Спосіб лікування аутизму та інших розладів аутистичного спектра препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин

Реферат: Спосіб лікування аутизму та розладів аутистичного спектра включає приготування препаратів у вигляді клітинної суспензії, яка містить стовбурові клітини, з подальшим її кріоконсервуванням та щонайменше одне введення вказаної клітинної суспензії стовбурових клітин. Виготовляють два препарати у вигляді клітинної суспензії стовбурових клітин, виділених з матеріалу фетуса людини 5-9-тижневої гестації, одна з яких містить стовбурові клітини фетальної печінки, а друга суспензія містить нервові стовбурові клітини фетального головного мозку. Клітинну суспензію стовбурових клітин фетальної печінки вводять шляхом внутрішньовенного введення, а клітинну суспензію нервових стовбурових клітин фетального головного мозку вводять підшкірно. При цьому перед введенням суспензії стовбурових клітин фетальної печінки додатково виконують премедикацію. UA 85144 U (12) UA 85144 U UA 85144 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить медицини, а саме: до неврології, педіатрії та клітинної терапії, та може бути використана при лікуванні дітей, хворих на аутизм та інші розлади аутистичного спектра шляхом введення суспензій, що містять стовбурові клітини ембріофетального походження, зокрема стовбурові клітини фетальної печінки та нервові стовбурові клітини фетального головного мозку. Відомо, що розлади аутистичного спектра (РАС) - це спектр психічних характеристик, що описують широке коло аномальної поведінки та утруднень в соціальній взаємодії і комунікаціях. До РАС належать наступні захворювання: аутизм, синдром Аспергера, дитячий дезінтегративний розлад, синдром Ретта та неспецифічні первазивні порушення розвитку. Так, аутизм - це порушення розвитку, що є наслідком неврологічного розладу і позначається на функціонуванні мозку, яке виявляється протягом перших трьох років життя [1, 5]. При цьому аутизм - це стан, що характеризується переважно замкнутим внутрішнім життям, активним відстороненням від зовнішнього світу та бідністю вираження емоцій. Діти з РАС зустрічаються в усіх країнах світу. Однак літературні дані, зокрема про аутизм, суперечливі. За даними одних дослідників аутизм зустрічається від 2 до 5 випадків на 10000 дитячого населення [2], інші дослідження говорять про 20 випадків [4]. Це пояснюється труднощами діагностики, особливо диференційної, різним розумінням клінічних та психологічних проявів аутизму і далеко не завжди адекватною оцінкою стану своєї дитини батьками. Проте, кількість дітей, у яких виявлений аутизм, різко виросла з 1980-х років, зокрема внаслідок зміни підходів до діагностики. Загалом же аутистичні розлади у дітей зустрічаються частіше, ніж дитячі онкологічні захворювання, синдром Дауна, глухота та сліпота, взяті разом. Однак проблемам РАС в Україні поки що приділяють мало уваги. Згідно з даними Міністерства охорони здоров'я (МОЗ) України, захворюваність на аутистичні розлади за останні роки зросла. За 2011 рік було зафіксовано більше тисячі вісімсот дітей, яким діагностували РАС, що майже втричі більше, ніж п'ять років тому. У 2012 році, згідно зі статистикою МОЗ України, аутизм вперше діагностували 413 хлопцям і дівчатам [2]. Сучасна наука не може однозначно встановити причини виникнення аутизму та інших розладів аутистичного спектра. Так, існують припущення, що аутизм може бути детермінований генетично та провокуватися такими факторами, як інфекції в період вагітності, важкими або неправильно проведеними пологами, щепленнями, психотравмуючими ситуаціями в ранньому дитячому віці [4, 5]. Згідно з літературними даними, хлопчики в 3-4 рази частіше страждають на аутизм та РАС, ніж дівчата, але аутистичні порушення у останніх мають більш злоякісний характер [3, 4]. Не дивлячись на великі досягнення у вивченні патогенезу аутизму та інших РАС, включаючи імунологічні та імуногенетичні дослідження з виходом на нові напрями патогенетичної терапії, це захворювання залишається однією з невирішених проблем сучасної неврології. Так зокрема аутизм є однією з головних причин дитячої інвалідності. Прогноз залежить від ступеня тяжкості аутистичних розладів, наявності чи відсутності органічних уражень, розвитку інтелекту, мови та своєчасності проведення лікувальних заходів. Відомо, що при відсутності лікування та корекційної допомоги у майже 70 % дітей з аутизмом розвиваються тяжкі порушення, що призводять до інвалідності та зумовлюють потребу в постійному догляді сторонніх осіб. Своєчасне лікувально-корекційне втручання значно покращує прогноз. Ранні діагностика та терапевтичні заходи можуть покращити симптоматику захворювання. Аутизм та інші РАС - невиліковні захворювання, але своєчасна діагностика та рання корекційна допомога дозволяють досягти значних успіхів: адаптувати дитину до життя в суспільстві, навчити її долати власні страхи та контролювати емоції. Відомий спосіб лікування дітей з аутистичними розладами на фоні стандартної терапії, що включає введення гліатиліну внутрішньом'язово по 2 мл щоденно курсом 10 ін'єкцій та здійснення транскраніальної мікрополяризації, яку проводять курсом 5 процедур через день із експозицією 20 хвилин на першому сеансі з подальшим збільшенням часу впливу на 5 хвилин на кожному наступному сеансі (патент Російської Федерації на винахід № 2429831, дата публікації - 27.05.2011 р., МПК: А61К 31/14, А61Р 25/28, A61N 1/20). При цьому електроди накладають на передньо-лобну ділянку (анод), на соскоподібний відросток (катод), на потиличну ділянку (анод) однойменної півкулі з наступним залученням протилежної півкулі в кінці лікування. Зазначений спосіб лікування дітей з РАС забезпечує покращення показників зорової пам'яті, слухомовної пам'яті, уваги, розумових процесів та емоційної сфери, що дозволяє істотно скоротити терміни госпіталізації та підвищити ефективність лікування. 1 UA 85144 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Недоліком відомого способу лікування дітей з РАС є те, що діти з даними розладами не завжди зможуть сидіти в одному положенні протягом 20 хвилин для здійснення транскраніальної мікрополяризації. Відомий спосіб лікування затримки психомовного та інтелектуального розвитку різного походження шляхом проведення нейротрансплантації ембріональної нервової тканини в кору головного мозку в різні області полів Бродмана: 44, 45, 46, 32, 43, 24, 25, 22, 41 і 42 (патент Російської Федерації на винахід № 2219937, дата публікації - 27.12.2003 р., МПК: А61К 35/48, А61К 35/54). При цьому для нейротрансплантації використовують ембріональну нервову тканину 5-7-тижневої гестації об'ємом 20-27 кубічних мм донорської тканини. Зазначений спосіб лікування затримки психомовного та інтелектуального розвитку різного походження дозволяє підвищити ефективність лікування. Недоліком відомого способу є його висока складність, що обмежує його застосування, а оперативне втручання може зумовити побічні ефекти та ускладнення. Найбільш близьким до способу лікування аутизму та інших РАС, що заявляється, є спосіб лікування розладів психічного розвитку, що включає приготування препарату у вигляді суспензії стовбурових клітин з подальшим її кріоконсервуванням та введення вказаної суспензії стовбурових клітин (патент Російської Федерації на винахід № 2303462, дата публікації 23.05.2006 р., МПК: 2006117602/15, A61L 27/54, А61К 35/28). При цьому як стовбурові клітини для приготування суспензії використовують 34-аутологічні мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), виділені із кісткового мозку пацієнта та культивовані in vitro, які вводять паренхіматозно у кількості 7-12 млн аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин в одну із раніше визначених 6 зон Бродмана 44, 43, 46, 24, 25, 22, 41 і 42 з концентрацією (0,7-1,2)×10 в 1 мл біотрасплантата. Причому при виражених анатомічних змінах зон мозку трансплантацію МСК проводять також внутрішньосудинно (внутрішньоартеріально або внутрішньовенно), причому загальна кількість МСК, що вводяться, становить від 7 до 25 млн. При операції поєднують обидва способи введення клітин, причому додаткове введення здійснюють з дозуванням (0,56 0,7)×10 аутологічних МСК на 1 кг ваги хворого. Зазначений спосіб лікування розладів психічного розвитку є ефективним при лікуванні затримки психічного розвитку у дітей, зокрема розумової відсталості з вираженим зниженням інтелектуально-мнестичних функцій, пов'язаних з психічним недорозвиненням та порушенням зв'язків центральної нервової системи (ЦНС). Недоліком відомого способу лікування розладів психічного розвитку є недостатнє зменшення патологічного процесу та збільшення обсягу відновлення неврологічних функцій при лікуванні саме аутизму та інших РАС. Крім цього, недоліком відомого способу є необхідність скорочення проміжку часу від отримання МСК з середовища, на якому культивують клітини, до їх трансплантації безпосередньо в мозок хворого. Це пов'язано з тим, що з кожною хвилиною певна кількість клітин стає нежиттєздатною, що впливає на кінцевий ефект. Задачею даної корисної моделі є удосконалення способу лікування аутизму та інших розладів аутистичного спектра препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин, в якому за рахунок запропонованої послідовності проведення лікування забезпечується висока ефективність лікування аутизму та інших розладів аутистичного спектра, зокрема вираженого зниження інтелектуально-мнестичних функцій, пов'язаних з психічним недорозвиненням та порушенням зв'язків ЦНС, при зменшенні патологічного процесу та збільшенні обсягу відновлення неврологічних функцій без необхідності підбору донора за антигенами гістосумісності. В результаті - зменшується психологічний дефіцит, покращуються когнітивні функції, якість життя та соціальна адаптація дітей, хворих на розлади аутистичного спектра. Крім цього забезпечується запобігання виникнення алергійних реакцій та запобігання відторгнення стовбурових клітин фетальної печінки і нервових стовбурових клітин фетального головного мозку організмом хворих на аутизм та інші розлади аутистичного спектра при проведенні лікування. Поставлена задача вирішується запропонованим способом лікування аутизму та інших розладів аутистичного спектра, що включає приготування препарату у вигляді клітинної суспензії, яка містить стовбурові клітини, з подальшим її кріоконсервуванням, та щонайменше одне введення вказаної клітинної суспензії стовбурових клітин, в якому виготовляють два препарати у вигляді клітинної суспензії стовбурових клітин, виділених з матеріалу фетуса людини 5-9-тижневої гестації, одна з яких містить стовбурові клітини фетальної печінки, а друга суспензія містить нервові стовбурові клітини фетального головного мозку, причому клітинну суспензію стовбурових клітин фетальної печінки вводять шляхом внутрішньовенного введення 6 в об'ємі, не меншому за 0,1 мл, з кількістю ядровмісних клітин не менше за 30,68×10 в 1 мл за одне введення, а клітинну суспензію нервових стовбурових клітин фетального головного мозку 2 UA 85144 U 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вводять підшкірно в об'ємі, не меншому за 0,1 мл, з кількістю клітин не менше за 8,7×10 в 1 мл за одне введення, при цьому перед введенням суспензії стовбурових клітин фетальної печінки додатково виконують премедикацію. При цьому клітинну суспензію стовбурових клітин фетальної печінки трансплантують разом із фізіологічним розчином натрію хлориду зі швидкістю 20-40 крапель за хвилину. Краще, коли премедикацію виконують шляхом внутрішньовенного введення 10 мг димедролу і 15 мг преднізолону. Перед введенням клітинної суспензії стовбурових клітин фетальної печінки та клітинної суспензії нервових стовбурових клітин фетального головного мозку додатково виконують клініко-неврологічне, нейропсихологічне та імунологічне обстеження стану хворого. Перед проведенням лікування та кожні три місяці після введення клітинної суспензії стовбурових клітин фетальної печінки та клітинної суспензії нервових стовбурових клітин фетального головного мозку здійснюють контроль активності патологічного процесу за клінічними, лабораторними та нейропсихологічними показниками. Нами було встановлено, що за рахунок введення принаймні двох клітинних суспензій стовбурових клітин ембріофетального походження, а саме внутрішньовенного введення суспензії стовбурових клітин фетальної печінки людини 5-9-тижневої гестації в об'ємі, не 6 меншому за 0,1 мл, з кількістю ядровмісних клітин не менше за 30,68×10 в 1 мл за одне введення та підшкірного введення суспензії нервових стовбурових клітин фетального головного мозку людини 5-9-тижневої гестації в об'ємі, не меншому за 0,1 мл, з кількістю клітин не менше 6 за 8,7×10 в 1 мл за одне введення, забезпечується цілеспрямований вплив на функціональні структури головного мозку, що сприяє відновленню балансу нейротрансмітерних систем мозку внаслідок синтезу нейромедіаторів, покращенню нейромедіаторної передачі по аксонам та відновленню проведення нервових імпульсів по збереженим нервовим волокнам, в результаті чого досягається зменшення патологічного процесу та збільшення обсягу відновлення порушених неврологічних функцій без виникнення побічних ускладнень при високій ефективності лікування аутизму та інших РАС в цілому. В результаті - зменшується психологічний дефіцит, покращуються когнітивні функції, якість життя та соціальна адаптація хворих дітей. При цьому виключається необхідність підбору донора за антигенами гістосумісності та забезпечується можливість введення суспензії стовбурових клітин фетальної печінки повторно. Крім цього проведення премедикації перед введенням клітинної суспензії стовбурових клітин фетальної печінки дозволяє запобігти виникненню алергійних реакцій та запобігти відторгненню стовбурових клітин фетальної печінки організмом хворих під час проведення лікування. При цьому використання саме фетальної печінки та фетальної нервової тканини головного мозку для отримання стовбурових клітин з метою приготування лікувальних препаратів у вигляді суспензій обумовлено їх пластичністю, зокрема здатністю таких клітин зазнавати змін та диференціації у відповідь на навколишній вплив або відповідно до їх внутрішньої програми. Відомо, що клітини ембріофетального походження здатні до росту, розмноження, диференціації, міграції та встановлення зв'язків з іншими клітинами. Порівняно з клітинами зрілих тканин, вони мають кращу здатність до проліферації. Їх введення є ефективнішим також з огляду на утворення великої кількості ростових факторів. Клітини фетальної печінки можуть виробляти значну кількість стимулюючих речовин, таких як ангіогенний і нейротрофічний фактори, що сприяють виживанню та росту, проліферації, диференціації та можуть стимулювати регенерацію за рахунок оточуючих клітин господаря. Крім цього клітини фетальної печінки мають здатність виживати при нижчому рівні кисню, ніж їх повністю диференційовані аналоги, що робить їх стійкими до ішемічного ушкодження як під час маніпуляцій in vitro, так і після трансплантації. Проліферуючі або незрілі клітини фетальної печінки переважно не мають довгих відростків або сильної міжклітинної адгезії і, таким чином, зазнають менших пошкоджень під час приготування суспензії клітин. Ці властивості дозволяють вводити клітини фетальної печінки шляхом внутрішньовенної ін'єкції суспензії [4, 5]. Дані характеристики можуть пояснити і підвищене виживання клітин і тканин фетальної печінки в порівнянні з дорослими після кріоконсервації. Спосіб лікування аутизму та інших розладів аутистичного спектра препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин здійснюють наступним чином. Виготовляють два препарати у вигляді клітинної суспензії стовбурових клітин, одна з яких містить стовбурові клітини фетальної печінки, а друга суспензія містить нервові стовбурові клітини фетального головного мозку. Для цього в умовах операційної, з дотриманням правил асептики та антисептики, одержують ембріофетальний матеріал, а саме тканину печінки, нервову тканину головного мозку фетусів людини від 5 до 9 тижнів гестації, які загинули 3 UA 85144 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внаслідок медичного аборту в випадках, коли вагітність переривали за соціальними показниками при відсутності патології розвитку чи інфікованості фетуса та письмової інформованої згоди жінки донора. Далі вилучені тканини ембріофетального походження поміщають в стерильне транспортне середовище розчину Хенкса з антибіотиком. В стерильних умовах тканини сепарують та гомогенізують в розчині Хенкса. Отриману клітинну суспензію піддають фільтрації. Як кріопротектор, використовують диметилсульфоксид. Аліквотують клітинну суспензію в кріопробірки об'ємом 0,3-1,0 мл. Кріоконсервування суспензії стовбурових клітин проводять у камері програмного заморожувана за визначеною програмою. Таке кріоконсервування забезпечує практично необмежене довгострокове зберігання вказаної суспензії, дозволяє протягом необхідного часу дослідити препарат у вигляді клітинної суспензії на бактеріологічну та вірусологічну безпеку, визначити якісні та кількісні показники клітинної суспензії, сформувати банк клітинних суспензій стовбурових клітин відповідно до визначених вимог до клітинного препарату. При формуванні банку клітинних суспензій з тканин ембріофетального походження для лікування хворих на аутизм та інші РАС клітинна суспензія стовбурових клітин фетальної печінки та клітинна суспензія нервових стовбурових клітин головного мозку повинна мати такі параметри: вміст ядровмісних клітин (підраховують загальну кількість ядровмісних клітин, в одиниці об'єму за допомогою клітинного аналізатора чи візуально під мікроскопом в лічильній 6 камері) повинен становити не менше ніж 30,68×10 в 1 мл за одне введення суспензії для клітин 6 фетальної печінки та не менше за 8,7×10 в 1 мл за одне введення для нервових клітин фетального головного мозку; вміст живих клітин після кріоконсервування - 70 %. Клітинні суспензії, що містять стовбурові клітини фетальної печінки, та нервові клітини фетального головного мозку зберігають в кріобанку в рідкому азоті при температурі -196 °C. Пробірки, що містять суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин фетальної печінки та суспензію кріоконсервованих нервових стовбурових клітин фетального головного мозку, безпосередньо перед введенням виймають з рідкого азоту, занурюють у водяну баню при температурі +37 °C та витримують до появи рідкої фази. Подальші маніпуляції проводять при кімнатній температурі з суворим дотриманням правил асептики. Час перебування розмороженої суспензії стовбурових клітин фетальної печінки та суспензії нервових стовбурових клітин фетального головного мозку при кімнатній температурі не повинен перевищувати 10 хвилин. При цьому перед введенням здійснюють додатковий контроль якості суспензії стовбурових клітин фетальної печінки та суспензії нервових стовбурових клітин фетального головного мозку, зокрема проводять мікроскопію та здійснюють підрахунок кількості життєздатних клітин за допомогою автоматичного клітинного аналізатора. Перед початком проведення лікування аутизму та інших розладів аутистичного спектра шляхом введення суспензії стовбурових клітин фетальної печінки та суспензії нервових стовбурових клітин фетального головного мозку виконують клініко-неврологічне, нейропсихологічне та імунологічне обстеження стану хворого та здійснюють контроль активності патологічного процесу за клінічними, лабораторними і нейропсихологічними показниками. Далі перед введенням суспензії стовбурових клітин фетальної печінки з метою запобігання виникненню алергійних реакцій під час лікування виконують премедикацію шляхом внутрішньовенного введення 10 мг димедролу і 15 мг преднізолону через систему для переливання крові. Після цього разом із фізіологічним розчином натрію хлориду вводять суспензію стовбурових клітин фетальної печінки шляхом внутрішньовенного введення зі швидкістю 20-40 крапель за хвилину. При цьому об'єм лікувальної дози суспензії для одного введення підбирають індивідуально, але не менше за 0,1 мл з кількістю ядровмісних клітин, не 6 меншою за 30,68×10 в 1 мл. Введення клітинної суспензії нервових стовбурових клітин фетального головного мозку здійснюють підшкірно в об'ємі, не меншому за 0,1 мл, з кількістю 6 клітин не менше за 8,7×10 в 1 мл за одне введення. Така кількість клітин забезпечує необхідну якість клітинної суспензії та достатня для отримання високої ефективності лікування аутизму та РАС. Після введення суспензії стовбурових клітин фетальної печінки та суспензії нервових стовбурових клітин фетального головного мозку хворий знаходиться під спостереженням. При цьому після проведення лікування кожні три місяці здійснюють контроль активності патологічного процесу за клінічними, лабораторними, нейропсихологічними показниками. При цьому точки спостереження вибирають згідно з протоколом клінічного застосування препарату з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин, розробленим на основі клінічного досвіду. Ефективність лікування аутизму та інших РАС оцінюють за зменшенням патологічного процесу та за збільшенням обсягу відновлення неврологічних функцій, зокрема покращенням 4 UA 85144 U 5 10 когнітивних функцій, якості життя та соціальної адаптації дітей. Так, з 2004 по 2012 роки у клініці клітинної терапії було проліковано 137 хворих на аутизм відповідно до способу лікування аутизму та інших розладів аутистичного спектра, що заявляється. У всіх хворих спостерігався синдром раннього післятрансфузійного покращення: відбувалося поліпшення сну, зорового контакту, апетиту, зменшення стереотипних рухів. Поступово знижувалась активність захворювання, про що свідчила динаміка клінічних та лабораторних показників, покращувались когнітивні функції за даними шкали АТЕС (табл. 1). Після введення суспензії стовбурових клітин фетальної печінки та суспензії нервових стовбурових клітин головного мозку в жодному випадку не спостерігались ускладнення чи побічні явища, в тому числі реакція "трансплантат проти господаря" (РТПГ). Таблиця 1 Шкала АТЕС, бали Загальний бал Мова/Зв'язок Комунікабельність Сенсорні/Когнітивні функції Здоров'я/Фізичне/ Поведінка До лікування, N=137 95,2±5,99 17,33±1,80 20,4±2,29 Після лікування, N=137 Через 3 місяці Через 6 місяців Через 12 місяців 87,93±5,95 83,33±5,52* 69,80±5,19* 16,2±1,78 14,87±1,59* 11,67±1,39* 18,13±2,09 14,53±1,84* 14,53±1,84* 20,93±2,04 19±1,96 14,93±1,52* 15,87±1,71* 36,53±2,73 34,60±2,78 32,80±2,59* 28,67±2,71* * р