Спосіб отримання та діабетичне застосування гіберелінів

1. Спосіб лікування діабету, його ускладнень та асоційованих станів, що передбачає призначення пацієнту, що цього потребує, сполуки формули (1) (гіберелінів) C2 2 (19) 1 3 79433 4 етер), або R7 разом з R6 утворює зв'язок (С11-С12 групи, яка складається з аналгетиків, антигіпертеподвійний зв'язок); нзивних засобів, седативних засобів, снодійних R8 представляє Н, гідроксил, меркаптан або галозасобів, ліпідознижувальних засобів, та антиінфеген, аміно, азидо, NR24R25, незаміщений або замікційних засобів або їх комбінацій. щений С1-С20алкіл, аліл, арил або арилалкіл, або 10. Спосіб за п. 1 для лікування діабету типу 1 та OR27, де R27 представляє груп у глікозилового етепов'язаних з ним станів. ру (глікозид-етер); 11. Спосіб за п. 1 для лікування діабету типу 2 та R9 представляє Н або ОН, або разом з R15 утвопов'язаних з ним станів. рює зв'язок (С9-С15 зв'язок); 12. Спосіб за п. 1 для лікування резистентного до R10 представляє Н, СН3, СНО, СООН або глікозиінсуліну діабету. ловий естер (глікозид-естер) вказаної групи СООН, 13. Спосіб за п. 1 для лікування пов'язаних з діаCH2O-R28 або -OR28, де R28 представляє Н або бетом ускладнень та асоційованих станів, вклюразом з R4 утворює зв'язок (лактон), або R10 разом чаючи опасистість, хвороби мікро- та макросудин, з R1 утворюють зв'язок (С1-С10 подвійний зв'язок); нефропатію, невропатію та хвороби очей. R11 представляє Н або ОН, або відсутній; 14. Антидіабетичний засіб, що містить як активний R12 представляє СН 3, СН2ОН, СООН або глікозиінгредієнт сполуку формули (1) та/або її похідні ловий естер (глікозид-естер) вказаної групи СООН; разом з фармацевтично прийнятним носієм. R13 представляє метилен, двовалентний гетеро15. Антидіабетичний засіб за п. 14, де засобом є атом або NR29, де R29 представляє NHR30 або медикамент, придатний для введення хірургічним OR30, де R30 представляє Н або С 1-С20алкіл, арил, методом глибоко у тканину. алкіларил; а подвійний зв'язок присутній між С 16 та 16. Антидіабетичний засіб за п. 14, де засобом є R13, коли R11 відсутній; або R13 представляє Н, ОН, композиція з уповільненим вивільненням. СН3, СНО, CH2X, де Х представляє галоген; 17. Антидіабетичний засіб за п. 14, де засіб приCHNR29 де R29 представляє NHR30 або OR30, де значений для перорального застосування. R30 представляє Н або С 1-С20алкіл, арил, алкіла18. Антидіабетичний засіб за п. 14, де засіб пририл, коли R11 представляє Н або ОН; за умови, що значений для застосування шляхом інгаляції. тоді, коли R11 представляє ОН, R13 не представляє 19. Антидіабетичний засіб за п. 14, де засіб приОН; значений для трансдермального застосування. 14 R представляє Н або ОН; 20. Антидіабетичний засіб за п. 14, де засіб приR15 представляє Н або разом з R 9 утворює зв'язок значений для парентеральних ін'єкцій. (C9-C15 зв'язок); 21. Антидіабетичний засіб за п. 14, де засіб прита/або її фармацевтично прийнятних похідних, значений для місцевого, ректального або вагінавключаючи лактони, глікозиди, естери, активні льного застосування. естери та солі. 22. Антидіабетичний засіб за будь-яким з пп. 14, 15 2. Спосіб за п. 1, в якому асоційовані з діабетом або 16, де похідне формули (1) вибирають з групи, ускладнення та стани є одним або більше з таких що складається з лактонів, естерів, солей лужних станів: опасистість, хвороби мікро- та макросудин, металів, солей лужноземельних металів, солей нефропатія, невропатія, хвороби очей та діабетиперехідних металів, солей амонію чи органічних чне укривання виразками. основ. 3. Спосіб за п. 1, в якому гібереліном є гіберелін 23. Антидіабетичний засіб за п. 22, де похідним є А3 . натрієва сіль формули (1). 4. Спосіб за п. 1, в якому гібереліни є сумішшю 24. Антидіабетичний засіб за п. 22, де похідним є гібереліну А3 та гібереліну А4 та/або гібереліну А7 . цинкова сіль формули (1). 5. Спосіб за п. 1, в якому фармацевтично прийнят25. Антидіабетичний засіб за п. 22, де похідним є ними похідними є солі, включаючи солі лужних етиловий естер формули (1). металів, солі лужноземельних металів, солі мета26. Застосування сполуки формули (1) та/або її лів та солі амонію чи органічних основ. похідних у виробництві анти-діабетичного засобу 6. Спосіб за п. 5, в якому органічними основами є для застосування при лікуванні діабету та пов'язалідокаїн або NR16R17R18R19 , де R16, R17 , R18, R19, які них станів. можуть бути однаковими або ні, представляють 27. Спосіб отримання гіберелінів, що містять гібегідроген, або заміщені чи незаміщені С 1-20алкіл, релін А3, який включає етапи: алканол або арил. (a) інкубація штаму мікроорганізмів, що продуку7. Спосіб за п. 1, в якому фармацевтично прийнятють гібереліни, у ферментаційному середовищі; ними похідними є лактони, глікозиди або естери та (b) доведення рН ферментаційного середовища активні естери. до рН 6,5 - 7,0 та фільтрування для отримання на 8. Спосіб за п. 1, що передбачає призначення спофільтрі шару міцелію мікроорганізмів та фільтрату; луки формули (1) (гібереліни) або її фармацевтич(c) промивка шару на фільтрі водою та поєднання но прийнятних похідних у комбінації з речовинами, промивок з фільтратом для утворення водного що вибирають з групи, яка складається з інсуліну, розчину; його фрагментних похідних, IGF, факторів росту та (d) концентрування водного розчину; інших фармацевтично сумісних антидіабетичних (e) змішування водного розчину з органічним роззасобів або їх комбінацій. чинником при температурі 5-10°С та доведення рН 9. Спосіб за п. 1, що передбачає призначення спосуміші до менше ніж 2,0; луки формули (1) (гібереліни) або її фармацевтич(f) розділення суміші на водну фазу та першу орно прийнятних похідних у комбінації з іншими суміганічну фаз у і видалення першої органічної фази; сними терапевтичними засобами, що вибирають з 5 79433 6 (g) повторна екстракція водної фази з етапу (f) 31. Спосіб за п. 27, де органічним розчинником є органічним розчинником з отриманням другої оретилацетат. ганічної фази; 32. Спосіб за п. 28, де органічним розчинником є (h) поєднання першої та другої органічних фаз та етилацетат. концентрування з утворенням концентрованого 33. Спосіб за п. 28, що включає крім того етапи: органічного розчину; (q) розчинення гібереліну А3 у метанолі; (і) нагрівання концентрованого органічного розчи(r) додавання розчину гібереліну до еквімолярного ну при 60-70°С протягом 3-4 годин з перемішуванводного розчину NaHСО3; ням, доки не припиниться осадження твердого (s) випарювання змішаних розчинів досуха для продукту; отримання твердого залишку; (j) охолодження концентрованого органічного роз(t) розчинення залишку у воді та сушіння сублімачину до кімнатної температури та фільтрування з цією з отриманням натрієвої солі гібереліну А3 . отриманням осаду; 34. Спосіб за п. 33, що включає крім того етапи (k) промивка осаду холодним органічним розчинрозчинення натрієвої солі гібереліну А3 у воді, ником та сушіння з отриманням білуватого твердопропускання розчину через колонку з завантажего продукту, що містить приблизно 80% гібереліну ною цинком іонообмінною смолою, промивки коА3 , приблизно 4% гібереліну А4 та приблизно 4% лонки водою, збирання та поєднання ефлюєнту та гібереліну А7. промивки і видалення води з отриманням цинкової 28. Спосіб за п. 27, який включає крім того етапи: солі гібереліну А3. (l) розчинення білуватого твердого продукту у су35. Спосіб за п. 28, що включає крім того етапи: міші 32,6% метанолу, 2,2% води та 65,2% ацетону (q) розчинення гібереліну А3 у суміші ацетону і з отриманням розчину гібереліну; води зі співвідношенням 50:1; (m) розбавлення розчину гібереліну сумішшю 10:1 (r) змішування розчину гібереліну А3 з еквімолярорганічного розчиннику та води; ними кількостями триетиламіну та етилхлорфор(n) фільтрування розбавленого розчину гібереліну міату та одною десятою молярної кількості Nта концентрування фільтрату випарюванням у метилморфоліну і перемішування при -15°С протявакуумі; гом 20 хвилин; (о) нагрівання концентрату до температури 60(s) розбавлення утвореної суміші безводним ета80°С протягом 2-3 годин з перемішуванням, охонолом та перемішування при кімнатній температулодження до кімнатної температури та фільтрурі; вання з отриманням твердого кристалічного осаду; (t) випарювання розбавленої суміші досуха та роз(р) промивка осаду холодним органічним розчинподілення залишку між етилацетатом та водою у ником та сушіння з отриманням кристалів гібереліспіввідношенні 6:1; ну А3 . (u) відокремлення шару етилацетату, промивка 2% 29. Спосіб за п. 27, де штамом мікроорганізмів, що НСl, а потім водою, далі 5% NаНСО3, знов водою продукують гібереліни, є Gibberella fujikuroi. та випарювання під зниженим тиском досуха з 30. Спосіб за п. 27, де концентрування розчинів на отриманням етилового естеру гібереліну А3. етапах (d) та (h) досягають випарюванням у вакуумі. Представлений винахід стосується застосування сполук формули (1) (гібереліни) та їх похідних для лікування діабету, його ускладнень та асоційованих станів, включаючи тучність, хвороби мікро та макросудин, нефропатію, невропатію, хвороби очей, діабетичне укривання виразками тощо, та їх застосування для отримання фармацевтичних композицій або медикаментів для лікування цих станів. Винахід призводить до нормалізації рівня глюкози у сироватці та інших фізіологічних станів. Представлений винахід стосується застосування групи сполук, відомих як гібереліни та їх похідні, для отримання фармацевтичної композиції для лікування діабету та зв'язаних станів, а також способу лікування цих та інших станів застосуванням гіберелінів та/або їх фармацевтично прийнятних солей або естерів, включаючи глікозидні естери, активні естери або лактони. Більш того, цей винахід стосується виробництва та застосування медикаменту для лікування діабету та зв'язаних з ним станів. Крім того, застосування гіберелінів та їх по хідних, особливо при застосуванні перорально, ін'єкціями, трансдермальними пластирами, або інгаляцією, можна використовувати замість лікування інсуліном та/або його фрагментними похідними та/або IGF (інсуліно-подібні фактори росту), або як вибір комбінаційної терапії інсуліном, його фрагментними похідними, IGF, факторами росту або іншими фармацевтично сумісними антидіабетичними засобами для лікування діабету та пов'язаних станів. Цей винахід стосується нового застосування гіберелінів у ветеринарії та медицині людини. Зокрема згідно з винаходом запропоновано фармацевтичні композиції, що містять гібереліни, та їх застосування для лікування діабету, включаючи лікування діабету типу 1 та типу 2, його ускладнень та асоційованих станів, включаючи тучність, хвороби мікро та макросудин, нефропатію, невропатію, хвороби очей, діабетичне укривання виразками тощо. Гібереліни є серією природно існуючих сполук, як відомі, як регулятори росту рослин, з широким застосуванням у царстві рослин [1]. їх виділено з метаболітів деяких мікроорганізмів, як-то Gibberella fujikuroi [2]. Гібереліни, особливо гіберелінова кислота (гіберелін А3), та її суміш з гібере 7 79433 8 ліном А4 та/або гібереліном А7, які комерційно до- The Preparation of Gibberellins (+/-)-GA103 and (+/-)ступні, широко застосовують в агрокультурі для GA73 " (Нова та ефективна стратегія загального посилення росту деяких фруктів (полуниці та виносинтезу поліциклічних дитерпеноїдів - Отримання град) та рослин (томати, капуста та квіткова капусгіберелінів (+/-)-GA103 та (+/-)-GA73), J Am. Chem. та), також, як харчова добавка при осолодженні Soc 119(16), 3828-3829 (1997)]. ячмінь [3]. (h) [Mander L. Ν., "Syn thesis of 12-Hydroxy-C[1]. 20-Giebberellin from Gibberellin A3" (Синтез 12[J. MacMillian, et al. "Isolation and Structure of Гідрокси-С-20-гібереліну з гібереліну А3), TetraheGibberellin From Higher Plants" (Виділення та струdron 53(6), 2137-2162 (1997)] та цитована тут лі тектура гібереліну з вищих рослин). Ad v. Chem. Ser ратура. 28, 18-24, (1961)]. Крім того, екстракція та виділення різних гібе[2]. релінів з різних рослин, паростків, фр уктів та на(a) [P.J. Curtis et al. Chem. & Ind. (London) 1066, сіння також широко опубліковані [5]. (1954)]. [5]. (b) [B.E. Cross, J. Chem. Soc. 4670, (1954)]. (a) [Pearce D.W., et al., Phytochemistry, 59(6), (c) [P.W. Brian et al, U.S. 2,842,051]. 679-687 (2002)]. (d) [С Т. Calam et al, U.S. 2,950,288]. (b) [Chang S. Т., et al., Physiologia Plantarum, (e) [A J. Birch et al, U.S. 2,977,285]. 112(3), 429-432 (2001)]. [3]. (c) [Nakayama M. et al., Phytochemistry, 57(5), (a) [M. Devlin, Plant Physiology, New York, Rein749-758 (2001); 48(4), 587-593 (1998)]. hold, (1966)]. (d) [Blake P. S., et al., Phytochemistry, 55(8), (b) [P.W. Brian et al, Plant Physiol, 5,669 (1955)]. 887-890 (2000); 53(4), 519-528 (2000)]. (c) [А.К Mehta et al, J. Hostic Sci 4,167 (1975)]. (e) [Koshioka M., et al., J. of Japanese Society (d) [R.J. Wea ver, Ad v. Chem. Ser 28, 89 (1961)]. for Horticultural Science, 68(6), 1158-1160 (1999); (e) [F.G. Gustafson, Plant Physical 35, 521 67(6), 866-871 (1998)]. (1960)]. (f) [Mander L. N. et al., Phytochemistry, 49(8), (f) [Fed. Reg. 25, 2162 (1960)]. 2195-2206 (1998); 49(6), 1509-1515 (1998)]. Гіберелін A3 та його суміш з гібереліном А4 (g) [Wynne G. et al., Ph ytochemistry, 49(7), та/або А7 можна отримувати ферментацією мікро1837-1840 (1998)]. організмів, як-то Gibberella fujikuroi Сирі сполуки Гібереліни на цей час використано для проти можна виділяти та очищати до кристалічного прозапалення, для лікування простатиту та псоріазу, дукту високої чистоти. Інші похідні гібереліну можлікування пухлин, та для загоєння виразок та пона отримувати напівсинтетичним шляхом з гібереранень [6]. [6]. ліну А3 або загальним синтезом, який добре (a) [U.S. 4424232 1/1984 Parkinson]. документований [4]. (b) [French 2597339 10/1987]. [4]. (c) [U.S. 5487899 1/1996 Davis]. (a) [The Merck Index, 12, 4426], цитована тут (d) [U.S. 5580857 12/1996 Oden]. література. (e) [AUS. 695054 11/1998 Wu]. (b) [Furber Μ., et al., "New Synthesis Pathways (f) [U.S. 6121317 9/2000 Wu]. From Gibberellins to Autheridiogens Isolated From Нами зараз виявлено застосування гібереліну the Fern Genus Anemia" (Новий синтетичний шлях або його похідних для лікування діабету, включавід гіберелінів до аутеридіогенів, виділених з Fern ючи діабет типу 1 та типу 2 та пов'язаних з ним Genus Anemia), J. of Org. Chem. vol 55, No.15, станів. 4860-4870 (1990)]. Зараз у нашій лабораторії виявлено, що гібе(c) [Mander L. N., et al., "C-18 hydroxylation of реліни виявляють властивості типу фактору росту Gibberellins" (C-18 гідроксилування гіберелінів), J. ссавців (як-то IGF, EGF). С. S., Perkm Trans. 1 (17), 2893-2894 (2000)]. Результати експерименту (приклади 3 та 4) (d) [Pour M. et al., (Синтез 3,12-дигідрокси-9,15підтверджують, що гібереліни, які утворюються циклогіберелінів), Tetrahedron 54(45), 13833-13850 рослинами та мікробами, діють як зв'язуючі широ(1998)]. кого спектру, що приєднуються до рецепторів фак(e) [Liu J P. et al., "A General Protocol For the тору росту. Вони відрізняються від факторів росту, Hydroxylation of C-14 in Gibberellins Synthesis of 14виявлених у тварин, кожний з них має високу споBeta-hydroxy-Gibberellin A, Meth yl Ester" (Загальний рідненість до специфічного рецептору. Це є репротокол гідроксилування С-14 у синтезі гіберелізультатом еволюції. Біологічні системи рослин та нів з метилового естеру 14-бета-гідроксимікробів продукують біологічні речовини, діючи на гібереліну A,), Tetrahedron 54(38), 11637-11650 ширшій (менш специфічній) основі ніж такі більш (1998)]. складні форми життя, як тварини. (f) [Pour M, et al., "Synthetic and Structural Оскільки гібереліни є меншими молекулами, Studies on Novel Gibberellins", (Синтез та структурніж фактори росту, зв'язування гіберелінів на рені дослідження нових гіберелінів), Pure and Applied цепторах фактору росту можливо є слабшим. У Chemistry 70(2), 351-354 (1998); "Синтез 12присутності низького рівня факторів росту гібереГідрокси-9,15-Цикло-гіберелінів", Tetrahedron Letліни зв'язуються з вакантними рецепторами факters, 39(14), 1991-1994 (1998); Australian J. of тору росту для стимуляції клітин росту та інших Chemistry 50(4), 289-299 (1997)]. функцій. За цієї умови гібереліни виконують функ(g) [King G. R et al., "A New and Efficient Stratції факторів росту. У присутності нормального рівegy for the Total Synthesis of Polycyclic Diterpenoids ня факторів росту, фактори росту зв'язуються з їх 9 79433 10 рецепторами більш легко, що обумовлено їх ви[7]. щою спорідненістю до тих рецепторних ділянок. (a) NTP Хімічний репозиторій, Фізична негабаритність цих факторів росту не дає [http://ntpserver.niehs.nih.gov/htdocs/CHEM_H& можливості або дає дуже малу можливість на діS/NTP_CHEM7/Radian77-06-5.html]. лянках рецептору, з якими гібереліни можуть зв'я(b) [The Agrochemicals Handbook, Royal Society зуватися. Це призводить до неефективності гібеof Chemistry, серпень 1991]. релінів, коли фактори росту з достатньою до (c) [Gold L S., Slone T. H, Ames B. N. (2001), зв'язування спорідненістю наявні у достатній кільPesticide Residues in Food and Cancer Risk (Пестикості. Цей механізм забезпечує дуже гарний процидні залишки у їжі та ризик раку: Критичний анафіль для гіберелінів, діючи як замісник або сенсиліз, Публікації від Carcinogenic Potency Project, у білізатор для факторів росту, включаючи IGF, Handbook of Pesticide Toxicity, Др уге видання, (R. оскільки наявність надлишку гіберелінів не діятиме Krieger, ed.), Academic Press]. на нормальні функції цих факторів росту. Отже, згідно з одним аспектом винахід стосуЦукровий діабет є хронічним розладом, що ється застосування сполуки формули (1) (гіберелівиявляється у гіперглікемії та зміні жирового та ни) або їх похідних для лікування діабету, його білкового метаболізм. За даними American ускладнень та асоційованих станів, включаючи Diabetes Association більш ніж 13 мільйонів громатучність, хвороби мікро- та макросудин, нефропадян США потерпають від діабету, а кожного року тію, невропатію, хвороби очей, діабетичне укриідентифікують близько 650000 нових випадків. вання виразками тощо. Згідно з наступним аспекУведення інсуліну та сульфонілсечовин предстатом винаходу запропоновано фармацевтичну вило важливі орієнтири при лікуванні цукрового композицію для лікування діабету та пов'язаних діабету. Інсуліно-подібний фактор росту - 1 (IGFстанів, включаючи тучність, хвороби мікро- та мак1),молекула зі структурою, гомологічною інсуліну, росудин, нефропатію, невропатію, хвороби очей, має свій власний специфічний рецептор, рецептор діабетичне укривання виразками тощо, вказана типу IGF-1, через який вона виявляє ряд метабофармацевтична композиція, включає гібереліни лічних ефектів, що є подібними інсуліну. Відкриття та/або їх фармацевтично прийнятні солі або естеактивного регіону фактору росту людини, відповідри. ного за інсуліно-подібну дію молекули призвело до розробки нових анти-діабетичних пептидних засобів. На додаток, фактори росту є поліпептидами, що регулюють реплікацію, диференціацію та метаболічний гомеостаз клітин. Вони посилюють ріст та/або життєздатність нейронів. У доклінічному тестуванні для лікування різних неврологічних розладів, включаючи діабетичні невропатії, IGF-2 збільшував швидкість регенерації нервів. Крім того, підвищені внутрішньоклітинні концентрації цАМФ посилюють залежність глюкози від секреції гібереліни мають таку формулу: інсуліну панкреатичними β-клітинами. Гібереліни Формула (1), де виявлені, як такі, що посилюють активність аденіR1 представляє Η або групу -O-R20, де R20 лат- та гріанілат-циклаз, так що внутрішньоклітинні представляє Н, групу глікозилового етеру (глікоконцентрації цАМФ та цГМФ можна збільшува ти зид-етер), С1-С6алкіл, або R1 разом з R2 або R10 застосуванням гіберелінів для посилення у свою утворює зв'язок (С1-С2 або С1-С10 подвійний зв'ячергу залежності глюкози від секреції інсуліну з зок, відповідно); панкреатичними β-клітинами. Тому здається, що R2 представляє Η або групу -O-R21, де R21 гібереліни можуть мати застосування при лікуванні представляє Н, групу глікозилового етеру (глікодіабету. зид-етер), або разом з R4 утворює зв'язок (лактон) Результати експерименту на тваринах (приабо R2 разом з R1 або R3 утворює зв'язок (С1-С2 клади 5 та 6) показали лікування діабетичних щуабо С2-С3 подвійний зв'язок, відповідно); рів 5мг/кг гібереліну, як суміш А3 та А4 або А7, поR3 представляє Н, =0, або -O-R22, де R22 предвертаючи рівні глюкози у їх сироватці, а також їх ставляє Η або групу глікозилового етеру (глікозидмаси тіла до нормальних Це свідчить, що гібереліетер), або R3 разом з R2 утворює зв'язок (С2-С3 ни можуть бути е фективними при лікуванні діаподвійний зв'язок); бету. R4 представляє ОН, або -OR23, де R23 предТоксичність гібереліну для ссавців є надзвиставляє незаміщений або заміщений С 1-С20алкіл, чайно низькою. Гостра пероральна ЛД50 для щурів аліл, арил, арилалкіл, амідин, -NR24R25 або нената мишей, як виявлено, 6,3г/кг [7а] та >15г/кг [7b] сичене або насичене кільце, що містить один або відповідно. У 90-добових дослідженнях харчуванбільше гетеро-атомів, вибраних з групи, що скланя, недіючий рівень для щурів та собак складає дається з нітрогену, оксигену та суль фуру; R24 та >1г/кг/добу [7b]. Він не подразнює шкіру та очі [7b]. R25, що можуть бути або не бути однаковими, Не виявлено канцерогенності [7с]. Класифікації: представляють гідроген, або С1-С20алкіл, аліл, Таблиця 5 класу WHO токсичності (клас продуктів арил, арилалкіл або ненасичене або насичене мінімально небезпечних для здоров'я, малоймовікільце, що містить один або більше гетеро-атомів, рно, щоб представляв гостру небезпеку при норвибраних з групи, що складається з нітрогену, окмальному застосуванні); клас ЕРА токсичності III сигену та суль фуру; або R4 разом з R21 або R28 (друга класифікація мінімальної небезпеки). утворює зв'язок (лактон); 11 79433 12 R5 представляє Η або групу глікозилового есУ випадку гібереліну А3 , R1 разом з R2 утвотеру (глікозид-естер), або незаміщені чи заміщені рюють зв'язок (С1-С2 подвійний зв'язок), R3 пред(наприклад галогеновані) С1-С20алкіл-естери, алілставляє (3-ОН, R4 разом з R28 утворює зв'язок (лаестери, арил-естери. арилалкіл-естери, активні ктон); R5, R6, R7 , та R9 представляють гідроген, R8 естери (як-то фенацил-естер, півалоїл-естер), представляє ОН, R11 відсутній, R12 представляє 6 7 R представляє Η або ОН, або разом з R метил; R13 представляє метилен, подвійний зв'яутворює зв'язок (С11-С12 подвійний зв'язок); зок присутній між С16 та R13; R14 та R15 представR7 представляє Н, =О, або -OR26, де R26 предляють гідроген. ставляє Η або групу глікозилового етеру (глікозидНайбільш легко доступними гіберелінами є гіетер) або R7 разом з R6 утворює зв'язок (С11-С12 берелін А3 та його суміш з гібереліном А4 та/або подвійний зв'язок); гібереліном А7 з ферментації Gibberella fujikuroi. R8 представляє Н, гідроксил, меркаптан, або Хоча способи виділення та очистки гіберелінів, галоген (наприклад F, СІ), аміно, азидо, NR24R25, включаючи екстракцію розчинником та хроматогнезаміщений або заміщений (наприклад галогенорафію, опубліковані, як згадано вище, є все ще ваний) С1-С20алкіл, аліл, арил, або арилалкіл, або необхідними прості та ефективні способи виділен-OR27, де R27 представляє групу глікозилового ня та очистки Згідно з представленим винаходом етеру (глікозид-етер); запропоновано практичний спосіб великомасштаR9 представляє Η або ОН, або разом з R15 бного виробництва гібереліну А3, що включає етаутворює зв'язок (С9-С15 зв'язок); пи інкубації штамів мікроорганізмів, що продук ують R10 представляє Н, СН3, СНО, СООН, або глігібереліни у ферментаційному середовищі, доки козиловий естер (глікозид-естер) вказаної групи концентрація гіберелінів не досягає приблизно СООН, CH2O-R28 або -OR28, де R28 представляє Η 3000мкг/мл середовища, а потім: або разом з R4 утворює зв'язок (лактон) або R10 (a) доведення рН ферментаційного середовиразом з R1 утворюють зв'язок (С1-С10 подвійний ща до рН 6,5-7,0 та фільтрування для отримання зв'язок); на фільтрі шару міцелію мікроорганізмів та фільтR11 представляє Н, або ОН або відсутній; рату; R12 представляє СН 3, СН2ОН, СООН або гліко(b) промивки шару на фільтрі з водою та поєдзиловий естер (глікозид-естер) вказаної групи нання промивки з фільтратом для створення водСООН; ного розчину; R13 представляє метилен, двовалентний гете(c) концентрування водного розчину; ро-атом, або NR23, де R29 представляє NHR30 або (d) змішування водного розчину з органічним OR30, де R30 представляє Н, або С1-С20алкіл, арил, розчинником при температурі 5-10°С та доведення алкіларил; а подвійний зв'язок присутній між С 16 та рН суміші до менше, ніж 2,0; R13 коли R11 відсутній; або R13 представляє Н, ОН, (e) дозволу суміші відокремитися на водну фаСН3, СНО, СН2Х, де X представляє галоген (назу та першу органічну фаз у i видалення першої приклад F, СІ); CHNR29 де R29 представляє NHR30 органічної фази; або OR30, де R30 представляє Η або С 1-С20алкіл, (f) повторної екстракції водної фази з етапу (f) арил, алкіларил, коли R11 представляє Η або ОН; органічним розчинником для отримання другої за умови, що там, де R11 представляє ОН, R13 не органічної фази, представляє ОН; (g) поєднання першої та другої органічної фаR14 представляє Η або ОН; зи та концентрування для створення концентроваR15 представляє Н, або разом з R9 утворює ного органічного розчину; зв'язок (С9-С15 зв'язок); (h) нагрівання концентрованого органічного Фармацевтично прийнятні похідні, включаючи розчину при 60-70°С протягом 3-4 годин з перемілактони, естери та солі сполук формули (1), вклюшуванням, доки не припиняється осадження тверчають їх солі лужних металів (наприклад Na+, K+), дого продукту, солі лужноземельних металів (наприклад Са 2+, (і) охолодження концентрованого органічного Мg2+), солі металів (наприклад Zn2+, Al3+), та солі розчину до кімнатної температури та фільтр ування амонію, органічних основ (як-то лідокаїн, або для отримання осаду; NR16R17R18R 19 де R16, R17, R18 , R19 , які можуть бути (j) промивки осаду холодним органічним розоднаковими або ні, представляють гідроген, С1чинником та сушки для отримання білуватого С20алкіл, алканол, арил). твердого продукту, що містить приблизно 80% Переривчаста лінія разом з суцільною лінією гібереліну А3, приблизно 4% гібереліну А4 та присвідчать, що подвійний зв'язок може бути між двоблизно 4% гібереліну А7 . ма з трьох атомів карбону, з'єднаних переривчасЯк варіант, згідно з представленим винаходом тою та суцільною лініями; за умови, що подвійного крім того запропоновано етапи. зв'язку нема, якщо R11 представляє гр упу ОН. (k) розчинення білуватого твердого продукту у Оскільки формула (1) відповідає нормальним суміші 32,6% метанолу, 2,2% води та 65,2% ацеправилам валентності, це зводиться до таких тону для отримання розчину гібереліну; умов: (І) розбавлення розчину гібереліну сумішшю R1 та R2 не можуть утворювати зв'язок, якщо 10:1 органічного розчиннику та води, R10 та R1 та/або R2 та R3 утворюють зв'язок; R10 та (m) фільтрування розбавленого розчину гібеR1 не можуть утворювати зв'язок, якщо R10 та R23 реліну та концентрування фільтрату випарюванутворюють зв'язок; R2 та R1 або R2 та R3 не можуть ням у вакуумі; утворювати зв'язок, якщо R4 та R21 утворюють (n) нагрівання концентрату до температури 60зв'язок. 80°С протягом 2-3 годин з перемішуванням, охо 13 79433 14 лодження до кімнатної температури та фільтрувинаходу, сполуки формули (1) для застосування вання для отримання твердого кристалічного осаяк активного терапевтичного засобу при лікуванні ду; діабету та пов'язаних станів. промивки осад холодним етилацетатом та суЗгідно з наступним аспектом винаходу запрошки для отримання кристалів гібереліну з чистопоновано спосіб виробництва фармацевтичної тою >95%. композиції, що містить комбінацію сполуки формуКрім того, розкрито способи для отримання ли (1) та/або її похідних з фармацевтично прийнясолей та естерів гібереліну. Зокрема, згідно з тним носієм. представленим винаходом запропоновано спосіб Згідно з наступним аспектом винаходу запроотримання натрієвої солі гібереліну, що містить поновано спосіб лікування діабету та пов'язаних етапи: станів у тварин, включаючи людину, що полягає у (a) розчинення гібереліну А3 у метанолі, застосуванні ефективної кількості сполуки форму(b) додавання розчину гібереліну до еквімоляли (1). рного водного розчину NaHCO3; Також запропоновано згідно з наступним аспе(c) випарювання змішаних розчинів досуха для ктом винаходу застосування сполуки формули (1) отримання твердого залишку; для виробництв фармацевтичної композиції для (d) розчинення залишку у воді та сушка сублілікування діабету та пов'язаних станів. мацією для отримання натрієвої солі гібереліну А3. Кількість сполуки формули (1), потрібна для Згідно з винаходом крім того запропоновано застосування при лікуванні діабету та пов'язаних спосіб отримання цинкової солі гібереліну, що станів залежить від частоти застосування, прировключає крім того етапи розчинення натрієвої солі ди лікованого стану та віку і стану тварини, вклюгібереліну А3 у воді, пропускання розчину через чаючи людину, та є в рамках досвіду ве теринара колонку з завантаженою з цинком іонообмінною чи лікаря. смолою, промивка колонки водою, збирання та Загалом придатна доза знаходиться у межах поєднання ефлюєнту та промивок і видалення приблизно від 0,1 до 100мг/кг маси тіла на добу, води для отримання цинкової солі гібереліну А3. переважно у межах 50 до 20мг/кг/добу. Згідно з винаходом крім того запропоновано Лікування переважно починають після або під спосіб отримання етилового естеру гібереліну, що час виникнення та подовження діабету, коли це містить етапи: необхідно. Також можливо застосовувати сполуки (a) розчинення гібереліну А3 у суміші ацетону з формули (1), як попереджувальне лікування водою у співвідношенні 50:1; Придатне лікування проводять 1-4 рази на до(b) змішування розчину гібереліну А3 з еквімобу, та подовжують, коли це необхідно. Альтерналярними кількостями триетиламіну та етилхлортивно, у випадку використання композиції з вивіформіату, та одною десятою молярної кількості Nльненням у часі, лікування можна давати раз на метилморфоліну, та перемішування при -15°С період від 2 діб до 1 тижня. протягом 20 хвилин; Бажана доза може бути одною дозою або, як (c) розбавлення утвореної суміші безводним розділеними дозами, застосовуваними з прийнятетанолом та перемішування при кімнатній темпеними інтервалами, наприклад, як дві, три, чотири ратурі; або більше дози на добу. (d) випарювання розбавленої суміші досуха та Сполуки формули (1) легко застосовувати у розподілення залишку між етилацетатом та водою формі одиничної дози, що містить, наприклад, 0,1у співвідношенні 6:1, 500мг активного інгредієнту на одиничну форму (e) відокремлення шару етилацетату, промивдозування. Хоча можливо застосовувати у терапії ка 2% НСІ, а потім водою, 5% NaHCO3, знов восполуки формули (1) як хімічно необробленими, дою, та випарювання під зниженим тиском досуха краще представляти активний інгредієнт як фарз отриманням етилового естеру гібереліну А3. мацевтичну композицію. Посилання тут далі на сполуки формули (1) Згідно з винаходом крім того запропоновано включають сполуки формули (1) та їх фармацевфармацевтичну композицію, що включає сполуки тично прийнятні похідні, включаючи їх солі, естери формули (1) або їх фармацевтично прийнятні пота лактони. хідні разом з одним або більше фармацевтично Фармацевтично прийнятні композиції сполук прийнятними носіями та. як варіант, іншими тераформули (1) можна також створювати їх поєднанпевтичними та/або профілактичними інгредієнтаням з одним або більше іншими активними інгредіми. Носії повинні бути прийнятними з огляду на їх єнтами, наприклад інсуліном, інсуліно-подібними сумісність з іншими інгредієнтами композиції та поліпептидами, похідними фрагментів інсуліну, нешкідливість для їх реципієнта. IGF, IGF фрагментами, факторами росту, або інФармацевтичні композиції включають компошими фармацевтично сумісними антизиції, придатні для перорального, ректального, діабетичними засобами для лікування діабету та назального, місцевого (включаючи букальне та пов'язаних станів. сублінгвальне), вагінального або парентерального Сполуки формули (1) виявляють активність як (включаючи внутрішньом'язове, інтрадермальне, інсулін та інсуліно-подібні агоністи та/або сенсибіпідшкірне та внутрішньовенне) застосування, або лізатори для лікування діабету, його ускладнень та у формі, придатній для вживання через шлунковоасоційованих станів, включаючи тучність, хвороби кишковий тракт, або у формі, придатній для вжимікро та макросудин, нефропатію, невропатію, вання через респіраторний тракт (включаючи нахвороби очей, діабетичне укривання виразками зальне застосування) наприклад інгаляцією або тощо. Запропоновано згідно з наступним аспектом вдуванням, або для інтрадермальної або підшкір 15 79433 16 ної імплантації або для трансдермального пластиактивний інгредієнт у придатному рідкому носії. ру. Композиції можна, за прийнятністю, представДля вагінального застосування композиції моляти як дискретні одиниці дозування та їх можна жуть бути песаріями, тампонами, кремами, геляотримувати будь-яким зі способів, відомих у рівні ми, пастами, пінами або спреями, що містять на техніки фармакопеї. Усі способи включають етап додаток до активного інгредієнту такі носії, які віпоєднання активної сполуки з рідкими носіями або домі у рівні техніки як прийнятні. мілко подрібненими твердими носіями, або обома Для ректального застосування кращими є суними, а далі, якщо необхідно, формування продукпозиторії в одиничній дозі з твердим носієм Приту у бажану композицію. датні носії включають масло какао та інші матеріФармацевтичні композиції, придатні для пероали, звичайно використовувані у рівні техніки, а рального застосування можуть бути представлені, супозиторії можна легко утворювати змішуванням як дискретні одиниці, як-то капсули, облатки або активної сполуки з пом'якшуючими або розтоплютаблетки, кожна з яких містить попередньо визнаваними носіями), а потім охолодженням та формучені кількості активного інгредієнту, як порошок ванням у прес-формі. або гранули, як розчин, суспензія, або як емульсія. Для застосування до респіраторного тракту Активний інгредієнт може також бути представле(включаючи назальне застосування) сполуки форним, як болюс, електуарій або паста. Таблетки та мули (1) можна застосовувати будь-яким зі спосокапсули для перорального застосування можуть бів та композицій, застосовуваних у рівні техніки містити звичайні екципієнти, як-то зв'язувальні для респіраторного тракту. засоби, наповнювачі, мастила, дезинтегратори, Отже загалом сполуки формули (1) можна заабо змочувальні засоби. Таблетки можуть бути стосовувати у формі розчину або суспензії або як покритими способами, добре відомими у рівні техсухий порошок. ніки. Пероральні рідкі препарати можуть бути у Розчини та суспензії повинні переважно бути формі, наприклад, водної або масляної суспензії, водними, наприклад отриманими тільки з водою розчину, емульсії, сиропу або еліксиру, або мо(наприклад стерильною водою без пірогенів) або жуть бути у формі сухого продукту для відтворенводою та фізіологічно прийнятним співрозчинниня водою або іншим придатним носієм перед заком (наприклад етанол, пропіленгліколь та полістосуванням. Такі рідкі препарати можуть містити етиленгліколі, як-то PEG 400). звичайні адитиви, як-то суспендувальні засоби, Такі розчини або суспензії можуть додатково емульгатори, неводні носії (які можуть включати містити інші екципієнти, наприклад, консерванти їстівні олії), або консерванти. (як-то хлорид бензалконію), солюбілізатоСполуки формули (1) можна також формувати ри/поверхнево-активні речовини, як-то полісорбадля парентерального застосування (наприклад ти (наприклад Tween 80, Span 80, хлорид бензалін'єкціями, наприклад болюсними ін'єкціями або конію), буфери, засоби доведення ізотонічності безперервним вливанням) та можуть бути у формі (наприклад натрій хлорид), посилювачі поглинання одиничної дози в ампулах, попередньо заповнених та посилювачі в'язкості. Суспензії можуть додаткошприцах, вливаннях невеликого об'єму, або у баво містити суспендувальні засоби (наприклад мікгатодозових контейнерах з доданим консерванрокристалічну целюлозу, натрійтом. Композиції можуть бути у формі суспензії, карбоксиметилцелюлозу). розчину, або емульсії у маслі або воді, і можуть Розчини або суспензії наносять безпосередмістити композиційні засоби, як-то суспендувальні, ньо у назальну порожнину звичайними засобами, стабілізуючі та/або диспергувальні засоби. Альтенаприклад крапельницею, піпеткою або як спрей. рнативно, активний інгредієнт може бути у формі Композиції можуть бути в одно- або багато-дозовій порошку, отриманого асептичним виділенням стеформі. В останньому випадку засоби дозування рильного твердого продукту або ліофілізацією з забезпечують за бажанням. У випадку крапельниці розчину для відтворення перед застосуванням чи піпетки цього можна досягти застосуванням придатним носієм, наприклад стерильною водою пацієнтом прийнятного попередньо визначеного без пірогенів. об'єму розчину або суспензії. У випадку спрею Для місцевого застосування на епідермі споцього можна досягти наприклад засобами дозувалуки формули (1) можна формувати, як мазі, крельного насосу для розпилення. ми або лосьйони, або як трансдермальний пласАерозольну композицію можна також використир. Мазі та креми можна, наприклад, формувати з товувати для застосування у респіраторному тракводною або масляною основою з додаванням ті, в ній сполуки формули (1) запропоновані в упапридатного желювального та/або загущувального ковці під тиском з придатним пропелентом, як-то засобу. Лосьйони можна формувати з водною або хлорфлуоркарбон (CFC) наприклад дихлордифлумасляною основою вони загалом також містять орметан, трихлорфлуорметан або дихлортетрафодин або більше емульгаторів, стабілізаторів, дислуоретан, карбон діоксид або інший придатний газ. пергувальних засобів, суспендувальні засобів, Аерозоль може також містити поверхнево-активну загущувальних засобів або барвників. речовину, як-то лецитин. Дозу ліків можна регулюДля місцевого застосування у роті, сполуки вати дозувальним клапаном. формули (1) можна формувати, як коржі, що місАльтернативно сполуки формули (1) можуть тять активний інгредієнт у смаковій основі, звичайбути у формі сухого порошку, наприклад, порошно сахарозі та камеді акації чи трагаканту; пастилкової суміші сполук з придатною порошковою оски, що містять активний інгредієнт у інертній новою, як-то лактоза, крохмаль, похідні крохмалю, основі, як-то желатин та гліцерин або сахароза та як-то гідроксипропілметилцелюлоза та полівінілпікамедь акації; та полоскання для рота, що містять ролідин (PVP). Порошкові носії повинні утворюва 17 79433 18 ти гель у порожнині носа. Порошкова композиція кування гіберелінів досягає піку (3000mg/мл сереможе бути у формі одиничної дози, наприклад, у довища), ферментацію зупиняють. капсулах або патронах, наприклад, з желатину, Виділення: Ферментаційне середовище (18л) або блістерних упаковках, з яких порошок можна доводять до рН 6,5-7,0 10% NaOH, далі відфільтзастосовувати засобами інгаляції. ровують. Шар на фільтрі (міцелій) промивають 4л У композиціях для застосування у респіраторН2О. Фільтрат та промивки комбінують та випарюному тракт, включаючи назальні композиції, сполук ють у вакуумі до об'єму 2л. Концентрат перемішуповинні взагалі мати невеликий розмір частинок, ють при 5-10°С з етилацетатом (5л) та доводять наприклад, порядку 5 мікрон або менше. Такий до рН1,5 6Η НСІ Далі два шари відокремлюють. розмір частинок можна отримувати засобами, доНижчий водний шар реекстрагують етилацетатом бре відомими у рівні техніки, наприклад, мікроніза(2л). Органічні екстракти комбінують, та промивацією. ють водою (2л), далі випарюють до 400мл. КонцеДля застосування у шлунково-кишковому трантрат перемішують та нагрівають при 60-70°С прокті сполуки формули (1) або фармацевтично притягом 3-4 годин, доки не припиняється осадження. йнятні їх похідні можна застосовувати будь-яким зі Після охолодження до кімнатної температури суспособів та композицій, застосовуваних у рівні спензію фільтрують. Твердий продукт промивають техніки у шлунково-кишковому тракті. холодним етилацетатом та сушать, отримуючи Коли бажано, композиції отримують з уповільсуміш гіберелінів А3 та А4/А7 , як білуватий твердий неним вивільненням активного інгредієнту. продукт (45г). Ця суміш містить приблизно 80% А3, Сполуки формули (1) можна також використо4% А4 та 4% А7. вувати у комбінації з іншими терапевтичними за(с) Очистка: 10г суміші гіберелінів А3 та А4/А7 , собами, наприклад, анти-діабетичними засобами, яку згадано вище, розчиняють у суміш 15мл метаяк-то інсулін, IGF, або аналгетики, антинолу, що містять 1мл води, та 30мл ацетону. Розгіпертензивні засоби, седативи, снодійні, ліпідопочин розбавляють 100мл етилацетату, що містять нижувальні засоби, антиінфекційні засоби тощо. 10мл води. Суміш фільтрують. Фільтрат випарюЗгідно з винаходом крім того запропоновано згідно ють у вакуумі до об'єму приблизно 80мл. Суміш з наступним аспектом комбінацію, що містить споперемішують та нагрівають при 60-80°С протягом луки формули (1) або фармацевтично прийнятні їх 2-3 годин, далі охолоджують до кімнатної темпепохідні разом з іншим терапевтично активним заратури і відфільтровують. Твердий продукт промисобом. вають холодним етилацетатом та сушать, отриКомбінації, згадані вище можна легко застосомуючи гіберелін А3 з чистотою >95%, як білі вувати у формі фармацевтичної композиції, отже кристали (6,3г). МС: 391 (М-1+2Na)+ 369 (М+23)+ такі композиції, що містять комбінацію, яку визна329 (М+1-Н2О)+. чено вище, разом з фармацевтично прийнятним Приклад 2. носієм, складають наступний аспект винаходу. Отримання солей та естерів гібереліну А3. Індивідуальні компоненти такої комбінації мо(а) Отримання гібереліну, як натрієвої солі: жна застосовувати послідовно або одночасно в Розчин 346мг (ммоль) гібереліну А3 розчиняють у окремій або комбінованій фармацевтичній компо1,5мл метанолу, додають до розчину NaHCO3 зиції. (84мг, 1ммоль) у 2мл води. Коли сполуки формули (1) використовують з Суміш випарюють під зниженим тиском досудругим терапевтичним засобом, активним при ліха. Залишок далі розчиняють у воді (2мл) та сукуванні діабету та пов'язаних станів, доза кожної шать сублімацією, отримуючи натрієву сіль гібесполуки може бути такою ж самою, як при застосуреліну А3 як білий твердий продукт з кількісним ванні кожної сполуки поодинці, або відрізнятися виходом. від неї. Прийнятні дози легко визначать фахівці. (b) Отримання цинкової солі гібереліну А3 : Сполуки формули (1) та їх фармацевтично 100мг натрієвої солі гібереліну А3 розчиняють у прийнятні похідні можна отримувати будь-якими 10мл води, далі пропускають через колонку (20мл) способами, добре відомими у рівні техніки для Dowex 50 із завантаженою іонами цинку смолою отримання сполук аналогічної структури. Колонку далі промивають 30мл Н2О. Ефлюєнт та Представлений винахід далі описано наступпромивки комбінують та випарюють у вакуумі до ними прикладами, які надано тільки для ілюстраневеликого об'єму, далі сушать сублімацією, тивної мети без обмеження винаходу. отримуючи цинкову сіль гібереліну А3 , як білий Приклад 1. твердий продукт з кількісним виходом. Ферментація, виділення та очистка гіберелінів. (c) Отримання етилового естеру гібереліну А3 : (а) Ферментація: штам Gibberella fujikuroi, що 346мг (1ммоль) гібереліну А3 розчиняють у суміші продукує гіберелін А3, А4 та А7 інокулюють та виацетону (10мл) та води (0,2мл). До суміші додають рощують у середовищі, що містить 100г глюкози, при -20°С, триетиламін (100мг, 1ммоль), N100г сахарози, 2,5г ΝΗ4ΝΟ3, 0,25г KН2РО4 , 0,2г метилморфолін (10мг, 0,1ммоль), етилхлорформіат (108мг, 1ммоль). Суміш перемішують при -15°С MgSO4 , 0,01г FeSO 4×7H2O, 0,03г ZnSO 4×7H2O, 0,1г протягом 20 хвилин, далі розбавляють безводним KCI, 10г пептону, 3г СаСО3, 1000мл Н2О, при 28°С етанолом (10мл). Суміш перемішують при кімнатпротягом 3-4 діб. Це переносять далі у середовиній температурі протягом ночі, далі випарюють ще для продукування, що містить 1000г глюкози, 100г пептону, 24г ΝΗ4ΝΟ3, 100г KН2РО4, 20г досуха. Залишок далі розподіляють між етилацетатом (30мл) та водою (5мл). Органічний шар віMgSO4×7Н2 О, 20г FeSO4×7H2О, 1,5г Na2B4O 7,10H2O, докремлюють та промивають послідовно 2% НСІ 8г CuSO4×7Н2О, 0,7г (NH 4)6MO7O 24-4H2O, 20л Н2О, (5мл), водою (5мл), 5% NaHCO3 (5мл´2), β водою при рН4,5 при 28°С протягом 8-10 діб. Коли проду 19 79433 20 (5мл), далі випарюють під зниженим тиском досуЕксперименти з культурою клітин шкіри людиха, отримуючи безбарвний твердий етиловий есни проводили, використовуючи середовища кератер гібереліну А3 (319мг, 85%) МС 375 (М+1)+. тиноцитів. Кожну комірку засівали 1500 клітинами. Приклад 3. Інкубацію проводили при 37°С протягом періоду 5 (а) Вплив гібереліну А3 на ріст клітин in vitro у діб. Експерименти показали: порівнянні з EGF. Експеримент 3,1 3,2 3,3 3,4 Середов ища Результати Суцільне середов ище кератиноцитів (що містить Дуже гарний ріст (шв идкість поділу кліт ин = 100) EGF) Суцільне середов ище кератиноцитів , (що містить Дуже гарний ріст (шв идкість поділу кліт ин = 100) EGF) плюс гіберелін А 3 (5mg/мл) Середов ище кератиноцитів , що не містить EGF Поганий ріст Середов ище кератиноцитів , що не містить EGF, Дуже гарний ріст (шв идкість поділу кліт ин = 100) але містить гіберелін А 3 (5mg/мл) Експерименти 3,1 та 3,3 свідчать, що EGF (епідермальний фактор росту) є суттєвим для росту клітин. Експеримент 2 свідчить, що наявність як EGF, так і гібереліну А3 не викликало додаткового впливу на швидкі росту клітин. Експеримент 4 засвідчив, що гіберелін А3 поодинці може стимулювати ріст клітин так ефективно, як EGF. (b) Вплив гібереліну А3 на ріст культури клітин у порівнянні з IGF, використовуючи IGF-1 замість EGF для експерименту з культурою клітин, згаданого в (а). Результати є подібними до наведених в (а). Приклад 4. Вплив суміші гібереліну А3 з гібереліном А4 та/або А7 порівнювали з впливом IGF-1 на ріст клітин in vitro. Результати є подібними до наведених у прикладі 3(b). Приклад 5. Вплив гібереліну А3 на діабетичних щурів. Способи: Самців щурів Wistar (290г~330г) зважували та трохи анестезували (4% галотану, 2:1 O2/N2 O) так, щоб рівні глюкози у крові можна було вимірювати на зразках хвостової вени, використовуючи глюкомер Precision Q.I.D.. Діабет далі викликають одною ін'єкцією стрептозотоцину у хвостову вену (STZ, 60мг/кг), який розчиняють безпосередньо перед застосування у цитратному буфері (50мМ лимонна кислота та 50мМ тринатрій цитрат; рН4,5). Еквівалентний об'єм цитратного буферу ін'єктують підібраним за віком контрольним щурам. Щурів розміщають групами по два протягом експерименту. Помешкання для тварин тримають при температурі 20°С (±2°С) з 12 годинним циклом світло/темрява, та щурам дають вільний доступ до їжі та води. Етичне схвалення для усіх експериментів отримано від Pharmacology Animal Ethics Committee. Застосування ліків та протокол добового моніторингу: Через 48 годин після застосування STZ (60мг/кг), беруть зразок кров на глюкозу і тварин з рівнями глюкози у крові більше 16мМ розглядають як діабетичних. Щурів є далі випадково розділяють на групи. Використовують повільно діючий інсулін Lente Monotard та натрієву сіль гібереліну, що зроблено за потребою у дистильованій воді безпосередньо перед застосуванням. Дані про глюкозу у крові отримують через 2 години або 5 годин після застосування ліків кожні три доби. Результати є такими: Група № Добов е застосув ання 1 2 3 4 5 Інсулін 4 одиниць/щура (підшкірно) Інсулін 2 одиниць/щура (підшкірно) гіберелін А 3 5мг/кг (підшкірно) +2 одиниць інсуліну/щур (підшкірно) гіберелін А 3 5мг/кг (інтраперитонально) +2 одиниць інсуліну/щур (підшкірно) гіберелін А 3 5мг/кг (перорально) +2 одиниць інсуліну/щур (підшкірно) Приклад 6. Вплив суміші гібереліну А3 та А4/А7 на діабетичних щурів. Протокол цього експерименту такий же, як у Комп’ютерна в ерстка Т. Чепелев а Рів ень глюкози у кров і (мМ) після доби 20 2 годин 5 годин 4-5 3-5 15-18 14-16 Зміна маситіла на добу 30 +8% -8% 4-6 N.A. +10% 4-5 4-6 +12% 4-6 +10% прикладі 5, але використовують замість гібереліну А3 суміш гібереліну А3 та А4/А7. Результати не відрізняються від представлених у прикладі 5. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601