показані H&E зрізи характерних тканин 2 мишей. Фіг. 10A-B. 8F4 індукує тимчасову лейкопенію створених гемопоетичних клітин людини після передачі пуповинної крові людини, збагаченої клітинами CD34+, у NOD/SCID мишей. Порції (50150 мл) свіжої HLA-A2+ пуповинної крові (CB) обробляли фиколом за допомогою Histopaque1077, промивали PBS, потім буфером CliniMACS (0,5 % HSA у PBS, pН 7,2/1 мМ 8 ЕДТО, Miltenyi). 10 клітин ресуспендували в 300 мл буфера MACS, змішаного з 100 мл CD34 + мікробус (Miltenyi) і інкубували при 4C протягом 30 хвилин і промивали. Клітини CD34 , мічені + магнітними бусами, очищали за допомогою колонок 2 LS (Miltenyi). Клітини CD34 елюювали з 6 колонки, підрахували і i.v. ін'єктували опроміненим (400 рад) NOD/SCID мишам (1-2,510 клітин на мишу). Контрольна миша СВ1-5 не одержала клітин CB. (Фіг. 10А) Починаючи з 4 тижня після трансплантації, периферичну кров мишей відбирали раз на тиждень або раз на два тижні, щоб контролювати приживлення трансплантата по пуповинній крові за допомогою FACS з використання CD45 миші, CD45 людини і маркерів HLA. Через 9-12 тижнів після перенесення мишам і.v. ін'єктували 20 мкг (1 мг/кг) 8F4 два рази з тижневим інтервалом між ін'єкціями (пунктирні стрілки). (Фіг. 10B) Через чотири тижні після другої ін'єкції 8F4 мишей забивали. Кров, селезінку і кістковий мозок аналізували на приживлення клітин людини, як описано вище. Фіг. 11. Схематична структура pCh8F4, pHu8F4-1, pHu8F4-2 і pHu8F4-2-AA (колективний вектор експресії). По годинниковій стрілці, починаючи від сайта SalІ на вершині, плазміда містить транскрипційний блок важкого ланцюга, починаючи з основного швидкого раннього промотору, і енхансер цитомегаловірусу (CMV) людини (промотору CMV) для ініціації транскрипції гена важкого ланцюга антитіла. За CMV-промотором ідуть VH-екзон, геномна послідовність, що містить константну область важкого ланцюга гамма-1 людини, включаючи СН1, шарнір, екзони CH2 і CH3 з проміжними інтронами, і сайт поліаденілювання після CH3екзона. Після послідовності гена важкого ланцюга починається транскрипційний блок легкого ланцюга з CMV-промотором, за яким іде VL-екзон і геномна послідовність, що містить людський екзон константної області каппа-ланцюга людини (CL) з частиною інтрона, що їй передував, і сайт поліаденілювання після CL-екзона. Ген легкого ланцюга потім іде за раннім промотором SV40 (SV40-промотор), ген ксантингуанінафосфорибозилтрансферази (gpt) E. coli і сегмент, що містить сайт поліаденілювання SV40 (полі(а) сайт SV40). Нарешті, плазміда містить частину плазміди pUC19, що містить бактеріальну ділянку початку реплікації (pUC ori) і ген беталактамази (β-лактамази). Фіг. 12. Вирівнювання амінокислотних послідовностей VH 8F4, VH гуманізованого 8F4 (Hu8F4) і VH людського акцепторного U96282. Амінокислотні залишки представлені у вигляді однобуквеного коду. Цифри вище послідовностей указують на положення, згідно з Kabat et al. (1991). Послідовності CDR, визначені Kabat et al. (1991), підкреслені. Залишки CDR у VH U96282 опускаються на Фігурі. Фіг. 13. Вирівнювання амінокислотних послідовностей VL 8F4, двох версій гуманізованого VL 8F4 (VL1 і VL2 Hu8F4) і VL акцепторного AY043146 людини. Амінокислотні залишки представлені у вигляді однобуквеного коду. Цифри вище послідовностей указують на положення, згідно з Kabat et al. (1991). Послідовності CDR, визначені Kabat et al. (1991), підкреслені. Підкреслені залишки в VL1 Hu8F4, як було прогнозовано, зв'язуються з CDR і відповідний залишок миші залишався в цьому положенні в VL1 Hu8F4. CDR залишків у VL AY043146 опускаються на Фігурі. Фіг. 14. SDS-PAGE-аналіз очищеного антитіла 8F4. Антитіла (5 мкг кожного) розганяли в 420 % SDS-PAGE-гелі у відновних умовах. Попередньо забарвлений стандарт SeeBluePlus2 від Invitrogen (Cat # LC5925) був використаний як стандарт молекулярних мас (смуги 1, 7 і 8). Зразки: 8F4.3.3 (доріжка 2), 8F4-4 (доріжка 3), Ch8F4 (доріжка 4), Hu8F4-1 (доріжка 5), Hu8F4-2 lot 9/9/10 (доріжка 6), Hu8F4-2 lot 1/23/11 (доріжка 9) і Hu8F4-2-AA (доріжка 10). Фіг. 15. ELISA-аналіз зв'язування Ch8F4, Hu8F4-1, Hu8F4-2 і Hu8F4-2-AA з PR-1/HLA-A2. Ch8F4, Hu8F-1, Hu8F4-2 і Hu8F-2-AA тестували в різних концентраціях, починаючи з 1 мкг/мл і серійними 3-кратними розведеннями, для зв'язуванні з PR-1/HLA-A2. Фіг. 16А-C. Специфічність зв'язування Hu8F4 і механізм дії. (Фіг. 16А) Тест на специфічність. (Фіг. 16B) Тест на афінність. (Фіг. 16C) CDC-аналіз. Фіг. 17. Лікування Hu8F4 виключає встановлення AML. Аналіз визначає відсоток приживлення трансплантата AML, одержаного за 3 тижні до лікування антитілом. 6 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 18. 8F4 викликає оборотну панцитопенію: ефекти на нормальні гемопоетичні клітинипопередники у SCID-мишей. Фіг. 19. 8F4 викликає оборотну панцитопенію: ефекти на нормальні клітини крові у імунокомпетентних мишей. Фіг. 20A-C. 8F4 затримує ріст раку пухлини грудей і продовжують життя. (Фіг. 20А) Пухлинозв'язані нейтрофіли в 231 BrCA ксенотрансплантатних пухлинах. (Фіг. 20B) Модель первинної пухлини. (Фіг. 20С). Модель метастатичної пухлини. Фіг. 21A-B. Поглинання NE і P3 клітинними лініями твердих пухлин. Клітинні лінії, що представляють солідні пухлини, інкубували з (Фіг. 21A) NE (10 мг/мл) або (Фіг. 21B) P3 (10 мг/мл), а потім пермеалізували й забарвлювали антитілами анти-NE або анти-P3. Дані представляють середнє 6 SEM кратне збільшенню поглинання NE або P3 проти клітин, що не піддавалися імпульсу, від ямок у трьох повторностях від двох незалежних експериментів. MDAMB-231, карцинома молочної залози; MIA PaCa-2, карцинома підшлункової залози; Mel 624 і Mel 526, меланоми; OVCAR3, аденокарцинома яєчника; SW-620, аденокарцинома товстої кишки. Фіг. 22А-D. Рак молочної залози ендогенно не експресує P3. мРНК екстрагували з (Фіг. 22А) лінії клітин раку молочної залози і (Фіг. 22B) первинної тканини раку молочної залози. ЗТ-ПЛР проводили з використанням праймерів Р3, що показує відсутність експресії мРНК P3 у клітинних лініях раку молочної залози і первинному раку молочної залози. Клітинна лінія Jurkat і лейкозна клітинна лінія HL-60 були використані як негативний і позитивний контролі, відповідно. Клітини первинного раку молочної залози з тканин пацієнта, зразки з молочної залози 1-3, були одержані шляхом LCM-представлення на пухлині, одержаній від пацієнтів під час хірургічної резекції. Мамаглобін-1 (MGB-1) був використаний для підтвердження аналізу клітин раку молочної залози. β-актин і GAPDH використовували як контроль навантаження. (Фіг. 22C) Імуноблоти демонструють відсутність білка P3 у WCL з п'яти різних клітинних ліній раку молочної залози. Гелі були навантажені 20 мг білка. Очищений P3 (5 мг) використовували як позитивний контроль і GAPDH використовували як контроль навантаження. (Фіг. 22D) Імуноблот, що показує відсутність P3 у тканині молочної залози пацієнта (молочна залоза 3). Ліва панель, зріз H&E (початкове збільшення 3200), що показує погано диференційовану карциному з домішкою нейтрофілів. Права панель, Імуногістохімічне забарвлення на P3 показує позитивне забарвлення P3 (коричневий) у домішаних нейтрофілах, але не в клітинах раку молочної залози. Вставка (початкове збільшення 3400) показує рідку пухлинну клітину, що поглинає нейтрофіл. Обидва зображення одержані з одного і того ж пацієнта і є типовими для п'яти тканин. Стрілки вказують нейтрофіли. Фіг. 23A-C. P3 поглинається клітинними лініями раку молочної залози і локалізується в лізосомальних компартментах. (Фіг. 23A) Лінії клітин MDA-MB-231, MCF-7 і MCF-7-HER18 інкубували з розчинним P3 (10 мг/мл) протягом 1, 4 і 24 год., а потім внутрішньоклітинно забарвлювали за допомогою анти-P3 Ab. MFI вимірювали для експериментальних груп у трьох повторностях і нормували MFI клітин, що не піддавалися імпульсу. Кратне збільшення в MFI у порівнянні з клітинами, що не піддавалися імпульсу, наноситься на y-вісь. Дані означають 6 стандартних похибок середнього і представляють два незалежних експерименти. (Фіг. 23B) Клітини MDA-MB-231 інкубували зі зростаючими дозами розчинного P3 або ОVА (ova) і аналізували способом проточної цитометрії на внутрішньоклітинне поглинання P3 або OVA за допомогою антитіл анти-P3 або анти-OVA, відповідно. Дані означають 6 стандартних похибок середнього від повторюваних експериментів. (Фіг. 23C) Клітини MDA-MB-231 культивували з розчинними P3 (10 мг/мл) і потім забарвлювали внутрішньоклітинно для P3 (червоний) і LAMP-2 (зелений). Зображення конфокальної мікроскопії демонструють локалізацію P3 у лізосомальних компартментах через 4 год. після поглинання, що показано шляхом накладення зображень (жовтий). Ядра здаються синіми за рахунок DAPI. Масштабні лінійки, 5 мм. Фіг. 24A-F. Поглинання P3 і крос-представлення P3 і NE збільшує сприйнятливість раку молочної залози до знищення за допомогою PR1-CTL і анти-PR1/HLA-A2. (Фіг. 24А) Клітини MDA-MB-231 раку молочної залози інкубували з розчинними P3, опроміненими PMN або РВМС протягом 4 год. Клітини пермеалізували, забарвлювали анти-P3 Ab і аналізували способом проточної цитометрії. Для клітинно-зв'язаного поглинання, розсіювання світла спостерігається на проточній цитометрії за умови чіткої відмінності між клітинами РВМС, PMN і MDA-MB-231. РВМС і PMN самі по собі використовувалися як негативний і позитивний контролі, відповідно. ANOVA з наступним Tukey-тестом проводили з використанням програмного забезпечення Prism 5.0 (*p, 0,05). Дані являють собою середні значення 6 СПС для повторюваних експериментів. (Фіг. 24В) Клітини MDA-MB-231 раку молочної залози культивували з розчинними P3 або NE (10 мг/мл) зі збільшенням часових точок і потім аналізували експресію PR1/HLA-A2. Середнє значення 6 СПС кратного збільшення MFI PR1/HLA-A2 проти клітин, що не піддавалися 7 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імпульсу, наведене з повторюваних експериментів. ANOVA з наступним Tukey-тестом проводили з використанням програмного забезпечення Prism 5.0 (*р=0,01, **p=0,0001). (Фіг. 24С-D) Клітини MDA-MB-231 культивували протягом 24 год. у середовищі, що містить NE або P3 (10 мг/мл) і інгібітори Ag-представлення брефелдин або лактацистин. Клітини потім аналізували на експресію PR1/HLA-A2. Середнє значення 6 СПС MFI PR1/HLA-A2 показане для повторюваних ямок типового експерименту. ANOVA з наступним Tukey-тестом проводили з використанням програмного забезпечення Prism 5.0 (*p=0,01, **p=0,0001). (Фіг. 24E) Клітини MDA-MB-231 культивували протягом ночі в середовищах, що містять P3 або NE (10 мг/мл), навантажених кальцеїном-AM, а потім спільно культивували з PR1-CTL протягом 4 год. Цитотоксичність визначали шляхом вимірювання вивільненого кальцеїну-AM. NE- або P3імпульсні клітини демонструють більш високий рівень знищення проти клітин MDA-MB-231, що не піддавалися імпульсу. PR1-імпульсні і клітини T2, що не піддавалися імпульсу, використовували як позитивний і негативний контролі, відповідно. Дані являють собою середні значення 6 СПС для повторюваних ямок типового експерименту. (Фіг. 24F) Клітини MDAMB-231 культивували з NE (10 мг/мл) або P3 (10 мг/мл) протягом 24 год. Клітини інкубували з антиPR1/HLA-A2 (8F4) Ab протягом 60 хв., а потім додавали комплемент. Комплементзалежну цитотоксичність вимірювали за допомогою вивільнення кальцеїну-AM і показує конкретні знищення NE- або P3-імпульсних клітин MDA-MB-231 за допомогою 8F4 Ab. Дані по цитотоксичності являють собою середні значення 6 СПС для повторюваних ямок типового експерименту. Непарний t-тест був проведений з використанням програмного забезпечення Prism 5.0 (*p=0,05). Фіг. 25А-D. PR1/HLA-A2 і PR1-CTL детектуються у пацієнтів з раком молочної залози і меланомою. (Фіг. 25А) Резектовані тканини раку молочної залози HLA-A2+-пацієнти (молочні залози 1 і 4) забарвлювали анти-PR1/HLA-A2 (8F4)-647 (червоний) і анти-CK7-FITC (зелений), і потім відображали за допомогою конфокальної лазерної мікроскопії. Виявилося, що PR1/HLAA2 експресується клітинами раку молочної залози, що показано спільним забарвленням 8F4 з CK7. DAPI-синій використовували для забарвлення ядер клітин. (Фіг. 25B) Послідовні зрізи резектованої HLA-A2+-тканини раку молочної залози забарвлювали анти-CD45-647 (червоний) (ліва панель) або анти-CK7-FITC (зелений) і 8F4-647 (червоний) (права панель), а потім відображали за допомогою конфокальної лазерної мікроскопії. PR1/HLA-A2 експресується клітинами раку молочної залози (8F4+/CK7+) в областях, що містять мінімальну кількість лейкоцитів (CD452), тим самим підтверджуючи експресію PR1/HLA-A2 клітинами раку молочної залози. DAPI-синій використовували для забарвлення ядер клітин. (Фіг. 25C) Графік з боксами і "вусиками" показує PR1-CTL у периферичній крові від HLA-A2+-пацієнтів з раком молочної залози (n=11), меланомою (n=7) і здорових (n=9) HLA-A2+-донорів. Mann-Whitney U-тест проводили з використанням програмного забезпечення Prism 5.0 (*p=0,05). (Фіг. 25D) Резектовані тканини HLA-A2+ (меланоми 1) і HLA-A22 (меланоми 2) пацієнтів забарвлювали 8F4-647 (червоний) і анти-MITF-FITC (зелений), і потім відображали за допомогою конфокальної лазерної мікроскопії. Виявилося, що PR1/HLA-A2 експресується в зразку HLA-A2+ меланоми (меланоми 1), що показано спільним забарвленням 8F4 з MITF. DAPI-синій використовувався для забарвлення ядер клітин. Масштабні лінійки, 20 мм. Фіг. 26A-F. Крос-представлення P3 і NE клітинами меланоми збільшує сприйнятливість до PR1-CTL. (Фіг. 26А) Подвійне забарвлення NE (коричневий) і MITF (рожевий) або (Фіг. 26В) P3 (коричневий) і MITF (рожевий) у зразках від пацієнтів з первинною меланомою показує відсутність NE і P3 у меланомі. Зображення були одержані при початковому збільшенні 3100. Вставка, початкове збільшення 3400, показує розкидані NE- або P3-позитивні клітини, які, швидше за все, є запальними клітинами. (Фіг. 26С) Вестерн-блот, що показує відсутність NE і P3 у клітинних лініях меланоми. Лейкозну клітинну лінію U-937 використовували як позитивний контроль для NE і P3. Тубулін використовували як контроль навантаження. М=маркер молекулярних мас. (Фіг. 26D-E) Лінію клітин меланоми 526 HLA-A2+ культивували з розчинними NE (10 мг/мл) або P3 (10 мг/мл) зі збільшенням часових точок і потім аналізували (Фіг. 26D) поглинання NE і P3 і (Фіг. 26E) крос-представлення (тобто експресію PR1/HLA-A2). -Кратне збільшення МFI NE або P3 (Фіг. 26D), або PR1/HLA-A2 (Фіг. 26E) проти не підданих імпульсу клітин показане на осі y. ANOVA з наступним Tukey-тестом проводили з використанням програмного забезпечення Prism 5.0 (**p=0,0001, *p=0,05). Дані представляють середнє значення 6 СПС для повторюваних експериментів. (Фіг. 26F) Кальцеїн-AM-аналіз на цитотоксичність показує знищення NE (10 мг/мл) і P3 (10 мг/мл) 24 год.-імпульсованих клітин меланомної лінії 526 HLA-A2+ за допомогою PR1-CTL проти не підданих імпульсу (Unp) Mel 526. Не піддані імпульсу (T2 Unp) і PR1-імпульсні (T2 PR1) T2-клітини були використані як негативний і позитивний контролі, відповідно. Дані являють собою середні значення 6 СПС для 8 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 повторюваних ямок типового експерименту. Непарний t-тест був проведений з використанням програмного забезпечення Prism 5.0 (*p=0,05). ОПИС ІЛЮСТРАТИВНИХ ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ PR-1 внутрішній пептид (VLQELNVTV; SEQ ID NO:45), як було показано, розпізнається на мембраноекспресованому HLA-A*0201 лейкозної клітини за допомогою CD8+ цитотоксичних Тлімфоцитів (CTL), і PR1-специфічні CTL специфічно лізують клітини мієлоїдного лейкозу, але не нормальні клітини кісткового мозку. Вакцинація HLA-A2+-пацієнтів з AML, CML і MDS PR1пептидом індукувала PR-1-CTL-імунітет у 58 % пацієнтів і реальні клінічні відповіді у 13 з 66 (20 %) пацієнтів. Хоча ці результати є обнадійливими, високе пухлинне навантаження залишається бар'єром для успішної вакцинації. На основі того, що PR1-пептид експресується в достатній кількості тільки на поверхні клітин мієлоїдної лейкемії, а не на нормальних клітинах кісткового мозку, автори винаходу намагалися розробити антитіла, націлені на PR1/HLA-A*0201, які можуть бути використані в терапевтичних цілях для лікування пацієнтів з мієлоїдним лейкозом або які могли б бути використані для визначення того, які пацієнти можуть бути чутливі до імунотерапії на основі PR1, наприклад вакцини або адоптивна T-клітинна передача. Оскільки HLA-A2+ є найбільше часто експресованою алеллю HLA (40 % загального населення білої європеоїдної раси), терапія на основі антитіл до Т-клітинного епітопа, унаслідок цього, була б новою і могла б мати широке застосування. Шляхом імунізації імунокомпетентних мишей BALB/c рекомбінантними мономерами PR1/HLA-A*0201, заявники одержали моноклональне антитіло IgG2a-kappa (8F4) зі специфічністю до комбінованого епітопа PR1/HLA-A*0201. Антитіло 8F4, як було показано, має високу афінність до PR1/HLA-A*0201 (KD=9,9 наномолів) і, як було показано, розпізнає тільки PR1-імпульсні T2-клітини-мішені, але не контрольні пептид-імпульсні клітини. 8F4 зв'язується з HLA-A2+AML за допомогою як FACS, так і конфокальної мікроскопії для мічення клітин, але не з нормальними клітинами периферичної крові HLA-A2+. Крім того, 8F4 індукувало дозозалежну комплемент-опосередковану цитотоксичність (CDC) HLA-A2+ первинного лейкозу людини, але не нормальних клітин кісткового мозку. По суті, антитіло 8F4 специфічно запобігало приживленню AML людини в HLA-A2 трансгенній NOD/SCID тваринній моделі з однократним лише впливом антитіла під час адоптивної передачі у тварину. Крім того, 8F4 затримує ріст пухлини раку молочної залози і збільшує тривалість життя, незважаючи на той факт, що Р3 і NE не експресуються в клітинах раку молочної залози. Узяті разом, ці результати показують, що створене антитіло зі специфічністю до клітинного мембранозв'язаного PR1/HLA-A*0201 епітопа, важливого Т-клітинного антигену-мішені, що специфічно виявляє і знищує людські лейкози і солідні пухлини. I. Визначення Вираз "виділений" або "біологічно чистий" стосується речовини, яка значною мірою або по суті не містить компонентів, звичайно супутніх речовині в той час як вона знаходиться у своєму нативному стані. Таким чином, виділені пептиди відповідно до винаходу, переважно, не містять речовин, що звичайно зв'язані з пептидами в їх навколишньому середовищі in situ. "Головний комплекс гістосумісності" або "МНС" являє собою кластер генів, що відіграють роль у контролі клітинних взаємодій, відповідальних за фізіологічні імунні реакції. В організмі людини комплекс МНС також відомий як комплекс HLA. Для докладного опису комплексів МНС і HLA дивіться Paul (1993). "Лейкоцитарний антиген людини" або "HLA" являє собою білок класу I або класу II головного комплексу гістосумісності (МНС) людини (див., наприклад, Stites, 1994). "Супертип або сімейство HLA", як використовується в даному описі, описує набори молекул HLA, згрупованих на основі загальних пептидзв'язувальних специфічностей. Молекули HLA класу I, які розділяють до деякої міри подібну афінність зв'язування з пептидами, що несуть визначені амінокислотні мотиви, згруповані в супертипи HLA. Терміни суперсімейство HLA, HLAсімейство супертипів, сімейство HLA і молекули HLA-xx-подібного супертипу (де xx позначає конкретний тип HLA) є синонімами. Термін "мотив" стосується структури залишків у пептиді визначеної довжини, звичайно пептиді довжиною приблизно від 8 до приблизно 13 амінокислоти для мотиву HLA класу I і приблизно від 6 до приблизно 25 амінокислот для мотиву HLA класу II, який розпізнається конкретною молекулою HLA. Пептидні мотиви, як правило, є різними для кожного білка, кодованого кожною алеллю HLA людини, і відрізняються в структурі первинного і вторинного якірних залишків. "Патологічна клітина" являє собою будь-яку клітину, яка, як вважається, має характеристики, притаманні для цього типу клітин, у тому числі атиповий ріст, типовий ріст в атиповому 9 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розташуванні або типову дію відносно атипової мішені. Такі клітини включають злоякісні клітини, доброякісні гіперплазичні або диспластичні клітини, запальні клітини або аутоімунні клітини. II. PR-1- і HLA-рестрикція А. PR-1 Внутрішній пептид PR-1 (VLQELNVTV; SEQ ID NO:45) є похідним протеїнази 3 (P3) і еластази нейтрофілів (NE), кожна з яких аберантно експресується при лейкозі. Було показано, що він розпізнається на мембраноекспресованому HLA-A*0201 лейкозної клітини CD8+ цитотоксичними Т-лімфоцитами (CTL). PR-1-специфічні CTL специфічно лізують мієлоїдний лейкоз, у тому числі гострий мієлогенний лейкоз (AML), хронічний мієлогенний лейкоз (CML) і мієлодиспластичний синдром (MDS), але не нормальні клітини кісткового мозку. Раніше, автори винаходу показали, що PR-1-вакцинація HLA-A2+-пацієнтів з AML, CML і MDS PR1-пептидом у Montanide ISA-51- і GM-CSF-індукувала PR-1-CTL-імунітет у 58 % пацієнтів і об'єктивні клінічні відповіді у 13 з 66 (20 %) пацієнтів. В. HLA-A2 Лейкоцитарна антигенна система (HLA) людини являє собою назву головного комплексу гістосумісності (МНС) в організмі людини. Суперлокус містить велику кількість генів, пов'язаних з функцією імунної системи в організмі людини. Ця група генів знаходиться на 6-ій хромосомі і кодує білки, що представляють антиген клітинної поверхні, і багато інших генів. Білки, кодовані визначеними генами, також відомі як антигени, як результат їх історичного відкриття як факторів при пересадженні органів. Основні антигени HLA є суттєвими елементами імунної функції. Різні класи мають різні функції. Антигени HLA класу I (A, B і C) представляють пептиди внутрішньої частини клітини (у тому числі і вірусні пептиди при наявності). Ці пептиди утворюються з розщеплених білків, які розщеплюються в лізосомах. Пептиди, як правило, являють собою невеликі полімери довжиною + близько 9 амінокислот. Чужорідні антигени залучають кілерні Т-клітини (також називані CD8 клітини), що руйнують клітини. Антигени HLA класу II (DR, DP і DQ) представляють антигени з зовнішньої сторони клітини Т-лімфоцитам. Ці специфічні антигени стимулюють Т-хелперні клітини до відтворення, і ці Т-хелперні клітини потім стимулюють продукуючі антитіла B-клітини, внутрішні антигени пригнічуються супресорними Т-клітинами. HLA-А2 (A2) являє собою серотип лейкоцитарного антигену людини в межах серотипної групи HLA-A "А". Серотип ідентифікує генні продукти багатьох HLA-A*02-алелей, у тому числі генні продукти HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206 і *0207. A*02 є більш розповсюдженим, однак A*0201 зустрічається з високою частотою в Північній Азії і Північній Америці. A2 є найбільш різноманітним серотипом, показуючи різноманітність у Східній Африці і Південно-Західній Азії. Незважаючи на те, що частота A*0201 у Північній Азії є високою, її різноманітність обмежена менш розповсюдженими азіатськими варіантами А*0201-*0203,*0206. 2 Серотип визначається за допомогою розпізнавання антитілом α -підмножини HLA-A αланцюгів. Для А2, α "А" ланцюг кодується групою HLA-A*02-алелей, а β-ланцюг кодується локусом B2M. A2 і A*02 практично є синонімами за змістом. А2 є більш розповсюдженим у Північній Азії і Північній Америці, ніж в інших країнах, і він є частиною декількох довгих гаплотипів. III. Антитіла Даний винахід стосується продукції і використання антитіл, які зв'язуються з PR1 у контексті презентації HLA-A2. Антитіла здатні до "специфічного зв'язування" з конкретною мішенню або серією антигенно споріднених мішеней. Як використовується в даному документі, антитіло, як говорять, здатне до "специфічного зв'язування" з антигеном, якщо антиген відрізняється від антигенно різних молекул по зв'язуванню з варіабельною областю антитіла. Такі взаємодії відрізняються від неспецифічного зв'язування, що включає класи сполук, незалежно від їх хімічної структури (наприклад, зв'язування білків з нітроцелюлозою і ін.). Зокрема, антитіло за даним винаходом може виявляти "високоспецифічне зв'язування" таким чином, що воно буде нездатне або практично нездатне зв'язуватися навіть із близькоспорідненими молекулами. Моноклональні антитіла можуть бути легко одержані за допомогою добре відомих способів, таких, які наведені як приклад у патенті США № 4196265, включеному в даний опис як посилання. Як правило, методика передбачає першу імунізацію придатної тварини вибраним антигеном (наприклад, поліпептидом або полінуклеотидом за даним винаходом) способом, достатнім для забезпечення імунної відповіді. Гризуни, такі як миші і щури, є переважними тваринами. Клітини селезінки імунізованих тварин потім зливають з клітинами безсмертної мієломної лінії. Успішні злиття потім перевіряють на продукцію відповідних антитіл. В одному з варіантів здійснення молекули антитіла містять фрагменти (такі як F(ab'), F(ab')2), які одержуються, наприклад, при протеолітичному розщепленні mAb, або одноланцюжкові 10 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобуліни, які одержуються, наприклад, за допомогою рекомбінантних засобів. Такі похідні антитіл є одновалентними. В одному з варіантів здійснення, такі фрагменти можуть бути об'єднані один з одним або з іншими фрагментами антитіл або рецепторними лігандами з утворенням "химерних" молекул зв'язування. По суті, такі химерні молекули можуть містити заміщувальні групи, здатні зв'язуватися з різними епітопами однієї і тієї ж молекули, або вони можуть бути здатні зв'язуватися з активованим епітопом протеїну С і неактивованим епітопом протеїну С. Якщо антитіла або їх фрагменти призначені для лікувальних цілей, то бажано "гуманізувати" їх для ослаблення будь-якої імунної реакції. Такі гуманізовані антитіла можуть бути вивчені в контексті in vitro або in vivo. Гуманізовані антитіла можуть бути одержані, наприклад, шляхом заміни імуногенної частини антитіла відповідною, але не імуногенною частиною (тобто химерні антитіла). Заявка РСТ PCT/U.S. 86/02269; заявка EP 184187; заявка EP 171496; заявка EP 173494; заявка РСТ WO 86/01533; заявка EP 125023; Sun et al. (1987); Wood et al. (1985); Shaw et al. (1988); кожна з яких включена в даний опис як посилання. Загальні огляди "гуманізованих" химерних антитіл наведені в статті Morrison (1985; також включена в даний опис як посилання). "Гуманізовані" антитіла також можуть бути одержані шляхом заміщення CDR або CEA. Jones et al. (1986); Verhoeyan et al. (1988); Beidler et al. (1988); кожне з посилань включене в даний опис як посилання. A. Варіанти Нижче наведене обговорення, яке стосується зміни амінокислот білка для одержання модифікованого білка. В одержанні таких замін може розглядатися індекс гідрофобності амінокислот. Важливість індексу гідрофобності амінокислот у наданні інтерактивної біологічної функції білку звичайно ясна в даній галузі (Kyte and Doolittle, 1982). Прийнято вважати, що відносний гідрофобний характер амінокислоти додає внесок у вторинну структуру одержуваного в результаті білка, що, у свою чергу, визначає взаємодію білка з іншими молекулами, наприклад ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антитілами, антигенами і тому подібним. З рівня техніки також відомо, що заміну подібних амінокислот можна ефективно виконувати на основі гідрофільності. У патенті США № 4554101, наведеному у даному описі як посилання, описано, що найбільша локальна середня гідрофільність білка, яка регулюється гідрофільністю сусідніх амінокислот, корелює з біологічною властивістю білка. Як описано в патенті США № 4554101, амінокислотним залишкам були надані наступні значення гідрофільності: основні амінокислоти: аргінін (+3,0), лізин (+3,0) і гістидин (-0,5); кислі амінокислоти: аспарагінова кислота (+3,0±1), глутамінова кислота (+3,0±1), аспарагін (+0,2), глутамін (+0,2); гідрофільні, неіонні амінокислоти: серин (+0,3), аспарагін (+0,2), глутамін (+0,2), треонін (-0,4), сірковмісні амінокислоти: цистеїн (-1,0) і метіонін (-1,3); гідрофобні, неароматичні амінокислоти: валін (-1,5), лейцин (-1,8), ізолейцин (-1,8), пролін (-0,5±1), аланін (-0,5) і гліцин (0); гідрофобні ароматичні амінокислоти: триптофан (-3,4), фенілаланін (-2,5) і тирозин (-2,3). Зрозуміло, що амінокислота може бути замінена іншою амінокислотою, яка має аналогічну гідрофільність і продукує біологічно або імунологічно модифікований білок. При таких змінах заміна амінокислот зі значеннями гідрофільності в межах ±2 є переважною, амінокислота з гідрофільністю в межах ±1 є особливо переважною і амінокислота з гідрофільністю в межах ±0,5 ще більш переважною. Як зазначено вище, амінокислотні заміни, як правило, основані на відносній подібності бічного ланцюга амінокислот-замісників, наприклад їх гідрофобності, гідрофільності, заряду, розміру і т. п. Типові заміни, що враховують різні вищевказані характеристики, добре відомі фахівцям у даній галузі і до них належать аргінін і лізин; глутамінова й аспарагінова кислоти; серин і треонін; глутамін і аспарагін; і валін, лейцин і ізолейцин. У даному винаході також може використовуватися застосування пептидних міметиків при одержанні поліпептидів (див., наприклад, Johnson, 1993), що мають багато які з природних властивостей антитіла, але зі зміненими і/або поліпшеними характеристиками. Розумним обґрунтуванням використання міметиків є те, що пептидний кістяк білків існує в основному для орієнтації бічних ланцюгів амінокислот так, щоб полегшити молекулярні взаємодії, наприклад, антитіла й антигену. Ці принципи можуть бути використані, у сполученні з принципами, викладеними вище, при конструюванні молекул другого покоління, що мають велике число природних властивостей антитіла, але зі зміненими і навіть поліпшеними характеристиками. Вважають, що в даному винаході можна також використовувати варіанти послідовності, такі як інсерційні або делеційні варіанти. У делеційних варіантів відсутні один або більше залишків нативного білка. Під інсерційними мутантами, як правило, розуміють додавання речовини в нетермінальну точку поліпептиду. Також варто розуміти, що варіанти з інсерційними послідовностями можуть включати N- або C-кінцеві амінокислоти, і, проте, усе ще будуть по суті 11 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 такими, як викладено в одній з послідовностей, описаних тут, за умови, що послідовність задовольняє критерії, викладені вище, у тому числі збереження біологічної активності. Даний винахід також стосується ізотипічної модифікації. Як обговорюється нижче, було визначено, що антитіло 8F4 являє собою Ig2a-κ. Для одержання іншого ізотипу можна досягти різних функціональних властивостей шляхом модифікації Fc-області. Наприклад, зміна в IgG1 може збільшити антитілозалежну клітинну цитотоксичність, переключення в клас А може поліпшувати тканинний розподіл і переключення в клас М може поліпшувати валентність. Модифіковані антитіла можуть бути одержані будь-яким способом, відомим фахівцям у даній галузі, у тому числі експресією стандартними молекулярно-біологічними способами або хімічним синтезом поліпептидів. Способи рекомбінантної експресії розглядаються в інших розділах даного документа. В. Одноланцюжкове антитіло Одноланцюжковий варіабельний фрагмент (scFv) являє собою злиття варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, зв'язаних разом коротким (як правило серин, гліцин) лінкером. Ця химерна молекула зберігає специфічність вихідного імуноглобуліну, незважаючи на відсутність константних областей і введення пептидного лінкера. На зображенні праворуч показано, як ця модифікація звичайно залишає специфічність у незміненому вигляді. Ці молекули історично були створені для полегшення фагового дисплея, де дуже зручною є експресія антигензв'язувального домену як єдиного пептиду. Крім того, scFv можуть бути одержані безпосередньо із субклонованих важкого і легкого ланцюгів, одержаних з гібридоми. Одноланцюжкові варіабельні фрагменти не містять константної Fc-області, присутньої у повнорозмірній молекулі антитіла, і тому загальні сайти зв'язування (наприклад, білок A/G) використовувалися для очищення антитіл. Ці фрагменти часто можна очищати/іммобілізувати з використанням білка L, оскільки білок L взаємодіє з варіабельною областю легких ланцюгів каппа. Гнучкі лінкери, як правило, складаються зі спіральних амінокислотних залишків, що сприяють повороту, таких як аланін, серин і гліцин. При цьому інші залишки також можуть функціонувати. Tang et al. (1996) використовували фаговий дисплей як засіб швидкого селектування спеціалізованих лінкерів для одноланцюжкових антитіл (scFv) з бібліотек білкових лінкерів. Була сконструйована бібліотека випадкових лінкерів, у якій гени варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів були зв'язані сегментом, що кодує 18-амінокислотний поліпептид 6 змінного складу. Спектр scFv (приблизно 510 різних членів) був показаний на ниткоподібних фагах і підданий афінній селекції з гаптеном. Популяція вибраних варіантів виявляла значне збільшення активності зв'язування, але зберегла значну різноманітність послідовностей. Скринінг 1054 окремих варіантів надалі утворював каталітично активне scFv, що ефективно продукувалося у розчинній формі. Аналіз послідовності виявив консервативний пролін у лінкері через два залишки після С-кінця VH і велику кількість аргінінів і пролінів в інших положеннях, як єдині загальні особливості вибраних границь. Рекомбінантні антитіла за даним винаходом також можуть включати послідовності або частини, які забезпечують димеризацію або мультимеризацію рецепторів. Такі послідовності включають такі, одержані з IgА, що дозволяють формувати мультимери в сполученні з Jланцюгом. Інший домен мультимеризації являє собою димеризаційний домен Gal4. В інших варіантах здійснення ланцюги можуть бути модифіковані речовинами, такими як біотин/авідин, що дозволяє комбінувати два антитіла. В одному з варіантів здійснення винаходу одноланцюжкове антитіло може бути одержане шляхом з'єднання легких і важких ланцюгів рецепторів з використанням непептидного лінкера або хімічної ланки. Як правило, легкі і важкі ланцюги потрібно продукувати у різних клітинах, очищати і надалі з'єднувати їх один з одним належним чином (тобто N-кінець важкого ланцюга прикріплюється до C-кінця легкого ланцюга через відповідний хімічний місток). Зшивальні реагенти використовуються для формування молекулярних містків, які зв'язують функціональні групи двох різних молекул, наприклад стабілізуючий і коагулюючий засіб. Однак передбачається, що можуть бути створені димери або мультимери одного і того ж аналогового або гетеромерного комплексу, що складається з різних аналогів. Для з'єднання двох різних сполук покроковим чином, можуть бути використані гетеробіфункціональні перехреснозшивальні реагенти, які усувають утворення небажаних гомополімерів. Таблиця 3 ілюструє деякі перехреснозшивальні реагенти. 12 UA 114108 C2 Таблиця 3 Гетеробіфункціональні перехреснозшивальні реагенти Лінкер Реагує з Сульфгідрили первинних амінів Сульфгідрили SPDP первинних амінів Сульфгідрили LC-SPDP первинних амінів Sulfo-LC- Сульфгідрили SPDP первинних амінів SMPT SMCC Сульфгідрили первинних амінів SulfoSMCC Сульфгідрили первинних амінів Сульфгідрили первинних амінів Сульфгідрили Sulfo-MBS первинних амінів Сульфгідрили SIAB первинних амінів Сульфгідрили Sulfo-SIAB первинних амінів Сульфгідрили SMPB первинних амінів SulfoСульфгідрили SMPB первинних амінів EDC/Sulfo Карбоксильні групи -NHS первинних амінів Неселектовані ABH карбогідрати MBS 5 10 15 20 Переваги і застосування Довжина плечей спейсера/ після перехресного зшивання Велика стабільність 11,2 A Тіолування Розщеплюване перехресне зшивання 6,8 A Подовжене плече спейсера 15,6 A Подовжене плече спейсера Водорозчинний Стабільна малеімідна реактивна група Кон'югація фермент-антитіло Кон'югація гаптен-білок-носій Стабільна малеімідна реактивна група Водорозчинний Кон'югація фермент-антитіло Кон'югація фермент-антитіло Кон'югація гаптен-білок-носій 15,6 A 11,6 A 11,6 A 9,9 A Водорозчинний 9,9 A Кон'югація фермент-антитіло 10,6 A Водорозчинний 10,6 A Подовжене плече спейсера Кон'югація фермент-антитіло Подовжене плече спейсера Водорозчинний Кон'югація гаптен-носій Реагує з цукровими групами 14,5 A 14,5 A 0 11,9 A Характерний гетеробіфункціональний перехреснозшивальний реагент містить дві реактивні групи: одну, реагуючу з первинною аміногрупою (наприклад, N-гідроксисукцинімідом), і іншу, реагуючу з тіольною групою (наприклад, піридилдисульфідом, малеїнімідами, галогенами і т. д.). Через первинний амін реактивної групи перехреснозшивальний реагент може реагувати з залишком(ами) лізиного одного білка (наприклад, вибраного антитіла або фрагмента), а через тіольну реактивну групу перехреснозшивальний реагент, вже приєднаний до першого білка, реагує з залишком цистеїну (вільною сульфгідрильною групою) іншого білка (наприклад, селективний реагент). Бажано, щоб був використаний перехреснозшивальний реагент, який має достатню стабільність в крові. Відомі численні види лінкерів, що містять дисульфідний зв'язок, які можна успішно використовувати для кон'югатного націлювання і лікувальних/профілактичних засобів. Лінкери, що містять дисульфідні зв'язки, які є стерично утрудненими, можуть дати велику стабільність in vivo, запобігаючи вивільненню націленого пептиду до досягнення ділянки дії. Ці лінкери є, таким чином, однією групою зшивальних реагентів. Інший перехреснозшивальний реагент являє собою SMPT, який є біфункціональним перехреснозшивальним реагентом, що містить дисульфідний зв'язок, який є "стерично утрудненим" сусіднім бензольним кільцем і метильними групами. Вважається, що стеричне утруднення дисульфідного зв'язку служить функцією захисту зв'язку від впливу тіолатних аніонів, таких як глутатіон, що можуть бути присутніми у тканинах і крові, і тим самим допомогти в запобіганні від'єднанню кон'югата до доставки приєднаного реагенту до ділянки-мішені. 13 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехреснозшивальний реагент SMPT, як і багато інших відомих згивальних реагентів, надає здатність перехресно зшивати функціональні групи, такі як SH цистеїну або первинних амінів (наприклад, епсилон-аміногрупа лізину). Інший можливий тип перехреснозшивального реагенту включає гетеробіфункціональні фотореактивні фенілазиди, що містять розщеплюваний дисульфідний зв'язок, такі як сульфосукцинімідил-2-(pазидосаліциламідо)етил-1,3'-дитіопропіонат. N-гідроксисукцинімідильна група реагує з первинними аміногрупами, і фенілазид (при фотолізисі) реагує неселективно з будь-яким амінокислотним залишком. На доповнення до утруднених перехреснозшивальних реагентів, неутруднені лінкери також можуть бути використані відповідно до даного документа. Інші корисні перехреснозшивальні реагенти, як вважають, що не містять або не утворюють захищений дисульфід, включають SATA, SPDP і 2-імінотіолан (Wawrzynczak & Thorpe, 1987). Використання таких перехреснозшивальних реагентів добре відоме в даній галузі. Інший варіант здійснення включає використання гнучких лінкерів. У патенті США № 4680338 описані біфункціональні лінкери, які можна використовувати для одержання кон'югатів лігандів з аміновмісними полімерами і/або білками, особливо для утворення кон'югатів антитіл з хелатуючими реагентами, лікарськими препаратами, ферментами, детектованими мітками і т. п. У патентах США №№ 5141648 і 5563250 описані розщеплювані кон'югати, які містять лабільні зв'язки, розщеплювані при різних м'яких умовах. Цей лінкер є особливо ефективним, оскільки реагент, що представляє інтерес, може бути зв'язаний безпосередньо з лінкером, при розщепленні, що приводить до вивільнення активного реагенту. Конкретні варіанти застосування включають додавання вільної амінної або вільної сульфгідрильної групи до білка, такого як антитіло або лікарський препарат. У патенті США № 5856456 описані пептидні лінкери для використання при з'єднанні поліпептидних компонентів для одержання злитих білків, наприклад одноланцюжкових антитіл. Лінкер складає до приблизно 50 амінокислот у довжину, містить щонайменше одну заряджену амінокислоту (переважно, аргінін або лізин), за якою іде пролін, і характеризується більшою стабільністю і зниженою агрегацією. У патенті США № 5880270 описані амінооксивмісні лінкери, ефективні в різноманітності імунодіагностичних методик і методик розділення. C. Очищення У деяких варіантах здійснення антитіла за даним винаходом можуть бути очищені. Термін "очищений", як використовується в даному документі, призначений для позначення композиції, яку можна відділити від інших компонентів, де білок очищають до будь-якого ступеня відносно його природно доступного стану. Очищений білок, отже, також належить до білка, вільного від середовища, у якому він може природно бути присутній. Якщо використовується термін "по суті очищений", то це позначення стосується композиції, у якій білок або пептид утворює основний компонент композиції, наприклад, що складає приблизно 50 %, приблизно 60 %, приблизно 70 %, приблизно 80 %, приблизно 90 %, приблизно 95 % або більше білків композиції. Способи очищення білків добре відомі фахівцям у даній галузі. Ці способи включають, на одному рівні, грубе фракціонування клітинного оточення на поліпептидну і відмінну від поліпептидної фракції. Після відділення поліпептиду від інших білків, поліпептид, що представляє інтерес, може бути додатково очищений за допомогою хроматографічного і електрофоретичного способів для досягнення часткового або повного очищення (або очищення до гомогенності). Аналітичні способи, особливо придатні для підготовки чистого пептиду, являють собою іонообмінну хроматографію, ексклюзійну хроматографію; електрофорез у поліакриламідному гелі; ізоелектричне фокусування. Інші способи очищення білка включають осадження сульфатом амонію, ПЕГ, антитілами і т. п., або шляхом теплової денатурації з наступним центрифугуванням; гель-фільтрацію, обернену фазу, гідроксилапатит і афінну хроматографію; і комбінацію цих і інших способів. При очищенні антитіла за даним винаходом може бути бажаним експресувати поліпептид у прокаріотичній або еукаріотичній системі експресії й екстрагувати білок з використанням денатуруючих умов. Поліпептид може бути очищений від інших клітинних компонентів за допомогою афінної колонки, що зв'язується з тег-вмісною частиною поліпептиду. Як відомо в даній галузі, вважається, що порядок проведення різних стадій очищення може бути змінений або що деякі стадії можуть бути опущені і, проте, давати в результаті придатний спосіб одержання в суттєвому ступені очищеного білка або пептиду. Звичайно, повнорозмірні антитіла фракціонують з використанням засобів (наприклад, білок А), які зв'язують Fc-частину антитіла. Крім того, можна використовувати антигени, щоб одночасно очищати і відбирати відповідні антитіла. Такі способи часто використовують зв'язувальні засоби селекції з підтримкою, такою як колонка, фільтр або буси. Антитіла 14 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язують з підтримкою, забруднення видаляють (наприклад, змивають) і антитіла вивільняють з використанням умов (сіль, тепло й ін.). Різні способи кількісної оцінки ступеня очищення білка або пептиду відомі фахівцям у даній галузі у світлі даного опису. До них належать, наприклад, визначення специфічної активності активної фракції або оцінка кількості поліпептидів у фракції шляхом аналізу методом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію. Інший спосіб оцінки чистоти фракції для розрахунку питомої активності фракції являє собою розрахунок специфічної активності фракції, порівняння її зі специфічною активністю вихідного екстракту і, таким чином, обчислення ступеня чистоти. Фактичні одиниці, використовувані для представлення кількості активності, будуть, звичайно, залежати від конкретного способу, вибраного для аналізу очищення, і від того, виявляє чи ні експресований білок або пептид детектовану активність. Відомо, що міграція поліпептиду може відрізнятися, іноді значно, при різних умовах електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (Capaldi et al., 1977). Тому варто враховувати, що при різних умовах електрофорезу уявна молекулярна маса очищених або частково очищених продуктів експресії може відрізнятися. D. Кон'югування антитіл з терапевтичними або діагностичними засобами В одному з варіантів здійснення антитіла за даним винаходом можуть бути з'єднані з різними реагентами для використання в діагностиці і терапії захворювання. Зв'язування може бути виконане з використанням множини добре відомих хімічних реакцій і засобів, деякі з яких описані в інших розділах даного опису. 1. Діагностичні реагенти Багато які діагностичні/візуалізуючі засоби відомі фахівцям у даній галузі, як і способи їх приєднання до білків, включаючи антитіла (див., наприклад, патенти США №№ 5021236; 4938948 і 4472509, кожний з яких наведений у даному описі як посилання). Використовувані для візуалізації речовини можуть являти собою парамагнітні іони, радіоактивні ізотопи, флуорохроми, ЯМР-детектовані речовини і засобирентгенівської візуалізації. У випадку парамагнітних іонів, можна відзначити, як приклад, іони, такі як хром(III), марганець(II), залізо(III), залізо(II), кобальт(II), нікель(II), мідь(II), неодим(III), самарій(III), ітербій(III), гадоліній(III), ванадій(II), тербій(III), диспрозій(III), гольмій(III) і/або ербій(III), гадоліній є особливо переважним. Іони, корисні в інших контекстах, таких як рентгенівська візуалізація, включають, як необмежувальні приклади, лантан(III), золото(III), свинець(II) і особливо вісмут(III). У випадку радіоактивних ізотопів для використання в терапевтичних і/або діагностичних 211 14 51 36 57 58 67 152 додатках можна відзначити астат , вуглець, хром, хлор, кобальт, кобальт, мідь , Еu, 67 3 123 125 131 111 59 32 186 188 75 галій , водень, йод , йод , йод , індій , залізо, фосфор, реній , реній , селен, 35 99m 90 125 сірку, технецій і/або ітрій . I часто є переважним для використання у визначених 99m 111 варіантах здійснення, і технецій і/або індій також часто є переважними через їх низьку енергію і придатність для детекції з великим радіусом дії. Радіоактивно мічені рецептори за даним винаходом можуть бути одержані згідно зі способами, відомими в даній галузі. Наприклад, рецептори можуть йодуватися при контакті з йодидом натрію і/або калію і хімічним окисним засобом, таким як гіпохлорит натрію, або ферментативним окислювальним засобом, 99m таким як лактопероксидаза. TcR відповідно до винаходу може бути мічений технецієм за допомогою процесу обміну лігандів, наприклад шляхом редукування пертехнату розчином олова, хелатування редукованого технецію на колонці із Сефадексом і застосування антитіла до цієї колонки. Крім того, можуть бути використані способи прямого маркування, наприклад, шляхом інкубації пертехнату, відновлювального засобу, такого як SNCl 2, буферного розчину, такого як розчин фталату натрію-калію й антитіла. Проміжні функціональні групи, які часто використовуються для зв'язування радіоізотопів, що існують як металеві іони, з антитілом являють собою діетилентриамінпентаоцтову кислоту (DTPA) або етилендіамінтетраоцтову кислоту (ЕДТО). Серед флуоресцентних міток, передбачених для використання як кон'югатів, є Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Су5,6-FAM, ізотіоціанат флуоресцину, HEX, 6-JOE, Орегон зелений 488, Орегон зелений 500, Орегон зелений 514, Pacific Blue, REG, родамін зелений, родамін червоний, ренографін, ROX, TAMRA, ТЕТ, тетраметилродамін і/або Техас червоний. 2. Терапевтичні реагенти Створена широка різноманітність терапевтичних засобів, що зв'язуються з антитілами за даним винаходом. Наприклад, радіоізотопи, які обговорювалися вище, хоча і корисні в діагностичних контекстах, можуть бути також використані як терапевтичні засоби. Хіміотерапевтичні засоби також можна кон'югувати з антитілами і вони включають цисплатин 15 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (CDDP), карбоплатин, прокарбазин, меклоретамін, циклофосфамід, камптотецин, іфосфамід, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, нітросурею, дактиноміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, блеоміцин, плікоміцин, мітоміцин, етопозид (VP16), тамоксифен, ралоксифен, зв'язувальні речовини рецептора естрогену, таксол, гемцитабін, навелбін, інгібітори фарнезилпротеїнтрансферази, трансплатинум, 5-фторурацил, вінкристин, вінбластин і метотрексат. Інший клас терапевтичних засобів являє собою токсини. Передбачені холерний токсин, токсин ботулізму, коклюшний токсин, A- і B-ланцюги рицину, а також інші природні або синтетичні токсини. Цитокіни і лімфокіни являють собою ще один клас терапевтичних засобів, що можуть зв'язуватися з TcR за даним винаходом, і включають IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, TNFα, GMCSF, INFα, INFβ і IFNγ. В інших варіантах здійснення протизапальні засоби передбачені як терапевтичні засоби, які можуть бути кон'юговані з антитілами. Протизапальні засоби включають засоби нестероїдної протизапальної терапії, стероїди, рапаміцин, інфліксимаб і онтек. Імуносупресивні засоби включають FK-506 і циклоспорин А. Агоніст TLR може бути зв'язаний з антитілом, наприклад, через Fc-частину молекули. Агоністи TLR є сполуками, які стимулюють або "вмикають" імунну систему. Природними агоністами для TLR9 є компоненти ДНК, що є загальними для бактерій і вірусів. Природними агоністами для TLR7 і 8 є структури РНК, що виявляються у вірусах. Після розпізнавання своїх природних ДНК- і РНК-агоністів, кожний з TLR7, 8 і 9 ініціює каскад різних захисних імунних реакцій. Агоністи TLR включають олігодезоксинуклеотиди, фрагменти гіалуронової кислоти, іміквімод, лавендустин C, ліпід А, лороксибін, LPS, монофосфорилліпід А, міристицин, резиквімод, флагелін S. typhimurium, HKLM, PAM3CSK4 і polyІ:C. IV. Нуклеїнові кислоти й експресія А. Нуклеїнові кислоти, що кодують антитіла В одному з аспектів винахід стосується нуклеїнових кислот, що кодують різні фрагменти важкого і легкого ланцюгів антитіла, варіабельних і константних доменів. Сегмент нуклеїнової кислоти може бути одержаний з геномної ДНК, комплементарної ДНК (кДНК) або синтетичної ДНК. Якщо бажаним є включення у вектор експресії, нуклеїнова кислота також може включати природний інтрон або інтрон, одержаний від іншого гена, а також інші некодуючі (наприклад, регуляторні) і кодуючі області (наприклад, лінкери). Як використовується в даному документі, термін "кДНК" призначений для позначення ДНК, одержаної з використанням матричної РНК (мРНК) як матриці. Перевага використання кДНК, на відміну від геномної ДНК або ДНК, полімеризованої з геномної, необробленої або частково обробленої матриці РНК, кДНК, у першу чергу, містить кодуючі послідовності відповідного білка. Термін "рекомбінантний" може використовуватися в сполученні з поліпептидом або назвою конкретного поліпептиду і, як правило, означає поліпептид, продукований з молекули нуклеїнової кислоти, на якій здійснювалися маніпуляції in vitro або яка являє собою реплікований продукт такої молекули. Рекомбінантні вектори і виділені сегменти нуклеїнової кислоти можуть різним чином включати власне кодуючі антитіло області, що несуть вибрані зміни або модифікації в основній кодуючій області, або вони можуть кодувати більш великі поліпептиди, що включають області, відмінні від областей антитіл. "Нуклеїнова кислота", як використовується в даному документі, включає одноланцюжкові і дволанцюжкові молекули, а також ДНК, РНК, хімічно модифіковані нуклеїнові кислоти й аналоги нуклеїнових кислот. Передбачається, що нуклеїнова кислота в межах обсягу даного винаходу може складатися з приблизно 10, приблизно 20, приблизно 30, приблизно 40, приблизно 50, приблизно 60, приблизно 70, приблизно 80, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 110, приблизно 120, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150, приблизно 160, приблизно 170, приблизно 180, приблизно 190, приблизно 200, приблизно 210, приблизно 220, приблизно 230, приблизно 240, приблизно 250, приблизно 275, приблизно 300, приблизно 325, приблизно 350, приблизно 375, приблизно 400, приблизно 425, приблизно 450, приблизно 475, приблизно 500, приблизно 525, приблизно 550, приблизно 575, приблизно 600, приблизно 625, приблизно 650, приблизно 675, приблизно 700, приблизно 725, приблизно 750, приблизно 775, приблизно 800, приблизно 825, приблизно 850, приблизно 875, приблизно 900, приблизно 925, приблизно 950, приблизно 975, приблизно 1000, приблизно 1100, приблизно 1200, приблизно 1300, приблизно 1400, приблизно 1500, приблизно 1750, приблизно 2000, приблизно 2250, приблизно 2500 або більше нуклеотидних залишків у довжину. 16 UA 114108 C2 5 10 15 Передбачається, що антитіло може кодуватися за допомогою будь-якої послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує відповідну амінокислотну послідовність, таку як послідовності в SEQ ID NO:3, 60, 5, 8, 9, 10 (важкі CDR1, 2 і 3; легкі CDR1 і 2, 3/JK) і SEQ ID NO:11 або 27, що включають важкі CDR і каркасні області 1, 2 і 3, які фланкують вверх за течією важких CDR 1, 2 і 3, відповідно, і SEQ ID NO:23, що включає легкі CDR і каркасні області 1, 2 і 3, що фланкують вверх за течією легких CDR 1, 2 і 3, відповідно. Конструювання і продукція нуклеїнових кислот, що кодують бажані послідовності амінокислот, добре відомі фахівцям у даній галузі, з використанням стандартизованих таблиць кодонів (Таблиця 4). У конкретних варіантах здійснення кодони, вибрані для кодування кожної амінокислоти, можуть бути змінені для оптимізації експресії нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні, що представляє інтерес. Термін "функціонально еквівалентний кодон" використовується в даному документі для позначення кодонів, які кодують однакові амінокислоти, такі як шість кодонів для аргініну або серину, а також стосується кодонів, які кодують біологічно еквівалентні амінокислоти. Кодонові переваги для різних видів клітини-хазяїна добре відомі в даній галузі. Кодони, переважні для використання в організмі людини, добре відомі фахівцям у даній галузі (Wada et al., 1990). Кодонові переваги для інших організмів також добре відомі фахівцям у даній галузі (Wada et al., 1990, наведений у даному описі в повному обсязі як посилання). Таблиця 4 Таблиця кодонів Амінокислоти Аланін Цистеїн Аспарагінова кислота Глутамінова кислота Фенілаланін Гліцин Гістидин Ізолейцин Лізин Лейцин Метіонін Аспарагін Пролін Глутамін Аргінін Серин Треонін Валін Триптофан Тирозин 20 25 30 Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y Кодони GCA GCC GCG GCU UGC UGU GAC GAU GAA GAG UUC UUU GGA GGC GGG GGU CAC CAU AUA AUC AUU AAA AAG UUA UUG CUA CUC CUG CUU AUG AAC AAU CCA CCC CCG CCU CAA CAG AGA AGG CGA CGC CGG CGU AGC AGU UCA UCC UCG UCU ACA ACC ACG ACU GUA GUC GUG GUU UGG UAC UAU В. Експресія нуклеїнових кислот Системи на основі прокаріот і/або еукаріот можуть бути використані для продукції послідовностей нуклеїнових кислот або їх споріднених поліпептидів, білків і пептидів. Даний винахід стосується використання такої експресійної системи для продукції антитіл, що зв'язують PR-1/HLA-A2. Одна ефективна експресійна технологія використовує систему клітин комах/бакуловірусів. Система клітин комах/бакуловірусів може забезпечувати високий рівень білкової експресії сегмента гетерологічної нуклеїнової кислоти так, як описано в патентах США №№ 5871986 і 4879236, кожний з яких представлений у даному описі як посилання, і яку можна придбати, наприклад, за назвою MAXBAC® 2.0 від INVITROGEN® і BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM від CLONTECH®. Крім того, існує множина інших систем експресії, які комерційно і широко доступні. Одним із прикладів такої системи є індуцибельна система експресії ссавців STRATAGENE®'s COMPLETE CONTROL, що включає синтетичний екдизон-індукований рецептор, або його систему експресії pET, систему експресії в E. coli. Інший приклад індукованої системи експресії доступний від INVITROGEN®, що несе систему T-REX™ (тетрациклін-регульована експресія), індукована 17 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 система експресії ссавців, що використовує повнорозмірний промотор CMV. INVITROGEN® також надає дріжджову систему експресії, називану Pichia methanolica Expression System, яка призначена для високого рівня продукції рекомбінантних білків у метилотрофних дріжджах Pichia methanolica. Будь-який фахівець у даній галузі знає, як експресувати вектор, такий як експресійна конструкція, щоб продукувати послідовність нуклеїнової кислоти або спорідненого з нею поліпептиду, білка або пептиду. 1. Вірусні вектори і доставка Існує ряд способів, у яких вектори експресії можуть бути введені в клітини. Віруси є потужним інструментом для експресії білкових продуктів, кодованих нуклеїновими кислотами. Таким чином, у визначених варіантах здійснення винаходу, вектор експресії містить вірусний або сконструйований вектор, що походить від вірусного геному. Здатність деяких вірусів проникати в клітини за допомогою рецептор-опосередкованого ендоцитозу, інтегруватися в геном клітини-хазяїна і експресувати вірусні гени стабільно й ефективно зробили їх привабливими кандидатами для перенесення чужорідних генів у клітини ссавців (Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986). Перші віруси, використовувані як генні вектори, являли собою ДНК-вмісні віруси, у тому числі паповавіруси (вакуолізуючий мавпячий вірус 40, вірус бичачої папіломи і вірус поліоми) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) і аденовіруси (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986). Аденовірусні вектори. Конкретний спосіб для доставки нуклеїнової кислоти включає використання аденовірусного вектора експресії. Незважаючи на те, що аденовірусні вектори, як відомо, мають низький потенціал для інтеграції в геномну ДНК, ця особливість врівноважується високою ефективністю перенесення генів, що надається цими векторами. Під "аденовірусним вектором експресії" маються на увазі ті конструкції, які містять аденовірусні послідовності, достатні для (a) забезпечення упакування конструкції і (b) щоб, у кінцевому рахунку, експресувати тканино- або клітиноспецифічну конструкцію, яка була клонована в ньому. Знання генетичної організації або аденовірусу, вірус з 36 т.п.н. лінійної дволанцюжкової ДНК, дозволяє заміщати великі фрагменти ДНК аденовірусу чужорідними послідовностями до 7 т.п.н. (Grunhaus and Horwitz, 1992). Вектори AAV. Нуклеїнову кислоту можна вводити в клітину з використанням аденовірусної асистованої трансфекції. Підвищена ефективність трансфекції була зареєстрована в клітинних системах з використанням аденовірус-зв'язаних систем (Kelleher and Vos, 1994; Cotten et al., 1992; Curiel, 1994). Аденоасоційований вірус (AAV) являє собою привабливу векторну систему для використання у вакцинах за даним винаходом (Muzyczka, 1992). AAV має широке коло хазяїнів для інфекційності (Tratschin et al., 1984; Laughlin et al., 1986; Lebkowski et al., 1988; McLaughlin et al., 1988). Подробиці, що стосуються одержання і використання векторів rAAV, описані в патентах США №№ 5139941 і 4797368, кожний з яких представлений у даному описі як посилання. Ретровірусні вектори. Ретровіруси подають надію як вектори генної доставки у вакцинах через здатність інтегрувати свої гени в геном хазяїна, переносячи велику кількість чужорідного генетичного матеріалу, заражаючи широкий спектр видів і типів клітин і будучи упакованими в спеціальних клітинних лініях (Miller, 1992). Щоб сконструювати ретровірусний вектор, нуклеїнова кислота (наприклад, кодуюча антиген, що представляє інтерес) вставляється у вірусний геном у ділянку визначених вірусних послідовностей для продукування вірусу, що є дефектним по реплікації. Для продукування віріонів конструюється пакувальна клітинна лінія, яка містить гени gag, pol і env, але без LTR і компонентів упакування (Mann et al., 1983). Коли рекомбінантна плазміда, що містить кДНК, разом з ретровірусною LTR і послідовностями упакування вводяться в спеціальну клітинну лінію (наприклад, за допомогою преципітації у фосфаті кальцію), пакувальна послідовність забезпечує упакування РНК-транскрипту рекомбінантної плазміди у вірусні частинки, які потім секретуються в культуральне середовище (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Середовище, що містить рекомбінантні ретровіруси, потім збирають, при необхідності концентрують і використовуються для перенесення генів. Ретровірусні вектори здатні інфікувати множину типів клітин. При цьому інтеграція і стійка експресія вимагають поділу клітин хазяїна (Paskind et al., 1975). Лентивіруси являють собою складні ретровіруси, які, на доповнення до загальних ретровірусних генів gag, pol і env містять інші гени з регуляторною або структурною функцією. Лентивірусні вектори добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997; патенти США №№ 6013516 і 5994136). Деякі приклади лентивірусів включають віруси імунодефіциту людини: ВІЛ-1, ВІЛ-2, і мавпячий вірус імунодефіциту: SIV. 18 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Лентивірусні вектори були одержані шляхом багаторазового ослаблення генів вірулентності ВІЛ, наприклад гени env, vif, vpr, vpu і nef видаляються, роблячи вектор біологічно безпечним. Рекомбінантні лентивірусні вектори здатні інфікувати клітини, що не діляться, і можуть бути використані для перенесення генів як in vivo, так і ex vivo і експресії послідовностей нуклеїнових кислот. Наприклад, рекомбінантний лентивірус, здатний інфікувати клітину, що не ділиться, де придатна клітина-хазяїн трансфікується двома або більше векторами, що несуть функції упакування, а саме gag, pol і env, а також rev і tat, описаний у патенті США № 5994136, що включений у даний опис як посилання. Можна націлити рекомбінантний вірус шляхом зв'язування білка оболонки з антитілом або конкретним лігандом для націлювання на рецептор конкретного клітинного типу. Шляхом вбудовування послідовності, що представляє інтерес (у тому числі регуляторної області), у вірусний вектор, поряд з іншим геном, який кодує ліганд для рецептора на конкретній клітині-мішені, наприклад вектор тепер стає мішенеспецифічним. Інші вірусні вектори. Інші вірусні вектори можуть бути використані як вакцинні конструкції за даним винаходом. Вектори, одержані з вірусів, таких як вірус вісповакцини (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), вірус Синдбіс, цитомегаловірус і вірус простого герпесу, можуть використовуватися. Вони мають ряд привабливих особливостей для різних клітин ссавців (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990). Лентивіруси також були вивчені як вакцинні вектори (VandenDriessche et al., 2002). Доставка за допомогою модифікованих вірусів. Нуклеїнові кислоти, що доставляються, можуть бути розміщені в інфекційному вірусі, який був сконструйований для експресії специфічного ліганду зв'язування. Вірусна частинка, таким чином, буде специфічно зв'язуватися зі спорідненими рецепторами клітини-мішені і доставляти вміст до клітини. Новий підхід, спланований для забезпечення конкретного націлювання ретровірусних векторів, був розроблений на основі хімічної модифікації ретровірусу за допомогою хімічного додавання залишку лактози до оболонки вірусу. Ця модифікація може забезпечити специфічне інфікування гепатоцитів через сіалоглікопротеїнові рецептори. Інший підхід до націлювання рекомбінантних ретровірусів був розроблений, у ньому були використані біотинільовані антитіла проти ретровірусного білка оболонки і проти специфічного клітинного рецептора. Антитіла були з'єднані через компоненти біотину за допомогою стрептавідину (Roux et al., 1989). За допомогою антитіл проти антигенів класу I і класу II головного комплексу гістосумісності вони продемонстрували інфікування множини клітин людини, що несли ці поверхневі антигени з екотропним вірусом in vitro (Roux et al., 1989). 2. Невірусна доставка нуклеїнових кислот Придатні невірусні способи доставки нуклеїнової кислоти для ефективної експресії композиції за даним винаходом, як вважають, включають практично будь-який спосіб, за допомогою якого нуклеїнова кислота (наприклад, ДНК) може бути введена в органелу, клітину, тканину або організм, як описано в даному документі або як може бути відомо будь-якому фахівцю в даній галузі. Такі способи включають, без обмеження, пряму доставку ДНК, наприклад, шляхом ін'єкції (патенти США №№ 5994624, 5981274, 5945100, 5780448, 5736524, 5702932, 5656610, 5589466 і 5580859, кожний з яких включений у даний опис як посилання), включаючи мікроін'єкцію (Harland and Weintraub, 1985; патент США № 5789215, включений у даний опис як посилання); шляхом електропорації (патент США № 5384253, включений у даний опис як посилання); шляхом преципітації фосфатом кальцію (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); з використанням DEAE-декстрану з наступним поліетиленгліколем (Gopal, 1985); шляхом безпосереднього завантаження при соніфікації (Fechheimer et al., 1987); шляхом ліпосома-опосередкованої трансфекції (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato еt al., 1991); шляхом мікропроекційного бомбардування (заявки РСТ №№ WO 94/09699 і 95/06128; патенти США №№ 5610042; 5322783, 5563055, 5550318, 5538877 і 5538880, і кожний з яких включений у даний опис як посилання); шляхом збовтування з карбідкремнієвими волокнами (Kaeppler et al., 1990; патенти США №№ 5302523 і 5464765, кожний з яких включений у даний опис як посилання) або шляхом ПЕГ-опосередкованої трансформації протопластів (Omirulleh et al., 1993; патенти США №№ 4684611 і 4952500, кожний з яких включений у даний опис як посилання); за допомогою висушування/інгібування-опосередкованого поглинання ДНК (Potrykus et al., 1985). Використання способів, таких як ці, можна стабільно або тимчасово трансформувати органелу(и), клітину(и), тканину(и) або організм(и). V. Антитіла для діагностики ракових або гіперпластичних або диспластичних порушень В одному з варіантів здійснення за даним винаходом запропоновані способи діагностики злоякісної пухлини, такої як лейкемія (наприклад, AML, CML, MDS), а також мієлодиспластичних 19 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розладів. Мієлодисплазія (MDS) належить до групи захворювань, при яких кістковий мозок не функціонує нормально і виробляє недостатню кількість нормальних клітин крові. MDS впливає на продукування будь-яких, а іноді всіх типів клітин крові, включаючи еритроцити, тромбоцити і білі клітини крові (цитопенії). Близько 50 % дитячої мієлодисплазії можна розділити на п'ять типів МДС: рефрактерна анемія, рефрактерна анемія з кільцевими сидеробластами, рефрактерна анемія з надлишком бластів, рефрактерна анемія з надлишком бластів при трансформації і хронічний мієломоноцитарний лейкоз. 50 %, що залишилися, як правило, присутні з виділеними або об'єднаними цитопеніями, такими як анемія, лейкопенія і/або тромбоцитопенія (низька кількість тромбоцитів). Незважаючи на хронічний характер, MDS прогресує, щоб стати гострим мієлоїдним лейкозом (AML) у 30 % пацієнтів. Також передбаченими для діагностики за даним винаходом є тверді пухлинні форми раку. Такою злоякісною пухлиною є рак легені, рак голови і шиї, рак молочної залози, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирок, рак кістки, рак яєчка, рак шийки матки, рак дванадцятипалої кишки, лімфоми, передпухлинні ураження в легенях, рак товстої кишки, меланома і рак сечового міхура. Інші гіперплазичні, пухлинні і диспластичні захворювання, включаючи доброякісні гіперпроліферативні захворювання, також знаходяться в сфері застосування діагностичних процедур, описаних у даному документі. A. Введення діагностичних реагентів Введення діагностичних реагентів добре відоме фахівцям у даній галузі і повинно варіюватися залежно від діагнозу, якого потрібно досягти. Наприклад, у випадку, де передбачається дискретна пухлинна маса або маси, може застосовуватися місцеве або регіонарне введення (наприклад, у кровоносні судини пухлини, локальну лімфатичну систему або місцеві артерії або вени). Крім того, можна надавати діагностичні реактиви регіонально або системно. Це може бути спосіб введення вибору, де бажана візуалізація всієї кінцівки або організму, де була визначена відома специфічна пухлинна маса, або при підозрі на метастази. В. Ін'єкційні композиції і склади Одним зі способів доставки лікарських засобів за даним винаходом є системний спосіб. Проте, фармацевтичні композиції, розкриті в даному описі, можна також вводити парентерально, внутрішньовенно, внутрішньошкірно, внутрішньом'язово, черезшкірно або навіть внутрішньоочеревинно, як описано в патенті США № 5543158; патенті США № 5641515 і патенті США № 5399363 (кожний з яких конкретно включений у даний опис як посилання у всій його повноті). Ін'єкцію лікарських засобів можна проводити за допомогою шприца або будь-якого іншого способу, використовуваного для ін'єкції розчину, за умови, що засіб може пройти через голку специфічного розміру, необхідну для ін'єкції. Була описана нова безголкова система упорскування (патент США № 5846233), яка має випускний отвір, що визначає камеру ампули для подачі розчину й енергетичний пристрій для подачі розчину з випускного отвору в ділянку доставки. Також була описана шприцева система для застосування в генній терапії, яка дозволяє здійснювати множинні ін'єкції заданої кількості розчину точно на будь-яку глибину (патент США № 5846225). Розчини активних сполук у вигляді вільної основи або фармакологічно прийнятних солей можуть бути приготовлені у воді, відповідним чином змішаній з поверхнево-активною речовиною, такою як гідроксипропілцелюлоза. Дисперсії також можуть бути одержані в гліцерині, рідких поліетиленгліколях і їх сумішах і оліях. При звичайних умовах зберігання і використання ці препарати містять консервант для запобігання росту мікроорганізмів. Фармацевтичні форми, придатні для ін'єкцій, включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій для негайного прийому (патент США № 5466468, спеціально включений у даний опис як посилання в повному обсязі). В усіх випадках форма повинна бути стерильною і повинна бути рідкою до такої міри, щоб легко вводитися через шприц. Вона повинна бути стабільною в умовах продукування і зберігання і повинна бути збережена від забруднюючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії і грибки. Носій може бути розчинником або дисперсійним середовищем, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь і т. п.), придатні їх суміші і/або рослинні олії. Належна плинність може підтримуватися, наприклад, шляхом використання покриття, такого як лецитин, шляхом підтримання необхідного розміру частинок у випадку дисперсії і використанням поверхневоактивних речовин. Запобігання дії мікроорганізмів може бути досягнуте за допомогою різних антибактеріальних і протигрибкових засобів, наприклад парабенів, хлорбутанолу, фенолу, сорбінової кислоти, тимеросалу тощо. У багатьох випадках буде переважно включати ізотонічні засобу, наприклад цукри або хлорид натрію. Пролонгована абсорбція ін'єктованих композицій 20 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 може бути досягнута за рахунок використання в композиціях засобів, що затримують абсорбцію, наприклад моностеарату алюмінію і желатину. Для парентерального введення у водному розчині, наприклад, розчин повинний бути відповідним чином забуферений, якщо необхідно, і рідкий розріджувач спочатку стає ізотонічним за допомогою достатньої кількості фізіологічного розчину або глюкози. Ці конкретні водні розчини особливо придатні для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, внутрішньопухлинного і внутрішньоочеревинного введення. У зв'язку з цим, стерильні водні середовища, які можуть використовуватися, повинні бути відомі фахівцям у даній галузі у світлі даного розкриття. Наприклад, одну дозу можна розчинити в 1 мл ізотонічного розчину NaCl і або додати до 1000 мл гіподермолітичної рідини або вводити в передбачувану ділянку інфузії (див., наприклад, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15-е видання, на сторінках 1035-1038 і 15701580). Деякі відмінності в дозуванні обов'язково будуть виникати залежно від стану індивідуума, що піддається лікуванню. Особа, відповідальна за введення, у будь-якому випадку буде визначати відповідну дозу для окремого індивідуума. Більше того, для введення людині препарати повинні відповідати в плані стерильності, пірогенності, загальної безпеки і стандартам чистоти відповідно до вимог Служби біологічних стандартів Управління по санітарному нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів. Стерильні ін'єкційні розчини готують шляхом включення активних сполук у необхідній кількості у відповідний розчинник з різними іншими інгредієнтами, перерахованими вище, як необхідно, з наступною стерилізацією фільтруванням. Як правило, дисперсії готують шляхом включення різних стерилізованих активних інгредієнтів у стерильний носій, що містить основне дисперсійне середовище й інші необхідні інгредієнти з тих, котрі перераховані вище. У випадку стерильних порошків для одержання стерильних ін'єкційних розчинів переважними способами одержання є способи вакуумного висушування і ліофілізації, що дають порошок активного інгредієнта плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт із раніше стерильногопрофільтрованого розчину цього. Композиції, розкриті в даному описі, можуть бути сформульовані в нейтральній або сольовій формі. Фармацевтично прийнятні солі включають кислотно-адитивні солі (що утворюються з вільними аміногрупами білка) і солі, що утворюються з неорганічними кислотами, такими як, наприклад, соляна або фосфорна кислота, або такими органічними кислотами, як оцтова, щавлева, винна, мигдальна і т. п. Солі, утворені з вільними карбоксильними групами, також можуть бути одержані з неорганічних основ, таких як, наприклад, гідроксиди натрію, калію, амонію, кальцію або заліза, і таких органічних основ як ізопропіламін, триметиламін, гістидин, прокаїн і т. п. Після складання розчин буде вводиться відповідно до дозованого складу й у такій кількості, що є терапевтично ефективною. Склади легко вводити у вигляді різних лікарських форм, таких як розчини для ін'єкцій, капсули вивільнення лікарського препарату тощо. Як використовується в даному документі, "носій" включає будь-який і всі розчинники, дисперсійні середовища, носії, покриття, розріджувачі, антибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні і затримуючі всмоктування засоби, буфери, розчини носіїв, суспензії, колоїди тощо. Використання таких середовищ і засобів для фармацевтичних активних речовин добре відоме в даній галузі. За винятком випадків несумісності якого-небудь звичайного носія або засобу з активним інгредієнтом, передбачається його використання в терапевтичних композиціях. Додаткові активні інгредієнти також можуть бути включені в композиції. Вираз "фармацевтично прийнятний" або "фармакологічно прийнятний" стосується молекулярних сутностей і композицій, які не викликають алергічну або подібну небажану реакцію при введенні в організм людини. Одержання водної композиції, що містить білок як активний інгредієнт, добре відоме фахівцям у даній галузі. Як правило, такі композиції одержують як ін'єктовані або у вигляді рідких розчинів або суспензій; тверді форми, придатні для розчинення або суспендування в рідині перед ін'єкцією, також можуть бути одержані. VI. Терапевтичні способи А. Ракові і гіперпластичні/диспластичні/неопластичні захворювання Антитіла за даним винаходом можуть застосовуватися в способах лікування гіперпластичних/диспластичних/неопластичних захворювань/станів, включаючи злоякісні пухлини. Види захворювань/умов, передбачених для лікування пептидами за даним винаходом, без обмеження, включають лейкози, такі як AML, МDS і CML, а також мієлодисплазії. Інші види злоякісних пухлин можуть включати рак легень, рак голови і шиї, рак молочної залози, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирок, рак кістки, рак яєчка, рак шийки матки, рак дванадцятипалої кишки, лімфоми, передпухлинні ураження в легень, рак товстої кишки, меланоми, рак сечового міхура й інші пухлинні захворювання. 21 UA 114108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Щоб знищити клітини, інгібувати ріст клітин, інгібувати метастазування, зменшити розмір пухлини/тканини, тяжкість пухлинних клітин або іншим способом змінити або зменшити злоякісний фенотип пухлинних клітин за допомогою способів і композицій за даним винаходом, звичайно необхідно гіперпластичну/пухлинну/злоякісну клітину піддати приведенню в контакт із терапевтичною сполукою, такою як поліпептид, або експресійною конструкцією, що кодує антитіло за даним винаходом, як правило, диспергованими у фармацевтично прийнятному буфері або носії (див. вище в обговоренні діагностичних засобів). Способи введення будуть змінюватися, природно, залежно від розташування і характеру ураження і включають, наприклад, внутрішньошкірне, трансдермальне, парентеральне, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, інтраназальне, підшкірне, черезшкірне, інтратрахеальне, внутрішньоочеревинне, внутрішньопухлинне, перфузійне, через полоскання, через безпосередню ін'єкцію і пероральне введення і склад. Будь-який зі складів і способів введення, що розглядається стосовно лікування або діагностики раку, також може використовуватися відносно неопластичних захворювань і станів. Передбачені варіанти здійснення ex vivo, де пухлинні клітини обробляються/трансдукуються поза організмом пацієнта (або спеціально, або як частина великої популяції клітин). Внутрішньопухлинна ін'єкція, або ін'єкція в судинне русло пухлини, спеціально передбачена для дискретних, твердих, доступних пухлин. Місцеве, регіональне або системне введення також може бути доречним. Для пухлин > 4 см об'єм введення повинен складати приблизно 4-10 мл, тоді як для пухлини
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMonoclonal antibodies for use in diagnosis and therapy of cancers and autoimmune disease
Автори англійськоюMolldrem, Jeffrey, Sergeeva, Anna
Автори російськоюМоллдрэм Джэффри, Сергеева Анна
МПК / Мітки
МПК: C07K 16/18, A61K 39/395
Мітки: моноклональне, злоякісних, захворювання, пухлин, терапії, антитіло, застосування, діагностиці, аутоімунного
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/95-114108-monoklonalne-antitilo-dlya-zastosuvannya-v-diagnostici-i-terapi-zloyakisnikh-pukhlin-i-autoimunnogo-zakhvoryuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання</a>
Моноклональне антитіло, яке спричиняє апоптоз кров’яних клітин, що містять ядро та інтегрин-пов’язаний протеїн людини (іпп), фрагмент моноклонального антитіла, гібридома, яка продукує моноклональне антитіло (ва
Номер патенту: 72192
Опубліковано: 15.02.2005
Автори: Уно Шінсуке, Фукушіма Наоші
МПК: C07K 16/28, C12N 5/20, C12P 21/08
Мітки: іпп, фрагмент, містять, ва, протеїн, моноклональне, людини, моноклонального, гібридома, антитіло, продукує, кров'яних, інтегрин-пов'язаний, яке, яка, апоптоз, антитіла, спричиняє, клітин, ядро
Формула / Реферат:
1. Моноклональне антитіло, яке зв’язується із інтегрин-пов’язаним протеїном людини (ІПП) і спричиняє апоптоз кров'яних клітин, що містять ядро та ІПП.2. Моноклональне антитіло за п.1, яке відрізняється тим, що антитіло отримують способом, що включає:а) імунізацію тварин з використанням ІПП людини як сенсибілізуючого антигена,б) одержання гібридом;в) відбір антитіл, що розпізнають ІПП людини та спричиняють апоптоз...
Лікарський засіб для терапії злоякісних пухлин та спосіб лікування злоякісних пухлин з його використанням
Номер патенту: 92302
Опубліковано: 11.10.2010
Автор: Суслов Євгеній Іванович
МПК: A61K 31/191, A61P 35/00, A61K 31/185
Мітки: лікування, лікарський, засіб, терапії, пухлин, використанням, злоякісних, спосіб
Формула / Реферат:
1. Лікарський засіб для терапії злоякісних пухлин, що містить антипроліферативну речовину у вигляді комплексної солі Са-альдонової та амінокарбонової кислоти, який відрізняється тим, що як комплексну сіль Са-альдонової та амінокарбонової кислоти містить сполуку формули (І), (I)де n = 4.2. Засіб за п. 1, який відрізняється тим, що приготований у вигляді...
Моноклональне антиподвійне інтегринове антитіло, що специфічно зв’язує людські інтегрини альфа v бета 3 та альфа v бета 5, фармацевтична композиція, що його містить, та їх застосування в терапії
Номер патенту: 83988
Опубліковано: 10.09.2008
Автори: Хевнер Джордж, Трікха Мохіт, Гілес-Комар Джілл, Снайдер Лінда
МПК: C07K 16/28, A61K 39/395, A61P 35/00, C12N 15/13, C12N 5/10
Мітки: терапії, бета, композиція, інтегринове, застосування, альфа, фармацевтична, містить, моноклональне, специфічно, зв'язує, антиподвійне, людські, антитіло, інтегрини
Формула / Реферат:
1. Моноклональне антиподвійне інтегринове антитіло людини, що специфічно зв'язує людські інтегрини Альфа V Бета 3 та Альфа V Бета 5 з високою афінністю зв'язування, принаймні 2,1±1,33х10-10 для Альфа V Бета З та принаймні 2,5±1,04х10-11 для Альфа V Бета 5, до очищених інтегринів, яке має варіабельний регіон важкого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 7, та варіабельний регіон легкого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 8. 2....
Моноклональне антитіло і спосіб його застосування
Номер патенту: 104587
Опубліковано: 25.02.2014
Автори: Састрі Кедарнат Нанджунд, Адхікарі Лаксмі, Наїр Прадіп, Вальядарес Хосефа Ломбардеро, Родрігес Роландо Перес, Раджкумар Сундарадж Дейвід, Баласубраманіан Хема, Касіміро Хосе Енріке Монтеро, Чаттерджі Моналіза, Меларкоде Рамакрішнан
МПК: A61P 37/06, A61P 17/06, C07K 16/28, A61P 19/02, A61K 39/395
Мітки: застосування, антитіло, моноклональне, спосіб
Формула / Реферат:
1. Моноклональне антитіло, що містить поліпептид важкого ланцюга та поліпептид легкого ланцюга, представлені послідовностями SEQ ID NO:1 та SEQ ID N0:2, відповідно, де згадані поліпептиди відповідають нуклеотидним послідовностям, представленим послідовностями SEQ ID NO:3 та SEQ ID N0:4, відповідно, яке специфічно зв'язується з доменом 1 (D1) CD6 та пригнічує проліферацію Т-клітин без перешкоджання зв'язуванню з ALCAM, причому згадане...
Моноклональне антитіло, химерне антитіло, повністю гуманізоване антитіло, антитіло до антиідіотипічного антитіла або його фрагмент до рецептора ліпопротеїнів низької щільності (лпнщ) людини, спосіб їх одержання
Номер патенту: 78489
Опубліковано: 10.04.2007
Автори: Антонетті Франческо, Бельзер Ілана, Йонах Начум, Суісса Дані, Дреано Мішель, Смоларскі Моше
МПК: G01N 33/577, G01N 33/68, C12N 5/20, C12P 21/08, C07K 16/28
Мітки: антиідіотипічного, моноклональне, людини, ліпопротеїнів, низької, антитіло, одержання, рецептора, лпнщ, щільності, спосіб, гуманізоване, антитіла, фрагмент, химерне, повністю
Формула / Реферат:
1. Моноклональне антитіло, химерне антитіло, повністю гуманізоване антитіло, антитіло до антиідіотипічного антитіла або його фрагмент, що специфічно розпізнає і зв'язує розчинний рецептор ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ)людини і його фрагменти, а також здатне інгібувати реплікацію вірусу гепатиту С, і яке одержують шляхом імунізації тварин формою +291 розчинного рецептора ЛПНЩ людини, тобто формою розчинного рецептора людини, що містить...
Попередній патент: Радіочастотний модуль цифрової шини
Наступний патент: Піразолопіримідинові сполуки
Випадковий патент: Спосіб лікування червоного плескатого лишаю слизової оболонки порожнини рота