Спосіб одержання комплексного антибіотика циклоспоріну та/або його компонентів та штам грибка tolypocladium varium

1, Способ получения комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компо Изобретение относится к способу получения комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов: цг.хлоспорина А, циклоспорина 3 и циклоспорина С, аэробной ферментацией. Отдельные компоненты комплекса представляют состоящие- из П аминокислот циклические, нейтральные, неполярные олигепептиды, которые отличаются друг от друга только одной или двумя участвующими в построении аминокислотами. Из компонентов комплексного антибиотика циклоспорин А и циклоспорин С были выделены скачала A.Ruegger и др. и циклоспорины В, D, Е и С, R.Tracer и др. из куль нентов, включающий кулыивированиз продуцента при аэробных условиях п питательной среде, содержащей усиливаемые ИСТОЧНИКИ углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением целевых продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что а качестве продуцента используют грибок Tolypocladium varium NCAIM(P)F 001005, при этом культивирование осуществляют при температуре 25-ЗО°С. 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве источника азота Приме няют пептон, сульфат аммония, трипказии, а качестве источнику углерода - глюкозу, мальтозу, сорйит. 3. Штамм грибка Tolypocladlum varium NCAtM (P) F 001005 - продуцента комплекс ного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов. туры идентифицированного ими раньше как Trlchoclerma polysporum (Link ex Hers.) Rifas грибка (NRRL ЗО'М). Позднее была уточнена систематическая классификация соотаетегвующего шгоммо грибка (NRRL 8044), и с тех пор он был назван в литературе как Toiypocladlum Inflatum Gams. В настоящее время известны уже 25 циклоспоринов, которые обозначаются буквами от А до Z. Из компонентов самым цепным по действию является имеющий избирательную иммунсподавляющую активность циклоспорин А. ІО 13320 Циклоспорин был известен сначала как аі.шпиогик со слабым противогрибковым др "хтриим, его значительное иммуноподэвляющее действие было открыто лишь позднге. При помощи целой серии опытов на жиі>ом оронизме и в пробирке можно было дикяззть.что циклоспорины A.CnG являются более специфическими активными вещестозми, чем известные до сих пор иммуноподавляющие лекарственные средства, Оказалось, что циклоспорин А подавлчет как гуморальный, так и целлюлярный иммунный ответ. При исследовании механизма действия было установлено, что он подавляет пролиферацию Т-кг.еток и rfpepwеает синтез интерлейкинд-2. О применении циклоспорина А в качества лекарственного средства или пересадке органов у человека сообщали а 1978. Первое применение было описано в связи с переселкой почки и трансплантацией костного мозга Применением циклоспорина А при пересалке органов можно препятствовать отторжению органа (почка, поджелудочная железа, печень, сердце, легкое), при трансплантациях костного мозга - отторжению костного мозга. Циклоспорин А с успехом применяли также для лечения определенных аутоиммунных заболеваний (например, воспаленно сосудистого тракта глаза, рематический артрит, чешуйчатый лишай и тяжелая миастения). По патентной литературе для получения содержащих комплексный циклоспорин ферментационных бульонов применяли до сих nor) культуры следующих штаммов микроорганизмов; Cylindrocarpon lucidum Boath. NKRL5760 (патент Швейцарии №589 716), Tolypociadiutn inf la turn Gams, NRRL P(M4 [по более старой номенклатуре: Irichocioima polys-portum (Link ex Pers) Rifal, патент Швейцарии N» 603790] no Blssett (1983) Tolynfeatum W. Gams, 1971 является синонимом cloiyniveum (Rostrup) Bisset coOIB. nov. и Fusarium solanl, MCI-1549, MIC1550 (опубликованная заявка из патент Японии № 82 63093). Однако промышленное использование этих штаммов микроорганизмов в способах ферментации имеет тот недостаток, что времена ферментации продолжительные (11-14 дней), получают мало комплексного циклоспорина (около 20-30 /.*г^,л) и коэффициент полезного действия иыделения комплекса из ферментационного бульона низкий (около 40%). В ходе исследований искали штаммы ^икроорганизмоо, при помощи которых можно пэлучать комплексный антибиотик циклоспорин или его компоненты D высокой концентрации и при более выгодных условиях, чем до сих пор. В процессе серийных исследований, которые распространялись 5 на много тысяч штаммов грибка, смогли выбрать принадлежащий к виду TolypocIacJium микроорганизм, который за более короткое время и в более значительном количестве Биосинтезирует комплексный циклоспорин, 10 чем известные штаммы, и который, как показали таксономические исследования, не идентичен ни с одним из известных продуцирующих циклоспорин штаммов грибка. Новый штамм (СУ/93) - который по собст15 ценным исследованиям следует рассматривать как член нового отличительного таксона рода Tolypociadlum - был описан под названием Tolypociadlum varlum species nova как голотигшый штамм. 20 Изобретение осноЕзыыается, следовательно, на том открытии, что в результате ферментации неизвестного до сих пор штамма типа Tolypoclodium varium species nova (домашнее название: СУ/93), кото25 рый был депонирован под номером NCAIM(P)F 001005 в Будапештском Университете садоводства и пищевой промышленносіи в Национальном собрании сельскохозяйственных и промышленных 30 микроорганизмов, можно получать ферментационный бульон с очень высокой концентрацией циклоспорина. Ферментационный бульон наряду с основным продуктом циклоспорина Л содержит в небольших количе35 стоах циклоспорин В и циклоспорин С. Испопьэуемыо для систематизации признаки выделенного нового штамма грибка сравнивают ниже с важнейшими из диагностических характеристик известных видов 40 Tolypocladium. Род Tolypociadium был описан о 1971 Gams как новый вид населяющих почву Monilales. Его характерными свойствами являются: медленный рост, полушкообразмые 45 белые или беловатые бактериальные колонии, конечные и боковые, расположенные частично на коротких боковых ветвях фиалиды с сильно разбухшим основанием, на котором можно различить нитевидную, часто 50 дугообразно наклоненную шейку, которая оканчивается маленькой одноклеточной конидией (головкой). Внутри этого рода Gams различал 3 следующих новых вида: T.geodes, Т. culindrosporum, T.infiatum име55 ет поразительный, напоминающий об актиномицетах запах земли, который полностью отсутствует у нового Т.varium sp. nov. СУ/93. Кроме того, клетки носителя T.geodes значительно уже, чем клетки носители Т. varium. sp. nov. СУ/93. Конидии Т. 1332G cylindiosporum характерно длинные и растянутые, конидии Т. variurn sp. nov. СУ/93, напротив, шароуидныс пли слабо растянутые. Конидии Т. inflatum эллиптические и длиннее, чем конидии Т. varlum sp. nov СУ/93. Фиалиды Т.іпПаіигп расположены шш непосредственно па іифе или на клетках держателя длиной 2-3 /їм клубком Для фиалидов T.vaiium sp. nov. СУ/93 расположение клубком не является характерным и наблюдается только із отдельных случаях. Бактериальные колонии всех известных до сих пор видов Tolypocladiurn белые, чго объясняется, в первую очзрадь, белым, ватооГ>рззным воздушным мицелием. Нижняя стороїш бактериальных колоний желтовато-с ерая, бесцветная пли желтая, характерный расіворимий пигмент не производ ится. Ц о этом отнош ении Т.variurn ар.nov. СУ/93 оілнчзегел от извостных видов: па питательных с радах с ?люкизой и пептоном, также на питательных средах с солодовые лксірактом/дрожжевым экстрактом грибок вырабатывает темный, варьируемый !зо времени от густого серого до черного цвета, пиімет. Диагностические признаки Тоїуросійсііит variurn fip. nov. СУ/93 можно сообщить следующим образом. Бактериальные колонии возрастом 10 дней имеют диаметр 10-25 мі-!, их поверхность покрыта ватооОразным белым, насыщенным спорами воздушным мицелием. Нижняя сторона бактериальных колоний желтонато-ссрая или грязно-серая. На многих комплексных питательных с ре/! ил образуется темно-серый растворимый пигмент. На гифах еоздушнего мимечич с порообразование протекает как конечное, гак и боковое. Фиапиды расположены местами или иногда также пучком на шфэх или на коротких (длиной 2-3,ям) клегкгі/. держателя. Фиалиды состоят из разбухшей основной чгсти (2-4x2-3 /іо є таблице Предметом изсіореїуііия является способ полутени 1! комплексного аніибиотика циклосіїоричл и/или ъго компонентов: циклоспорина А, ЦИІ'Л ; ІСПОГДЇПЗ В и цикла10 спо}п*.из С ку ifc-'wmipuG'iHv.ct-i Пиосинтези! руto цсго маэранн*.1е а'-ітмП'іОїики иітзмма гриСка в сидоржаи'іейусзаимемьіе источники углерода и азота м минеральные соли питательной среде, при ззробмых услопиях, 45 и отделением обраэоЕ^эмчыу продуктов. Для спосоОа отличпгольной чор~о"і яеллатея то, что аро/хуцирующый ?амг*пексный ангиоиоТ1-.К циклоспорин ипигмл ногаго вида грибка Tolypocladium vrnium, предпочтительно де50 попкрованный под номером fJCA! M(P)r 001005 в будапештском Университете садоводегва и пищевей пропишленпости а Нацчолальпом соПрзнии сельскохозяйстпепныл v. промишлянні ІХ иіїкроорганиз^св 55 шгаїїмТоІуросІасЛит varlum sp. nov. СУ/93, культивируют R содержащей исючники углерода, а тїікхх* органические и кеорі эпические источники азота и мпнерал^мыз соли питательной среде, при ээрибных услоиикч. при температура 25-30°С, в ел учло нео(но 13320 к выдел я-ют образованный комплек!'!гі апгиОиілик или его компоненты из ферментационного бульона и о случае необходимости ОЧИІЦЗЮГ. По изобретению для получение комп- 5 /1-ксчого антибиотика циклоспорина применяют предпочтительно культуру нового штамма folypocladium varium sp. nov, (///93. Этот штамм вследствие своего быстрого роста является особенно выгодным. 10 Сахарозу, глюкозу, сорСозу, мальтозу, фрук(озу, крахмал, глицерин и различные жиры и масла он хорошо использует как источник углерода. В качестве источников азота принимают Bpacnev различные органические 15 и неорганические источники озотэ, іїапри-мор иоду набухания кукурузы, пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, нитрат плгриіі, (їй грэт аммония, сульфат аммония и различные аминокислоты. Кроме этих ис- 20 їо'нііков углерода и азота, питательная среди може і содержать еще минеральные соли ( мпримгр хлористый калий, сульфат магґ 'І.ІЯ Р1І-1 кИСЛЫЙ фОСфОрПОКИСЛЫЙ КЗЛИЙ), микроэлементы (например, медь, марганец 25 и ^e/is-jo), а также витамины и пеногасящие По предпочтительному варианту осуще ствления способа по изобретению от депо нированного под номером NCAtM(P)F 30 (Ю1005 о Будапештском Университете сэдокодства vt пищепой промышленности D Национальном собрании сельскохозяйст венных и промышленных микроорганизмов ші-зммаТоіуросІасЛит varium sp.nov. СУ/93 35 делают посев культуры из косом згаре, сусП'МІЗИЄЙ спор и суспензией мицеллмя кото рого припивают питательную 1 среду ипокущз, зятем добавляют культуру инокуля іа возрастом 3 дня к приблизительно де- 40 г чтикратному количеству среды продуцирования и инкубируют среду продуи.'рог*яния при 25-30°С, предпочтительно 2J°C, Я течение 5-7 дней. Во время фермеп, дции поддерживают величину рН между 45 Ь,0 и 2,5, предпочтительно при 5,2. Фермен тация происходит при аэробных условиях и при интенсивном перемешивании (950-1000 мин'1). Потребность культуры в воздухе соСЧЗРЛЯЄГ около 300 л/час. 50 Во время ферментации за содержанием зкгт;нога пещестаа п ферментационном бульина наблюдают путем микробиологического измерения величин и путем жидкост-чой хроматографии при высоком давлении 55 (HPLC), Когда содержание активного веще-aus достигло своего максимума, ферментацию прекращают и антибиотик выделяют методами экстракции и/или адсорбции. З Для микробиологического измерения величин используюі оказанное циклоспорином А на многие гифоммцеты избирательное торможение роста. В качестве тест-организмов наиболее подходящим яоляются Asperglllus nlgor, Aspe rg il tu s japanicus и Curvulaifa lunata. Для анализа жидкостном хроматографией при высоком давлении (HPLC) ферментационного бульона применяют фильтрат разбавленных в отношении 1:10 метанолом проб (аппарат: LKB, модель насоса 2150, модель ультрафиолетового детектора 2151; измерение при 220 им; колонка BST - ЮС-Са, 7/ім; высота колонки 25 см, внутренний диаметр 0,4 см; жидкий злюеит:ацетонитрил и триэтйламин фосфорной кислоты (рН 6,8) в отношении 65:35). Экспериментальные опыты показали, что новый штамм Tolypocladium varium sp. nov, СУ/93 дает с очень высоким выходом (950 //г/мл) комплексный антибиотик, содержащий G качестве основного продукта циклоспорин А и наряду с ним а качестие небольших компонентов циклоспорин В и циклоспорин С Выделение комплексного циклоспорина из ферментационного бульона целесообразно проводить экстракцией. Выгодно перед экстракцией удалять мицелий из питательной среды фильтрованием или центрифугированием. От отдельной биомассы прилипший антибиотик целесообразно промывать низшими спиртами, особенно метанолом, или кетонами, особенно ацетоном, в то время как для экстракции растворенных в питательной среде циклоспоринов находят применение несмешиааемые с содой растворители, например, этилацетат, п-бутилацетат, і-бутилацетат, дихлорметан, 1 «2-дихлорзтан или хлороформ, предпочтительно п-бутилацетат. Полученный экстракцией сырой продукт загрязнен продуцированными грибком красными и лиловыми пигментами. Последние можно удалять адсорбцией на активном угле или силикагеле. Имеющиеся при случае в фермйнтацуюином бульоне примеси липидного характера (например, антипепениватели) можно удалять диспергированием сырого продукта в петролейном эфире и содержащем 10% соды метаноле. Липидообразные примеси переходят в фазу петролейного эфира. Из водно-метанолооой фазы метанол удаляют выпариванием в вакууме, остающуюся водную фазу экстрагируют дихлорметаном и выпаривают экстракт. Из полученного таким путем очищенного продукта можно отделять циклоспорин А и дру 13320 гие образованные в меньшем количестве компоненты циклоспорина хроматографией на колонне или перекристаллизацией. При сравнении с известными до сих пор способами способ по изобретению имеет ряд преимуществ, которые можно суммировать следующим образом: 1 Основное преимущество способа со стоит этом, что штамм Tolypocladium varium sp. nov. СУ/93 дает в несколько раз более количество комплексного циклоспорина, получаемого известными до сих пор метода ми, при лабораторных условиях количества достигают до 950 //г/мл. 2 Новый штамм дает комплексный цик лоспорин благоприятного состава (около 85% комплекса состоят из циклоспорина А), и поэтому ферментационный бульон можно проще и экономичнее перерабатывать, чем это имеет место при известных способах Выделенные продукты идентифицировали исследованиями ультрафиолетового спектра, инфракрасного спектра, спектра Н-ядерного магнитного резонанса и Сядерного магнитного резонанса, анализом аминокислот и жидкостной хроматографией при высоком давлении Изобретение поясняют подробнее на основании следующих примеров. П р и м е р 1. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Tolypocladium varium sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия суспензию спор. При помощи 1 мл этой суспензии спор засевают 100 мл питательной среды с инокулятом, которая находится в колбе Эрленмейера объемом 500 мл. Состав питательной среды с инокулятом 1С Глюкоза 40 г Казеиновый пептон 5г Нитрат натрия 3г Кислый фосфорнокислый калий 2г Хлористый калий 0,5 г Сульфат магния -7Н2О 0,5 г Сульфат железа (И) -7Н2О 0,01 г в 1000 г водопроводной воды . Питательную среду устанавливают до рН 5,2 и после этого стерилизуют при 121°С п течение 25 минут. Культуру встряхивают на аппарате для встряхивания (340 мин" , отклонение 3,5 см) при 25°С в течение 3 дней. При помощи 5 мл полученной культуры инокулята засеивают 15 колб Эрленмейера объемом 500 мл, в которых находятся г,о 100 мл стерильной питательной среды FCi. 10 Состав питательной среды FCi Глюкоза 80 г Трипкаэин 40 г Мочевина 2г 5 Сульфат аммония 12 г Нитрат натрия 3г Кислый фосфорнокислый калий 2г Хлористый калий 0,5 г Сульфат магния -7НгО 0,5 г 10 Сульфат железа (II) -7Н2О 0,01 г в 1000 мл водопроводной воды . Питательную среду устанавливают до рН 5,2 и после этого стерилизуют при 121°С в течение 25 минут. 15 Колбы встряхивают на аппарате для встряхивания (340 мин , отклонение 3,5см) при 25°С. За изменением содержания антибиотика в ферментационном бульоне наблюдают при помощи микробиологического 20 метода диффузии в агаре. Метод диффузии в агаре для микробиологического измерения величин основывается на п ро ти во г риб к ов ом д е йс тв ии циклоспорина А. В качестве тест-организма 25 применяют Aspergtlfus nfger. Активность образованного комплексного циклоспорина измеряют относительно циклоспорина Астандарта. Содержащие 2-8 /гг/мл циклосп орина А, приготовл енные с водным 30 спиртом стандартные растворы дают на содержащей дрожжевой экстракт и глюкозу агаровой среде зоны торможения диаметром 16-25 мм. Ферментацию продолжают 168 часов, 35 потом выделяют образованный комплексный антибиотик из ферментационного бульона. Из одного литра ферментац ионного бульона, который при прекращении фер-40 ментзции содержал 400 /(г/мл комплексного циклоспорина, получают антибиотики следующим образом. Клетки удаляют фильтрованием из ферментационного бульона и прилипшие анти-45 биотики отмывают 2 х 200 мл метанола. Из водно-метаноловой промывочной жидкости удаляют метанол при пониженном давлении и экстрагируют полученный водный концентрат 2 х 50 мл п-бутилацетата. Из 50 фильтрата ферментационного бульона экстрагируют комплексный циклоспорин 200 мл п-бутилацетата. Экстракты соединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают при пониженном давлении при 55 АО°С. Полученный сырой продукт(3,7 г) растворяют в 10 мл метанола, и липофильные примеси удаляют элюированием с метанолом на слое геля из Sephadex LH-20 (высота 40 см, диаметр 2,6 см). Содержащие комп 11 лексный циклоспорин фракции выпаривают при пониженном давлении при 40°С. Полученный комплексный циклоспорин разделяют на его компоненты на приготовленной из 20 г силикагеля (силикагсль 40, Реанал, Будапешт) колонке элюированием, повышающим градиенты хлороформа-метанола сод ерж ан ием м ет ан ол а. Эл ю ир ов ан ие начинают с 100 мл хлороформа и продолжают с 100 мл - количествами элюента, в котором содержание метанола при каждой стадии повышают на 0,5%. За содержанием циклоспорина в хроматографических фракциях следят при помощи тонкослойной хроматографии (пластины с силикагелем 60 F254. DC- алюминиевая фольга, Мерк; конструктор; этилацетат и изопропанол 95:5, окраска: пары йода). Циклоспорин А отделяют от колонки содержащим 2,0% метанола хлороформом, циклоспорин В идет при 2,5% содержания метанола, и циклоспорин С можно найти во фракции с 3,0% метанола. Хроматографическііе фракции, содержащие отдельные компоненты циклоспорина в чистом виде, выпаривают о вакууме. Таким путем получают 225 мг циклоспорина А (точка плавления: 137-140°С; [а]о: - 189° (метачол ); 25 мг цикл осп орина В ( точка плавления: 149-151°С) и 52 мг циклоспорина С (точка плавления: 150-152°С). П р и м е р 2. Описанным в примере 1 способом приготовляют на аппарате для встряхивания культуру инокулята. 200 мл этой культуры засевают 5 литров питательной среды с инокулятом 1С, которые находятся в л абораторной установке для ферментации объемом 10 литров, и стерилизуют при 121°С в течение 45 минут. Культуру перемешивают при 25°С с числом оборотов 1 750 мин' и при этом аэрируют количеством воздуха 300 л/час, После 72 часов ферментации 500 мл полученной культуры инокулята применяют для засевания 5 литров питательной среды РСг- которая находится в лабораторной ус тановке для ферментации объемом 10 л, и стерилизуют при 121°Св течение 45 минут. Состав питательной среды FC2 Глюкоза 80 г Трипказин 40 г Мочезина 2г Сульфат аммония 12 г Нитрат натрия 3г Кислый фосфорнокислый калий 2г Хлористый калий 0,5 г Сульфат магния *7НгО 0,5 г Сульфат меди -7Н2О 0.01 г Сульфат марганца (II) -7Н2О 0,01 г Сульфат железа (II) -7НгО 0,01 г 13320 12 о 1000 мл водопроводной воды. Величину рН питательной среды устанавливают перед стерилизацией до 5,2. Посевную культуру перемешивают при 25°С с 5 числом оборотов 750 мин" и при этом аэрируют количество воздуха 300 л/час. Ферментацию продолжают в течение 144-168 часов и прекращают после достижения максимальной концентрации циклоспорина. 10 Из 4,8 литра ферментационного бульона, который к концу ферментации содержит 500/ ІГ/ МЛ комплексного циклоспорина, выделяют циклоспорин А следующим образом. 15 Клетки удаляют из ферментационного бульона фильтрованием, прилипшее на клетках содержание антибиотика вымывают 2 х 1 литром метанола. Из промывочной жидкости метанол удаляют при попижен20 ном давлении и активное вещество экстрагирую т из концентрат а 2 х 250 мл пбутилацетата. Из фильтрата ферментационного бульона комплексный циклоспорин экстрагируют 25 2 х 500 мл п-бутилацетатом. Экстракты соединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают при пониженном давлении при 40°С. Полученный сырой продукт (19,2г) предварительно очищают методом 30 хроматографии на колонне на 100 г силикагеля 60 (размер частиц: 0,063-0,2 мм) с хлороформом;метанолом:ацетоном = 92:4:4 в , качестве элюента. Содержащие комплексный циклоспорин фракции (тонкослойная 35 хроматография на пластинах из силикагеля 60 F254, DC-алюминиевая фольга (Мерк); конструктор: гексан и ацетон в отношении 2:1, окраска: хлор и толидин) выпаривают досуха. Из остатка от выпаривания (5,28 г) 40 отделяют методом хроматографии на колонне циклоспорин. Колонна содержит 115 г силикагеля 60 (размер частиц: 0,063-0,2 мм). В качестве растворителя применяют содержание ацетона, повышающее градиент гек45 сана-ацетона. Циклоспорин А промывают содержащим 23% ацетона n-гексаном из колонны. Выпариванием содержащих циклоспорин А фракций получаю т 1 , 4 6 г циклоспорина А. 50 П р и м е р 3. Из выращенной из содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаро иозрастом 5-7 дней культуры штамма Tolypocladlum varium sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовлд55 ют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия суспензию спор. Суспензию спор применяют для посева В00 мд питательной среды 1С указанного в примере 1 состава, которая находится в колбе Эрленмейера обьемом 3 яитра и которая предварительно 13 была стерилизована. Колбу встряхивают в аппарате для встряхивания (340 мин" , отклонение 3.5 см) при 25°С в течение 2,5 дней. Полученной культурой инокулята засевают 5 литров питательной среды РСзПитательная среда находится в лабораторной установке для ферментации обьемом 10 л и была предварительно стерилизована при 121°С в течение 45 минут. Состав питательной среды FC3 Сорбоза 60 г Трипказин 40 г Мочевина ' 2г Сульфат аммония 12 г Нитрат натрия 3г Кислый фосфорнокислый калий 2г Хлористый калий . 0,5 г Сульфат магния -7НгО 0,5 г Сульфат марганца (II) -7Н2О 0,01 г Сульфат железа (II) -7Н2О 0,01 г D 1000 мл водопроводной воды . Посевную культуру поддерживают термостатом при 25°С, перемешивают (1000 мин' ) и аэрируют 300 литрами/час воздуха. Культуру ферментируют 120-168 часов, после этого ферментационный бульон по микробиологичес ким измерениям вел ичин содержит 600 //г/мл комплексного циклоспорина. Из одного литра ферментационного бу л ьон а опис ан ным в прим ер е 2 способом получают 310 мг циклоспорина А. П р и м с р 4. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Tolypocladium varium sp. nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия суспензию спор. Суспензию спор применяют для посева 500 мл питательной среды 1С указанного о примере 1 состава, которая находится в колбе Эрленмейера объемом 3 литра и была предварительно стерилизована. Колбу встряхивают в аппзрэте для встряхивания (340 мин* , отклонение 3,5 см) при 25°С в течение 3 дней. Полученной культурой инокуллта засевают 5 литров питательной среды Fd Питательная среда находится в лабораторной устанопке для ферментации объемом 10 литроо и она была предварительно стерилизована при 121°С в течение 45 минут. Состав питательной среды FC4 Мальтоза 80 г Трипказин 40 г 1332Q 5 14 Мочевина Сульфат аммония Нитрат натрия Кислый фосфорнокислый калий Хлористый калий Сульфат магния -7Н2О 2г 12 г 10 Сульфат меди (I!) -7Н2О Сульфат марганца (И) -7Н2О Сульфат железа (II) -7НгО в 1000 мл водопроводной ЕОДЫ . Зг 2г 0,5 г 0,5 г 0,01 г 0,01 г 0,01 г Питательную среду перед стерилизацией устанавливают до величины рН 5,2. Посевную культуру подвергают ферментации при 25°С и при перемешивании (1000 15 мин") и аэрации (300 л/час) в течение 144 часов. В конце ферментации ферментационный бульон по микробиолоіическим измерениям величин содержит G20 рг/мп комплексного циклоспорина. Из одного лит20 ра ферментационного бульона описанным о примере 1 способом получают 305 нг циклоспорина А. П р и м е р 5. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой 25 экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Tolypocladlt'm varium sp. nov.Cy/93 (MCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия суспензию спор. Суспензию спор 30 применяют для засевания 500 мл питательной среды 1С указанного в примере 1 состави, которая находится в колбе Эрленмейера обьемом 3 литра. Колбу встряхивают при 25°С на вибрационной машине с мельнич35 ным ситом (430 мин' , отклонение 3,5 см) в течение 2 дней. Полученной культурой инокулята засевают 5 литров питательной ере-. ды FCi, Питательная среда находится в лабораторной установке для ферментации 40 объемом 10 литров и она была предварительно стерилизована при 121°С в течение 45 минут. Посевную культуру подвергают ферментации при 25°С при перемешивании (750 мин"1) и аэрации (300 л/час). В 96-й час 45 добавляют 2% отдельно стерилизованной мальтозы, затем производят ферментацию до 144-го часа. Ферментационный бульон содержит к этому моменту по микробиологическим измерениям величин 950 |мг/мл 50 комплексного циклоспорина. Из 2,8 литра ферментационного бульона описанным а примере 2 способом выделяют 2,75 г циклоспорина А. 55 Toiypocladiutn Tolypociadiuni Tolypocladium Tolypocladium geodes vanum CY/93 cylindrosporum cyiindrosporum C3S 717.70 CBS 721 70CBS 718.70 Toiypociadium geodes 722.70 Trichcderma poiysporum ATCC 16641 Cyfindrocarpon lucfdum NRRL5760 Разложение целлюлозы Воздушный мицеллий Ч-++ зеленый или голубоватоэел. Красный растворимый пигмент Коричневый пигмент на железопептоновом агаре Темно-коричи. пигмент на синт. глицерин-агаре Усваиваемость сахарозы Усззиваемость инулина Рост при 5°С Рост при 37°С Стойкость к ЄО-мин. нагреву при 50°С Получение кислоты из ++ЧО -г-Н ГЛЮКОЗЫ Усваиваемость Na-салицилата Усваиваемость Na-малоната Усзаиваемость Na-тартрата Лиловый растворимый ! пигмент на тиоозин-лейцинзгаре ел н + 13320 Упорядник Замовлення 4109 " Техред М.Моргентал Коректор Л. Фїль Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна, 101