Пристрій, спосіб і прилад для кількісного аналізу щонайменше одного компонента в пробі продукту

1 Пристрій для якісного і/або КІЛЬКІСНОГО аналізу щонайменше одного компонента в пробі продукту шляхом його мічення і фіксації, що містить контейнер і кришку, з'єднані з утворенням закритого резервуара, який відрізняється тим, що закритий резервуар має вертикальну вісь, а контейнер і кришка мають коаксіальні циліндричні стінки, які при з'єднанні контейнера з кришкою розміщуються попарно одна проти одної, утворюючи щонайменше три концентричні кільцеві камери всередині резервуара у напрямі від осі, камеру впускання, призначену для введення проби і, при необхідності, мічення компонента, камеру фіксації і зчитування міченого компонента і камеру виведення, при цьому коаксіальні циліндричні стінки, які утворюють перегородки між послідовними кільцеподібними камерами, мають кожна щонайменше один отвір, при цьому кришка і контейнер в зібраному стані встановлені з можливістю повороту по відношенню один до одного навколо вертикальної осі, і отвори коаксіальних циліндричних стінок контейнера і кришки знаходяться в певних кутових положеннях таким чином, що при переміщенні циліндричних стінок кожної пари, отвори кожної пари стінок розміщуються навпроти один одного або зміщені під кутом для з'єднання або ізолювання послідовних кільцевих камер одна від одної 2 Пристрій за п 1, який відрізняється тим, що отвори в коаксіальних циліндричних стінках контейнера і кришки розташовані таким чином, що коли отвори однієї пари циліндричних стінок знаходяться навпроти один одного для з'єднання двох послідовних кільцевих камер, отвори інших пар циліндричних стінок зсунуті під кутом, щоб ІНШІ кільцеві камери були ізольовані 3 Пристрій за будь-яким з пп 1 або 2, який відрізняється тим, що містить на кришці і на контейнері засоби для встановлення їх в заданому положенні 4 Пристрій за п 3, який відрізняється тим, що засоби для встановлення в заданому положенні кришки і контейнера утворені із отвору, розмір якого відповідає довжині дуги кутового сектора циліндричної стінки кришки, в якій він виконаний, розташованій зовні і, яка створює ЗОВНІШНІЙ периферичний край резервуара, і з виступу, радіально виступного на циліндричній СТІНЦІ контейнера кришки, що встановлюється проти зовнішньої циліндричної стінки, причому виступ призначений для входу в отвір зовнішньої циліндричної стінки кришки і для переміщення в цьому отворі при повороті кришки відносно контейнера таким чином, щоб привести виступ в положення упора у два бічних КІНЦІ отвору, причому обидва положення упора виступу в отворі відповідають двом певним положенням кришки і контейнера 5 Пристрій, за п 4, який відрізняється тим, що перше положення упора виступу в отворі відповідає положенню, коли камера впускання проби сполучається з камерою фіксації і зчитування міченого компонента, причому камера виведення залишається ізольованою від інших камер, а друге положення упора виступу в отворі відповідає положенню, коли камера фіксації і зчитування сполучається з камерою виведення, а камера впускання ізольована 6 Пристрій за будь-яким з попередніх пп 1-5, який відрізняється тим, що кришка містить виступ на ЗОВНІШНІЙ стороні однієї з и коаксіальних циліндричних стінок, розташований зовні інших циліндричних стінок, для утворення зовнішнього периферичного краю резервуара, причому виступ утворює зчеплення або опору для повороту кришки навколо вертикальної осі по відношенню до контейнера 7 Пристрій за будь-яким з попередніх пп 1-6, який відрізняється тим, що резервуар містить поперечний центральний отвір, ізольований від безпосередньо примикаючої кільцевої камери і призначений для введення в нього привідного о 00 ю 59428 вертикального вала, що обертається, який приводить в обертання резервуар 8 Пристрій за будь-яким з попередніх пп 1-7, який відрізняється тим, що містить в основі кришки або в основі контейнера отвір, що входить в камеру введення 9 Пристрій за будь-яким з пп 1-8, який відрізняється тим, що резервуар містить між камерою впускання і камерою виведення декілька концентричних камер фіксації і зчитування 10 Пристрій за будь-яким з попередніх пп 1-9, який відрізняється тим, що коаксіальні циліндричні стінки, які утворюють перегородки між послідовними кільцевими камерами мають кожна три отвори, рівномірно розподілені по їх колу 11 Пристрій за будь-яким з попередніх пп 1-10, який відрізняється тим, що резервуар має форму диска 12 Пристрій за будь-яким з попередніх пп 1-11, який відрізняється тим, що контейнер виконаний з прозорого матеріалу, що дозволяє підраховувати фіксовані мічені компоненти в камері фіксації і зчитування через стінки резервуара 13 Пристрій за будь-яким з пп 1-12, який відрізняється тим, що він виконаний з пластмасового матеріалу 14 Пристрій за будь-яким з пп 1-13, який відрізняється тим, що містить в камері фіксації щонайменше один рецептор компонента, що аналізується, причому рецептор фіксується на щонайменше одній з стінок камери 15 Пристрій за будь-яким з пп 1-14, який відрізняється тим, що рецептор фіксується на СТІНЦІ основи контейнера 16 Пристрій за будь-яким з пп 1-15, який відрізняється тим, що камера впускання містить маркувальний елемент, здатний мітити компонент, що аналізується 17 Пристрій за будь-яким з пп 1-16, який відрізняється тим, що фіксований рецептор вибраний з групи, що складається з антитіл, антигенів, послідовностей комплементарних нуклеїнових кислот, істинних рецепторів, для аналізу ВІДПОВІДНО компонентів, якими є антигени, антитіла і ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнових кислот, ліганди рецепторів 18 Пристрій за будь-яким з пп 1-17, який відрізняється тим, що камера фіксації і зчитування розділена на багато кутових секторів, на яких фіксуються рецептори, ВІДМІННІ один від одного, і призначені кожний для фіксації і підрахунку окремого міченого компонента 19 Пристрій за п 18, який відрізняється тим, що кутовий сектор камери фіксації позбавлений рецепторів, який являє собою контрольний сектор, призначений для пристрою, який ініціалізує зчитування 20 Пристрій за будь-яким з пп 16 або 17, який відрізняється тим, що мічення здійснюють фізичними або ХІМІЧНИМИ засобами 21 Пристрій за п 20, який відрізняється тим, що мічення здійснюють за допомогою часток і/або флуоресцентних елементів або елементів, які можуть виявити себе флуоресцентними 22 Пристрій за п 21, який відрізняється тим, що частки мають певний діаметр, який більший або дорівнює 100-кратному діаметру компонента або компонентів, призначених для аналізу, і мають оптичні властивості, що дозволяють виявляти їх за допомогою підрахунку 23 Пристрій за п 21, який відрізняється тим, що частки мають діаметр, який дорівнює 2 мкм 24 Пристрій за будь-яким з пп 16-23, який відрізняється тим, що маркувальний елемент являє собою мічене антитіло або мічений антиген, або мічену ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеїнової кислоти, або будь-який елемент рецептора, який може бути міченим 25 Пристрій за будь-яким з попередніх пп 1-24, який відрізняється тим, що кришку обробляють таким чином, щоб уникнути шкідливих випромінювань, а зчитування здійснюють за допомогою камери CCD 26 Пристрій за п 25, який відрізняється тим, що камера CCD здатна довільно підраховувати шляхом емісії/ прийому світлового сигналу КІЛЬКІСТЬ фіксованих мічених компонентів в кожній камері фіксації і зчитування, щоб отримати цифровий сигнал виявлення 27 Спосіб якісного і/або КІЛЬКІСНОГО аналізу щонайменше одного компонента в пробі продукту шляхом мічення і фіксації, який відрізняється тим, що використовують щонайменше один пристрій згідно з одним з пп 1-26, який містить специфічні рецептори компонента, що аналізується, фіксовані в кожній камері фіксації і зчитування, і в якому а) вміщують в камеру впускання, ізольовану від інших кільцевих камер, пробу продукту, що містить мічений компонент, б) повертають кришку відносно контейнера таким чином, щоб з'єднати камеру впускання з камерою фіксації і зчитування, причому камера виведення залишається ізольованою від інших кільцевих камер, в) приводять у обертання пристрій навколо його вертикальної осі таким чином, щоб шляхом центрифугування розподілити в камері фіксації і зчитування пробу продукту, що містить мічений компонент, причому цей компонент внаслідок міцної взаємодії сполучається зі специфічними рецепторами, фіксованими в камері фіксації і зчитування, г) повертають кришку відносно контейнера таким чином, щоб з'єднати камеру фіксації і зчитування з камерою виведення, д) приводять у обертання пристрій навколо його осі, щоб з допомогою центрифугування направити надлишок проби в камеру виведення, є) промивають пристрої зсередини за допомогою мийної рідини, яку направляють шляхом центрифугування в різні кільцеві камери пристрою, відтворюючи етапи б), в), г) і д), щоб зберегти в камері фіксації і зчитування тільки мічений компонент, зв'язаний внаслідок міцної взаємодії з фіксованими рецепторами, ж) виявляють і аналізують через стінку або стінки пристрою компонент, мічений за допомогою ВІДПОВІДНОГО засобу 28 Спосіб за п 27, який відрізняється тим, що мічення кожного окремого компонента проби продукту, що аналізується, здійснюють поза пристроєм перед його введенням в камеру впускання 59428 29 Спосіб за п 27, який відрізняється тим, що мічення кожного компонента проби, що аналізується, здійснюють в камері впускання і мічення, шляхом введення спочатку специфічного маркувального елемента кожного компонента, що аналізується, переважно в сухій нефіксованій формі, а потім введення проби в ізольовану камеру впускання, щоб маркувальний елемент сполучився внаслідок міцної взаємодії з ВІДПОВІДНИМ компонентом, що міститься в пробі продукту 30 Спосіб за будь-яким з пп 27-29, який відрізняється тим, що операцію зчитування, що дозволяє виявляти фіксований мічений компонент в камері фіксації і зчитування, здійснюють з допомогою камери CCD 31 Спосіб за п ЗО, який відрізняється тим, що камера CCD здійснює довільний підрахунок шляхом емісм/прийому світлового сигналу фіксованих мічених компонентів в кожній камері фіксації і зчи тування для отримання цифрового сигналу виявлення 32 Спосіб за будь-яким з пп 27-31, який відрізняється тим, що зчитування фіксованих мічених агентів здійснюють згідно з радіусами камери фіксації і зчитування 33 Прилад для здійснення способу за будь-яким з пп 27-32, який відрізняється тим, що він містить привідний вертикальний вал, здатний обертатися, на якому розміщені пристрої за пп 1-26, засоби для підтримки на відстані один від одного вказаних пристроїв, засоби для приведення у обертання в двох напрямах вертикального привідного вала, засоби для вприскування проб продукту і мийної рідини в камери впускання, встановлених на привідному валу пристроїв, і засобу для повороту кришок пристроїв відносно контейнерів, щоб з'єднати або ізолювати різні ПОСЛІДОВНІ кільцеві камери цих пристроїв, і засіб для зчитування фіксованих мічених агентів Даний винахід відноситься до пристрою для КІЛЬКІСНОГО або якісного аналізу щонайменше одного компонента в пробі продукту, що дозволяє здійснювати імунологічний аналіз, а також до способу і приладу з використанням вказаного пристрою Були розроблені різні способи ідентифікації, виявлення або визначення КІЛЬКОСТІ речовин, що аналізуються в ХІМІЧНИХ або біологічних пробах БІЛЬШІСТЬ ЦИХ способів заснована на формуванні комплексів, отриманих внаслідок спорідненості між членами однієї пари специфічного зв'язку Ці реакції типу ліганд/рецептор, є, зокрема, результатом взаємодії між антигеном і специфічним антитілом, або результатом гібридизації між двома послідовностями комплементарних нуклеїнових кислот або феномена розпізнавання між сайтом скріплення протеїну, наприклад ферменту, гормону або іншої біологічної частки, і и лігандом, субстратом або рецептором Утворення комплексу внаслідок спорідненості дозволяє виявити присутність шуканої речовини, що аналізується в пробі Ця речовина, що аналізується при необхідності може бути визначена КІЛЬКІСНО у випадку, якщо можливо ВІДДІЛИТИ комплексні форми від форм, що залишилися у вільному вигляді, або виміряти міру зайнятості специфічних лігандів речовини що аналізується Такий метод виявлення і визначення КІЛЬКОСТІ речовини, що аналізується, присутньої в пробі, що знаходиться ІНОДІ у вигляді СЛІДІВ, представляє великий інтерес для дослідницьких або аналітичних лабораторій, зокрема, для лабораторій КЛІНІЧНОГО або біологічного аналізу Однак для використання їх в повсякденній практиці необхідно, щоб такі методи могли застосовуватися одночасно на великій КІЛЬКОСТІ проб Крім того, часто буває необхідно виконати декілька тестів на одному і тому ж зразку Тому в більшості випадків протоколи звичай них аналізів, що проводяться вручну, включають в себе декілька послідовних реакцій і етапів Ці численні тести виконуються на серійних зразках в дуже великих центрах, де за один день доводиться тестувати декілька десятків тисяч зразків Для виконання численних тестів потрібно досить багато часу Крім того, необхідність виконання послідовних операцій може привести до помилок в результатах Таким чином, досить швидко виникла проблема автоматизації проведення тестів такого типу і для її рішення були розроблені різні пристрої для автоматизації або, принаймні, для спрощення вищеназваних послідовних етапів БІЛЬШІСТЬ ЦИХ пристроїв залишаються відносно складними або пристосованими до виявлення одного типу речовини (клітини або молекули), що аналізується або ж дозволяють виконувати тільки ЯКІСНІ аналізи Такі пристрої, зокрема, описані в документах ЕР 0339277 і ЕР 0426729 Зокрема, в патенті ЕР 0339277 описується пристрій для проведення послідовних аналітичних реакцій при визначенні КІЛЬКОСТІ речовини, що аналізується в рідкому зразку, який досліджується з використанням аналітичних реакцій між речовиною, що аналізується і аналітичними реактивами, які взаємодіють з речовиною, що аналізується для отримання ВІДПОВІДІ, яка отримується в залежності від речовини, що аналізується Цей пристрій містить закритий резервуар, що має горизонтальну вісь обертання Закритий резервуар обмежений зовні циліндричною стінкою і містить всередині дві концентричні стінки у вигляді ложки, які визначають між собою зону впускання проби Між стінками в формі ложки і циліндричною периферичною стінкою знаходиться декілька реакційних зон, в які вміщені спеціальні аналітичні реактиви Згідно З ЦИМ патентом, зразок вводять через вхідний канал в камеру впускання, утворену між стінками в формі ложки і що виходить до реакцій 59428 них зон При обертанні названого резервуара ВІДПОВІДНО до рушення "маятника" навколо його горизонтальної осі, рідкий зразок під дією сили тяжіння перетікає в реакційні зони, де він вступає у взаємодію з реактивами, потім він переміщається в зону для дослідження, розташовану в центрі резервуара Такий пристрій був розроблений, головним чином, для того, щоб уникнути центрифугування продукту під час КІЛЬКІСНОГО аналізу Також, з патенту JP НЕІ-5 215 750 відомий пристрій для виявлення і аналізу клітинних популяцій, який містить горизонтальний колоподібний металевий диск, що обертається навколо вертикальної осі Цей відкритий диск покритий антитілами, Диск приводять у обертання навколо вертикальної осі таким чином, щоб проба, введена в його центр, рівномірно розподілялася під дією відцентрової сили на диску Подальші етапи промивання виконуються таким же чином шляхом введення в центр диска промиваючої рідини, яка при обертанні диска виводиться до периферії, промиваючи поверхню, на якій зафіксований компонент, що визначається Для рекуперації миючої рідини передбачений резервуар, який вміщений під диском Нарешті, з документа WO 94 25 159 відомий пристрій для здійснення якісного і/або КІЛЬКІСНОГО аналізу конкретного компонента в пробі продуктів, який містить практично колоподібний контейнер, встановлений з можливістю обертання на пусковому валу в його центрі, в якому влаштовані камери для тестування, розташовані по радіусах контейнера і, які мають градієнт ЩІЛЬНОСТІ У центральній частині контейнера передбачена кільцева камера для центрифугування, яка сполучена з кожною тестувальною камерою Кільцева камера для центрифугування може бути розділена на дві частини, які сполучаються між собою через верхній отвір Обмежувальна стінка першої частини камери для центрифугування нахилена таким чином, що переміщення речовини з першої частини у другу частину здійснюється переливанням за обмежувальну стінку, через з'єднувальний отвір Точно також і обмежувальна стінка другої частини камера центрифугування нахилена таким чином, що переміщення суміші в кожну камеру для тестування здійснюється шляхом переливання через з'єднувальний отвір між другою частиною камери центрифугування і названими камерами для тестування Кут нахилу обмежувальної стінки другої частини камери центрифугування більше кута нахилу обмежувальної стінки першої частини, тому при центрифугуванні речовина переміщується спочатку від першої частини камери центрифугування, розташованою поруч з віссю обертання контейнера, у другу частину камери центрифугування, а потім переміщується в камери для тестування В основу винаходу поставлена задача створення нового аналізуючого пристрою, простого по конструкції і у використанні, який може працювати індивідуально з мінімальним числом операцій і дозволяє проводити аналіз в безпосередній бли 8 зькості від місця взяття проби продукту, який містить певний компонент, що аналізується, оптимізованої конструкції і, крім того, який дозволяв би провести серійні дослідження на невеликих кількостях проб Зокрема, згідно з винаходом, пропонується пристрій для виконання якісного і/або КІЛЬКІСНОГО аналізу щонайменше одного певного компонента в пробі продукту, шляхом мічення і фіксації, який містить контейнер і кришку, з'єднані між собою, для утворення закритого резервуара Пристрій характеризується тим, що закритий резервуар має вертикальну вісь, контейнер і кришка мають коаксіальні циліндричні стінки, які при монтажі встановлюються парами одна проти іншої, утворюючи щонайменше три концентричні кільцеві камери всередині резервуара, а саме, одну камеру впускання біля осі, призначену для введення проби і, у разі необхідності, мічення компонента, камеру фіксації і зчитування названого міченого компонента, і камеру виведення, при цьому циліндричні коаксіальні стінки, які створюють перегородки між послідовними кільцевими камерами, містять кожна щонайменше один отвір, а з'єднані між собою кришка і контейнер встановлені з можливістю обертання відносно один одного навколо вертикальної осі, а отвори циліндричних коаксіальних стінок контейнера і кришки розміщені в певних кутових положеннях, таким чином, що при переміщенні циліндричних стінок кожної пари однієї відносно іншої, отвори кожної пари стінок здатні займати положення одна проти іншої або під кутом, щоб з'єднувати або ізолювати один від одного ПОСЛІДОВНІ кільцеві камери ВІДПОВІДНО ДО переважного варіанту втілення пристрою отвори, передбачені в циліндричних коаксіальних стінках контейнера і кришки, розташовані таким чином, щоб отвори однієї пари циліндричних стінок знаходилися навпроти один одного для з'єднання двох послідовних кільцевих камер, а отвори інших пар циліндричних стінок розташовувалися зсунутими під кутом таким чином, щоб ІНШІ кільцеві камери залишалися ізольованими ВІДПОВІДНО ДО ІНШИХ варіантів втілення при строю згідно з винаходом, на кришці і на контейнері є засоби для встановлення їх в заданому положенні Кришка має виступ на ЗОВНІШНІЙ поверхні одної з коаксіальних циліндричних стінок, розташованих зовні інших циліндричних стінок з утворенням зовнішнього периферичного борта резервуара, причому цей виступ утворить захват або опору, які забезпечують обертання кришки навколо вертикальної осі по відношенню до контейнера Пристрій згідно з винаходом має поперечний центральний отвір, ізольований від безпосередньо примикаючої кільцевої камери, і призначений для введення в нього вертикального привідного вала, що обертається, який приводить у обертання названий резервуар В основі кришки або в основі контейнера може бути передбачений вхідний отвір в камеру впускання ВІДПОВІДНО ДО ОДНОГО З варіантів пристрою пе редбачено, щоб резервуар містив між камерою 59428 впускання і камерою виведення декілька концентричних камер фіксації і зчитування Пристрій згідно з винаходом має оптимізовану ергономічну форму Зокрема, резервуар має форму диска Переважно, контейнер пристрою виконаний з прозорого матеріалу, що дозволяє зчитувати мічені фіксовані компоненти в камері фіксації і здійснювати зчитування через стінки резервуара Кришка може бути непрозорою або обробленою таким чином, щоб усунути ШКІДЛИВІ випромінювання, причому зчитування можна проводити за допомогою камери CCD Пристрій згідно з винаходом переважно містить в камері фіксації щонайменше один рецептор компонента, що аналізується, причому рецептор фіксується в камері Потрібно зазначити, що під рецептором і лігандом загалом розуміють два елементи, які сполучені міцними взаємодіями, наприклад, мова може йти як про пару антигени/антитіла, так і про пару нуклеїнова кислота/ комплементарна нуклеїнова кислота або ж істинний ліганд і рецептор або про ІНШІ МІЦНІ взаємодії Фахівцеві в цій області техніки добре ВІДОМІ способи, що дозволяють фіксувати протеїни (наприклад, антигени, антитіла) або нуклеїнові кислоти на поверхнях з пластику або навіть з скла Мова йде про методики фіксації компонентів, що використовуються в цей час цього типу на стандартних чашоподібних пластинах, які використовуються, наприклад, в тесті ELISA, або які можуть бути адаптовані в залежності від типу полімерного матеріалу, що використовується Переважно рецептор закріпляють на дні контейнера у вигляді моношару таким чином, щоб зробити зчитування більш легким і зручним Дійсно, якщо засобом зчитування є камера CCD, то випромінювання буде проходити через дно контейнера і буде або не буде модифіковане внаслідок присутності міченого компонента, потім буде рекуперовано після другого проходу через дно контейнера Методика, що використовується багато в чому схожа на спосіб імунологічного аналізу, який називається "сендвіч", коли виявлений елемент вступає в реакцію з рецептором, наприклад, з антитілом, і сам мітиться іншим елементом, що його розпізнає, який мас або фізичну мітку, тобто частки, або хімічну мітку, наприклад, за допомогою флуоресцентних елементів або тих, які можна зробити флуоресцентними У зв'язку з цим згідно з переважною характеристикою винаходу, частки, призначені для мічення, мають певний діаметр, переважно більше або рівний 100 діаметрам компонента, що аналізується або компонентів, і мають оптичні властивості, що дозволяють їх виявляти шляхом підрахунку Під виразом "мають оптичні властивості" розуміється той факт, що названі частки здатні все світлове випромінювання, що випускається системою виявлення, або його частину, направляти в свій бік Хоч компонент можна мітити перед його введенням в пристрій, переважно, щоб призначений для мічення елемент, здатний мітити компонент, що аналізується, вміщувався в камеру впускання, 10 наприклад, в сухій, нефіксованій формі Мова може йти, наприклад, про мічені антитіла, що розпізнають один з епітопів антигену, що аналізується, причому інше антитіло фіксується в камері фіксації і мічення У пристрої згідно з винаходом фіксований рецептор вибраний з групи, що складається з антитіл, антигенів, послідовностей комплементарних нуклеїнових кислот, істинних рецепторів для аналізу специфічних компонентів, якими є антигени, антитіла, ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнових кислот, ліганди названих рецепторів При імунологічних аналізах вважають за краще використовувати антиген або мічене антитіло, щоб визначити додатковий елемент і фіксувати інший додатковий елемент в камері фіксації і зчитування Можливо також здійснювати множинний аналіз, що дозволяє, при необхідності, визначати КІЛЬКІСНИЙ ЗМІСТ декількох антигенів або декількох антитіл Для цього досить, щоб камера фіксації і зчитування була розділена на багато кутових секторів, в яких фіксуються ВІДМІННІ один від одного рецептори, кожний з яких призначений для фіксації і для зчитування іншого міченого компонента Для цього треба, і це є особливо переважним варіантом винаходу, щоб один з кутових секторів камери фіксації залишався без рецепторів і являв собою контрольний сектор, який би ініціалізуючому зчитуванні названого пристрою виставляв нуль Зчитування згідно з винаходом може виконуватися за допомогою камери CCD, яка може бути об'єднана в систему з інформаційним пристроєм, який дозволить відтворювати результати аналізу кожного з елементів в залежності від зчитувань, зроблених в різних секторах ВІДПОВІДНО ДО особливо переважної характеристики пристрою згідно з винаходом, камера CCD здатна підраховувати довільним образом, шляхом емісії прийому світлового сигналу, КІЛЬКІСТЬ мічених фіксованих компонентів в кожній камері фіксації і зчитування, щоб отримати цифровий сигнал виявлення Це відбувається при використанні часток або мікросфер для мічення одного або декількох компонентів, що аналізуються в пробі, причому ці частки мають, переважно, розмір, рівний 100кратному розміру шуканих молекул, і здатні відображати все або частину світлового випромінювання, що направляється на частки, причому відображене випромінювання відповідає КІЛЬКОСТІ явищ відображення на частках, яку здатна зареєструвати камера CCD з подальшою передачею на інформаційний пристрій, який видає результат в абсолютних значеннях і в реальному часі явищ, що реєструються Згідно З винаходом запропонований також спосіб КІЛЬКІСНОГО і/або якісного аналізу щонайменше одного компонента в пробі продукту шляхом мічення і фіксації Цей спосіб відрізняється тим, що використовують щонайменше один пристрій, який містить специфічні рецептори компонента, що аналізується, фіксовані в кожній камері фіксації і зчитування, в якому а) пробу продукту, що містить мічений компо 11 59428 12 нент, вміщують в камеру впускання, ізольовану від находом, інших кільцевих камер, Фіг 5 - дві діаграми виявлення компонента в б) повертають кришку відносно контейнера тасироватці за допомогою флуоресценції і підрахунким чином, щоб камера впускання сполучилася з ку мічених мікросфер, згідно з винаходом, кожною камерою фіксації і зчитування, а камера Фіг 6 - діаграми виявлення компонента в сировиведення залишилася ізольованою від інших ківатці методом ELISA і за допомогою підрахунку льцевих камер, мікросфер, згідно з винаходом в) пристрій приводять у обертання навколо йоПристрій для виконання якісного і/або КІЛЬКІСго вертикальної осі таким чином, щоб розподілити НОГО аналізу щонайменше одного компонента в шляхом центрифугування в кожній камері фіксації і пробі продукту шляхом мічення і фіксації показазчитування пробу продукту, що містить мічений ний на фіг 1-4 компонент, при цьому названий компонент сполуТакий пристрій використовують переважно для чається шляхом міцної взаємодії зі специфічними виконання імунологічного аналізу, виявлення мікрецепторами, фіксованими в кожній камері фіксароорганізмів, аналізу забруднюючих речовин, а ції і зчитування, також для виявлення окремої ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнової кислоти г) повертають кришку відносно контейнера таким чином, щоб з'єднати камеру фіксації і зчитуПристрій містить контейнер 110 і кришку 120, вання з камерою виведення, які монтуються один з одним з утворенням закритого резервуара д) пристрій приводять у обертання навколо осі таким чином, щоб направити шляхом центрифугуКонтейнер 110 і кришка 120 мають круглу фовання надлишок проби в камеру виведення, рму з центральною віссю симетрії 101, тому, коли вони сполучені, утворений таким чином закритий є) пристрій промивають зсередини за допоморезервуар має форму диска з вертикальною віссю гою миючої рідини, яка прямує завдяки центрифу101 гуванню в різні кільцеві камери пристрою із здійсненням попередніх стадій б), в), г) і д) таким Контейнер 110 і кришка 120 мають основу ВІДчином, щоб в кожній камері фіксації і зчитування ПОВІДНО 110а І 120а, на яких розташовані коаксіазберігався тільки мічений компонент, пов'язаний льні циліндричні стінки 111, 112, 113, 121, 122, 123 шляхом міцної взаємодії з фіксованими рецепто(у варіанті, що описується їх число 3) При з'єдрами, нанні контейнера 110 з кришкою 120 ці коаксіальні циліндричні стінки розташовуються парами одна ж) мічений компонент виявляють і аналізують проти іншої, утворюючи всередині закритого резечерез стінку або стінки пристрою рвуара три концентричні кільцеподібні камери 102, Спосіб згідно з винаходом є автоматизованим 103, 104 способом широкого спектра, він може застосовуватися при виявленні і підрахунку речовинУ напрямі від осі циліндричні стінки утворять мішеней, як у вигляді молекул, так і у вигляді часспочатку камеру 102 впускання, призначену для ток везикул або клітин введення проби продукту і у разі необхідності для мічення компонента, що аналізується, наприклад, Згідно З винаходом запропонований також антитіла, міченого часткою в сухому вигляді, потім прилад для реалізації вказаного способу, що харакамеру фіксації і зчитування міченого компонента ктеризується тим, що містить вертикальний приві103, що містить, наприклад, фіксоване антитіло в дний вал для приведення у обертання, на який основі контейнера, і потім вивідну камеру 104 насаджені пристрої згідно з винаходом, засоби для підтримки названих пристроїв на відстані один від У варіанті, що описується, кришка має діаодного, засоби для приведення у обертання в метр, трохи перевищуючий діаметр контейнера, двох напрямах названого вертикального привіднощоб вона могла встановлюватися на контейнері го вала, засоби вприскування проб продукту і миЦиліндрична стінка 123 кришки 120, розташована ючої рідини в камери впускання названих пристрозовні по відношенню до інших коаксіальних цилінїв, насаджених на привідний вал, і засоби для дричних стінок 121, 122 утворить ЗОВНІШНІЙ периповороту кришок пристроїв відносно контейнерів феричний край названого резервуара Коаксіальні таким чином, щоб з'єднувати або ізолювати ПОСЛІциліндричні стінки 111, 112, 113 контейнера 110 ДОВНІ кільцеві камери, і засіб зчитування мічених розміщені навпроти внутрішніх сторін коаксіальних фіксованих агентів (речовин) циліндричних стінок 121, 122, 123 кришки 120 Прилад, що пропонується дозволяє автоматиВнутрішні коаксіальні циліндричні стінки 111, чно при використанні пристрою аналізувати різні 112 і 121, 122 контейнера 110 і кришки 120, які компоненти однієї і тієї ж проби, або один і той же утворюють перегородки між послідовними кільцеконкретний компонент в декількох пробах різних подібними камерами 102, 103, 104, мають кожна продуктів щонайменше один отвір 111а, 112а і 121 а, 122а Надалі винахід пояснюється описом переважКожна з коаксіальних циліндричних стінок 111, них варіантів втілення винаходу з посиланнями на 112, 121, 122 має три отвори 111а, 111Ь, 111с, супроводжуючі креслення, на яких 112а, 112Ь, 112с, 121а, 121b, 121c, 122a, 122b, 122с, рівномірно розподілені по периметру кожної Фіг 1 зображає кришку пристрою (вигляд зверстінки і зсунуті попарно під кутом приблизно 120° ху), згідно з винаходом, кутових Фіг 2 - розріз по лінії 11-І І на фіг 1, згідно з винаходом, У представленому варіанті виконання отвори Фіг 3 - контейнер (вигляд зверху), згідно з викоаксіальних циліндричних стінок контейнера 110 і находом, кришки 120 утворені шляхом вирізування матеріалу Фіг 4 - розріз по лінії IV-IV на фіг 3, згідно з ви 13 59428 Отвори коаксіальних циліндричних стінок контейнера 110 і кришки 120 розміщені у визначених кутових положеннях і сполучені кришка 120 і контейнер 110 встановлені з можливістю повертатися по відношенню один до одного навколо вертикальної осі 101, причому при переміщенні однієї по відношенню до іншої циліндричних стінок кожної пари, що утворює перегородку послідовних кільцеподібних камер, отвори кожної пари стінок розташовуються навпроти один одного або зсунуті під кутом для з'єднання послідовних кільцеподібних камер або ізолювання їх одна від іншої У цьому випадку отвори 111а, 111Ь 111с, виконані в циліндричній СТІНЦІ 111 контейнера 110, розташовуються ВІДПОВІДНО навпроти отворів 112а, 112Ь, 112с, виконаних в циліндричній СТІНЦІ 112 контейнера 110 Іншими словами, кожний отвір 111а, 111Ь, 111с, виконаний в циліндричній внутрішній СТІНЦІ 111 контейнера 110, розташовується навпроти ВІДПОВІДНОГО отвору 112а, 112Ь, 112с, виконаного в коаксіальній циліндричній СТІНЦІ 112, зовні названої стінки 111 Навпаки, отвори 121 а, 121Ь, 121с, утворені в циліндричній СТІНЦІ 121 кришки 120, зсунуті по відношенню до отворів 122а, 122Ь, 122с, виконаним в коаксіальній циліндричній СТІНЦІ 122 кришки 120, розташованій зовні циліндричної стінки 121 під кутом, рівним приблизно 60 градусів, щоб отвори, виконані в СТІНЦІ, не знаходилися навпроти отворів, утворених в ІНШІЙ наступній за нею коаксіальній СТІНЦІ При такому компонуванні, коли кришка 120 сполучена з контейнером 110, вона розміщується по відношенню до контейнера таким чином, що отвори однієї пари циліндричних стінок знаходяться навпроти один одного і дозволяють послідовним кільцеподібним камерам сполучатися одна з іншою, причому отвори іншої пари циліндричних стінок зсунуті під кутом, щоб дві ІНШІ подальші кільцеподібні камери були ізольовані одна від іншої Крім того, кришка 120 і контейнер 110 забезпечені засобами для встановлення їх в задане положення Згідно З описаним варіантом засоби для встановлення в задане положення кришки 120 і контейнера 110 складаються з отвору 123а, розмір якого відповідає довжині дуги кутового сектора циліндричної стінки 123 кришки 120, розташованій зовні від інших коаксіальних циліндричних стінок і, яка створює ЗОВНІШНІЙ периферичний край резервуара, і з виступу 11 За, радіально виступаючого на циліндричній СТІНЦІ 113 контейнера 110, призначеній для розміщення проти зовнішньої циліндричної стінки 123 кришки 120, причому виступ 113а може входити в отвір 123а зовнішньої стінки 123 кришки 120 і переміщатися в цьому отворі 123а при повороті кришки 120 відносно контейнера 110 до положення упора об два бічних КІНЦІ 123'а, 123"а отвору 123а Отвір 123а, виконаний у ЗОВНІШНІЙ СТІНЦІ 123 кришки 120, виконаний у вигляді виїмки, довжина якої приблизно відповідає 70 кутовим градусам Обидва положення упора, які займає виступ 11 За в отворі 123а, відповідають двом визначеним відносним положенням кришки 120 і контейнера 110 14 Перше положення упора виступу 113а об край 123'а отвору 123а відповідає положенню, при якому камера впускання 102 проби продукту сполучається з камерою 103 фіксації і зчитування міченого компонента, причому камера 104 виведення залишається ізольованою від інших камер Друге положення упора виступу 113а об інший край 123"а отвору 123 відповідає положенню, при якому камера 103 фіксації і зчитування сполучається з камерою 104 виведення і камери 102 впускання від інших камер Щоб обертання кришки 120 відносно контейнера 110 було більш легким, кришка 120 містить виступ 123Ь, радіальне виступаючий від зовнішньої сторони циліндричної стінки 123, розташованої зовні від інших циліндричних стінок, причому виступ 123Ь утворить зчеплення або опору для повороту кришки 120 навколо вертикальної осі 101 по відношенню до контейнера 110 Контейнер 110 і кришка 120 забезпечені центральним поперечним отвором 105, ізольованим від безпосередньо прилеглої кільцевої камери 102 впускання за допомогою коаксіальних циліндричних стінок 105а і 105Ь Коли кришка сполучена з контейнером, стінки 105а і 105Ь контейнера 110 і кришки 120 розташовуються одна проти іншої, і закритим таким чином резервуар має центральний поперечний отвір, ізольований двома циліндричними розташованими одна протії іншої стінками 105а і 105Ь, від безпосередньо примикаючої кільцевої камери 102 Цей центральний поперечний отвір 105 призначений для розміщення в ньому вертикального привідного вала, що обертається, який приводить у обертання резервуар Отвір 105 мас діаметр приблизно 4мм Отвори, виконані в коаксіальних циліндричних стінках контейнера 110 і кришки 105 для з'єднання кільцевих камер резервуара, мають ширину, рівну приблизно 5мм Кришка 120 (фиг 1) має на основі 120а отвір 102а, що виходить в камеру впускання 102 Він примикає до поперечного отвору 105, оскільки камера впускання безпосередньо примикає до поперечного отвору 105 Природно, можна передбачити, щоб цей отвір, що входить в камеру впускання, був виконаний в основі 110а контейнера 110 (не показано) Контейнер 110 виконаний з прозорого матеріалу, що дозволяє прочитувати мічені фіксовані компоненти в кожній камері фіксації і здійснювати зчитування через стінку основи контейнера, наприклад, за допомогою камери CCD, шляхом трансмісії і відображення випромінювання Кришка тоді може бути непрозорою, або обробленою так, щоб уникнути шкідливого випромінювання Переважно, щоб контейнер і кришка були виконані шляхом формування з пластмасового матеріалу, коаксіальні циліндричні стінки формуються разом з кришкою Для виконання пристрою згідно з винаходом може бути використаний будь-який класичний пластмасовий матеріал, що застосовується для покриття молекул Молена використати, наприклад, полістирол або, переважно, пластик ZYLAR 15 (зареєстрований товарний знак), такий пластик володіє дуже сильною адгезією як покриття Згідно З ОДНИМ З варіантів виконання аналізуючого пристрою переважно, щоб камера 103 фіксації і зчитування була розділена на безліч кутових секторів, в яких фіксуються рецептори, ВІДМІННІ один від одного, і призначені кожний для фіксації і для зчитування міченого компонента Згідно з цим варіантом особливо переважно передбачити, щоб один кутовий сектор камери фіксації був вільний від фіксованих рецепторів і утворював сектор з холостим сайтом, який при початку зчитування дає нульове значення Можна також передбачити згідно з іншим варіантом винаходу, щоб резервуар містив між камерою впускання і камерою виведення декілька інших концентричних і послідовних камер фіксації і зчитування для фіксування різних мічених компонентів Аналізуючий пристрій, що утворюється при з'єднанні контейнера 110 і кришки 120, дозволяє здійснити спосіб КІЛЬКІСНОГО і/або якісного аналізу щонайменше одного компонента в пробі продукту шляхом фіксуючого мічення Згідно З ЦИМ способом використовують, щонайменше один пристрій вищеописаного типу, що містить два елементи, контейнер і кришку, представлений на фіг 1 і 3, і сполучений з утворенням закритого резервуара, що містить специфічні рецептори компонента, що аналізується, фіксовані в камері фіксації і зчитування На першій стадії а) в камері впускання, ізольованій від інших кільцевих камер резервуара, вміщують пробу продукту, що містить мічений компонент, що аналізується Потім на стадії б) повертають кришку по відношенню до контейнера таким чином, щоб сполучилися камера впускання і камера фіксації і зчитування, при цьому камера впускання ізольована від інших кільцевих камер Потім на стадії с) приводять в обертання пристрій навколо вертикальної осі таким чином, щоб шляхом центрифугування розмістити в камері фіксації і зчитування пробу продукту, що містить мічений компонент, що аналізується, причому цей компонент за рахунок сильної взаємодії сполучається зі специфічними рецепторами, фіксованими в камері фіксації і зчитування Потрібно підкреслити, що при обертанні пристрою здійснюється перехід проби продукту з камери впускання в камеру фіксації і зчитування, а також проба перемішується всередині цієї камери, щоб мічений компонент зв'язався з фіксованими рецепторами На наступній стадії д) повертають кришку по відношенню до контейнера так, щоб з'єднати камеру фіксації і зчитування з камерою виведення, потім на стадії є) приводять > обертання пристрій навколо його осі, щоб шляхом центрифугування направити надлишок проби в камеру виведення З цією метою, як показано на фіг 3 і 4, в основі 110а контейнера 110 передбачений кругоподібний виступ 114 поблизу внутрішньої циліндричної стінки 112, яка створює перегородку між камерою фіксації і зчитування і камерою виведення Цей кругоподібний виступ 114 утворить бар'єр проти 59428 16 повернення надлишку проби, що направляється при центрифугуванні в камеру виведення, або миючої рідини, що рекуперується в цій камері, як буде описано нижче На стадії є) здійснюють декілька промивань внутрішньої частини пристрою за допомогою миючої рідини, яку направляють шляхом центрифугування в різні кільцеві камери пристрою, повторюючи попередні стадії б), в), г) і д) для видалення інших компонентів продукту, які можуть закріпитися внаслідок адсорбції на внутрішніх стінках пристрою або можуть виявитися пов'язаними внаслідок слабкої взаємодії (такого як адсорбція) зі специфічними фіксованими рецепторами в камері фіксації і зчитування Таким чином, в камері фіксації і зчитування після промивання зберігають тільки мічений компонент, пов'язаний шляхом міцної взаємодії з рецепторами, фіксованими вданій камері Тоді на стадії ж) через стшку(і) пристрою виявляють мічений компонент, пов'язаний з фіксованими рецепторами, і здійснюють якісний і/або КІЛЬКІСНИЙ аналіз міченого компонента Це виявлення може бути здійснене згідно із запропонованим способом за допомогою камери CCD Для цього треба, щоб мічення компонента, що аналізується здійснювалося фізичним або ХІМІЧНИМ шляхом з допомогою, наприклад, флуоресцентних мікросфер або мікросфер, які можуть стати флуоресцентними Зчитування фіксованих мічених агентів може проводитися по радіусах камери фіксації і зчитування Зокрема, згідно з способом, з допомогою камери CCD підраховують число фіксованих мічених компонентів в кожній камері фіксації і зчитування Це можливо при використанні в якості елементів, що маркірують компонент, що аналізується, часток або мікросфер, які приблизно в 100 раз більші, ніж шукані молекули, і сполучені з антимлом або антигеном, який потрібно виявити Для ефективного використання камери CCD віддають перевагу часткам, діаметр яких рівний 2мкм Ці мікросфери такі, що вони відображають все або частина випромінювання, яке на них направлене Вони можуть являти собою латекс або будьяку іншу речовину, яка піддається виявленню і може бути КІЛЬКІСНО визначена шляхом підрахунку Таким чином, камера С CD здатна реєструвати певне число явищ відображення і видавати ВІДПОВІДНИЙ результат в абсолютному числі фіксованих компонентів, що аналізуються Камера CCD сполучається з системою програмного забезпечення, яка на виході дає цифровий сигнал виявлення Така візуальна система здійснює підрахунок в реальному часі від декількох одиниць до 100000 мікросфер на мм кв з відніманням фонового шуму за допомогою еталонної поверхні і ВІДПОВІДНИХ алгоритмів Ця система володіє виборчою здатністю, оскільки може розпізнавати і усувати гетерогенні зображення, здатні спотворювати аналіз даних На фіг 5 і 6 показані діаграми, отримані способом виявлення за допомогою вказаного вище підрахунку і найбільш класичних способів виявлення, типу флуоресценції або методу ELISA для даного компонента, що аналізується в даній сироватці 18 17 59428 Діаграми цих фігур дозволяють перевірити, з ного міченого рецептора кожного компонента, що одного боку, чи є коректування між підрахунком аналізується в сухому нефіксованому вигляді, помікросфер і концентрацією компонента, що аналітім, на другій стадії, вводять в ізольовану камеру зується, і, з іншого боку, чи є метод підрахунку впускання пробу продукту для того, щоб мічений мікросфер згідно з винаходом більш точним, ніж рецептор внаслідок міцної взаємодії зв'язався з методи виявлення, які називаються класичними ВІДПОВІДНИМ компонентом, що міститься в пробі Зокрема, аналіз шляхом підрахунку мікросфер продукту показує динаміку більше 4 лог проти 2 лог за меЗаявлений спосіб може бути здійснений за дотодом ELISA Це є великою перевагою, тому що помогою іншого пристрою такого ж типу, щоб одзначно збільшуються межі виявлення Результати, ночасно аналізувати один і той же компонент у отримані при сильному розведенні проби, показумножині різних проб або аналізувати різні компоють, таким чином, що спосіб має чутливість на 2 ненти в одній і тій же пробі продукту лог вище ніж метод ELISA Результати, отримані З цією метою запропонований прилад, що випри слабому розведенні проби, також показують, користовує множину вказаних вище пристроїв що спосіб дозволяє здійснювати аналізи при кон(фіг 1-4), який містить вертикальний привідний центраціях речовини, що аналізується, ВІДПОВІДНИХ вал, здатний обертатися, на який встановлені порогу насичення в способі ELISA Це дозволяє аналізуючі пристрої, засоби для підтримки цих усунути або зменшити можливий вплив розведенпристроїв на відстані один від одного, засоби для ня на деякі компоненти проби, що тестуються приведення у обертання в двох напрямах названий вертикальний привідний вал, щоб здійснити Згідно З способом мічення кожного окремого центрифугування шляхом обертання названих компонента проби може бути здійснено поза припристроїв, засоби для вприскування проб і миючої строєм перед введенням проби в камеру впусканрідини в камери впускання пристроїв, і засоби для ня пристрою поворої) кришок відносно контейнерів, щоб з'єднуВ одному з варіантів мічення кожного окремого вати або ізолювати різні ПОСЛІДОВНІ кільцеві камекомпонента проби, що аналізується може бути ри названих пристроїв, і засіб для зчитування мівиконано безпосередньо в камері впускання і марчених фіксованих агентів кірування при введенні на першій стадії специфіч1233 Фіг. 2 19 59428 20 ИЗ а 102 Фіг, З 101 , 1 0 5 a 11 на 1 f uj І '«/-І И / І 113 в/ Фіг. 4 fti Г~ С •.5 коефіцієнт озведепия сироватки 1C 0M 0 ФІГ. 6 Комп'ютерна верстка О В Кураєв Підписано до друку 06 10 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна