Спосіб визначення впливу речовини на нуклеїнову кислоту

Спосіб визначення впливу речовини на нуклеїнову кислоту, що передбачає формування рідиннокристалічної дисперсії з нуклеїнової кислоти, який відрізняється тим, що шляхом висушування розчину суміші нуклеїнової кислоти й речовини формують рідиннокристалічну дисперсію та одержують плівку з відповідними текстурами і по величині відношення площі текстур на плівці до площі всієї плівки роблять висновок про вплив речовини. Винахід відноситься до аналітичної біотехнології, медичної техніки й фармацевтичної промисловості. Спосіб може бути використаний для проведення відбору хімічних сполук, лікарських речовин та біологічно активних сполук (БАС) у молекулярній фармакології, у клінічній та медичній біохімії для визначення наявності БАС в розчинах. Відомий спосіб визначення впливу речовин на нуклеїнову кислоту (НК) [Т.Е. Strzelecka, Davidson M.W., R.L. Rill. Multiple liquid crystal phases of DNA at high concentration. // Nature. -1988. - Vol.331. P.457-460], згідно з яким по характеру сформованих рідиннокристалічних (РК) текстур визначають вплив речовини на НК. Однак спроби використання цього способу для відбору БАС і лікарських речовин не дають бажаного результату, тому що для дослідження беруться розчини з такими концентраціями НК, при яких заздалегідь забезпечується існування дисперсної середи з РК фазою (надалі - дисперсії). Таким чином, вплив речовини на формування РК фази даним способом визначити неможливо. Крім того, даний спосіб не передбачає кількісної оцінки впливу БАС на молекули НК. Найбільш близьким аналогом (прототипом) до об'єкту, що заявляється, є спосіб визначення впливу речовини на нуклеїнову кислоту [C.K.S. Pillai, Neethu Sundaresan, M.Radhakrishnan Pillai, T.Thomas, TJ.Thomas. Investigations on the liquid crystalline phases of cation-induced condensed DNA. // Pranama -journal of physics. - 2005. - Vol.65, №4. P.723-729], згідно з яким готують дисперсію і по характеру текстур визначають вплив речовини на НК. Однак спроби використання цього способу для відбору БАС і лікарських речовин не дають бажаного результату, тому що для дослідження беруться розчини з такою концентрацією НК, при яких або забезпечується існування дисперсії, або концентрація ще недостатня для її утворення. Крім того, даний спосіб не передбачає кількісної оцінки впливу БАС на молекули НК. В основу винаходу поставлено задачу: вдосконалити спосіб визначення впливу речовини на нуклеїнову кислоту шляхом підвищення чутливості (19) UA (11) 86246 (13) (21) a200701531 (22) 13.02.2007 (24) 10.04.2009 (46) 10.04.2009, Бюл.№ 7, 2009 р. (72) ГЛИБИЦЬКИЙ ГЕННАДІЙ МАРКСОВИЧ, UA, КРАСНИЦЬКА АЛЛА АБРАМІВНА, UA (73) ІНСТИТУТ РАДІОФІЗИКИ ТА ЕЛЕКТРОНІКИ ІМ. О.Я.УСИКОВА НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, UA (56) RU 2139933 C1, 20.10.99. RU 2032895 C1, 10.04.95. RU 2028363 C1, 09.02.90. RU 2169770 C1, 27.06.01. RU 2199442 C2, 27.02.03. RU 2222334 C2, 27.01.04. Евдокимов Ю.М. и др. "Фантомная" структура растворителя и упаковка двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот в частицах жидкокристалли C2 1 3 процесу формування дисперсії до впливу речовин, що забезпечує здійснення кількісної оцінки впливу речовини на НК за рахунок висушування утримуючого НК і речовину розчину при відповідних величинах вологості й температур. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення впливу речовини на НК, що включає формування дисперсії, згідно з винаходом, висушуванням розчину суміші НК й речовини формують дисперсію та одержують плівку з відповідними текстурами і по величині відношення площі текстури на плівці до площі всієї плівки роблять висновок про вплив речовини. Висушування збільшує концентрацію НК у розчині й сприяє формуванню дисперсії. При концентраціях, близьких до фізіологічних, ця властивість є фундаментально важливою для вивчення механізмів упакування НК in vivo, які співвідносяться з природною тенденцією напівтвердих полімерів формувати РК фази в концентрованих розчинах. [Randolf L. Rill. Liquid crystalline phases in concentrated aqueous solutions of Na+DNA. // Biophysics, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol.83. - P. 342-346; Т.Е. Strzelecka, Davidson M.W., R.L. Rill. Multiple liquid crystal phases of DNA at high concentration. // Nature. 1988. - Vol.331. - P.457-460]. Упорядкування напівтвердих полімерів при високих концентраціях відбувається спонтанно й з метою мінімізації виключеного обсягу. Поводження напівтвердих поліелектролітів ускладнюється необхідністю існування захисної зарядженої оболонки. Сильні поліелектроліти оточуються протиіонним шаром, що визначає ефективне осьове відношення й виключений обсяг. Завдяки тому, що фазова поведінка біополімеру залежить від його ефективного обсягу, критична концентрація для впорядкування молекул НК є функцією іонної сили й типу протиіонов. Відомі наступні механізми зменшення ефективного обсягу НК: - зміна до більше впорядкованої фази; - ущільнення протиіонного шару; - зміна конформації НК; - зміни в гідратній оболонці. Останні два фактори залежать від рівня вологості й температури навколишнього середовища. Завдяки тому, що зазначені фактори безпосередньо впливають на характер упорядкування молекул НК у розчині, і, отже, на формування текстури на плівці одержуваної з розчинів НК, то по характеру отриманої текстури можна зробити попередні висновки про здатність досліджуваної речовини сприяти формуванню в концентрованому розчині нуклеїнової кислоти РК фази, або гальмувати формування РК фази. При випарюванні води поступово концентрація НК у розчині наближається до величини, достатньої для утворення РК фази; з іншого боку, процес випарювання вологи з розчину веде до дегідратації молекул НК, що перешкоджає утворенню РК фази. Крім того, фактором, що сприяє або перешкоджає утворенню РК фаз є присутність у розчині молекул речовин, вплив яких на НК і є предметом вивчення. 86246 4 Якщо присутність речовини сприяє виникненню дисперсії, то формується більший об'єм РК фази, якщо присутність речовини не сприяє виникненню дисперсії - то утвориться менший об'єм РК фази при тих самих умовах навколишнього середовища (вологості й температури). Таким чином, відповідні площі текстур на висушеній плівці будуть більше або менше по величині; величина площі текстур на поверхні плівки є функцією властивостей речовини, що впливає на НК і яка перебуває у розчині, з якого отримана плівка. Заявлений спосіб здійснюється таким чином. В кювету наливають розчин НК з досліджуваною речовиною. Висушують розчин до формування дисперсії; подальшим висушуванням одержують в кюветі плівку з текстурою, площа якої відповідає обсягу РК фази у сформованої дисперсії. Обчислюють величини площі всієї плівки, що визначається площею кювети, та площі текстур на плівці. Обчислюють відношення площі текстур на плівці до площі всієї плівки. По величині відношення роблять висновок про вплив речовини на НК. Приклад 1. Визначення впливу солі NaCl на НК. Висушуванням розчину, що містить суміш солі NaCl з концентрацією 0.01Na-ДНК з концентрацією 0.02мг/мл при Т=40°С та відносної вологості Н=20% одержана плівка з площею Sп=441mm2. Площа текстур на плівці S т=132мм2, Фіг.1. Sт/Sп=0,299. Приклад 2. Визначення впливу солі КСl на НК. Висушуванням розчину, що містить суміш солі КСl з концентрацією 0.01М і Na-ДНК з концентрацією 0.02мг/мл при Т=40°С та відносної вологості Н=20% одержана плівка з площею Sп=441мм2. Площа текстур на плівці S т=6.7мм2, Фіг.2. Sт/Sп=0,015. Приклад 3. Визначення впливу солі RbCl на НК. Висушуванням розчину, що містить суміш солі RbCl з концентрацією 0.01М і Na-ДНК з концентрацією 0.02мг/мл при Т=40°С та відносної вологості Н=20% одержана плівка з площею Sп=441мм2. Площа текстур на плівці S Т=5.24мм2, Фіг.3. Sт/Sп=0,012. Приклад 4. Визначення впливу солі СаСІ 2 на НК. Висушуванням розчину, що містить суміш солі СаСІ 2 з концентрацією 0.01М і Na-ДНК з концентрацією 0.02мг/мл при Т=40°С та відносної вологості Н=20% одержана плівка з площею Sп=441мм2. Площа текстур на плівці S т=2.61мм2, Фіг.4. Sт/Sп=0,006. Таким чином, найбільш сприятливим для природного укладання НК є розчин з сіллю NaCl, найменш сприятливим є розчин з сіллю СаСІ 2. Для дослідження текстур плівок, одержуваних з розчинів НК при різних рівнях вологості й температурах, була створена герметична камера, що містить термометр, гігрометр і камеру для кювети 5 86246 з розчином. Герметична камера містить патрубки для прокачування через неї повітря й розташована в термостаті; через допоміжні отвори термостата Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 6 з'єднується з витратоміром повітря, манометром і вакуумним насосом. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601