Спосіб оцінки клітинного імунітету

Спосіб оцінки клітинного імунітету, що включає визначення міграційної активності лейкоцитів із капілярів у присутності антигену, який відрізняється тим, що камери монтують на предметних скельцях, клітини зони міграції фіксують і встановлюють рівень специфічної сенсибілізації низький - при відсутності пригнічення рухливості нейтрофілів і наявності в зоні міграції поодиноких лімфоцитів, наявності лімфобластів з крупними, слабо покрашеними ядрами, помірний - при посиленні міграційної активності лімфобластів і лімфоцитів, наявності груп лімфобластів, їх асоціації з нейтрофілами або еозинофілами, наявності асоціацій клітин пам'яті з лімфобластами і гранулами еозинофілів, повній відсутності нейтрофілів, високий - при переважанні в зоні міграції лімфобластів, наявності асоціацій лімфобластів з активованими клітинами пам'яті або гранулами еозинофілів, білкового ексудату, агрегатів тромбоцитів, скупчень дегенерованих клітин пам'яті Винахід відноситься до медицини, розділу клітинної імунологи та імунопатології вакцинального і інфекційного процесів і може бути використаний для оцінки клітинно-обумовленого імунітету та встановлення імунологічного діагнозу в КЛІНІЧНИХ лабораторіях і науково-дослідних установах У даний час для визначення стану імунної системи організму використовуються різноманітні методи /1-9/Зокрема, для оцінки in vitro клітиннообумовленого імунітету на чужорідні антигени застосовують реакції бласт трансформації лімфоцитів /РБТЛ/, гальмування міграції лейкоцитів /РТМЛ/, імунолейкоцитолізу/РІЛ/ Вказані методи дозволяють виявити рівень специфічної сенсибілізації до конкретних антигенів при різних інфекційних захворюваннях, імунодефіцитах, вакцинальних, алергічних та аутоімунних процесах Необхідно, однак, підкреслити, що показники цих реакцій характеризують різні параметри функціонування імунної системи організму Так, РБТЛ відображає проліферативну активність Т - 1 В-лімфоцитів, РТМЛ - продукцію Т-ефекторами пперчутливості сповільненого типу /ГСД/ фактора гальмування міграції лейкоцитів, РІЛ - виділення пошкоджуючих клітини біологічно активних речовин У зв'язку з цим для вивчення рівня специфічного клітинного імунітету до антигенів проходиться використовувати декілька реакцій Слід врахувати також, що результати РІЛ недостатньо інформативні для встановлення типу пперчутливості та спектру втягнених в імунну ВІДПОВІДЬ клітин ПІ, методика постановки РБТЛ технічно досить складна, довготривала /від 3 до 5 днів/, а у випадку високої специфічної сенсибілізації організму із-за пошкоджуючої дії на лімфоцити специфічного антигену її показники не відображають фактичного рівня клітинного імунітету /10/ Щодо РТМЛ, то у частини хворих або вакцинованих гальмування міграційної активності нейтрофілів та моноцитів-макрофапв не визначається /1,10/ із-за одночасної активації рухливості лімфоцитів / 1 / або еозинофілів /11/ Внаслідок цього метод недостатньо точний та інформативний На думку Петрова Р В з співавт/12/ розроблення Інформативних методів оцінки стану імунної системи організму in vitro продовжує залишатися актуальною задачею, так як рішення багатьох проблем сучасної медицини залежить від успіхів у вивченні взаємодії різних типів клітин імунної системи та запалення /13-16/ Тому важливо розробити спосіб, який би дозволив одночасно досліджувати реакцію імунокомпетентних клітин та клітин запалення і оцінювати сумарну реакцію організму на конкретним антиген Параметри функціонування клітин системи імунітету та запалення зареєст О ю о> ю 59501 ровані за допомогою такого способу, дозволили б оцінити рівень клітинно-обумовленого імунітету in vivo, ступінь втягнення в імунну ВІДПОВІДЬ клітин запалення та прогнозувати розвиток імунного та імунопатолопчного процесу Відомий спосіб виявлення клітиннообумовленого імунітету у людини за допомогою реакції гальмування міграції лейкоцитів із капілярів /1/ РТМЛ виконується слідуючим чином Із гепаринизованої крові обслідуваного виділяють лейкоцити і поміщають їх в скляні капіляри, котрі запаюють з однієї сторони і центрифугують при 900 об/хв 10 хв , відрізають трохи нижче лінії розділу клітини-рідина і кладуть в культуральні камери, змонтовані на широких пластинах Запаяним кінцем капіляри закріплюють в СИЛІКОНОВІЙ СМОЛІ на дні камери Потім в камери вносять середовище 199 з 10% сироватки, антиген і закривають покривними стеклами В контрольні культури антиген не вносять Після інкубації при 37 С протягом 24 годин за допомогою проектуючого устрою замальовують зони міграції на папері, вирізають їх, зважують їх і вираховують міграційний індекс /М1/, який являє собою співвідношення площі міграції в контролі Значення М1 нижче 1,0 вказує на шпбіцію під впливом антигену, значення М1 вище 1,0 вказує на індуковану антигеном стимуляцію міграції лейкоцитів Недоліки відомого способу 1/ Неможливість встановлення фактичної продукції клітинами гальмуючого міграцію фактора у випадку його одночасного виділення з стимулюючими факторами 2/ Неможливість визначення типу клітин, рухливість котрих гальмується чи стимулюється З/ Неможливість встановлення участі в імунній ВІДПОВІДІ еозинофілів і тромбоцитів 4/ Неможливість виявлення проліферативної активності лімфоцитів, клітин пам'яті, виду пошкоджених клітин, клітинних взаємодій при реалізації імунної ВІДПОВІДІ на антиген В основу винаходу поставлена задача підвищити точність та інформативність способу, скоротити число проведених реакцій, щоб забезпечити сумарну оцінку реакцій клітин імунної системи та запалення і встановити рівень специфічної сенсибілізації організму до данного антигену Поставлена мета досягається тим, що камери монтують на предметних стеклах, клітини зони міграції через 18-20 годин культивування в камерах при 37°С фіксують метиловим спиртом, красять за Романовським-Гімзою, досліджують їх морфологію, склад і рухливість За числом бластних форм лімфоцитів визначають рівень бласттрансформацм, при відсутності в зоні міграції нейтрофілів судять про активність продукції гальмуючого міграцію фактора, присутність еозинофілів вказує на виділення активуючого їх фактора, виявлення численних тромбоцитів, їх агрегація та асоціація з клітинами свідчить про виділення фактору, що активує міграцію тромбоцитів і викликає агрегацію останніх Визначають також вид пошкоджених клітин та клітин пам'яті На основі отриманих даних визначають спектр, інтенсивність та глибину втягнення в імунну ВІДПОВІДЬ КЛІТИН системи імунітету та запалення, їх взаємозв'язок, ступінь експресії специфічної сенсибілізації in vivo, що дозволяє встановлювати імунологічний діагноз Оскільки морфологічні критерії ідентифікації форменних елементів периферійної крові людини загальновідомі, об'єктивні і широко використовуються в практичних та наукових закладах, аналіз клітин зони міграції не становить труднощів /фіг 1 /Клітини пам'яті визначають за наявністю компактного округлої форми ядра і вираженої зони цитоплазми /фіг 2 / Спосіб здійснюється так Лейкоцити виділяють із 12 мл гепаринизованої крові /5ОД/мл/, яку після додавання розчину желатину до концентрації 0,4% і перемішування шкубують 20 хвилин при 37°С Збагачену лейкоцитами плазму центрифугують 10 хвилин при 1000 об/хв Лейкоцити промивають фосфатним буферним розчином /ФБР/ рН7,2 Еритроцити лізують холодним 0,83% розчином хлориду амонію протягом 10 хвилин при 4°С Потім клітини ДВІЧІ промивають ФБР і розводять цим же розчином до концентрації 2-3 х 108 кл/мл РІВНІ КІЛЬКОСТІ суспензії лейкоцитів /3-5x106кл/ розміщують в скляних капілярах об'ємом 20мкл з внутрішнім діаметром 0,86-1 мм Капіляри запаюють в полум'ї горілки, центрифугують 4 хвилини при 1000об/хв , відрізають по лінії концентрованих клітин і закріплюють запаяним кінцем в краплі стерильного вазеліну на дні культуральних камер, змонтованих на предметних стеклах за допомогою зубопротезного воску В камери вносять відтитровані дози антигену і середовище 199 з 10% телячої ембріональної сироватки В контрольні зразки антиген не додають Наповнені до країв камери ретельно закривають покривними стеклами і шкубують 18-28 годин при 37°С Потім тонко відтягнутою пастеровською піпеткою обережно відбирають культуральну рідину, клітини підсушують на повітрі, фіксують метиловим спиртом 3-5 хвилин, красять за Романовським-Гімзою Після видалення камер клітини досліджують під мікроскопом з використанням об'єктивів хЮ, х40, х90 Безпосередньо поблизу щільної зони клітин встановлюють наявність або відсутність зони гальмування, величину зони міграції, індифікують в ній склад мігруючих клітин, виявляють їх взаємодію та морфологічні зміни На основі отриманих даних визначають ступінь сенсибілізації організму до даного антигену, встановлюють імунологічний діагноз і прогноз розвитку імунного та імунопатолопчного процесу Оптимальні від титровані дози антигенів для виявлення специфічного клітинно-обумовленого імунітету складають а/1-2 Id/мл дифтерійного анатоксину, б/ 0,2мг/мл рекомбінантного HbsAg, в/ 0,1 мл герпетичної вакцини, г/0,1 мл токсоплазменного алергену, д/0,05 мл стафілококового алергену КІЛЬКІСНИМ та якісний аналіз зон міграції в присутності специфічного антигену проведено у 47 донорів щеплених АДС-анатоксином, у 12 донорів щеплених генно-інженерною вакциною проти гепатиту В, 31 хворого хронічними інфекціями /герпес, цитомегаловірусна інфекція, токсоплазмоз, хламідм, сепсис/ Проведені дослідження показали, що в імунній ВІДПОВІДІ окрім лімфоцитів, нейтрофілів та макрофагів активну участь приймають еозинофіли 59501 і тромбоцити Виявлено 3 типи клітинних реакцій, що характеризують різний рівень специфічної сенсибілізації і дозволяють прогнозувати розвиток імунної ВІДПОВІДІ або імунопатолопчного процесу Низький рівень специфічної сенсибілізації характеризує відсутність пригнічення рухливості нейтрофілів і наявністю в зоні міграції одиничних лімфоцитів і/або лімфобластів з крупними слабо покрашеними ядрами Вказана морфологічна картина спостерігається у здорових не щеплених донорів При помірній сенсибілізації спостерігається посилення міграційної активності лімфобластів і лімфоцитів, гніздова бластна реакція лімфоцитів/по 5 і більш лімфобластів/, їх асоціація з нейтрофілами /фіг 3 / або еозинофілами, зустрічаються поодинокі клітини пам'яті Вказана реакція спостерігається в період розвитку первинної імунної ВІДПОВІДІ і у хворих хронічними інфекціями в період помірної активації інфекційного процесу Високий рівень специфічної сенсибілізації встановлюють за розміром зони гальмування, повною відсутністю в зоні міграції нейтрофілів, різким посиленням рухливості та активації клітин пам'яті, наявністю асоціацій клітин пам'яті з лімфобластами і гранулами еозинофілів /Фіг 4 , 5 / Описаний тип клітинних реакцій виявляється в перші 2-3 МІСЯЦІ ПІСЛЯ повторної імунізації в період розвитку вторинної імунної ВІДПОВІДІ, а також у хворих з частими рецидивами герпетичної інфекції в період загострення, при активному перебігу хламідійної татоксоплазменної інфекцій Дуже висока сенсибілізація до специфічного антигену характеризується формуванням зони гальмування, до складу якої входять бластні форми лімфоцитів та обширні поля білкового ексудату, асоціації гранул еозинофілів з лімфоцитами В зоні міграції знаходять клітини пам'яті з ознаками дегенеративних змін /пікноз ядра, зменшення розмірів клітин/ Міграційна активність тромбоцитів посилена, відмічається їх агрегація та асоціація з іншими типами клітин /фіг 6/ В контрольних зразках спостерігається спонтанна бластна гнізд на реакція лімфоцитів, активація еозинофілів і тромбоцитів, виявляються окремі клітини пам'яті та слабо мігруючи нейтрофіли /Фіг 7/ Вказаний тип реакцій виявляють у багаторазово щеплених протягом перших 2-3 МІСЯЦІВ після імунізації, а також при важкому перебігу герпетичної, хламідійної та інших інфекцій Таким чином, запропонований спосіб оцінки клітинного імунітету має слідуючі переваги перед прототипом 1/ підвищення точності за рахунок встановлення типу клітин та виділених ними медіаторів,що приймають участь в розвитку інфекційного процесу або реалізації імунної ВІДПОВІДІ на конкретний антиген in vivo, 2/ підвищення інформативності та скорочення числа проведених реакцій за рахунок точного виявлення не тільки продукції фактора, гальмуючого міграцію нейтрофілів, але й антигенної та мітогенноі трансформації лімфоцитів, активації еозинофілів, активації та агрегації тромбоцитів, асоціації компонентів імунної системи та запалення, що приймають участь в імунної ВІДПОВІДІ, З/ можливість in vitro репструвати процеси, що реалізуються на клітинному рівні in vivo, оцінювати сумарну реакцію на антиген клітин імунної системи та запалення Запропонований спосіб дозволяє діагностувати стан імунної системи організму, глибину втягнення в імунну ВІДПОВІДЬ клітин запалення та імунокомпетентних і може бути використаний для визначення імунологічної ефективності та нешкідливості вакцин, оптимізацм схем вакцинопрофілактики, виявлення пошкодженої ланки імунітету при захворюваннях з вираженим імунопатогенезом, прогнозу розвитку імунного або імунопатолопчного процесу, підтвердження КЛІНІЧНОГО діагнозу, індивідуалізації імунокорекцм ВІДОМОСТІ, ЩО підтверджують можливість здійснення винаходу Приклад 1 Лейкоцити виділяють із 12мл гепаринизованої крові /5ЛД/мл/ щепленого АДС-препаратом донора, котру після додавання розчину желатину до концентрації 0,4% та перемішування шкубують 20 хвилин при 37°С Збагачену лейкоцитами плазму центрифугують 10 хвилин при 1000об/хв, клітини промивають фосфатним буферним розчином /ФВР/ рН 7,2 Еритроцити лізують холодним 0,83% розчином хлориду амонію протягом 10 хвилин при 4°С Лейкоцити ДВІЧІ промивають ФБР і розводять цим розчином до концентрації 2-3x108кл/мл РІВНІ КІЛЬКОСТІ суспензії лейкоцитів /3-5x106кл/ поміщують з скляні капіляри об'ємом 20мкл з внутрішним діаметром 0,8-1,0мм Капіляри запаюють в полум'ї горілки, центрифугують 4 хвилини при 1000об/хв , відрізають по лінії концентрованих клітин і закріплюють запаяним кінцем в краплі стерильного вазеліну на дні культуральних камер, змонтованих на предметних стеклах за допомогою зубопротезного воску В камери вносять дифтерійний анатоксин в дозі 271Умл та середовище 199 з 10% телячої ембріональної сироватки В контрольні зразки антиген не додають Заповнені до країв камери ретельно закривають покривними стеклами та шкубують 18-20 годин при 37°С Потім тонко відтягнутою пастеровською піпеткою обережно відбирають культуральну рідину, клітини підсушують на повітрі, фіксують метиловим спиртом 3-5 хвилин, красить за Романовським-Гімзою Після випалення камер клітини досліджують під мікроскопом з використанням об'єктивів хЮ, х40, х90 Безпосередньо поблизу щільної зони клітин встановлюють наявність чи відсутність зони гальмування, величину зони міграції, ідентифікують склад мігруючих клітин, виявляють їх взаємодії та морфологічні зміни На основі отриманих даних визначають ступінь сенсибілізації організму до дифтерійного анатоксину і збереження в організмі введенного дифтерійного анатоксину При обстеженні донора М ,27 років, через 1 місяць після повторної з інтервалом 1 місяць імунізації ДИфтеріЙНО-ПраВЦеВОІ ВаКЦИНИ Lovax /ВМІСТ дифтерійного анатоксину в 1 щеплюваній дозі 11,77lu/ в контролі виявлена спонтанна трансформація лімфоцитів в бласти, посилення міграційної активності клітин пам'яті, еозинофілів і тромбоцитів, пригнічення міграції нейтрофілів Це вказує на 59501 8 ду виробництва бактерійних препаратів продовження стимуляції імунної ВІДПОВІДІ введенВ контролі виявлені численні асоціації лімфоням анатоксину і формуванням високого рівня клібластів з нейтрофілами, клітини пам'яті та їх асотинного імунітету з втягненням імунокомпетентних ціації з тромбоцитами В присутності антигену віклітин і клітин запалення, накоплениям клітин парусу герпесу міграція нейтрофілів повністю м'яті Таке висновування підтверджується якісним пригнічена, різко посилена рухливість клітин пата КІЛЬКІСНИМ складом клітин зони міграції в присум'яті, а численні асоціації клітин пам'яті одна ж тності дифтерійного анатоксину У донора виявлеодною і лімфобластами, поля білкового ексудату, но різко виражена бласттрансформація лімфоцичастина клітин пам'яті має пікнотичне ядро, клітитів, повна відсутність нейтрофілів, асоціація ни пам'яті і лімфобласти формують симпласти гранул еозинофілів з бластами, асоціація клітин /фіг 7 / Імунологічний діагноз високий рівень спепам'яті з бластами, їх активація, агрегація тромбоцифічного клітинного імунітету до антигенів вірусу цитів і дегенеративні зміни окремих клітин пам'яті герпесу, виражена пперчутливість негайного і спо/фіг 2 / вільненого типу до вказаних антигенів, антигенеПриклад 2 мія, активний перебіг герпетичної інфекції РекоЛейкоцити хворої Б ,26 років, з тяжким пемендується лікування протигерпетичними ребігом генітального герпесу виділяли і хіміопрепаратами в поєднанні з донорським Iq з досліджували як описано в прикладі 1 Оптимальвисоким вмістом специфічних антитіл або лафена доза антигену вірусу герпесу складала 0,1 мл роном герпатичної вакцини виробництва Одеського заво 59501 10 КД,-'.'Ж»«ОГС JffJE".'ietJ 11 Комп'ютерна верстка М Мацело 59501 12 Підписано до друку 06 10 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна