Пептид, що підвищує резистентність капілярів, фармацевтична композиція на його основі і спосіб її застосування

1. Пептид лізил-глутаміл-аспарагінова кислота загальної формули: H-Lys-Glu-Asp-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1]. 2. Пептид лізил-глутаміл-аспарагінова кислота загальної формули: H-Lys-Glu-Asp-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1], що має біологічну активність, C2 2 (13) 1 3 Технічний результат винаходу полягає в створенні нового пептиду, що підвищує резистентність капілярів, а також фармацевтичної композиції, що містить цей пептид як активне начало, використання якої підвищує резистентність капілярів і міцність стінок судин за рахунок нормалізуючого впливу на метаболічні процеси в клітинах стінок судин. Даний винахід стосується пептиду лізилглутаміл-аспарагінова кислота загальної формули: H-Lys-Glu-Asp-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1]. Виявлено, що пептид лізил-глутаміласпарагінова кислота загальної формули: H-Lys-Glu-Asp-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1], має біологічну активність, що проявляється в підвищенні резистентності капілярів. Інший аспект даного винаходу стосується фармацевтичної композиції, що підвищує резистентність капілярів, що містить як активне начало ефективну кількість пептиду лізил-глутаміласпарагінова кислота загальної формули: H-LysGlu-Asp-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1] і фармацевтично прийнятний носій. При цьому фармацевтична композиція знаходиться в формі, що підходить для парентерального введення. Наступний аспект даного винаходу стосується способу профілактики і лікування порушення мікроциркуляції в органах і тканинах, що полягає у введенні пацієнту фармацевтичної композиції, що містить як активне начало пептид лізил-глутаміласпарагінова кислота загальної формули: H-LysGlu-Asp-OH послідовності 1 [SEQ ID NO:1] в дозі 0,01-100мкг/кг маси тіла, принаймні, один раз на день протягом періоду, необхідного для досягнення терапевтичного ефекту. При цьому введення здійснюють парентерально. Пептид глутаміл-лізил-аспарагінова кислота загальної формули: H-Lys-Glu-Asp-OH отримують класичним методом пептидного синтезу в розчині. Можливість об'єктивного досягнення технічного результату при застосуванні заявленого винаходу підтверджена достовірними даними, представленими в прикладах, що містять експериментальні дані, отримані в дослідженнях, виконаних відповідно до методик, загальноприйнятих в даній галузі техніки. Регулююча дія пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH на судинну стінку, тобто що підвищує резистентність капілярів і міцність стінок судин, виявлена при його експериментальному вивченні. Вивчення біологічної активності проводили на експлантатах стінки судин, при експериментальному парадонтиті у щурів і у пацієнтів з ураженням судин різної етіології. Поняття "фармацевтична композиція", має на увазі різні лікарські форми, що містять пептид, які можуть знайти лікувальне застосування в медицині як засіб, що підвищує резистентність капілярів. Для отримання фармацевтичних композицій, що відповідають винаходу, ефективна кількість пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH як активного начала (діючої речовини) змішують з фармацевтично при 91137 4 йнятним носієм згідно з прийнятими в фармацевтиці способами компаундування. Поняття "ефективна кількість", має на увазі використання такої кількості активної речовини, яка відповідно до її кількісних показників активності і токсичності, а також на основі знань фахівця повинна бути ефективною в даній лікарській формі. Носій може мати різні форми, які залежать від лікарської форми препарату, бажаної для введення в організм. Для парентерального введення носій звичайно включає фізіологічний розчин або стерильну воду, хоч можуть бути включені інші інгредієнти, що сприяють стабільності, або для збереження стерильності. Суть винаходу пояснюється фігурою і таблицями. У Таблиці 1 показаний вплив пептиду H-LysGlu-Asp-OH на морфологічні і біохімічні показники периферичної крові морських свинок при вивченні токсичності. У Таблиці 2 показаний вплив пептиду H-LysGlu-Asp-OH на резистентність капілярів шкіри пацієнтів з гіповітамінозом. У Таблиці 3 показаний вплив пептиду H-LysGlu-Asp-OH на показники гемостазу у хворих на сенільну пурпуру. На Фігурі показаний вплив пептиду H-Lys-GluAsp-OH на розвиток експлантатів судинної стінки. Винахід ілюструється прикладом синтезу пептиду лізил-глутаміл-аспарагінова кислота загальної формули: H-Lys-Glu-Asp-OH (приклад 1), прикладами випробування токсичності і біологічної активності пептиду (приклади 2, 3, 4, 5, 6, 7), а також прикладами результатів клінічного застосування пептиду, що демонструють його фармакологічні властивості і підтверджують можливість досягнення профілактичного і/або лікувального ефекту (приклади 5, 6). Приклад 1. Синтез пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH 1. Назва сполуки: лізил-глутаміл-аспарагінова кислота. 2. Структурна формула: H-Lys-GIu-Asp-OH 3. Брутто-формула без протиіона: C15H26N4O8. 4. Молекулярна вага без протиіона: 390,39. 5. Протиіон: ацетат. 6. Зовнішній вигляд: білий аморфний порошок без запаху. 7. Спосіб синтезу: пептид отриманий класичним методом синтезу в розчині по схемі: 5 ВОС - трет.бутилоксикарбонільна група, Z - бензилоксикарбонільна група, OSu - N-оксисукцинімідний ефір, DCC - N,N-дициклогексилкарбодіімід, OBzl - бензиловий ефір, TFA - трифтороцтова кислота. 6. Характеристики готового препарату: - вміст основної речовини: 98,15% (по ВЕРХ, 220нм), - ТШХ - індивідуальний, Rf=0,65 (ацетонітрилвода 1:3), - вміст вологи: 6%, - рН 0,01% розчину: 4,77, - Питоме оптичне обертання: [ ]D22: -31°(с=1, Н2О), "Polamat A", Carl Zeiss Jena. Приклад синтезу: 1) BOC-Glu(OBzI)-OSu, N-оксисукцинімідний ефір N-трет.бутилоксикарбоніл-( -бензил) глутамінової кислоти (І). N-трет.бутилоксикарбоніл-( -бензил)глутамінову кислоту BOC-Glu(OBzl)-OH (33,7г, 0,1 моль) розчиняли в 50мл N,N'-диметилформаміду, охолоджували до температури -10°С, додавали при перемішуванні охолоджені (4-6°С) розчини N,N'дициклогексилкарбодііміду (23,0г, 0,11 моль) в 30мл N,N'-диметилформаміду і N-гідроксисукциніміду (13,0г, 0,11 моль) в 20 мл N,N'диметилформаміду. Реакційну суміш перемішували протягом 12год. при охолоджуванні льодом і далі протягом 1 доби при кімнатній температурі. N,N'-дициклогексилсечовину, що випала, відфільтровували і отриманий розчин активованого ефіру використовували без виділення на наступній стадії. 2) BOC-GIu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH, N.-трет.бутилоксикарбоніл-( -бензил)глутаміл-( -бензил)аспартат (II). ( -Бензил)аспарагінову кислоту H-Asp(OBzl)OH (28,0г, 0,12 моль) і 36мл (0,12 моль) триетиламіну суспендували в 50мл N,N'-диметилформаміду і перемішували протягом 1 год. Потім додали порціями розчин активованого ефіру BOC-Glu(OBzl)OSu (І), отриманий на попередній стадії. Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом двох діб. Потім підкисляли 0,5н сірчаною 91137 6 кислотою до рН 2-3 і екстрагували етилацетатом 4 50мл. Витяжки об'єднували і послідовно промивали 0,5н H2SO4 3 50мл, водою 2 50мл, 5% розчином NaHCO3 2 50мл, водою 2 50мл, насиченим розчином NaCl 2 50мл. Органічний шар сушили над Na2SO4, упарювали розчинник у вакуумі, залишок кристалізували під гексаном. Отримано 50г продукту (92%). Rf=0,34 (бензол-ацетон 2:1). 3) TFAH-Glu(OBzl)-Asp(OBzI)-OH (III), трифторацетат ( -бензил)-глутаміл-( -бензил)аспартату. N-трет.бутилоксикарбоніл-( -бензил)глутаміл( -бензил)аспартат (II) 5,68г ( 0,01 моль) розчиняють в 20мл суміші дихлорметан-трифтороцтова кислота (3:1). Через 2 год. розчинник упарювали у вакуумі при температурі 40°С, упарювання повторювали з новою порцією дихлорметану (2 10мл), залишок сушать у вакуумі над NaOH. Отримане масло 5,80г ( 100%). Rf=0,63 (н-бутанол-піридин-оцтова кислотавода, 15:10:3:12). 4) Z-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (IV), N,N дибензилоксикарбоніллізил-( -бензил) глутаміл-( бензил)аспартат. Трифторацетат ( -бензил)глутаміл-( -бензил) аспартату (III) 5,65г (0,01 моль) розчиняють в 10мл диметилформаміду, додають триетиламін 2,80мл (0,02 моль) і N-оксисукцинімідний ефір N,N дибензилоксикарбоніллізину 6,64г (0,013 моль). Суміш перемішують 24 години при кімнатній температурі. Продукт висаджують 0,5н розчином сірчаної кислоти (150мл), екстрагують в етилацетат (3 30мл), промивають 0,5н розчином сірчаної кислоти (2 20мл), водою, 5% розчином бікарбонату натрію (1 20мл), водою, 0,5н розчином сірчаної кислоти (2 20мл), водою і сушать над безводним сульфатом натрію. Етилацетат фільтрували, упарювали у вакуумі температурі при 40°С, залишок кристалізували в системі етилацетат/гексан. Продукт відфільтровували і сушили у вакуумі над Р2О5. Вихід 6,04г (72%). Т пл.=142°С. Rf=0,60 (бензол-ацетон, 1:1). 5) H-Lys-Glu-Asp-OH (V), лізил-глутаміласпартат. Захищений трипептид Z-Lys(Z)-Glu(OBzl)Asp(OBzl)-OH (IV) (0,90г) розчиняли в суміші метиловий спирт - вода (4:1) і гідрували над каталізатором Pd/C (5%) протягом 4год. Повноту проходження реакції деблокування контролювали по ТШХ в системі ацетонітрил-вода (1:3). Розчинник упарювали у вакуумі, залишок сушили у вакуумі над КОН. Для очищення 300мг препарату розчиняли в 4мл 0,01% трифтороцтової кислоти і піддавали високоефективній рідинній хроматографії на колонці із зверненою фазою 50х250мм Diasorb-130C16T, 7mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Умови хроматографування А: 0,1% TFA; В: MeCN/0,1% TFA, градієнт В 0 50% за 100хв. Об'єм проби 5мл, детекція при 215нм, сканування 190-600нм, швидкість потоку 10мл/хв. Відбирали фракцію 42,0-47,0хв. Розчинник упарювали у вакуумі при температурі не вище за 40°С, упарювання 7 багато разів (5 разів) повторювали з 10мл 10% розчину оцтової кислоти. Остаточно залишок розчиняли в 20мл деіонізованої води і ліофілізовували. Отримано 270мг очищеного препарату у вигляді аморфного білого порошку без запаху. 6) Аналіз готового препарату. - Вміст основної речовини визначали методом ВЕРХ на колонці Phenomenex С18 LUNA 4,6 150mm. A: 0,1% TFA, B: MeCN; grad.B 0-100% in 10min. Швидкість потоку 1мл/хв. Детекція при 220нм, сканування 190-600нм, проба 20 l. Вміст основної речовини 98,15%. - ТШХ: індивідуальний, Rf=0,65 (ацетонітрилвода 1:3, пластинки ПТШХ-П-В-УФ Sorbfil, силікагель СТХ-1ВЕ 8-12мкм, проявлення хлор/бензидин). - Вміст вологи: 6% (гравіметрично по втраті маси при сушінні 20мг при 100°С). - рН 0,01% розчину: 4,77 (потенціометрично). - Питоме оптичне обертання: [ ]D22:-31° (с=1, Н2О), "Polamat A", Carl Zeiss Jena. Приклад 2. Вивчення токсичності пептиду HLys-Glu-Asp-OH Загальнотоксичну дію пептиду H-Lys-Glu-AspOH досліджували відповідно до вимог "Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (2000): гострої токсичності при однократному введенні препарату, а також підгострої і хронічної токсичності при тривалому введенні пептиду. Дослідження по вивченню гострої токсичності проведене на 66 білих безпородних мишах-самцях масою 20-23г. Тварини були рандомізовано розділені на 6 однакових груп. Препарат вводили тваринам однократно внутрішньом'язово в дозах 1мг/кг, 2мг/кг, 3мг/кг, 4мг/кг, 5мг/кг в 0,25мл стерильного 0,9% розчину NaCl. Тваринам контрольної групи в тому ж об'ємі вводили 0,9% розчин NaCl. Дослідження по вивченню підгострої токсичності проведене на 60 білих безпородних щурахсамцях масою 160-240г. Щодня однократно тваринам піддослідних груп вводили препарат внутрішньом'язово протягом 90 днів в дозах 1мкг/кг, 0,1мг/кг, 1мг/кг в 0,5мл стерильного 0,9% розчину NaCl. Тваринам контрольної групи вводили в тому ж об'ємі стерильний 0,9% розчин NaCl. До введення препарату, на 30, 60 і 90 добу після початку введення препарату у тварин досліджували морфологічний склад і властивості периферичної крові. При завершенні експерименту досліджували біохімічні і коагулологічні показники крові. Дослідження по вивченню хронічної токсичності проводили протягом 6 місяців, виходячи з тривалості клінічного призначення препарату, що рекомендується, на 96 морських свинках-самцях масою 300-340г. Тварини піддослідних груп отримували щодня однократно внутрішньом'язово пептид протягом 6 міс. в дозах 1мкг/кг, 0,1мг/кг, 1мг/кг в 0,5мл стерильного 0,9% розчину NaCl. У контрольній групі тваринам вводили по аналогічній схемі стерильний 0,9% розчин NaCl в тому ж об'ємі. У тварин в периферичній крові загальноприйнятими методами визначали: кількість еритроцитів, гемоглобіну, ретикулоцитів, тромбоцитів, лейкоцитів, 91137 8 лейкоцитарну формулу, швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ), резистентність еритроцитів. Нарівні з цим визначали вміст в сироватці крові загального білка по методу Лоурі, калію і натрію методом плазменної спектрофотометрії. Після завершення експерименту проводили патоморфологічне дослідження головного і спинного мозку, спинномозкових гангліїв, щитовидної залози, паращитовидних залоз, надниркових залоз, сім'яників, гіпофіза, серця, легені, аорти, печінки, нирки, сечового міхура, підшлункової залози, шлунка, тонкої кишки, товстої кишки, тимуса, селезінки, лімфатичних вузлів, кісткового мозку. При вивченні гострої токсичності встановлено, що однократне введення пептиду, що досліджується, тваринам в дозі, що перевищує терапевтичну, рекомендовану для клінічного застосування, більш ніж в 5000 разів, не викликає токсичних реакцій, що свідчить про велику терапевтичну широту препарату. Вивчення підгострої і хронічної токсичності пептиду свідчить про відсутність побічних ефектів при тривалому застосуванні препарату в дозах, що перевищують терапевтичну в 100-1000 разів. При дослідженні впливу пептиду на морфологічний склад крові морських свинок встановлено збільшення кількості лейкоцитів через 3 і 6 місяців після початку введення препарату (Таблиця 1). Інші показники морфологічного складу крові тварин практично не змінювалися. Не відмічено достовірного впливу препарату на ШОЕ, резистентність еритроцитів і біохімічні показники сироватки крові. При оцінці загального стану тварин, морфологічних і біохімічних показників периферичної крові, морфологічного стану внутрішніх органів, стану серцево-судинної і дихальної систем, функції печінки і нирок патологічні зміни в організмі не виявлені. Відсутність загальнотоксичної дії дозволяє рекомендувати фармацевтичну композицію, що містить як активне начало пептид H-Lys-Glu-Asp-OH, для проведення клінічних випробувань. Приклад 3. Вплив пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH на розвиток експлантатів судинної стінки Експерименти проведені на 32 фрагментах судинної стінки периферичної артерії щурів лінії "Wistar", масою тіла 150-200г. Поживне середовище для культивування експлантатів складалася з 35% розчину Ігла, 25% фетальної сироватки теляти, 35% розчину Хенкса, 5% курячого ембріонального екстракту, в середовище додавали глюкозу (0,6%), інсулін (0,5од./мл), пеніцилін (100од./мл), глютамін (2мМ). Фрагменти судинної стінки вміщували в це середовище і культивували в чашках Петрі в термостаті при 36,7°С протягом 2 діб. У експериментальне середовище додавали пептид H-Lys-Glu-Asp-OH в концентраціях 1, 10, 100 і 200нг/мл. Критерієм біологічної активності служив індекс площі (ІП) - співвідношення площі всього експлантата разом із зоною росту до вихідної площі фрагмента судинної стінки. Значення ІП виражали в процентах, контрольне значення ІП приймалося за 100%. 9 На Фіг. показаний вплив пептиду H-Lys-GluAsp-OH на розвиток експлантатів судинної стінки. Встановлено, що через 1 добу культивування відбувалося розшарування експлантатів на колагеновій підкладці і починалося виселення клітин, що проліферують і мігрують по периферії експлантата. На 3-тю добу культивування при концентрації пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH 100нг/мл спостерігалося достовірне підвищення ІП експлантатів на 24%, в порівнянні з контрольними значеннями ІП. При дослідженні експлантатів судинної стінки на більш тривалих термінах культивування (7 днів) була виявлена аналогічна стимулююча дія пептиду HLys-Glu-Asp-OH в тій же концентрації. Таким чином, відносно тканини судинної стінки пептид H-Lys-Glu-Asp-OH чинив тканиноспецифічну дію, що проявляється в стимуляції росту експлантатів. Приклад 4. Вплив пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH на мікроциркуляцію у щурів з експериментальним пародонтитом Експерименти проведені на 45 білих безпородних щурах обох статей, з масою тіла 180-200г. Модель пародонтиту легкого ступеня досягалася методикою диференційованого годування щурів з використанням стандартного гранульованого корму ПК-120 протягом 1,5 місяців. У ході експерименту тварини були розподілені на 3 групи по 15 щурів в кожній: 1 група тварин з експериментальним пародонтитом, що був наданий самостійному перебігу; 2 група тварин з експериментальним пародонтитом, яким вводили 0,1мл стерильного 0,9% розчину NaCl в слизову перехідної складки ясен (контроль); 3 група тварин з експериментальним пародонтитом, яким вводили пептид H-Lys-Glu-Asp-OH протягом 10 днів шляхом щоденної однократної ін'єкції в дозі 2мкг в 0,1мл стерильного 0,9% розчину NaCl в слизову перехідної складки ясен з одночасним втиранням розчину пептиду. У всіх серіях дослідів під нембуталовим наркозом проводилася біомікроскопія слизової оболонки ясен у щурів з використанням контактних об'єктивів, оцінювалася швидкість кровотоку в капілярах за допомогою лазерного аналізатора капілярного кровотоку ЛАКК-01. Дослідження проводилися в 3х зонах ясен; у вільних яснах, в прикріплених яснах і перехідній складці при збільшенні 100. Клінічні прояви пародонтиту оцінювали візуально. При біомікроскопічній оцінці мікроциркуляторного русла в тканинах пародонта тварин 1-ої групи виявлено переважання запальних змін в мікросудинах, особливо яскраво виражене у вільних яснах. У даній області капіляри різко розширені, кровотік в них помітно уповільнений. У венулярній частині капіляри переобтяжені кров'ю за рахунок порушення венозного відтоку. Периваскулярна тканина набрякла, фон каламутний. По ходу капілярів відмічалися дифузні периваскулярні геморагії, що свідчить про значне підвищення проникності їх стінок. У зоні прикріплених ясен вказані ознаки порушення мікроциркуляції зберігаються, але виражені в меншій мірі. У перехідній складці ясен ознаки розладу мікроциркуляції носять більш різноманіт 91137 10 ний характер: в поверхневому шарі слизової оболонки порожнини рота спостерігаються гіперемовані капіляри з адгезією лейкоцитів і діапедезними геморагіями, особливо виражених в посткапілярній ланці мікроциркуляторного русла. У глибоких шарах слизової оболонки на фоні набряку тканин виявляються гіперемовані артеріоли з деформованими контурами, а також гіперемовані венули з уповільненим зернистим кровотоком. Найбільший показник індексу мікроциркуляції (ЇМ), що характеризує сумарну бальну оцінку порушення мікроциркуляції, був виявлений при гінгівіті у вільних яснах - 0,54±0,01, що більш ніж в 2 рази вище, ніж в нормальному пародонті (0,21±0,30). Цей показник в прикріплених яснах становив 0,31±0,08, а в області перехідної складки - 0,27±0,04. Морфометричне дослідження показало збільшення діаметрів капілярів у всіх зонах ясен: у вільних яснах 9,7±0,21мкм, в прикріплених яснах - 8,9±0,25мкм і в перехідній складці - 8,7±0,11мкм. У всіх зонах, що досліджуються, спостерігалося підвищення щільності капілярів на одиницю площі в порівнянні зі здоровими тканинами пародонта в середньому до 40±1,2мм2 (в нормі 29,3±2,3мм2). Лазерна доплерографія показала підвищення швидкості кровотоку у всіх зонах ясен: у вільних яснах - 29±1,2 ум. од.; в прикріплених яснах - 27±0,5 ум. од.; в перехідній складці - 22±1,0 ум. од. (в нормі - 18±1,3 ум. од.). Огляд слизової оболонки ясен щурів 2-ї групи (контроль) виявив поширену зміну її забарвлення від блідо-рожевого до яскраво-червоного з синюшним відтінком кольору. Біомікроскопія слизової оболонки виявила подальше погіршення трофічного забезпечення тканин пародонта у вигляді прогресуючого розладу мікроциркуляції. Так, кровотік в капілярах і дрібних венулах вільних і прикріплених ясен набував зернистого і уповільненого характеру з локальною агрегацією еритроцитів. Контури судин набували звивистого характеру і були деформовані. Помітно наростала проникність гістогематичного бар'єра, про що свідчить набряклість інтерстицію у вигляді помутніння фону і дифузні периваскулярні геморагії. Як компенсаторна реакція на порушення мікроциркуляції на гіпоксію тканин, що розвивається, спостерігалися ознаки посиленої проліферативної активності ендотелію, що виражається в наростанні звивистості мікросудин і феномені дуплікації капілярних петель. Ці зміни найбільш виразно виявлялися в прикріплених яснах і в поверхневих шарах перехідної складки. У перехідній складці на фоні помітного зниження швидкості кровотоку відмічалося зменшення числа функціонуючих капілярів, змінювалася форма капілярних петель у вигляді посилення їх звивистості, появи варикозних розширень та ін. Капілярний фон каламутний, контури капілярів нечіткі, що відображає порушення бар'єрних можливостей їх стінок з прогресуванням периваскулярних геморагій. Потрібно підкреслити, що появі ознак структурної перебудови мікроциркуляторного русла передувала генералізація патологічного процесу в тканинах ясен, що необхідно розглядати як несприятливу прогностичну ознаку. У даній групі експериментів відмічалося подальше збільшення ступеня порушення мікроциркуляції в тка 11 нинах пародонта у вигляді зростання HIM: у вільних яснах - до 0,75±0,03; в прикріплених яснах - до 0,63±0,04; в області перехідної складки - до 0,39±0,02. Морфометрія діаметрів мікросудин зон слизової оболонки ясен, що досліджуються в даній групі дослідів показала їх подальше розширення (у вільних яснах -12,3±0,36; в прикріплених яснах 9,8±0,35; в перехідній складці - 9,1±0,09) на фоні певного зниження щільності капілярів на одиницю площі в середньому до 30±1,5мм2. Лазерна доплерографія виявила значне зниження швидкості капілярного кровотоку у всіх зонах ясен: у вільних яснах - 15±1,5 ум.од.; в прикріплених яснах 17±0,7 ум.од., в перехідній складці - 19±1,2 ум.од. Огляд слизової оболонки ясен щурів, що отримували ін'єкції пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH, виявив зміну її кольору на блідо-рожевий і зниження набрякло-запальної реакції, особливо в області перехідної складки і прикріплених ясен. Біомікроскопія слизової оболонки ясен загалом виявила виражену корекцію ознак патологічної перебудови мікроциркуляторного русла і стихання ознак запалення, набряку тканин. Зміни мікроциркуляції в більшій мірі зберігаються у вільних яснах. Капіляри цієї зони дещо розширені, однак швидкість кровотоку в них різко зросла, кровотік став гомогенним. Контури капілярів відносно рівні, без ознак діапедезу еритроцитів, капіляроскопічний фон навколо них прозорий, що свідчить про відновлення порушеної проникності гістогематичного бар'єра. У зоні прикріплених ясен і перехідної складки біомікроскопія слизової оболонки ясен показала повну корекцію ознак порушення мікроциркуляції: помітно підвищилася кількість капілярів, що функціонують, їх контури стали рівними, чіткими, кровотік зберігав незначну зернистість, немає ознак порушення проникності і периваскулярного набряку тканин. У перехідній складці, в глибоких шарах слизової оболонки в одиничних венулах зберігався зернистий характер току крові. Індекс HIM у вільних яснах знижувався до рівня в нормальному пародонті - 0,29±0,15; а в прикріплених яснах і перехідній складці, відповідно, - 0,22±0,05 і 0,20±0,18. При морфометрії виявлене зменшення діаметрів капілярів у всіх зонах ясен (у вільних яснах - 8,2±0,1; в прикріплених яснах - 7,8±0,20 і в перехідній складці - 6,57±0,1) на фоні підвищеної щільності їх на одиницю площі, яка в середньому становила 34±2,7мм2. Показники лазерної доплерографії судин помітно знизилися майже до норми (у вільних яснах - 20±0,9 ум.од.; в прикріплених яснах 20±1,1 ум.од.; в перехідній складці -19±2,3 ум.од.). Таким чином, внаслідок експериментальних досліджень встановлено, що застосування пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH чинить нормалізуючий вплив на стан стінок капілярів, підвищуючи їх резистентність і проникність, а також на стан мікроциркуляторного русла слизової оболонки ясен і пародонта. Приклад 5. Вплив пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH на резистентність капілярів шкіри у пацієнтів з гіповітамінозом Дослідження проведене на 25 пацієнтах у віці 19-35 років з ознаками гіповітамінозу у весняний 91137 12 період. Пацієнти були рандомізовано розділені на дві групи. Основну групу хворих розділили на три підгрупи в залежності від ступеня тяжкості проявів гіповітамінозу. Пацієнтам, що страждають на гіповітаміноз важкого ступеня, фармацевтичну композицію, що містить як активне начало пептид H-Lys-GluAsp-OH, вводили в дозі 5,0мг в 1,0мл фізіологічного розчину щодня однократно внутрішньом'язово протягом 10 днів; пацієнтам з гіповітамінозом середнього ступеня тяжкості - в дозі 100,0мкг, а пацієнтам з легкими проявами гіповітамінозу - в дозі 1,0мкг в 1,0мл фізіологічного розчину щодня однократно внутрішньом'язово протягом 10 днів. Контрольна група включала 18 пацієнтів, що отримували ін'єкції фізіологічного розчину по аналогічній схемі. Пацієнти обох груп в цей період отримували тільки збалансовану вітаміновмісну дієту. Оцінка впливу пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH на резистентність капілярів шкіри проводилася з використанням манжеткової проби Румпеля-ЛеєдеКончаловського. Пацієнтам на верхню третину плеча накладали манжету тонометра. У манжеті створювали тиск в 200мм рт. ст. протягом 3хв. Резистентність капілярів шкіри оцінювали на ділянці дозованого навантаження на капіляри шкіри (під манжетою). Крововиливи підраховували з допомогою лупи. Резистентність капілярів шкіри оцінювали за п'ятибальною шкалою: І - до 5 дрібних петехій, II-від 6 до 15, III - до 30, IV - більше за 30 крововиливів, V - число крововиливів не піддається підрахунку, зливна реакція. Внаслідок проведеного дослідження було встановлено, що застосування пептиду H-Lys-GluAsp-OH сприяє підвищенню резистентності капілярів шкіри, що виражалося в достовірному зменшенні кількості крововиливів в шкірі з 30-47, що виявлялися у хворих обох груп до лікування, до 68 у хворих основної групи після лікування, в той час як у пацієнтів контрольної групи кількість крововиливів не змінилася (Таблиця 2). Таким чином, застосування фармацевтичної композиції, що містить як активне начало пептид H-Lys-Glu-Asp-OH в різному дозуванні, доцільне в комплексній терапії пацієнтів з гіповітамінозами з метою підвищення резистентності капілярів і запобігання ламкості судин. Приклад 6. Ефективність застосування пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH у хворих з сенільною пурпурою Дослідження проведене на 23 хворих сенільною пурпурою у віці 70-82 років, які пред'являли скарги на часту спонтанну появу плям крововиливів на обличчі, шиї, передпліччях і кистях рук. У хворих відмічалася прогресуюча динаміка розвитку захворювання. Всі хворі раніше отримували симптоматичну і патогенетичну терапію з приводу конкретних клінічних проявів судинної патології. 13 91137 Пацієнти були рандомізовано розділені на 2 групи. Основну групу становили 12 хворих, яким вводили фармацевтичну композицію, що містить як активне начало пептид H-Lys-Glu-Asp-OH, в дозі 100мкг в 1,0мл фізіологічного розчину щодня однократно внутрішньом'язово протягом 10 днів. Контрольна група включала 11 пацієнтів, що отримували ін'єкції стерильного фізіологічного розчину по аналогічній схемі. У динаміці оцінювали скарги хворих, проводили загальноклінічне дослідження крові і сечі, біохімічне вивчення крові. З метою дослідження гемостазу визначали коагулограму крові і використовували пробу Геса з джгутом. На відміну від контрольної групи, у хворих основної групи після застосування фармацевтичної композиції, що містить як активне начало пептид Н-Lys-Glu-Asp-OH в різному дозуванні, спостерігався більш виражений нормалізуючий вплив пептиду на показники гемостазу, що вивчаються, які 14 практично наближалися до показників у здорових осіб (час рекальцифікації, протромбіновий час, активований частковий тромбопластиновий час, етаноловий тест); у пацієнтів контрольної групи відмічалося лише невелике недостовірне поліпшення показників гемостазу (Таблиця 3). Внаслідок проведеного дослідження встановлено, що у хворих на сенільну пурпуру після застосування фармацевтичної композиції, що містить як активне начало пептид H-Lys-Glu-Asp-OH в різному дозуванні, спостерігалися поліпшення стану шкіри і підвищення міцності стінок капілярів, про що свідчать результати проби Геса, що показують зменшення кількості крововиливів. Таким чином, застосування фармацевтичної композиції, що містить як активне начало пептид H-Lys-Glu-Asp-OH, доцільне для лікування хворих сенільною пурпурою для підвищення резистентності і міцності стінок капілярів і нормалізації мікроциркуляції крові. Таблиця 1 Введення пептиду H-Lys-Glu-Asp-OH (1мкг/кг) Показник 12 Еритроцити, 10 /л Гемоглобін, г/л Ретикулоцити, % Тромбоцити, 109/л Лейкоцити, 109/л Нейтрофіли паличкоядерні, % Нейтрофіли сегментоядерні, % Еозинофіли, % Базофіли, % Моноцити, % Лімфоцити, % ШОЕ, мм/год. Резистентність еритроцитів, % NaCl - максимальна - мінімальна Загальний білок в сироватці крові, г/л Натрій в сироватці крові, г/л Калій в сироватці крові, г/л * - Р