Спосіб визначення впливу речовини на біополімери

Реферат: Винахід належить до способу визначення впливу речовини на біополімери, який передбачає формування розчину біополімеру з речовиною, отримання з розчину плівки з текстурами, визначення коефіцієнта впливу, що враховує площу текстур на плівці (Кт). Додатково в способі визначають коефіцієнти, що враховують: фрактальну розмірність текстур (D) logN(  ) ,    log D  lim де N - кількість квадратів, достатніх для покриття текстури;  - лінійний розмір квадрата; коефіцієнт, що враховує площу масштабно інваріантних фрактальних текстур (KMІФТ_S), KMІФТ_S=SМІФТ/S, де SМІФТ - площа масштабно інваріантних фрактальних текстур на плівці; S - площа всієї плівки; та коефіцієнт, що враховує середню питому довжину МІФТ на плівці (КМІФТ_L) UA 111769 C2 (12) UA 111769 C2 n L   i    _ L   i S n i n , де L   i - довжина МІФТ і-го зразка на плівці; n - кількість зразків на поверхні плівки, які були проаналізовані; S(n)i - площа і-го зразка; а вплив досліджуваної речовини (Ρ) визначають як добуток цих коефіцієнтів: Ρ=Κт•D•KMІФТ_S•KMІФТ_L, причому високі значення Р відповідають речовинам, у присутності яких біополімер знаходиться у нативному стані, а низькі значення Р відповідають іонам, які збільшують частоту помилок реплікації. UA 111769 C2 5 10 15 20 25 30 35 Винахід належить до аналітичної біотехнології, медичної техніки і фармацевтичної промисловості. Спосіб може бути використаний в молекулярній фармакології та медичній біохімії для проведення відбору хімічних сполук (лікарських речовин, біологічно активних речовин (БАР) та ін.) за ступенем впливу на біополімери, зокрема на нуклеїнову кислоту (НК) і білок. Відомий спосіб визначення впливу речовин на біополімери (на НК), згідно з яким готується поліфункціональний рідкокристалічний (РК) композит, який є продуктом тривимірної радикальної полімеризації біс-макромономера поліетиленгліколю, у водно-сольовому розчині якого сформована холестерична РК дисперсія лінійних дволанцюжкових молекул нуклеїнової кислоти (патент РФ № 2224781 від 2004 p.). Однак цей спосіб має ряд обмежень, пов'язаних з використанням складної суміші розчину НК, який досліджується, і компонентів композита, з дорожнечею, трудомісткістю і необхідністю у висококваліфікованому персоналі. Також немає достатніх підстав припускати, що процедура полімеризації з численними компонентами композита не чинить побічного впливу на стан НК. Найбільш близьким аналогом (прототипом) до об'єкта, що заявляється, є спосіб визначення впливу речовини на біополімери (патент України № UA 86246 C2, 10.04.2009 р., автори: Глибицький Г. М., Красницька А. А.). Відомий документ з рівня техніки до об'єкта, що заявляється, є спосіб визначення впливу речовини на біополімери (заявка на патент України № а201312123 від 16.10.2013 p., автори: Глибицький Г. М., Глибицький Д. М.). Цей спосіб передбачає формування розчину біополімеру з досліджуваною речовиною (ДР), отримання плівки з текстурами та визначення коефіцієнтів впливу речовини на біополімер, які враховують площу текстур на плівці, площу масштабно інваріантних фрактальних текстур (МІФΓ) і фрактальну розмірність текстур. Однак цей спосіб для відбору ДР має недостатню чутливість визначення виливу речовини внаслідок того, що при визначенні площі МІФТ на плівці виникає похибка у зв'язку з високою щільністю розташування МІФТ разом із текстурами, які не є масштабно інваріантними. Також не враховується близькість розташування МІФТ на одній й тієї ж площі, тому що текстури мають таку конфігурацію та розташовані так, що контури, які описують конфігурації текстур частково накладаються одна на одну (див. фіг. 1). В основу винаходу поставлено задачу удосконалити спосіб визначення впливу речовини на біополімери шляхом врахування довжини МІФТ на плівці, що дозволяє підвищити чутливість визначення впливу речовини. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення впливу речовини на біополімери, який передбачає формування розчину біополімеру з речовиною, отримання з розчину плівки з текстурами, визначення коефіцієнта впливу, що враховує площу текстур на плівці, площу МІФТ і фрактальну розмірність текстур, згідно з винаходом, додатково визначають коефіцієнт, що враховує довжину МІФТ на плівці. У конкретному випадку, згідно з пунктом 2, вплив речовини на біополімери може бути визначений за допомогою коефіцієнта, що враховує середню питому довжину МІФТ: n L   i i 40    _ L  Sn i n (1), де L  i - довжина МІФТ і-го зразка на плівці; 45 50 55 n - кількість зразків на поверхні плівки, які були проаналізовані, S(n)i - площа і-го зразка. Як було показано в роботах (Sclavi В. Fractal-like patterns in DNA films, В form at 0 % relative humidity, and antiheteronomous DNA: an IR study / B.Sclavi, W.L.Peticolas, J.W.Powell // Biopolymers. - 1994. - N 8 (34) (Aug.). - P. 1 105-1113) та (A study of Na-DNA films containing NaCl via scanning electron and tunneling microscopies / C.H.Mayeres, S.A.Lee, D.A.Pinnick, B.J.Carter, J.Kim // Biopolymers. - 1995. - V. 36. - P. 669-673; Ascorbic Acid and BSA Protein in Solution and Films: Interaction and Surface Morphological Structure. R.R. G. Maciel, A. A. Almeida et al. // Biomed Res Int. 2013: 461365) формування МІФT на поверхні плівок біополімеру можна пояснити тим, що молекули біополімеру з молекулами води та з іонами металу утворюють кристалогідраті комплекси. Якщо до первинного розчину додасться біологічно активна досліджувана речовина (ДР), що порушує умови формування кристалогідратів при висушуванні розчину, то довжина МІФТ на поверхні плівки зменшується, або взагалі МІФТ не формується при відповідних концентраціях ДР; причиною може бути окисне пошкодження білка (Interactions of di-imine copper(II) complexes with albumin: competitive equilibria, promoted oxidative damage and DFT studies. M. A. A. Azzellini, M. P. Abbott et al. // J. Braz. Chem. Soc. vol. 21 no. 7, 2010). 1 UA 111769 C2 5 10 15 Суть винаходу пояснюється кресленнями, які представлені фотографіями та графіками. На фіг. 2-6 представлені фото плівок біополімеру - білка (з розчинів бичачого сироваткового альбуміну, БСА) з МІФТ. На фіг. 7-12 представлені розподіли питомих довжин МІФТ і фрактальної розмірності по площі кювет. Спосіб, що заявляється, здійснюється наступним чином. Формують розчин біополімеру з ДР. Висушують розчин до отримання плівки з текстурами. Для плівки біополімеру, отриманої з розчину біополімеру з ДР, дія якого на біополімер досліджується, визначають коефіцієнт впливу ΚT, що враховує площу текстур на плівці за формулою: KT=ST/S, (2) де ST - площа текстур на плівці; S - площа всієї плівки. Одним з параметрів, що використовують для аналізу МІФТ, є фрактальна розмірність D, яка характеризує ступінь розгалуженості або порізаності текстури (Фізична енциклопедія. - М., 1998. - Т. 5. - С. 371). У загальному випадку D виражається у вигляді: D  lim  20 де N - кількість елементів (квадратів, кругів тощо), достатніх для покриття МІФТ (заповненої області на зображенні), ε - лінійний розмір елементів. У випадку, якщо неможливо чітко розділити фон та структуру, застосовується різновид фрактальної розмірності, що враховує "інтенсивність" зображення: D  lim   25 log   log (3б), де X- певна кількісна характеристика вмісту елементів. Для розрахунку фрактальної розмірності був застосований метод підрахунку квадратів "варіація диференціального об'єму". Для кожного значення ε (із заздалегідь заданого ряду масштабів) зображення покривається квадратною сіткою зі стороною квадрата ε. Для кожного квадрата розраховується інтенсивність   30 log   log , (3а),  1  i, j,  , i, j (4) де δΙI,j,ε. - різниця між максимальною та мінімальною "інтенсивностями" зображення у межах даного квадрата. 2 Iε, відповідає "об'єм" Vε = lε•ε . Будується залежність log(V) від log(ε) і нахил регресійної прямої, відповідно, розраховується як S  lim ln V   ln1/  35 40 45 (5), а фрактальна розмірність - за формулою D=3-(S/2) (6), Визначають коефіцієнт впливу KMІФТ_S, що враховує МІФТ: KMІФТ_S=SМІФТ/S (7), де SМІФТ - площа масштабно інваріантних фрактальних текстур на плівці. Додатково визначають коефіцієнт, що враховує середню питому довжину МІФТ (довжину на одиницю площі, яка обмежена лінією, описаною навколо МІФТ). Відбір зразків проводився таким чином: поверхня кювети представлялася покритою прямокутною координатною сіткою з певним кроком, на n перетинах координатних ліній (у вузлах сітки) проводиться фотографування. Таким чином, отримують вибірку з n фотографій текстур плівки. Визначають коефіцієнт впливу KMІФТ_L, що враховує довжину МІФТ. І згідно з формулою (1): n L   i i    _ L  50 Sn i n . Вплив досліджуваної речовини Ρ визначається як добуток всіх розрахованих коефіцієнтів: Ρ=Κт•D•KMІФТ_S•KMІФТ_L · (8). Приклади здійснення способу. Приклад 1 (фото плівки - фіг. 2, графік розподілу питомих довжин МІФТ по площі кювети фіг. 7, графік розподілу фрактальної розмірності по площі кювети - фіг. 8). 2 UA 111769 C2 -1 5 10 15 20 Розчин містить 20 мМ NaCl+БСА. Середня питома довжина МІФТ LMІФТ_i=4,55 мм . Приклад 2 (фото плівки - фіг. 3, графік розподілу питомих довжин МІФТ по площі кювети фіг. 9, графік розподілу фрактальної розмірності по площі кювети - фіг. 10). Розчин містить 20 мМ NaCl+0,05 мМ FеСl3+БСА. Середня питома довжина МІФТ LMІФТ_i=3,62 -1 мм . Приклад 3 (фото плівки - фіг. 4, графік розподілу питомих довжин МІФT по площі кювети фіг. 11, графік розподілу фрактальної розмірності по площі кювети - фіг. 12). Розчин містить 20 мМ NaCl+0,05 мМ СuСl2+БСА. Середня питома довжина МІФT LMІФТ_i=3,11 -1 mm . Приклад 4 (фото плівки - фіг. 5). Розчин містить 20 мМ NaCl+0,1 мМ FeCl3+БСА. Середня питома довжина МІФT LMІФТ_i=3,66 -1 мм . Приклад 5. Розчин містить 20 мМ NaCl+0,15 мМ FeCl3+БСА. Середня питома довжина МІФT LMІФТ_i=6,19 -1 мм . Приклад 6. Розчин містить 20 мМ NaCl+0,2 мМ FeCl3+БСА. Середня питома довжина МІФT LMІФТ_i=1,96 -1 мм . Приклад 7 (фото плівки - фіг. 6). Розчин містить 20 мМ NaCl+0,25 мМ FeCl3+БСА. Середня -1 питома довжина МІФТ LMІФТ_i=0 мм . Розрахункові дані надані в Таблиці. Таблиця -1 Досліджувана речовина КТ, Δ=5 % D Δ=5 % KMІФТ_S Δ=10 % KMІФТ_L мм Δ=10 % 1 20 mM NaCl 0,05 mМ FeCl3+(*) 0,05 mМ СuСl2+(*) 0,10mM FeCl3+(*) 0,15 mM FeCl3+(*) 0,20 mМ FeCl3+(*) 0,25 mМ FeCl3+(*) 2 0,98 0,90 0,95 0,84 0,98 0,95 0,89 3 2,71 2,68 2,70 2,67 2,73 2,74 2,73 4 0,53 0,34 0,34 0,46 0,50 0,15 0,00 5 4,55 3,62 3,11 3,66 6,19 1,96 0,00 Р відомий з Р -1 рівня техніки винахід, мм документ Δ=16 % Δ=12 % 6 7 1,41 6,41 0,82 2,97 0,87 2,71 1,03 3,78 1,34 8,28 0,39 0,77 0,00 0,00 (*)-20mM NaCl 25 Результат аналізу даних колонок 6, 7 таблиці свідчить про те, що чутливість визначення впливу речовини заявленим способом значно вище, ніж у відомих з рівня техніки дослідженнях, причому високі значення Р відповідають речовинам, у присутності яких біополімер знаходиться у нативному стані, а низькі значення Р відповідають іонам, які збільшують частоту помилок реплікації. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 Спосіб визначення впливу речовини на біополімери, який передбачає формування розчину біополімеру з речовиною, отримання з розчину плівки з текстурами, визначення коефіцієнта впливу, що враховує площу текстур на плівці (Кт), який відрізняється тим, що додатково визначають коефіцієнти, що враховують: фрактальну розмірність текстур (D) D  lim  40 logN(  ) , log де N - кількість квадратів, достатніх для покриття текстури;  - лінійний розмір квадрата; коефіцієнт, що враховує площу масштабно інваріантних фрактальних текстур (KMІФТ_S), KMІФТ_S=SМІФТ/S, де SМІФТ - площа масштабно інваріантних фрактальних текстур на плівці; 3 UA 111769 C2 S - площа всієї плівки; та коефіцієнт, що враховує середню питому довжину МІФТ на плівці (KMІФТ_L) L   i n i S n i    _ L  , n 5 10 де L   i - довжина МІФТ і-го зразка на плівці; n - кількість зразків на поверхні плівки, які були проаналізовані; S(n)i - площа і-го зразка; а вплив досліджуваної речовини (Ρ) визначають як добуток цих коефіцієнтів: Ρ=Κт•D•KMІФТ_S•KMІФТ_L, причому високі значення Р відповідають речовинам, у присутності яких біополімер знаходиться у нативному стані, а низькі значення Р відповідають іонам, які збільшують частоту помилок реплікації. 4 UA 111769 C2 5 UA 111769 C2 6 UA 111769 C2 7 UA 111769 C2 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8