Терапевтичне застосування варіантів хемокінів

1. Застосування поліпептиду, що містить послідовність SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 4, як лікарського засобу для лікування автоімунних, запальних або інфекційних захворювань. 2. Застосування за п.1, яке відрізняється тим, що згаданий поліпептид містить константну ділянку важкого ланцюга людського імуноглобуліну. 3. Застосування поліпептиду, що містить послідовність SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 4, для виготовлення лікарського засобу для лікування автоімунних, запальних або інфекційних захворювань. 4. Застосування за п.3, яке відрізняється тим, що згаданий поліпептид містить константну ділянку важкого ланцюга людського імуноглобуліну. 2 (19) 1 3 91820 4 10. Фармацевтична композиція, яка містить фармацевтично прийнятний носій та поліпептид, вибраний з групи, яку складають: a) CCL2-P8A (послідовність SEQ ID NO: 2); b) CCL2*-P8A (послідовність SEQ ID NO: 4); c) активний мутант (а) або (b); або d) поліпептид, що містить (а), (b) або (с) і амінокислотну послідовність, що належить іншій білковій послідовності, відмінній від згаданого хемокіну. 11. Фармацевтична композиція за п.10, яка відрізняється тим, що згаданий поліпептид має форму активної фракції, попередників, солі, похідної, комплексу або кон'югату. 12. Застосування поліпептиду, вибраного з групи: a) CCL2-P8A (послідовність SEQ ID NO: 2); b) CCL2*-P8A (послідовність SEQ ID NO: 4); c) активний мутант (a) або (b); або d) поліпептид, що містить (а), (b) або (с) і амінокислотну послідовність, що належить іншій білковій послідовності, відмінній від згаданого хемокіну; для виготовлення лікарського засобу для лікування автоімунних, запальних або інфекційних захворювань. Цей винахід стосується нових способів терапевтичного застосування різновидів хемокінів і, зокрема, людського хемокіну CCL2. Хемокіни представляють собою невеликі секретовані передзапальні білки, які опосередковують спрямовану міграцію лейкоцитів із крові до місця пошкодження. У залежності від положення консервативних цистеїнів, що характеризують це сімейство білків, сімейство хемокінів, у структурному відношенні, може бути підрозділеним на С, С-С, СХ-С і С-Х3-С хемокіни, які зв'язуються з рядом мембранних рецепторів (Баджоліні М. (Baggiolini M.) та інші, 1997; Фернандес Е.Дж. (Fernandez E.J.) і Лоліс Е. (Lolis E.), 2002). Ці мембранні рецептори, усі з яких є сполученими із семиспіральним G білком, надають можливість хемокінам чинити свою біологічну активність на клітини-мішені, які можуть представляти специфічні комбінації рецепторів, у залежності від свого статусу та/або типу. Фізіологічні ефекти хемокінів є наслідком складної та інтегрованої системи одночасних взаємодій: згадані рецептори часто мають лігандну специфічність, що взаємно перекривається, завдяки чому один рецептор може зв'язувати різні хемокіни, так само як і один хемокін може зв'язуватись із різними рецепторами. Хемокіни, як правило, продукуються на ділянці пошкодження і викликають міграцію та активацію лейкоцитів, тобто відіграють фундаментальну роль у запальних, імунних, гомеостатичних, гемопоетичних та ангіогенних процесах. Незважаючи навіть на існування потенційних недоліків у застосуванні хемокінів у ролі терапевтичних агентів (зокрема, схильність до агрегування та безладного зв'язування), ці молекули вважаються добрими мішенями-"кандидатами" для терапевтичного втручання у захворювання, що пов'язуються з такими процесами, шляхом інгібування специфічних хемокінів та їхніх рецепторів такою мірою, щоб запобігати надмірному рекрутуванню та активації лейкоцитів (Баджоліні М. (Baggiolini Μ.), 2001; Летшер П.(Loetscher Р.) і Кларк-Льюїс І. (Clark-Lewis I.), 2001; Годессарт Н. (Godessart Ν.) і Кункель С.Л. (Kunkel S.L.), 2001). Результати досліджень взаємозв'язку між структурою і активність вказують на те, що хемокіни мають дві головні ділянки взаємодії зі своїми рецепторами, а саме гнучку амінокінцеву ділянку і конформаційно жорстку петлю, яка знаходиться за другим цистеїном. Вважають, що хемокіни "стикуються" з рецепторами за допомогою петльової ділянки, і цей контакт, як гадають, полегшує зв'язування амінокінцевої ділянки, наслідком чого є активація рецептора. Важливість амінокінцевої ділянки була також продемонстрована випробуванням природних і синтетичних хемокінів, згадана ділянка у яких була модифікована або скорочена. Ця обробка, після протеолітичного розщеплення, мутагенезу або хімічної модифікації амінокислот, може активізувати ці молекули або позбавити їх активності, з одержанням сполук з агоністичною та/або антагоністичною активністю. Таким чином, хемокіни зі специфічними модифікаціями амінокінцевої ділянки мають терапевтичний потенціал у відношенні запальних та автоімунних захворювань (Шварц (Schwarz) і Уеллс (Wells), 1999). CCL2, відомий також як хемоатрактантний білок моноцитів 1 (МСР-1) або фактор хемотаксису і активації моноцитів (MCAF), був ідентифікований як такий, що відіграє центральну роль у запаленні, оскільки має здатність до стимулювання рекрутингу моноцитів і лімфоцитів у відповідь на сигнали про пошкодження та інфекцію у разі різних запальних захворювань, різних типів пухлин, серцевого алотрансплантата, СНІДу та туберкульозу (Йошімура Т. (Yoshimura Т.) та інші, 1989; Гу Л. (Gu L.) та інші, 1999). Фізіологічна активність, пов'язана з CCL2, екстенсивно досліджувалась на трансгенних тваринах, що надало можливість продемонструвати, що цей хемокін контролює не лише рекрутинг моноцитів у моделях запалення, але також і експресію цитокінів, пов'язану з реакціями Тклітин-хелперів та початковою стадією атеросклерозу (Гу Л. (Gu L.) та інші, 2000; Гослінг Дж. (Gosling J.) та інші, 1999; Лу Б. (Lu В.) та інші, 1998). Щодо структури, CCL2 складається з Nкінцевої петлі та бета-складки, яку на С-кінці накриває альфа-спіраль, і утворює гомодимери, незважаючи на те, що за певних експериментальних умов його виявляли у формі мономеру (Хандел Т. (Handel Т.) та інші, 1996; Кім К.С. (Kim K.S.) та інші, 1996; Любковскі Дж. (Lubkowski J.) та інші, 1997). Як і щодо багатьох інших хемокінів, літературні джерела надають багато прикладів досліджень 5 залежності "структура-активність", при проведенні яких одержували мутанти CCL2 шляхом експресії різновидів зі скороченою N-кінцевою ділянкою або з моносайтовою заміною для визначення ролі видалених або замінених амінокислот у пов'язаній з CCL2 зв'язувальній активності та інших властивостях (Гонг Дж. (Gong J.) і Кларк-Льюїс І (Clark-Lewis I.), 1995; Жанг І. (Zhang Υ.) та інші, 1996; Стейц С.А. (Steitz S.A.) та інші, 1998; Гу Л. (GuL.) та інші, 1999; Хеммеріх С (Hemmerich S.) та інші, 1999; Сіт Б.Т. (Seet B.T.) та інші, 2001). Зокрема, досліджували роль димеризації у зв'язуванні та активації рецепторів CCL2. Було показано, що різні мутації на кінцевій ділянці, які ускладнюють димеризацію, можуть змінити деякі активності CCL2, зокрема, рецепторзв'язувальну спорідненість, стимуляцію хемотаксису, інгібування аденілатциклази і стимуляцію припливу кальцію (Паавола К. (Paavola С.) та інші, 1998). У той час як один із мутантів, описаних Паавола, який у цьому описі було названо Р8А*, не димеризується, однак зберігає вихідну активність і ефективність, було показано, що інший облігатний мономерний мутант, описаний Паавола, який у цьому описі було названо Y13A*, має у сто разів слабкішу зв'язувальну спорідненість in vitro, є набагато слабішим інгібітором аденілатциклази і стимулятором припливу кальцію in vitro, і є неспроможним стимулювати хемотаксис у культурі клітин. Подібно Y13A*, мутант [1+9-76] МСР-1 (різновид CCL2, якому бракує залишків 2-8), антагонізує активності CCL2 in vitro. Зв'язувальні властивості мутанта CCL2, що містить заміну Р8А, досліджувались також на експериментальній моделі, основу якої становить розпізнавання вірусного хемокінзв'язувального білка М3, з демонстрацією ефективного зв'язування цього вірусного білка зі згаданим мутантом CCL2 (Александер Дж.М. (Alexander J.M.) та інші, 2002). Більше того, було показано, що мономерні різновиди хемокінів, наприклад, CCL2-P8A, є позбавленими активності in vivo, хоча повною мірою зберігають активність і не відрізняються від димерної форми in vitro (Праудфут A. (Proudfoot Α.) та інші, 2003). Приклади мутантів CCL2, які містять залишки, що не впливають на димеризаційний профіль кінцевого білка, уже були описані у літературі як такі, що ведуть до одержання молекул з антагоністичними властивостями відносно CCL2 (патент США №5739103, WO 03/84993). Відомий рівень техніки, однак, не вказує на те, що мутант конкретного хемокіну і, зокрема, мутант CCL2, що є облігатним мономером унаслідок моносайтової заміни (із залученням, наприклад, проліну), може діяти, як антагоніст хемокіну. Несподівано встановили, що різновиди гомодимеротвірних хемокінів, наприклад, CCL2, що мають моноамінокислотну заміну на ділянці димеризації, яка змінює конфігурацію водневих зв'язків, наслідком чого є одержання облігатного мономеру, який зв'язується з рецептором і має агоністичні властивості in vitro, можуть антагонізувати природні хемокіни і і мають протизапальну активність in vivo. 91820 6 Різновиди, опис яких наводиться, є придатними як лікарський засіб. Поліпептиди, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ №2, та поліпептиди, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ №2 з додатковою мутацією ізолейцину у положенні 64 ПОСЛІДОВНОСТІ №2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №4), є придатними як лікарські засоби. Різновиди, опис яких наводиться, є придатними як лікарські засоби для лікування автоімунних, запальних або інфекційних захворювань. Поліпептиди, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ №2, та поліпептиди, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ №2 з додатковою мутацією ізолейцину у положенні 64 ПОСЛІДОВНОСТІ №2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №4), є придатними як лікарські засоби для лікування автоімунних, запальних або інфекційних захворювань. За одним із прикладів, поліпептиди, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ №2, та поліпептиди, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ №2 з додатковою мутацією ізолейцину у положенні 64 ПОСЛІДОВНОСТІ №2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №4), є придатними як лікарські засоби для лікування розсіяного склерозу. Різновиди, опис яких наводиться, є додатково придатними у способах лікування автоімунних, запальних та інфекційних захворювань. Такі способи включають введення ефективної кількості мономерного різновиду відповідно до цього винаходу, де згаданий різновид є наслідком щонайменше моноамінокислотної заміни, що змінює конфігурацію водневих зв'язків на ділянці димеризації згаданого хемокіну. Прикладами таких мономерних різновидів, які можуть застосовуватись у таких способах, є: а) поліпептид, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №2; b) поліпептид, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4; с) активний мутант а) або b); d) поліпептид, що містить а), b) або с) і амінокислотну послідовність, що належить іншому білку, окрім згаданого хемокіну; а також відповідні молекули у формі їх активних фракцій, попередників, солей, похідних, комплексів або кон'югатів. Цей винахід додатково включає фармацевтичні композиції, до складу яких входить поліпептид, який містить облігатні мономерні антагоністичні різновиди хемокіну відповідно до цього винаходу. Цей винахід додатково охоплює гібридні білки, що містять облігатний мономерний антагоністичний різновид хемокіну, опис якого наведено, злитий з нехемокінною білковою послідовністю, наприклад, амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ №2, злитою з константною ділянкою важкого ланцюга імуноглобуліну людини (ПОСЛІДОВНІСТЬ №5). Цей винахід додатково охоплює способи одержання таких гібридних білків. Цей винахід додатково охоплює способи обслідування з метою виявлення облігатних мономерних антагоністичних різновидів хемокінів, опис яких наведено, які включають: a) здійснення моносайтових мутацій CCL2, які блокують здатність останнього до димеризації; b) ідентифікування згаданих різновидів, які зв'язуються з рецептором і демонструють агоністичні властивості in vitro: c) ідентифікування згаданих різновидів із групи, ідентифікованої у вищенаведеному пункті (b), 7 що додатково характеризуються як такі, що інгібують рекрутинг клітин перітонеального ексудату. Інші особливості та переваги цього винаходу будуть зрозумілими з наведеного нижче докладного опису. Фіг.1: Амінокислотні послідовності людського зрілого CCL2 (залишки 24-99, номер депонування у банку даних SWISSPROT P13500; ПОСЛІДОВНІСТЬ №1), зрілого CCL2-P8A (ПОСЛІДОВНІСТЬ №2), зрілого CCL2* (ПОСЛІДОВНІСТЬ №3), зрілого CCL2*-P8A (ПОСЛІДОВНІСТЬ №4). Мутація ізолейцину у положенні 64 (М64І) обведена рамкою у CCL2* і CCL2*-P8A; відповідна мутація Р8А виділена жирним шрифтом і підкреслена. Фіг.2: Графік порівняння активності рекрутування клітин рекомбінантним людським CCL2 і CCL2-P8A з вихідним рівнем у аналізі рекрутування клітин перітонеального ексудату. Фіг.3: Графік, який показує дозозалежну інгібувальну активність CCL2-P8A у аналізах рекрутування клітин перітонеального ексудату із застосуванням двох різних індукторів: CCL2 (А) або тіогліколяту (В); результати порівнюють із вихідним рівнем, негативним контролем (лише носій, фізіологічний розчин) і позитивним контролем, дексаметазоном (Dex; лише у В). Фіг.4: Графік, який показує інгібувальну активність CCL2-P8A у аналізі індукованого овальбуміном запалення легень; результат порівнюють із вихідним рівнем і негативним контролем (фізіологічний розчин). Фіг.5: Графік, який показує ефективність CCL2P8A щодо зниження клінічної оцінки у балах у тварин, на яких моделюється розсіяний склероз, який називають ЕАЕ (експериментальний автоімунний енцефаломієліт), у разі, коли тварини мають слабкий перебіг захворювання з низькою клінічною оцінкою у балах (не більше за 2; А) або тяжкий перебіг із високою клінічною оцінкою у балах (щонайменше 3; В); наведені дані порівнюють із даними, які одержали у разі застосування лише носія (негативний контроль) або позитивного контролю для моделі ЕАЕ (мишачий бета-інтерферон); кількість зірок під кожним графіком вказує рівень статистичної значущості ефекту, що спостерігався, у разі порівняння з негативним контролем у кожній часовій точці (* означає р