Спосіб визначення впливу речовини на біополімери

Реферат: Винахід належить до галузі аналітичної біотехнології, медичної техніки і фармацевтичної промисловості. Спосіб визначення впливу речовини на біополімери полягає в отриманні плівки з текстурами шляхом висушування розчину біополімера з досліджуваною речовиною. Вплив речовини визначають, виходячи з площі текстур на плівці, площі масштабно інваріантних фрактальних текстур і фрактальної розмірності текстур. Винахід забезпечує підвищення чутливості способу в порівнянні з найближчим аналогом. UA 110130 C2 (12) UA 110130 C2 UA 110130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до аналітичної біотехнології, медичної техніки і фармацевтичної промисловості. Спосіб може бути використаний в молекулярній фармакології та медичній біохімії для проведення відбору хімічних сполук (лікарських речовин, біологічно активних речовин (БАР) та ін.) за ступенем впливу на біополімери, зокрема на нуклеїнову кислоту (НК) і білок. Відомий спосіб визначення впливу речовин на біополімери (на НК), згідно з яким готується поліфункціональний рідкокристалічний (РК) композит, який є продуктом тривимірної радикальної полімеризації біс-макромономера поліетиленгліколю, у водно-сольовому розчині якого сформована холестерична РК дисперсія лінійних дволанцюжкових молекул нуклеїнової кислоти (патент РФ № 2224781 від 2004 p.). Однак цей спосіб має ряд обмежень, пов'язаних з використанням складної суміші розчину НК, який досліджується, і компонентів композиту, з дорожнечею, трудомісткістю і необхідністю у висококваліфікованому персоналі. Також немає достатніх підстав припускати, що процедура полімеризації з численними компонентами композиту не чинить побічного впливу на стан НК. Найбільш близьким аналогом (прототипом) до об'єкта, що заявляється, є спосіб визначення впливу речовини на біополімер - нуклеїнову кислоту (патент України № 86246 від 2009 p., автори: Глибицький Г.М., Красницька А.А.). Цей спосіб передбачає формування розчину з нуклеїнової кислоти з досліджуваною речовиною (ДР), отримання плівки з текстурами та визначення коефіцієнта впливу речовини на НК, що враховує площу текстур на плівці. Однак цей спосіб для відбору БАР і лікарських речовин має недостатню чутливість визначення впливу речовини внаслідок того, що враховується тільки площа текстур на плівці, а структурні особливості текстур не враховуються. В основу винаходу поставлено задачу удосконалити спосіб визначення впливу речовини на біополімер шляхом врахування структурних особливостей текстур на плівці, що дозволяє підвищити чутливість методу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення впливу речовини на біополімери, який передбачає формування розчину біополімера з речовиною, отримання плівки з текстурами, визначення коефіцієнта впливу, що враховує площу текстур на плівці, згідно винаходу, додатково визначають коефіцієнти, що враховують площу масштабно інваріантних фрактальних текстур (МІФТ) і фрактальну розмірність текстур. Відомо, що на поверхні плівок, отриманих з розчинів при вологості 0 %, що містять poly-dA * poly-dT і poly-dA-dT * poly-dA-dT та іони натрію, формуються фрактальні структури (Sclavi В. Fractal-like patterns in DNA films, В form at 0 % relative humidity, and antiheteronomous DNA: an IR study / B.Sclavi, W.L.Peticolas, J.W.Powell // Biopolymers. - 1994. - N 8 (34) (Aug.). - P. 1105-1113). При цьому припущено, що впорядковані дендритні структури (патерни) з повторюваною структурною конфігурацією формуються відрізками молекул НК. Проведені у роботі (A study of Na-DNA films containing NaCl via scanning electron and tunneling microscopies / C.H. Mayeres, S.A. Lee, D.A. Pinnick, B.J. Carter, J. Kim // Biopolymers. - 1995. - V. 36. - P. 669-673) дослідження отриманих аналогічним чином неорієнтованих плівок Na-ДНК дозволили зробити висновки про взаємозв'язок формування кристалів хлориду натрію з формуванням патернів на поверхні плівок ДНК. Також було обґрунтовано припущення про формування молекулами ДНК упорядкованих патернів. Таким чином, формування МІФТ на поверхні плівок НК можна пояснити тим, що молекули НК з іонами металу утворюють кристалогідратні комплекси. Зменшення площі, займаної МІФТ на поверхні плівки НК (або відсутність МІФТ) пояснюється порушенням умов, при яких утворюються кристалогідратні комплекси НК після введення у вихідний розчин досліджуваних речовин. Утворення МІФТ відбувається і для плівок, отриманих з розчинів білків з іонами металів. Суть винаходу пояснюється ілюстраціями, на яких представлені фотографії плівок, отриманих з розчинів НК і білків з досліджуваними речовинами: На фігурах 1, 2, 3 - плівки НК з масштабно інваріантними фрактальними текстурами: на фіг. 1 - досліджувана речовина - NaCl (концентрація 10 мМ); на фіг. 2 - досліджувана речовина - KСl (концентрація 10 мМ); на фіг. 3 - досліджувана речовина - RbCl (концентрація 10 мМ); на фігурах 4, 5, 6 - плівки НК, що не містять масштабно інваріантних фрактальних текстур: на фіг. 4 - досліджувана речовина - NaCl (концентрація 10 мМ) і СuСl2 (концентрація 0,2 мМ); на фіг. 5 - досліджувана речовина - NaCl (концентрація 10 мМ) і ZnCl2 (концентрація 0,4 мМ); на фіг. 6 - досліджувана речовина - NaNO3 (концентрація 10 мМ) і AgNO3 (концентрація 0,4 мМ); 1 UA 110130 C2 5 10 15 20 на фігурах 7, 8 - плівки бичачого сироваткового альбуміну (БСА) і сироваткового альбуміну людини (САЛ) з масштабно інваріантними фрактальними текстурами: на фіг. 7 - досліджувана речовина - NaCl (концентрація 20 мМ); на фіг. 8 - досліджувана речовина - KСl (концентрація 20 мМ); на фігурах 9, 10 - плівки БСА і САЛ, що не містять масштабно інваріантних фрактальних текстур: на фіг. 9 - досліджувана речовина - NaCl (концентрація 20 мМ) і СuСl2 (концентрація 0.1 мМ); на фіг. 10 - досліджувана речовина - КС1 (концентрація 20 мМ) і СuСl2 (концентрація 0.4 мМ). Спосіб, що заявляється, здійснюється наступним чином. Формують розчин біополімера з ДР. Висушують розчин до отримання плівки з текстурами. Для плівки біополімера, отриманої з розчину біополімера з ДР, дія якого на біополімер досліджується, визначають коефіцієнт впливу К Т , що враховує площу текстур на плівці за формулою: КТ  SТ / SП , (1) де SТ - площа текстур на плівці; SП - площа всієї плівки. Визначають коефіцієнт впливу КМІФТ , що враховує масштабно інваріантні фрактальні текстури: КМІФТ  SМІФТ / SП , (2) де SМІФТ - площа масштабно інваріантних фрактальних текстур на плівці. Одним з параметрів, що використовуються для аналізу МІФТ, є фрактальна розмірність D , яка характеризує ступінь розгалуженості або порізаності текстури (Фізична енциклопедія. - М, 1998. - Т. 5. - С. 371). У загальному випадку D виражається у вигляді межі: 25 D  lim  logN(  ) , (3) log де N - кількість квадратів, достатніх для покриття МІФТ (заповненої області на зображенні),  - лінійний розмір елементів. 30 35 40 45 Для розрахунку фрактальної розмірності був застосований метод підрахунку квадратів. Для кожного значення  (із заздалегідь заданого ряду масштабів) зображення покривається квадратною сіткою зі стороною квадрата  . Підраховується кількість квадратів N , які містять ділянку зображення, що належить МІФТ; потім будується залежність log(N) від log() і визначається регресійна пряма для цієї залежності. Кут нахилу регресійної прямої є шуканим значенням D . Вплив досліджуваної речовини визначається як добуток цих коефіцієнтів ( P ): P  KТ  KМІФТ  D . (4) Приклади Для оцінки впливу речовини (іонів металів) на біополімери були використані фотографічні зображення плівок. Розрахункові дані визначення впливу (Р) ДР для плівок, представлених на Фіг. 1-10 і приготованих з відповідних розчинів, наведені в Табл. 1 і Табл. 2. Розчини були отримані з суміші Na-ДНК тимуса теляти з концентрацією 0,25 мг / мл і солей металів відповідних концентрацій, а також суміші БСА та САЛ з концентрацією 0,52 мг / мл і солей металів відповідних концентрацій. Отримані результати показують, що для іонів натрію, калію і рубідію високі значення Р відповідають речовинам, у присутності яких НК знаходиться у нативному стані, а низькі значення Р відповідають іонам, які збільшують частоту помилок реплікації (Infidelity of DNA synthesis in vitro: screening for potential metal mutagens of carcinogens / M.A. Sirover, L.A. Loeb // Science.-1976. - V. 194 (4272). - P.1434-1436). 2 UA 110130 C2 Таблиця 1 Розрахункові дані визначення впливу ДР для плівок, приготованих з розчинів НК з ДР. Досліджувана речовина 10mM NaCl 10тМ KСІ 10mM RbCl 0.2 mM CuCl2* 0.4 mM ZnCl2* 0.4mM AgNO3** D КТ КМІФТ P 1,68±0,02 1,52±0,08 1,52±0,05 1,69±0,02 1,72±0,02 1,54±0,04 0,53±0,02 0,32±0,02 0,14±0,02 0,53±0,02 0,35±0,02 0,08±0,02 0,83±0,1 0,51±0,1 0,96±0,1 0,00 0,00 0,00 0,75±0,13 0,25±0,07 0,20±0,06 0,00 0,00 0,00 Частота помилок реплікації (Sirover M.A., Loeb L.A., 1976) 0,00675 0,0074 0,045 36,25 2,65 61,66 *+10mM NaCl **+10mM NaNO3 Таблиця 2 Розрахункові дані визначення впливу ДР для плівок, приготованих з розчинів білків з ДР Досліджувана речовина БСА+20 мМ NaCl БСА+20 мМ NaCl+0,1 мМ СuСl2 САЛ+KСl 20 мМ САЛ+20 мМ NaCl+0,4 мМ СuСl2 D КТ КМІФТ P 1,83±0,07 1,83±0,06 1,85±0,06 1,84±0,07 0,61±0,02 0,20±0,02 0,50±0,02 0,19±0,02 0,40±0,1 0,00 0,01±0,003 0,00 0,44833±0,14 0,00000 0,00925±0,003 0,00000 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 1. Спосіб визначення впливу речовини на біополімери, який передбачає формування розчину біополімера з речовиною, отримання з розчину плівки з текстурами, визначення коефіцієнта впливу, що враховує площу текстур на плівці, який відрізняється тим, що додатково визначають коефіцієнти, що враховують площу масштабно інваріантних фрактальних текстур і фрактальну розмірність текстур. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що коефіцієнт, що враховує площу текстур на плівці: КТ  SТ / SП , 15 де SТ - площа текстур на плівці, SП - площа всієї плівки; коефіцієнт, що враховує масштабноінваріантні фрактальні текстури: КМІФТ  SМІФТ / SП , де SМІФТ - площа масштабно інваріантних текстур на плівці; коефіцієнт, що враховує фрактальну розмірність текстур, розраховується методом підрахунку квадратів: D  lim  20 logN(  ) , log де N - кількість квадратів, достатніх для покриття текстури,  - лінійний розмір квадрата, а вплив P речовини визначається як добуток цих коефіцієнтів: P  KТ  KМІФТ  D . 3 UA 110130 C2 4 UA 110130 C2 5 UA 110130 C2 6 UA 110130 C2 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7