Спосіб дестабілізації мікробного сечужного ферменту

1. СПОСОБ ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ МИКРОБНОГО СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА посредством химической модификации, осуществляемой путем обработки сьгчуж- , ного фермента модифицирующим агентом при оптимальной температуре в водной среде, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью снижения термической стабильности, в качестве модифицирующего агента используют окислитель из группы свободных галогенов - хлор, бром или иод или их производные, в которых галоген имеет число окисления 1-3, а массовое отношение окислителя к общему содержанию белка в реакционной смеси составляет 0,01-1,0, 2. Способ п о п . 1 , о т л и ч а ю щ и й с я тем, что обработку микробного сычужного фермента окислителем ведут при рН 5-9 до уровня дестабилизации 5-11°С при потере активности до 50Z, предпочтительно до 30Z. 3. Способ по пп.1,2, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве микробного сычужного Фермента используют фермент, продуцируемый Mucor miehei. СП С о СП РГ.О-Х 1 1109054 Изобретение относится к способу дестабилизации микробного сычужного фермента, В производстве сыра молоко свертывают для отделения творога от сыворотки. Для этих целей используют продукты, содержащие реннин, который является свертывающим молоко энзимом, выделенным из желудка теленка. 10 Известно несколько заменителей 'сычужного фермента теленка, включающих известные микробные сычужные ферменты из Mucor miehei и Mucor pusillus І П . Сычужный фермент, вырабатываемый Mucor miehei, предпочтителен в сыроварении благодаря его низкой стоимости, низкой неспецифической протеолитической активности и большому сходству с реннином в отношении чув- 20 ствительности к иону кальция. Кроме того, Mucor miehei отличается стабильностью при хранении сычужного фермента, что объясняется его высокой термостабильностью. 25 Некоторые пастеризованные сыворотки используются в качестве добавок к цельному молоку, например, в виде порошка для получения обогащенного молока, например детского питания. 30 Пастеризованная сыворотка, полученная ич сыра, изготовленного с помощью сычужного фермента Mucor miehei, и м е ет незначительный уровень активности сычужного фермента благодаря высокой термостабильности последнего, проду- 35 цируемого Mucor miehei. Известен способ дестабилизации ' том описании, измерены при рН 6,0, поскольку результаты измерений зависят от значения рН. І5 Обычно обработка фермента согласно изобретению сопровождается потерей активности. Установлено, что по экономическим причинам дестабилизацию не следует проводить на стадии, 20 соответствующей потере активности в среднем более 50%, предпочтительно на стадии при потере 30% и более предпочтительно при потере активности мене 10%, 25 Обычно дестабилизацию проводят до уровня 10е С и при потере активности менее 10%. В качестве оксиляющих агентов, • которые могут быть использованы в ЗО способе согласно изобретению, игпол ьзуют гипохлорит, например гипохлорит натрия, гипобромид, например гипобромид натрия, свободный хлор, N-хлорсукцинимид, хлорамин-Т и три35 хлоризоциануровую кислоту. Окислитель должен применяться в такой концентрации,чтобы желаемая степень дестабилизации достигалась за приемлемое время, которое может 40 исчисляться от нескольких минут до 48 ч и более в тех случаях, когда протекает не прерываемая охлаждением реакция. Если концентрация окислителя слишком мала, то дестабилизация слишком слаба, если же концентрация 45 окислителя очень высокая, то потеря активности слишком велика. Оптимальные концентрации окислителя обычно соответствуют весовому соотношению между окислителем и общим количеством 50 белка, содержащегося в ферментном препарате, и составляет 3-30 ч. окислителя на 100 ч. общего белка. Если препарат микробного сычужного фермента очищен до высокой степени единичной активности, то количество окислителя может быть снижено до 1 г на 100 г общего белка. . ~ П р и м е р 1. Исходным материалом служит концентрат сычужного фермента (культуральная жидкость концентрируется до активности, примерно соответствующей 1%-ному раствору чистого фермента, 18%-ный раствор пова 1109054 образом проб разбавляют 50 мл воды ренной соли добавляется к сырому кони устанавливают рН 6,0 смесью уксусцентрату) , Этот концентрат носит ной кислоты и ацетата натрия. Разбавназвание "Реннилаза-46". ленные пробы с установленным значеВ двух сериях пробы, включающих нием рН подвергают тепловой обработпо три порции (25 м л ) , приготовленке при 55°С в течение 30 мин. ных смешением 12,5 мл реннилазы-46 и Результаты дестабилизации сычуж12.5 мл волы, устанавливают рН 7,0, ного фермента гипохлоритом в услови8,0 и 9,0 соответственно добавлением ях рН 5,0-7,0 и t° 18-2O°C приведе1 к. NaOH и к каждой из этих смесей 10 ны в табл. 4. добавляют 0,4 мл 2,25 М раствора П р и м е р З . В 600 мл реннигипохлорита натрия (NaClO), при этом лазы-46 при температуре около 10°С значения рН сохраняют постоянными на устанавливают значение рН 6,0 указанном уровне. 4 н. NaOH. Эту порцию разделяют на Первую серию, включающую три пор15 6 ч . по 100 мл в каждой. К каждой ции, помещают в холодильник на ночь из этих 6 ч. добавляют 0, 0,8, 1,2, (приблизительно на 18 ч ) . Вторую се1,6, 2,0 и 2,4 мл коммерческого рию, включающую три порции, оставля2,25 М раствора NaOCl соответственно ют при комнатной температуре на 2 ч. и устанавливают рН 7,0. Снижение значения рН измеряют по После вьщержки около 15 ч примерпрошествии указанных периодов време- 20 но при 5°С добавляют 2 мл 1 М Na a S0 3 ни. Затем порции разбавляют смешес целью устранения избыточного гипонием 0,2 мл смеси с 50 мл воды и одхлорита. Добавка сульфита не изменяновременно устанавливают значение ет стабильности сычужного фермента. рН 6,0 смесью ацетата натрия и уксусИзмеряют изменение активности. Про25 ной кислоты. бы по 5 мл разбавляют 10-кратно Влияние гипохлорита натрия на ос0,1 М ацетатным буфером с рН 6,0, таточную активность фермента рН припосле чего разбавленные пробы подведено в табл. 1. вергают тепловой обработке при 60 С Затем разбавленные образцы подв течение 15 мин. вергают тепловой обработке при 55°С Определяют остаточную активность в течение 30 мин при рН 6,0, после после тепловой обработки и вычислячего измеряют остаточную активность. ют полупериод долговечности и дестаВлияние тепловой обработки на билизацию. остаточную активность модифицированРезультаты представлены в табл,5. ного гипохлоритом сычужного фермента П р и м е р 4. Исходным материаприведено в табл. 2. лом для этого примера, служит реннелаВлияние тепловой обработки на уроза-46 без Ш NaCl. вень дестабилизации фермента, модиНа основе указанного исходного фицированного гипохлоритом, приведематериала готовят пять образцов по но в табл. 3. 40 200 г с добавкой 0,5; 10; 15 и П р и м е р 2. Значение рН трех 20£ NaCl соответственно. Устанавливапорций реннилазы-46 по 150 мл в кажют значение рН 6,0 с помощью дой устанавливают 5,0, 6,0 и 7,0 со4 н. NaOH. От каждого из пяти образцов берут ответственно. Каждую из трех порций 45 пробы по 100 мл. К каждой такой пробе разделяют на три части, к каждой из добавляют 1 мл коммерческого которых добавляют 0,8, 1,2 и 1,6 мл 2,25 н. NaOCl при 5-10вС. Затем для коммерческого 2,25 М раствора NaOCl всех пяти проб устанавливают рН 7,0 соответственно, при этом рН поддержис помощью 4 н. NaOH и хранят примервают постоянным в указанных выше зна50 но при 5°С. чениях. По истечении времени хранения Эти девять образцов хранят затем (около 20 ч) определяют изменение при комнатной температуре (22°С) в активности. Пробы по 5 мл разбавляют течение 20 ч, после чего из каждого 10-кратно 0,1 М ацетатным буфером с образца берут пробу (10 мл). К каж5S рК 6,0, после чего разбавленные продой такой пробе добавляют 0,4, 0,6 бы с установившимся значением рН подили 0,8 мл 1 М раствора Na 2 S0 3 соотвергают тепловой обработке при 60 С ветственно для удаления избытка гипов течение 15 мин. хлорита, 0,2 мл обработанных таким 1109054 8 ляют на 10 мин и затем добавляют 4 мл J М раствора Na2 S03 с целью удаления избыточного хлора. 0,2 мл пробы до и после введения хлора разбавляют 50 мл воды и устанавливают рН 6,0 смесью ацетата натрия и уксусной кислоты. Потеря активности, связанная с реакцией между сычужным ферментом и хлором, составляет 21%. После нагревания обработанного хлором сычужного фермента при 55°С в течение 30 мин остаточная активность равна 63%, что соответствует полупериоду долговечности около 45 мин или дестабилизации около 8 С. П р и м е р 8. Готовят две порции по 25 мл реннилаэы-46 и 25 г ледяной воды. Устанавливают рН 7,0 4 н. NaOH. К этим смесям добавпяют 60 и 120 мг трнхлоризоциануровои кислоты соответственно и одновременно устанавливают рН 7,0. Через 4 ч 0,2 мл полученных смесей разбавляют 50 мл воды и одновременно устанавливают рН 6,0 смесью ацетата натрия и уксусной кислоты. Разбавленные пробы подвергают тепловой обраI ботке при 55°С в течение 30 мин. П р и м е р 6. Готовят раствор Результаты дестабилизации сычужNaOBr (примерно 2 М ) , добавляя по ного фермента трихлоризоцнануровой каплям бром к 10 мл перемешиваемого кислотой приведены в табл. 8. 4 н. NaOH при охлаждении в ледяной П р и м е р 9. Две порции реннилабане. зы-46 по 25 мл смешивают с 20 г ледя25 мл реннилазы-46 смешивают с ной воды для каждой порции и устанав25 мл воды н устанавливают рН 7,5 ливают рН 7,0 с помощью 4 н. NaOH. однонормальным раствором NaOH. К 25 мл Затем к каждой из этих порций добавполученного раствора в течение часа ляют 70 и 140 мг хлорамина Т, растводобавляют 0,5 мл раствора гипобромиренного в 5 мл ледяной воды, соот40 да натрия, при этом поддерживают ветственно и одновременно устанавлирН 7,3-7,8 добавкой 1 н. НС1. вают рН 7,0. Примерно через 30 мин определяют Примерно через 2 ч 0,2 мл каждого потерю активности и термостабнльнособразца разбавляют 50 мл воды с одть. Потеря активности около 20%, основременным регулированием значения таточная активность после тепловой рН до 6,0 с помощью смеси ацетата обработки в течение 20 мин при 60 С натрия и уксусной кислоты. Разбавлени рН 6,0 составляет 14%, что соотные пробы с установленным рН подверветствует полупериоду долговечности гают тепловой обработке при 55°С в теоколо 7 мин или дестабилизации окочение 30 мин. 50 ло 8°С. Результаты дестабилизации ферменП р и м е р 7. 50 мл реннилаэы-46 та хлорамином-Т приведены в табл. 9. разбавляют 50 мл воды. Смесь охлаждают в ледяной бане и устанавливают П р и м е р 10. Реннилазу-46 Г>ез рН 7,0 с помощью 1 н. NaOH. Затем добавки NaCl 3-кратно разбавляют. вводят около 0,1 г свободного хлора, 20 мл разбавленной реннилазы-46 при этом значение рН падает до 3,8, доводят до рН 8,5 и охлаждают до Р°С, жидкость становится мутной, а затем после чего добавляют 0,7 мл 0,05 М прозрачной. Реакционную смесь оставраствора иода в 0,25 М йодистом Определяют остаточную активность (не подвергнутую тепловой обработке пробу анализируют параллельно в качестве контроля). Результаты испытаний приведены в табл. 6. П р и м е р 5. Готовят две порции смеси 25 мл реннилазы-46 и 20 г ледяной воды, устанавливают рН 7,0 с помощью 4 н. NaOH. К этим двум пор-Ю цинм добавляют 33 и 66 мг N-хлорсукцинимида соответственно, растворяют в 5 мл ледяной воды, при этом рН постоянно поддерживают равным 7,0. Через 2 ч 0,2 мл этих порций раз- t5 бавляют 50 мл воды, одновременно устанавливая рН 6,0 с помощью смеси ацетат натрия и уксусной кислоты. Остаточная активность после реакции сычужного фермента с N-хлорсук- 20 цинимидом следующая: при использовании 33 мг N-хлорсукцинимида 99%, а при использовании - 66 мг - 96,5%. Проводят тепловую обработку при 55 С в течение 30 мин при рН 6,0. 25 После этого определяют остаточную активность ї вычисляют полупериод ї долговечности и дестабилизацию. Результаты приведены в табл. 7. 1109054 калии. Примерно через 15 мин устанавливают рН 6,0 добавкой 0,1 М NaHSO. Для анализа этот образец разбавляют и одновременно устанавливают рН 6,0 с помощью смеси уксусной кис- ^ лоты и ацетата натрия. Затем обраа зец нагревают птзи 60 С в течение 30 мин. Общая активность составила 42,6%; остаточная активность после тепловой Ю обработки 35%, полупериод долговечности при 60°С и рН 6,0 20 мин, что соответствует дестабилизации примерно 5°С (контрольный образец дает такой же полупериод при 65°С). 15 П р и м е р 11. 3 г протеазы, продуцируемой штаммом микроорганизмов Mucor pusillus (питательная среда, 1:220000), растворяют в 30 мл 10%-ного NaCl и устанавливают рН 6,5 20 при 5-10°С. Добавляют 15%-ный NaOCl по 50 мкл трижды с интервалом 30 мин. После перемешивания в течение 3 ч смесь выдерживают при 4°С в течение 16 ч и затем устанавливают рН 5,0. 25 Пробы отбирают для определения активности и термостабильности. В табл. 10 представлено влияние 20-часового хранения на уровень дестабилизации . 30 П р и м е р 12. Исходным материалом служит реннилаза-46, в которую вместо 18% NaCl добавлено 6%. t л исходного материала разделяют на 4 ч по 250 мл. Температуру поддерживают 5-10°С и в трех частях устанавливают рН 6,5 с помощью 4 н. NaOH. К этим трем частям добавляют 1, 1,2 и 1,4 об.% 10,5%-ного (по весу) NaOCl соответственно, пос- 40 ле чего устанавливают рН 7,5 с помощью 4 н. NaOH и пробы выдерживают в термостате при 5°С. По истечении времени реакции (3,27 и 53 ч соответственно) отбира- 45 ют 50 мл пробы от каждой из обработанных гипохлоритом натрия частей и к каждой отобранной пробе добавляют 250 мг (0,5 вес.% к объему) активированного угля. Через день после 50 введения активированного угля пробы фильтруют и испытывают на стабильность и активность сычужного фермента (1-е определение)і Пробы поспе добавки гипохлорита выдерживают при 5°С в течение 9 дней, после чего их снова испытывают на стабильность и активность сычужного фермента (2-е определение). 10 После 4-дневной выдержки при 5*С и 2-дневной при 25°С снова определяют активность сычужного фермента и вычисляют общую активность (3-е определение) . Полученные результаты сведены в табл. 11 и 12. Из табл. 11 и 12 видно, что не наблюдается существенного изменения дестабилизации или общей активности с увеличением времени реакции от 3 ч до 53 ч. П р и м е р 13. Пять образцов реннилазы-46 по 25 мл готовят с рН 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 и 6,0 соответственно . К каждому из этих образцов добавляют 0,04 г гипохлорита натрия, при этом значения рН поддерживают на указанном уровне. Образцы хранят при 5°С в течение 6 дней, после чего анализируют остаточную активность и термостабильность при 55 а С и рН 6,0. Результаты представлены в табл.13і П р и м е р 14. Исходным материалом служит реннилаза-46, модифицированная в двух отношениях: культуральную питательную среду концентрируют до активности, соответствующей 1,6%-ному раствору чистого фермента, к неочищенному концентрату добавляют9% NaCl. Таким образом модифицируют 5952 кг реннилаэы-46 на опытной установке. Устанавливают рН 6,4 при 9°С с помощью 34%-ного NaOH и добавляют 10 кг 12,5%-ного (по объему) раствора NaOCl к ферменту. Во время этой* обработки рН увеличивается до 8,0 значение рН 7,4 устанавливают посредством 37%-ной НС1. Через 18 ч при 9-5°С значение рН снижают до 6,9. Затем добавляют 1% активированного угля при 4-5° С. Спустя 26 ч проводят фильтрацию через фильтр-пресс и снова измеряют дестабилизацию, после чего поверхностный слой концентрируют при пониженном давлении при ЗЭ°С и рН 6,7 и добавляют NaCl до общего содержания 18%. Полупериод долговечности конечного продукта равен 11 мин, а дестабилизация составляет 16°С. Таким образом, реализация изобретения обеспечивает снижение термической стабильности сычужного ферменте, сохраняя ее в необходимом интервале. II UO9O5V • t2 Т а б л и ц а 1 t Исходное значение рН рН через 2 ч Остаточная актив- . ность, X 18 ч 2 ч !8 ч 7,0 6,9 6,9 86,3 83,1 8,0 7,6 7,6 86,1 ft!,7 9,0 8,2 8,2 78,4 75,4 Т а б л и ц а 2 Остаточная активность образцов, %, серии Исходное значение рН II 7 16, 3 42 8 16, 3 4,3 9 32, 3 14,6 98,7 Эталон Т а б л и ц а Исходное значение рН Полупериод Т,»г мин^ через 2 ч 3 , Дестабилизация, через 18 ч "С, 18 ч 2 ч 7,0 11 ,5 6,5 11 8,0 11 ,5 6,6 11 12 9,0 18 .4 10,8 10 И ... J1 13 1109054 Т а б л и ц а рН Добавка NaOCl, Общая активность, мл X Дестабилизация, °С Остаточная Полупериод активность. долговечности, мин % 99,4 59,4 39,9 8 95,3 57,6 37,7 9 1,6 6,0 0,8 1.2 5,0 84,8 56,1 36,0 9 53,9 33,6 9 100 0,8 1,2 91,6 50,5 30,4 9 1,6 7,0 81,4 47,9 28,3 9 0,3 98,1 49,1 29,2 9 1,2 87,7 42,7 24,4 10 1,6 78,3 35,7 20,2 10 ь Т а б л и ц а Добавка 2,25 М NaOCl, мл 0,8 1.2 5 Изменение Остаточная Полупериод Дестабиобщей ак- активность долговеч- лизация, тшшости, после теп- ности, мин °С % ловой обработки, % і 0 +0,6 0 4 99 35 9,9 9 19 6,3 10 1.6 -4,4 14 5,3 10 2,0 -8,5 10 4,5 10 2,4 -14,9 7 3,9 11 15 Добавка 2,25 М NaOCl, мл Добавка NaCl, 1 0 Z 5 іо j , . • " * 8,9 9 32 9 8 +4,0 40 11,3 +6,6 « • 1 [ ™ +7,8 ' 46 .13,4 ;"' И В 8 • ,20 51 1 мг Полулери- Дестабиод Т 1/2 лизация, а долговечс ности, мин — L 33 41, 5 23,6 26, 4 15,6 10 > • > Т а б л и ц а Трихлоризоциан кислоты. Общая активность, X мг 8 Полупе- Дестабириод лизация, долго°С вечнос ти; мин 10 66 •• В 15,4 Т а б л и ц а 7 Добавка ОстаточN-хлор- ная аксукцин- тивность, имида, % 6 Дестабилизация, °С 31 -4,2 1 Полупериод долговечности, мня 98 1 •* ' 16 Т а б л и ц а Остаточная активность, 1 Изменение общей активности, 0 0 15 !109054 60 ; 93,0 35 9 120 31, 5 16 10 Т а б л и ц а 9 Хлорамин-Т, Общая мт Полупери- Дестабиактив- од долго- лизация, ность, вечности, °С Z мин 70 96,5 19,2 10 140 77,9 8, 5 12 17 1109054 18 Т а б л и ц а Проба/вре- Общая мя реакактивции ность, Полупериод долговечности, мин, после термообработки 10 Дестабилизация , % 0-30 мин при 50*С 24 ч 100 144-155 18-31 2 84-91 Контроль рН 6,0, 55 вС 26-22 5-11 5 Т а б л и ц а Добавка ги- Определение похлорита, об.% Дестабилизация, 11 °с • ; время реакции, ч 3 27 53 9,2 2 1 9,3 10,0 9,4 10,1 9,3 9,8 10,0 10,1 10,1 1 10,6 10,7 t0,5 2 1,4 9,1 2 1,2 9,4 10,6 10,6 10,7 Т а б л и ц а Добавка гипохлорита, об. % Определение 12 Выход (общая активность),% время реакции, ч 3 27 53 1 96 ?9 • 97 2 97 99 95 3 97 . 97 98 19 1109054 20 Продолжение табл. 12 Добавка Выход (общая активность), Определение гипохло рита, время реакция, ч об. А. Г 1.2 Г 27 3 І 53 1 90 93 92 2 9А 90 92 3 92 94 94 1 89 V 90 2 92 89 91 3 91 89 88 Т а б л и ц а Исходное значение рН 13 Остаточная Полупе- Дестаактивность, риод билидолго- зация, вечное-і °С ти, мин [ І (через . t 30 мин ' ' ПОСЛе ; , термо- і І обра- j 'ботки) ' 2,0 122 5.5 2,5 73 63 6,7 . 3.0 90 53 7,0 3.5 97 48 7.3 6.0 ВНИИПИ 23 94 49 7.2 • Заказ 5S98/45 Тираж 522 Подписное Филиал Ш Ш "Патент", г. Ужгород,ул.Проектная, 4 X