Спосіб оцінки клітинного імунітету зубощелепного сегмента

Запропонована корисна модель відноситься до галузей медицини і біології. Може бути використана для оцінки стану клітинного імунітету зубощелепного сегмента у нормі та у хворих з одонтогенними запальними процесами щелеп для уточнення діагнозу, обґрунтування та моніторингу терапії. Відомі такі способи оцінки клітинного імунітету з убощелепного сегмента: визначення Т- і В-лімфоцитів у відсотках і тисячах в 1мкл, оцінка субпопуляцій Т-лімфоцитів, збагачених клітинами з хелперною і супресорною активністю в ясеневій крові, в крові з ранової поверхні після видалення зуба [Комплекс экспресс- микрометодов оценки общего и местного иммунитета для практической стоматологии / Робустова Т.Г., Лебедев К.А., Понякина И.Д., Чукаева Н.А., Осокина М.И., Казимирский В.А. //Стоматология. -1990. -№2. -С.22-25]; визначення фенотипу внутрішньоепітеліальних лімфоцитів слизової оболонки порожнини рота за допомогою маркерів CD 3, CD 4, CD 8, CD 20, CD 16, CD 14 (CD - cluster of differentiation - кластер диференціювання) [Пат. №48519A (UA); МПК А61С17/00 / Кайдашев І.П., Ткаченко П.І., Куроедова В.Д., Карасюнок О.О., Шинкевич B.I., Ба штовенко О.А.: Спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки порожнини рота // заявка 2001096503; заявл.24.09.2001: Опубл. 15.08.2002, бюл. №8 -С.4.37]. Найближчим способом до запропонованого є спосіб визначення фенотипу лімфоцитів периферичної крові пародонту за допомогою маркерів CD 3, CD 4, CD 8, CD 16, CD 19, CD 56 [Особенности клеточного иммунитета при катаральном гингивите. Сообщение 2. / Максимовский Ю.М., Чиркова Т.Д., Ульянова М.А. // Стоматология. -2003. -№4. -С.29-31]. Для його здійснення проводять забір крові пародонту в пробірку мікропіпеткою по 200мкл. Клітинний імунітет досліджували методом проточної лазерної цитометрії на приладі FACScan фірми "Becton Dickinson" (США) із застосуванням моноклональних антитіл Becton Dickinson. Для підвищення інформативності результатів застосовували 2- і 3-колірні комбінації антитіл. Недоліком даного способу є недостатня інформативність щодо характеристики імунокомпетентних клітин, які беруть участь у одонтогенному запаленні при локалізації первинного запального вогнища в періапікальних тканинах щелеп зумовлена наступними обставинами. Забір крові з пародонту проводиться в ділянці ясен, які в першу чергу і постійно піддаються антигенному подразненню внаслідок дії зубних нашарувань, що є головним пусковим механізмом виникнення захворювань пародонту [Иванов B.C. Заболевания пародонта. -Москва: МИ А. -1998. -294с.]. CD 16 і CD 56 визначають NK-клітини, що призводить до дублювання. Дані обставини не дозволяють дати об'єктивну оцінку клітинного імунітету зубощелепного сегмента. В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб оцінки клітинного імунітету зубощелепного сегмента, який надає можливість оцінити склад субпопуляцій лімфоцитів, задіяних в імунних реакціях, які відбуваються безпосередньо в одонтогенному вогнищі запалення періапікальних тканин. Поставлену задачу вирішують шляхом створення корисної моделі способу оцінки клітинного імунітету зубощелепного сегмента, що включає забір ясеневої крові, приготування з цільної крові лейкоконцентрату, в якому визначають субпопуляції лімфоцитів методом проточної лазерної цитометрії, який згідно корисної моделі, відрізняється тим, що забір крові проводиться в ділянці прикріплених ясен, а дослідження субпопуляцій лімфоцитів проводиться за експресією маркерів CD 3, CD 4, CD 8, CD 16, CD 20 методом непрямої імунофлюоресценції, що усуває дублювання використаних маркерів та уточнює субпопуляційний склад В-клітин. [Методи клінічних та експериментальних досліджень в медицині / Беркало Л.В., Бобович О.В., Боброва Н.О. і др.; Під ред. Кайдашева І.П. -Полтава: Полімет, 2003. -320с.]. Спосіб оцінки здійснюють наступним шляхом: 1. Ма теріал для дослідження одержують шляхом забору ясеневої крові (500мкл) з допомогою мікропіпетки в ділянці прикріплених ясен після попередньої скарифікації слизової оболонки. Місце забору матеріалу визначають з урахуванням ступеня фізіологічної чи патологічної резорбції коренів тимчасових або постійних зубів, а також з урахуванням проекції вогнища резорбціїї в періапікальних тканинах щелеп на поверхню ясен. У випадку видалення зубів забір матеріалу проводять з ранової поверхні. 2. В охолоджену пробірку з гепарином (з розрахунку 25ОД на 1мл крові) вливають цільну кров. 3. Після лізису еритроцитів готують лейкоконцентрат. 4. Проводять інкубацію клітин з моноклональними антитілами (МКАТ) до CD 3, CD 4, CD 8, CD 16, CD 20. Для їх візуалізації проводять наступну інкубацію з FIТС-кон'югованими козячими антитілами до мишиних імуноглобулінів. 5. Аналіз відсоткового вмісту субпопуляцій лімфоцитів проводять з допомогою проточного цитофлюориметра "COULTER EPICS XL-MC". Приклад використання 1. Проведено дослідження ясеневої крові з ранової поверхні після видалення тимчасових молярів з приводу їх фізіологічної зміни за допомогою непрямого імунофлуоресцентного методу. Як первинні моноклональні антитіла використовували CD 3, CD 4, CD 8, CD 16, CD 20 мишачі антитіла. Для виявлення комплексу АГ+АТ використовували FITC-мічені антитіла. Приклад використання 2. Проведено дослідження ясеневої крові з ранової поверхні після видалення тимчасових молярів з приводу хронічного періодонтиту в стадії ремісії. Отримані результати досліджень, проведених запропонованим методом, дозволяють зробити висновок про високу інформативність аналізу клітинного імунітету з убощелепного сегмента, який дозволяє оцінити роль імунних механізмів у патогенезі одонтогенних запальних процесів щелепно-лицевої ділянки.