Спосіб одержання оксикислот або їх лактонів

союз советских СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК -SIL (5D4 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ !253432 A3 С 12 Р 1/02//А 61 К 35/70 (С U V 1/02, С 12 R 1:66). ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21) (22) (31) (32) (33) (46) (7О 2935800/30-.15! 13.06.80 77807 21.09.79 " US . 23.08.86. Бюл. № 31 Мерк энд Ко., Инк. (US) соон он путем ферментации питательной среды мтаммом A s p e r g i l l u s t e r r e u s ATCC № 20542 с последующим выделением ука (72) Ричард Л. Монагэн, Альфред В. Альберте (US), Джордж Альберс-* Сконберг (СН), Генри "Йошуа, Мария Б, Лопез и Карл Х.Хоффман (US)і (53) 615.779.932 (038,8) (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИКИСЛОТ ИЛИ И ЛАКТОНОВ общих формул . Х СООН ОН эанньгк соединений из фермеятацмонной смеси экстрагированием растворителем и последовательной хроматографией. ьо > РЦФ-к І 1253432 * Изобретение относится к способу ществ, обладающих гипохолестеремиполучения новых лекарственных веческой активностью, общих формул СНз Эти соединения подавляют биосинтез холестерина и могут быть использованы для лечения атеросклероза, гиперлипемии и других подобных заболеваний, а также в качестве противоплесневых агентов. Оксикислоты или их лактоны получают путем ферментации питательной среды штаммом Aspergillus terreus АТСС № 20542 с последующим выделением соединении из ферментационной смеси экстрагированием растворителем и последовательной хроматографией. Штамм AspergiUus terreus (обозначенный MF-4845) в собрании культур (фирма Мерк энд Ко., Инк., Ревей, Нью-Йорк) помещен на постоянное хранение в коллекцию Американского Собрания Видов Культур, 12331, Паркалун Драйв, Роквилл, Мэриленд 20852 и получил помер по каталогу АТСС № 20542. Морфологическая характеристика микроорганизмов АТСС № 20542 аналогична морфологическим характеристикам рода Aspergillus. В результате сравнения с известными видами установлено, что штамм принадлежит виду Aspergillus terreus. 35 40 45 50 Выращивание этого штамма с целью получения новых соединений осуще55 ствляется в водной среде, обычной для получения других продуктов ферментации. Такая среда содержит источники углерода, азота и неорганичес кие соли, которые устаиваются микро- , организмами. Углеводы, такие как сахара, например глюкоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, ксилоза, манитол и т.п., крахмалы, такие как крахмал зерна, например овса, риса, кукурузный крахмал, кукурузная мука крупного помола и т.п., можно использовать, как по отдельности, так и в комбинации , в качестве источников усваиваемого углерода в питательной среде. Точное количество источника или источников углеводов, которое используется в среде, зависит частично от других ингредиентов, содержащихся в среде, но в общем случае количество углеводов обычно варьируется в пределах от 1 до 6 вес.% среды. Источники углерода можно использовать по отдельности или несколько таких источников углерода используется в комбинации. В качестве источников азота в процессе ферментации можно использовать протеиновые материалы. К соответствующим источникам азота относятся, например, гидролизаты дрожжей, первичные дрожжи, мука крупного помола соевых бобов, мука семян хлопка, гидролизаты казеина, насыщенный ликер кукурузы, растворимые вещества из дистиллятора или томатная паста и т;п. Источники азота используются либо по отдельности, либо в комбинации в количествах от 0,2 до 6 вес.Х от веса водной среды. 1253432 К питательным неорганическим соподвергается центрифугированию или лям, которые можно использовать в фильтруется. среде для выращивания культуры, отноДля реализации в более значительсятся обычные соли, содержащие натных масштабах ферментация осущестрий, калий, аммоний, кальций, фосфат, 5 вляется в подходящем резервуаре,снабсульфат, хлорид, карбонат и другие женном мешалкой и средствами для подобные ноны. Они также могут соаэрации средь' Ферментации. В соотдержать следы металлов, таких как ветствии с предлагаемым способом кобальт, марганец, железо и магний. питательная среда загружается в реФерментация осуществляется при ю зервуар и стерилизуется при помощи нагревания примерно до 120°С. После 20-37 °С. Однако с целью получения охлаждения стерилизованная среда оптимальных результатов ферментация прививается предварительно выращен- ' осуществляется при 22-ЗО°С. рН питаными семенами (потомством) продуцительной среды, предназначенной для рующей культуры и процесс ферментакультивирования Aspergillus и полу- J5 ции продолжается в течение» напричения новых соединений, может варьимер, 3-5 дней. Одновременно осущестроваться от 6,0 до 8,0. вляется перемешивание и/или аэрация Хотя новые соединения вырабатыпитательной среды и поддерживается ваются культурой как на поверхности, так и в погруженном состоянии, про- 20 температура примерно 28°С, Этот способ биосинтеза новых соединений цесс ферментации осуществляется в предназначен, в частности, для полупогруженном состоянии. В небольших чения больших количеств. масштабах ферментация в общем случае осуществляется при помощи внесения Соединения известным способом на соответствующую питательную ере- 25 выделяются из бульона для ферментаду культуры Aspergillus и затем, ции. после переноса питательной среды с Соединения I и II можно подпривитой культурой в среду для провергнуть гидролизу с основаниями, дуцирования, ферментация осущесттакими как КаОН, чтобы получить совляется при постоянной температуре ли, такие как соли натрия соедине50 около 28°С в течение нескольких ний III и IV. Используя основания с дней при периодическом встряхивании. другими приемлемыми с фармацевтической точки зрения катионами, можно Ферментация инициируется в степолучить соли этих катионов. Аккурилизованной колбе со средой при ратное подкисление солей дает оксипомощи одной или нескольких стадий 35 кислоты III и IV, которые можно развития семян. Питательной средой превратить в соединения I и II при для стадии семени может быть любая кислотных значений рН. Обрабатывая подходящая комбинация источников соединения I н II при помощи кисуглерода и азота. Колба с семенами лотного или щелочного катализа с выдерживается в камере при постоян- 40 металлометанолом, этанолом, про паноной температуре около 28°С в течелом или бутанолом, или с фенил, диние двух дней при периодическом метиламино или ацетиламнно алкановстряхивании или до тех пор, пока лами, получают соответствующие сложрост не достигнет удовлетворительноные эфиры соединений III и IV. го уровня и часть полученной в результате для прививки потомства втоСоединения III и IV (особенно рой стадии или среды для продуцироIII) можно выделить известным спования. Колбы с потомством промежусобом без использования хроматограточных стадий, если таковые испольфии в форме солей аммония. Такой 50 способ выделения является бопее зуются, культивируются по существу тем же способом, т.е. ч-асть содержиудобным и гораздо больше приспособмого колбы со стадии последнего лен для промышленного использовапотомства используется для прививки ния, чем хроматография. Кроме того, среды для продуцирования. Колбы с соли соединения III и IV являются привитой культурой встряхиваются 55 гораздо более активными, чем соедипри постоянной температуре в теченения I и II в реальных условиях с ние нескольких дней, а в конце.пецелью ингибирования процесса биосинриода инкубирования содержимое колб теза холестерина и в качестве проти 5 1253432 Декстроза 4 воплесневых агентов. В действительАгар 20 ности, оксикислоты (и их соли) являДистиллированная вода 1000 мл ются активными формами. СледовательрН 7,0 при помощи NaOH. но, такие соли являются более предНаклонная пробирка с привитой почтительными, в частности, при ис, культурой инкубируется в течение пользовании в форме доз. Кроме солей 11 дней при комнатной температуре. аммония; являются и соли тетраметил** Затем она хранится при -60°С в течеаммония и соли этилендиамина, натние 3-4 мес. Часть содержимого этой рия, калия, кальция, N-метнлглюкамина, лизина, аргинина и орнитина. t пробирки затем суспендируется в o 250-миллилитровую колбу Эрленмайера Указанные соединения являются без перегородки (семенная колба 2 ) , фармакологически активными соедисодержащую 40 мл среды С. Колба с нениями и могут применяться как лепривитой культурой инкубируется в текарственные препараты стоматическим или парентеральным способом в фор15 чение 24 ч при 28°С на вибраторе, совершающем 220 кол./мин (размах, ме капсул, таблеток, инъекций и т.п. 5.08 см). Приготавливаются шесть В общем случае используется стомаколб Эрленмайера емкостью 250 мл тический способ применения. Дозы без перегородки» содержащих 40 мл можно парыгровать в зависимости от 2Q среды С. Затем з каждого колбу привозраста, степени заболевания, веса вивается культура при помощи 2 мл тела и других факторов человека, но на каждую колбу содержимого семенной ежедневная доза для возрослого паколбы 2. Эти шесть колб инкубируются циента содержится в области примерв течение 48 ч при 28°С на вибратоно от 2 до 2000 мг(в предпочтитель2S ре, совершающем 220 кол,/мин (разном варианте 2-100 м г ) , которая момах 5,08 см). Затеям берут шесть двухжет быть разделена на две - четыре литровых колб Эрленмайера, содержаотдельные дозм. При необходимости щих среду F в объеме 500 мл, и в можно использовать н более высокие каждую колбу прививается культура дозы. при помощи содержимого семенной колСоединения можно также исполь30 бы 3. Среда F имеет следующий сосзовать в качестве противоплесневых тав, г: агентов. Насыщенный кукурузный 15 • . П р и м е р t. Ферментация.Пюг>бирка с лмофилиэованной культурой Крахмал СРС 20 Aspergillus terreus АТСС № 20542 Кукурузная мука грубого помола 1 35 открывается в стершіьшлх условиях Измельченные соевые бобы 4 и содержимое суспендируется в 250 мл Глюкоза 5 колбу Эрленмайера без перегородки Соевое масло 2,5 v (семенная колба 11), содержащую (NH,)ZSO одного и -ґого же экстракта бульона, эквивалентные по производительности дополнительным 60Q ran (2271 л) сырья для ферментации, соединяются в соответствии с приведенным в растворе метиленхлорида. Половина этого раствора используется для дальней 1а 13 1 253432 . тей хроматографии на силикагеле. Исре 5,23 мг/мл CHjCN. Это значение следование небольшой порции показыполучено при помощи измерения длины вает, что общее содержание твердых волны линии натрий-D. 13 частиц составляет 325 г. Раствор обС ЯМР химические сдвига рабатывается 40 г обесцвеченного уг- s (CDClj), ррм: лерода, фильтруется и лепешка про11,8; 14,9, 16,5; 21,1; 23,Г, мывается метиленхлоридом. Соединен26,7 (2С); 30,9; 31,3, 33,0; 35,7; ные фильтрат и промывочные растворы 35,9; 37,4; 48,5; 38,6; 41,9 (2С); концентрируются под вакуумом до мас62,3; 70,1; 76,5; 131,0; 132,6, лянистого остатка. Остаток вновь to 171,2 и 176,7. растворяется в 800 мл смеси этилацеНа основании этих и других данных тат-метнленхлорнд (30-70 об./об.) и можно предположить, что продукт имераствор превращается в штамм добавет следующую химическую с т е р е о лением 225 г силикагеля. Шламм заструктуру гружается в верхнюю часть слоя сили- 15 кагепя колонны с размерами 14 35 см, заполненной той же смесью растворителей. Проявление осуществляется смесью этитцстат-метиленхлорид (40/60 об./об.). Головной прогон, г о составляющий 3 л, сбрасывается, а •J ZL і JKr ft затем собираются фракции объемом 800 мл каждая. Хроматография при обращенно-фазовом заполнении. 25 Соответствующие оксикислоти (сое40 мл из 12 фракцшш хроматоградинение IV) тогда имеет структуру фической процедуры концентрируется до масла весом 500 мг и затем масло вновь растворяется в 5 мл ацетонитрила. Этот ацетонитрильный раствор 30 =\1 загружается в хроматографическую колонну из нержавеющей стали с разме/в/ рами: внешний диаметр 1,59 см, длиOb І Н на 1,8м, заполненную препаративной обращенной фазовой жидкостью для колонн хроматографии Бонданак С 18/По- 35 разил В. Колонна злюируется смесью, П р и м е р 4. Ингибирование в содержащей 55% об./об. ацетонитрила пробирке редуктаэы H G кофермента А. K и 45% и 0,05 М раствора фосфата Используется модифицированный аммония, рН 3. Объем элюирования между 1360 и 1700 мл собирается на 4Q метод Бега. Модификация •заключается в инкубировании фермента с ингибиоснове исследования показателя претором в течение 5 мин перед инициироломления. Органический растворитель ванием реакции с субстратом. При удаляется под вакуумом и остаточный работе с такими сильными ингибитораводный раствор экстрагируется этил45 ми, какими являются новые соединеацетатом. После удаления под вакуния^, стандартная процедура, в соотумом этилацетата остается 120 мг ветствии с которой фермент добавлясоединения, которое кристаллизуется ется только в смесь ингибитор-'субиз концентрированного ацетонитрилострат, дает нелинейную кинетику. вого раствора, в результате чего 50 Используя модифицированную прообразуются кристаллы MSD 883 (соецедуру, соль натрия соединения IV динение II), т.пл. 129-131 °С, моледает показатель I C W интибирования кулярный вес 406, найдено при поморедуктазы HMG-CoA, равный 7,10-М, щи спектроскопии 406, 2706, рассчи3 по сравнению с 5,4 «10~ М для соедитано 406, 2719. 55 нения M 236 В. L Оптическое вращение. эсМнСн о Характерное оптическое вращение = 148Ч6° определяют на раство D Х Ингибирование в реальных условиях синтеза холестерина (соединение I I ) . 15 1253432 . | 6 Нескольким группам самцов крыс L-M в культуре. Испытуемое соединеГолтцмана вводится либо 5% эмульфор ние в 10 мкл диметилсульфоксида дов соляном растворе, либо испытываебавляется в монослойные культуры с мое соединений в эмульфоре через 5 f*C ацетата. После 3 ч инкубиротрубку, введенную в желудок. Спустя 5 вания клетки омьшяются и С хо1 ч вводится ВП 80 MCi iA С ацетата/ лестерин экстрагируется и выделяет/кг. Затем спустя 50 мин производится при помощи тонкослойной хромася анализ крови крыс и определяется тографии на силикагеле с использовасодержания С холестерина, как мением смеси петролейный эфир - диры синтеза холестерина: '0 этиловый простой эфир-уксусная Доза, мг/кг Ингибировакислота