Спосіб діагностики туберкульозу та мікобактеріозів тварин

Корисна модель, що передбачається, відноситься до ветеринарної мікробіології, імунології та біотехнології, а саме до способу детекції ДНК бактерій роду Mycobacteria та їх диференціації за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Існує декілька способів діагностики туберкульозу. Відомий спосіб диференціації мікобактерій, заснований на методах біологічних, бактеріологічних та біохімічних досліджень. Ці комплексні дослідження включають швидкість утворення пігменту (при світлі чи у темряві), морфологію колоній, здатність до росту на простих живильних середовищах та при температурі 2025°С, каталазну активність, пероксідазну активність, термостабільність каталази, первинну стійкість до препаратів першого ряду - стрептоміцину, ізоніазіду, ПАСК. Важливу інформацію дають опити на тваринах. Дані методи є трудомісткими, мають значний термін виконання (до 3міс.) та не є високо специфічними. Крім того, відомий метод ідентифікації мікобактерій шляхом визначення нуклеотидного складу ДНК по температурі плавлення, ступеню подібності нуклеотидних послідовностей в порівнянні між собою, де вимагається клонування фрагментів відомої ДНК, створення рекомбінатних ДНК-зондів на плазмідних векторах. Цей метод складний та невисоко специфічний через відсутність універсальності отриманих ДНК-зондів, тобто він вимагає розробку ДНК-зондів, специфічних до кожного виду мікобактерій. Відомий також метод (Шилова В. И., Фаизов Т. Х., Алимов A. M., Хазипов Н. З. «Способ дифференциации различных видов микобактерий туберкулеза».) для визначення гіперваріабельних послідовностей в геномі мікобактерій за допомогою ДНК-зонду, виготовленого з ДНК бактеріофагу М13. Недоліками даного методу є велика складність та трудомісткість, пов'язана з фрагментуванням та клонуванням специфічних ділянок ДНК, також цей метод не дає можливості швидко та стовідсотково диференціювати мікобактерії до виду і вимагає значних матеріальних затрат. Існує спосіб (Гинзбург А. Л., Хоменко А. Г., Голышевская В. И., Шагинян И. А., Нестеренко Л. Н., Гришина Т. Д. «Способ диагностики туберкулеза».), який виконується наступним чином: для виявлення мікобактерій в клінічному матеріалі використовують дві ампліфікаційні тест-системи, в яких підбирають оптимальні концентрації компонентів реакційної суміші, а відпал праймерів здійснюється при 65°С. Це рішення може бути прототипом. Недоліком цього способу є те, що він здатний виявити мікобактерії тільки групи туберкульозу. В основу корисної моделі, що передбачається, поставлено задачу розробити спосіб діагностики туберкульозу та мікобактеріозів тварин полімеразною ланцюговою реакцією шляхом виявлення специфічного фрагменту ДНК збудників інфекції в біологічних пробах застосуванням 11 тест-систем з родо - та видоспецифічними праймерами, щоб забезпечити ефективність способу діагностики туберкульозу та мікобактеріозів тварин. Сутність способу полягає в тому, що диференціацію проводять в декілька етапів. З досліджуваного зразка біологічного матеріалу (клінічний матеріал, патматеріал, бактеріальна маса) виділяється ДНК, яка служить об'єктом при постановці каскаду реакцій. Для отримання остаточної відповіді про приналежність мікобактерії до того чи іншого виду застосовується 11 тест-систем з родо- та видоспецифічними праймерами. 1. Першим етапом є проведення ПЛР з родоспецифічними праймерами, специфічними до ділянки гена, що кодує 16S рібосомальну РНК (набір „РаnМус-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є мікобактерії. Наступним етапом є проведення ПЛР з видоспецифічними праймерами, використання яких залежить від виду тварин, які саме органи уражені, ступеня їх ураженості та підозри дослідника щодо можливого виду мікобактерій. 2. При підозрі на наявність у досліджуваному зразку мікобактерій туберкульозного комплексу проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки інсерційного елементу IS 6110 (набір „ТВС-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є мікобактерії туберкульозного комплексу. 3. При підозрі на наявність у досліджуваному зразку виду Mycobacterium bovis проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки гену EcoRI (набір „MBov-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є bovis. 4. При підозрі на наявність у досліджуваному зразку виду Mycobacterium tuberculosis проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки гену Mpt40 (набір „MTub-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є Mycobacterium tuberculosis. 5. При підозрі на наявність у досліджуваному зразку мікобактерій, які входять до Mycobacterium avium complex, а також Mycobacterium kansasii, Mycobacterium paratuberculosis проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки гена, що кодує 16S рібосомальну РНК (набір „МуcAvC-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є вище перераховані мікобактерії. 6. Щоб відрізнити з-поміж мікобактерій, що входять до комплексу Mycobacterium avium complex, Mycobacterium intracellulare проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки гена, що кодує 16S рібосомальну РНК (набір „МІсеl-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є Mycobacterium intracellulare. 7. Щоб диференціювати Mycobacterium intermedium проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки гена FR 300 (набір „MInt-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є Mycobacterium intermedium. 8. Щоб відрізнити з-поміж мікобактерій, що входять до комплексу Mycobacterium avium complex, Mycobacterium avium проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки інсерційного елементу IS 1245 (набір „MAv1-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є Mycobacterium avium. 9. Деякі штами з Mycobacterium avium можуть мати замість інсерційного елементу IS 1245 інший інсерційний елемент IS 901, в цьому випадку, коли реакція з праймерами, специфічними до ділянки інсерційного елементу IS 1245, негативна, проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки інсерційного елементу IS 901 (набір „МАv2-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є Mycobacterium avium. 10. Деякі штами з Mycobacterium avium можуть мати замість інсерційних елементів IS 1245 та IS 901 інший інсерційний елемент IS 902, в цьому випадку, коли реакція з праймерами, специфічними до ділянки інсерційних елементів IS 1245 та IS 901, негативна, проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки інсерційного елементу IS 902 (набір „МАv3-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є Mycobacterium avium. 11. При підозрі на наявність у досліджуваному зразку виду Mycobacterium paratuberculosis проводять ПЛР з праймерами, специфічними до ділянки інсерційного елементу IS 900 (набір „MParaTb-Україна"), в разі позитивної реакції роблять висновок, що у досліджуваному матеріалі є Mycobacterium paratuberculosis. Запропонований спосіб є високочутливим і дуже специфічним. Мінімальна кількість складає 2 клітини в досліджуваному зразку. На постановку кожної з реакцій затрачується біля 5-6 годин. Приклад 1 Обробка бактеріальної маси: - В усі досліджувані пробірки вносили бактеріальну масу по 2-3 колонії з твердого живильного середовища і додавали 200мкл бідистильованої води; якщо живильне середовище рідке, 1мкл цього середовища центрифугували при 12000об/хв протягом 5 хвилин, осад (седімент) переносили до інших пробірок і додавали 200мкл бідистильованої води. - Проводили інактивацію матеріала шляхом прогрівання пробірок у термостаті протягом 20 хвилин при 80°С. - Розміщували пробірки в ультразвуковому дезінтеграторі на 10 хвилин при 35кГц. - Кожну пробірку прогрівали у термостаті протягом 10 хвилин при 100°С. - Пробірки центрифугували 5 хвилин на мікроцентрифузі при 12000об/хв. - Надосадову рідину (супернатант) використовували для постановки реакції ампліфікації. Приклад 2 Постановка полімеразної ланцюгової реакції: - Наготовляли й пронумеровували пробірки для проведення ампліфікації ємністю 0,5мл (або 0,2мл), включали пробірки для позитивного й негативного контролю (рекомендується використовувати пробірки фірми "QSP"). - За 20-30 хвилин до готування ампліфікаційнної суміші витягали комплект реагентів для ампліфікації з морозильника, розморожували вміст (бажано помістити пробірку з Taq-полимеразою у охолоджувач). - Додавали по 48мкл ампліфікаційної суміші в усі пробірки, підготовлені для ампліфікації. - Додавали в усі пробірки по 1 краплі (близько 30мкл) мінерального масла. - Вносили 2мкл зразка з підготовленої проби, що аналізується у відповідну пробірку з реакційною сумішшю під шар масла для проведення ампліфікації. - Вносили в пробірку для негативного контрольного зразка - 2мкл деіонізованої води, а в пробірку для позитивного контрольного зразка 2мкл позитивні контрольної ДНК зі складу набору. - Пробірки закривали й стряхували на вихровому змішувачі (вортексі). - Пробірки центрифугували 10 секунд при 2000об/хв на мікроцентрифузі для осадження маленьких крапельок зі стінок пробірки. - Переносили пробірки в нагрітий до температури 94°С програмний термостат (ампліфікатор) і проводили ампліфікацію за наступною програмою: Таблиця 1 Програма ампліфікації з праймерами, специфічними до ділянки гена, що кодує 16S рібосомальну РНК (набір „PanMyc-Україна") № циклу 1 2 3 4 Температура 96°С 96°С 60°С 72°С 72°С 4°С Час 1хв 15сек 1хв 1хв 5хв 20год Кількість циклів 1 35 1 1 Таблиця 2 Програма ампліфікації з праймерами, специфічними до ділянки інсерційного елементу IS 6110 (набір „ТВС-У країна"), до ділянки гену EcoRI (набір „MBov-Україна"), до ділянки гену Mpt 40 (набір „MTub-Україна") № циклу 1 2 3 4 Температура 96°С 96°С 65°С 72°С 72°С 4°С Час 1хв 15сек 1хв 1хв 5хв 20год Кількість циклів 1 25 1 1 Таблиця 3 Програма ампліфікації з праймерами, специфічними до ділянки гена, що кодує 16S рібосомальну РНК (набір „MycAvC-Україна"), до ділянки інсерційного елементу IS 901 (набір „MAv2-Україна"), до ділянки інсерційного елементу IS 1245 (набір „MAv1-Україна"), до ділянки гена FR 300 (набір „Mint-Україна") № циклу 1 2 3 4 Температура 95°С 95°С 65°С 72°С 72°С 4°С Час 1хв 20сек 1хв 1хв 5хв 20год Кількість циклів 1 25 1 1 Таблиця 4 Програма ампліфікації з праймерами, специфічними до ділянки гена, що кодує 16S рібосомальну РНК (набір „МІсеl-Україна") № циклу 1 2 3 4 Температура 96°С 96°С 60°С 72°С 72°С 4°С Час 1хв 15сек 1хв 1хв 5хв 20год Кількість циклів 1 40 1 1 Таблиця 5 Програма ампліфікації з праймерами, специфічними до ділянки інсерційного елементу IS 902 (набір „MAv3-y країна") № циклу 1 2 3 4 Температура 95°С 95°С 65°С 72°С 72°С 4°С Час 1хв 20сек 1хв 1хв 5хв 20год Кількість циклів 1 30 1 1 Приклад 3 Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР: - Готували робочий розчин буфера (ТБЕ) для електрофорезу (х1). В мірну колбу ємністю 1000,0см3 вносили вміст одного пакета з буфером (або вміст флакона з концентрованим розчином буфера) для електрофорезу, доводили до мітки дистильованою водою та ретельно перемішували до повного розчинення осаду. - Приготовляли агарозний гель. В конічну колбу, ємністю 250см3 вносили вміст одного пакета з агарозою, додавали 100,0см3 робочого розчину буфера ТБЕ (´1) і ставили колбу на електричну плитку або в мікрохвильову піч. Доводили вміст колби до кипіння і після того, як агароза повністю розтопиться (через 10-20 хвилин), колбу з розтопленою агарозою знімали з плитки. Отриманий розчин агарози повинен бути прозорим і не вміщувати окремих нерозчинених часток. Розптоплену агарозу при кімнатній температурі охолоджували до температури 5060°С. - Підготовка електрофоретичної камери до заливання агарозного гелю. Збирали платформу для заливання гелю. Встановували гребінку (можна встановити 2 і навіть 3 гребінки залежно від кількості проб для аналізу) на платформу. Гребінки розміщували на відстані не ближче 3см одна від одної. - Охолоджену до температури 50°С агарозу заливали на платформу. Товщина шару агарози повинна бути 56мм. - Після застигання агарози (приблизно через 25-30хв.) обережно витягували гребінки, щоб не пошкодити при цьому карманів (лунок), платформу з агарозним гелем переносили до електрофоретичної камери. - Заливали необхідну кількість розчину буфера ТБЕ в електрофоретичну камеру так, щоб він покривав агарозний гель шаром товщиною 4-5мм. - Виставляли пробірки з продуктами ампліфікації у штатив послідовно. - В кожну пробірку вносили 10мкл «стоппера», пробірки встряхували на вортексі і центрифугували 5-7сек при 2000об/хв. - На пластиковий планшет з луночками в кожну луночку вносили по 1 краплі броміду етидія і до нього додавали 12-15мкл ПЛР-суміші з продуктом ампліфікації, ретельно піпетували кілька разів. - У відповідну лунку агарозного гелю, під шар буфера ТБЕ, внесили по 12,0-15,0мкл ПЛР-суміші з продуктом ампліфікації, так щоб вміст одного карману агарозного гелю не перетікав у інший. Можливо використовувати один наконечник, промиваючи його піпетуванням 3-4 рази буфером з камери після внесення кожної проби. - Встановлювали кришку на камеру, підключали електрофоретичну камеру до джерела живлення, дотримуючи полярності (лунки агарозного гелю повинні бути зі сторони катоду ("-")). Якщо немає порушення контактів, то при проходженні струму від електродів повинні підніматися пухирці. Електрофорез проводили у градієнті напруги 10В/см до того моменту, як барвник відходив від старту на 1,0-1,5см. - Через 20-30 хвилин електрофоретичну камеру відключали від джерела живлення і тільки після цього знімали кришку з електрофоретичної камери. Виймали платформу з агарозним гелем з електрофоретичної камери, давали рідині стекти з гелю і обережно промивали агарозний гель 200см3 бідистильованої води 2-3 рази. - Обережно вміщували агарозний гель на скло УФ-трансілюмінатора. Надягали захисну маску або встановлювали захисний екран, вмикали трансілюмінатор і аналізували отримані результати. - Фрагменти аналізованої ДНК виявлялись у вигляді світлих жовтогарячо-червоних смужок при проходженні УФ-випромінювання з довжиною хвилі 310нм. Запропонований спосіб є ефективним при діагностиці туберкульозу і мікобактеріозів тварин.