Зоотехнічний спосіб введення похідної вітаміну е та композиція

1. Зоотехнічний, нелікувальний спосіб орального введення до організму сільськогосподарських тварин з однокамерним шлунком стабільної похідної вітаміну Е, окремо або в суміші з добавкою і/чи кормом, причому ця похідна може бути гідролізованою з перетворенням у засвоювану форму вітаміну Е, який відрізняється тим, що зазначену похідну вітаміну Е наносять на носій - двоокис кремнію - і вводять тваринам у присутності щонайменше одного кормового емульгатора, вибраного з неетоксильованих складних ефірів сорбіту і жирних кислот, що підсилюють біологічне засвоєння вітаміну Е та забезпечують відділення зазначеного похідного від носія - двоокису кремнію. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що похідна вітаміну Е та, щонайменше, один із зазначених емульгаторів вводять до організму тварин одночасно. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений емульгатор вводять до організму тварин до введення вітаміну Е. 4. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що похідну вітаміну Е і/чи зазначений принаймні один емульгатор домішують до корму. 5. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що похідну вітаміну Е і/чи зазначений принаймні один емульгатор домішують до корму. 2 (19) 1 3 Даний винахід відноситься в цілому до введення вітаміну E до організму сільськогосподарських тварин з однокамерним шлунком, таких, як свині, а також птахів, риб і креветок. Вітамін E або d- -токоферол у природі присутній головним чином у рослинних оліях; його одержують різними синтетичними способами у вигляді рацемату d, l- -токоферол (скорочено Тоl). Вітамін E в нативному вигляді є маслянистою, ліпофільною рідиною, яка змішується в будь-якій пропорції з будь-якою гідрофобною або ліпідною фазою. Вітамін E надзвичайно не стабільний і легко окислюється, в окисленому стані втрачає свою головну властивість: біологічну активність. Його біологічна доступність при перебуванні в організмі тварини не перевищує 50% після орального введення, тому що, швидко окислюючись, він здебільшого поглинається в окисленій неактивній формі. Тому в тих випадках, коли його призначають орально, вітамін E застосовують у вигляді більш стабільної похідної, яка вибирається, як правило, зі складних ефірів, наприклад, ацетату, і солей вітаміну Е. Перш ніж розглянути найбільш близький прототип винаходу і проблеми, не вирішені в цьому прототипі, а також описати винахід, нижче приводиться визначення поняття біологічної доступності речовини, як його розуміють далі в описі. Біологічна доступність вітаміну E або похідної вітаміну E визначається концентрацією цього вітаміну, який надійшов у кров, відносно концентрації вітаміну E в раціоні тварини або відносно концентрації, вираженої в еквіваленті вітаміну E його похідної, введеної, до раціону тварини у випадку призначення застосування похідного вітаміну. Отже, таке визначення поняття біологічної доступності вітаміну E передбачає всмоктування вітаміну E або його похідної кишковиком під час травного пасажу. Згідно Т. Julianto та ін., International Journal of Pharmaceutics, № 200, 2000 p., стор. 53-57, готували розчин вітаміну E в пальмовій олії з додаванням суміші емульгаторів, розводили водою і досліджували біологічну доступність вітаміну E в організмі людини, а потім порівнювали її з біологічною доступністю вітаміну Е, що вводиться у вигляді желатинових капсул. Виявилося, що при уведенні вітаміну E в вигляді зазначеного вище розчину, доступність вітаміну E є в три рази вищою. Однак, приймаючи до уваги нестабільність вітаміну E в неетерифікованому вигляді, такий розчин не може знайти застосування як харчова добавка. Відомі різні кормові добавки для тварин, зокрема, добавки, виготовлені заявником, до яких вітамін E вводиться у вигляді ацетату або ацетату d, l - -токоферилу (Тас) в адсорбованій формі на різних носіях, наприклад, на двооксиді кремнію, або в інших формах, наприклад, у вигляді емульсії «олія у воді». Після публікації Н.Е. Gallo-Torres, Lipids, 1970 р. т. 5, № 4, стор. 379 - 384, стало відомо, що аце 92137 4 тат d, l- -токоферилу безпосередньо не засвоюється людиною і тваринами, і що він дійсно піддається гідролізу з перетворенням у вітамін Е, який відбуваються в шлунково-кишковому тракті під дією панкреатичних ферментів, так званих холестерин-естерогідролаз (скорочено СЕН) , при цьому остаточне всмоктування вітаміну E відбувається в тонкому кишковику. Однак ацетат d, l- токоферилу має обмежену біологічну доступність, яка становить, наприклад, 40%, незалежно від того, якій тварині він уводиться. Метою даного винаходу є підвищення біологічної доступності похідних вітаміну Е, зокрема, ацетату d, l- -токоферилу. Зовсім несподівано було виявлено, що присутність спеціального емульгатора істотно підвищує біологічну доступність похідної вітаміну Е, причому зазначена похідна вітаміну E може бути гідролізованою і перетворюється в засвоювану форму вітаміну Е. Зазначений емульгатор є кормовим і вибирається з неетоксильованих складних ефірів сорбітолу і жирних кислот. З документа SU-1 676 572 відома композиція, яка містить ацетат вітаміну Е, поліетоксильований емульгатор і етанол. Ця композиція додається в питво для птахів у кількості, яка забезпечує добову дозу вітаміну E в кількості близько 3мг за певний період часу. Автори простежили за засвоюваністю вітаміну Е, при цьому коефіцієнт виживання і збільшення ваги птахів трохи перевищили ті ж показники, одержані при використанні традиційних композицій. Проблема, пов'язана з біологічною доступністю вітаміну E для сільськогосподарських тварин при додаванні його до кормового раціону, як і раніше залишається актуальною через дуже низьку його біодоступність, яку можна забезпечити за допомогою відомих композицій. Заявник виявив більший вплив емульгатора на біологічну доступність вітаміну E в складі композиції і, особливо, поліетоксильованого емульгатора. Ним також було встановлено, що даний емульгатор сприяє гідролізу похідної вітаміну E в шлунково-кишковому тракті з утворенням засвоюваної форми, причому це явище позитивно впливає на вивільнення біологічно ефективного вітаміну Е. Докладніше винахід описується нижче, його переваги приводяться в прикладах, зокрема, у порівняльних прикладах. Відповідно до кращого варіанта здійснення винаходу емульгатор вибирається зі складних ефірів жирної кислоти з довгим ланцюгом, наприклад, таких, як насичений або ненасичений вуглеводневий ланцюг, який містить, принаймні, 11 атомів вуглецю. Таким чином, першим об'єктом винаходу є зоотехнічний спосіб, який дозволяє вводити до організму сільськогосподарських тварин з однокамерним шлунком композицію з похідної вітаміну Е, у якій вітамін E залишається захищеним до свого 5 надходження на ділянку всмоктування й одночасно проявляє високу біологічну доступність. Спосіб відповідно до винаходу не є лікувальним і полягає в оральному введенні до організму сільськогосподарських тварин з однокамерним шлунком стабільної похідної вітаміну E окремо або у вигляді суміші з добавкою і/чи кормом, при цьому зазначена похідна може бути гідролізованою з перетворенням у засвоювану форму вітаміну E в присутності, щонайменше, одного кормового емульгатора, обраного з неетоксильованих складних ефірів сорбітолу і жирних кислот. Під жирною кислотою відповідно до винаходу слід розуміти переважно монокарбонову кислоту з вуглеводневим ланцюгом з n атомами вуглецю, при цьому n означає ціле число від 0 до 30, зазначений ланцюг є насиченим або ненасиченим. Відповідно до більш кращого варіанта винаходу жирні кислоти відповідно містять насичений або ненасичений вуглеводневий ланцюг, який містить, щонайменше, 11 атомів вуглецю. Спосіб відповідно до винаходу передбачає введення до організму тварини одночасно або послідовно похідної вітаміну E та емульгатора, наприклад, спочатку вводиться емульгатор, а потім похідна вітаміну Е. Отже, похідна вітаміну E і/чи емульгатор або емульгатори можуть бути домішані до корму. Також винахід стосується кормової композиції для тварин, яка дозволяє, зокрема, застосовувати описаний вище спосіб, у якому зазначена композиція містить стабільну похідну вітаміну Е, причому ця похідна може бути гідролізованою з перетворенням у засвоювану форму вітаміну Е, і, щонайменше, один кормовий емульгатор, обраний з неетоксильованих складних ефірів сорбітолу і жирних кислот. Відповідно до одного з варіантів винаходу бажано застосовувати два кормових емульгатора, які відповідають приведеному вище визначенню. Бажано, щоб композиція відповідно до винаходу задовольняла, принаймні, одну з приведених нижче характеристик. Вагове відношення між емульгатором або емульгаторами і похідною вітаміну може складати від 10:1 до 1:200, краще - від 1:5 до 1:100. Похідна вітаміну E є переважно складним ефіром вітаміну Е, зокрема, ацетатом вітаміну Е. Кращим емульгатором служить складний ефір сорбітолу, обираний з монолаурату, монопальмітату, моностеарату, моноолеату і тристеарату. Моноолеат є кращим. Як буде показано в прикладах, які нижче приводяться, краща композиція відповідно до винаходу містить ацетат вітаміну E і, щонайменше, один емульгатор, обраний з монолаурату сорбітолу і моноолеату сорбітолу. Іншим об’єктом винаходу є застосування кормового емульгатора, обраного з неетоксильованих складних ефірів сорбітолу і жирних кислот і призначеного для приготування кормової композиції для тварин на основі похідної вітаміну Е, при цьому бажано, щоб зазначені жирні кислоти відповідали приведеному,вище визначенню. Ще одним об'єктом винаходу є застосування 92137 6 описаного вище кормового емульгатора, призначеного для підвищення біологічної доступності вітаміну E в організмі сільськогосподарських тварин з однокамерним шлунком, причому ця похідна може бути гідролізованою з перетворенням у засвоювану форму вітаміну Е. Приклади, які нижче приводяться, показують вплив емульгатора відповідно до винаходу на біологічну доступність похідної вітаміну Е, його більшу ефективність у порівнянні з відомими емульгаторами і вплив на гідроліз похідної вітаміну Е, з посиланням на малюнки, на яких: фіг. 1 є графіком, на якому показана еквівалентна кількість вітаміну Е, зв'язаного клітинною культурою, у нмолях/см2 залежно від кількості інкубованого ацетату d, l- -токоферилу в нмолях/см2, при цьому ацетат d, І- -токоферилу інкубується без моноолеату (порожні стовпчики) і з застосуванням 0,05% моноолеату (заштриховані стовпчики); фіг. 2 і 3 є графіками, на яких показана еквівалентна кількість зв'язаного вітаміну Е, яка відповідає ацетату ретинілу (Rac, внутрішній еталон) у чорних колонках, ацетату d, І- -токоферилу в заштрихованих колонках і ацетату d, l- -токоферилу в порожніх колонках залежно від відсутності або наявності і типу емульгатора, інкубованого разом з ацетатом d, І- -токоферилу. Згідно фіг. 2 співвідношення між емульгатором і еквівалентом вітаміну E складає 6, згідно фіг.3 це співвідношення дорівнює 1; фіг. 4 показує ступінь гідролізу ацетату d, l- токоферилу і d, l- -токоферолу залежно від часу інкубації в умовах, описаних у прикладі 5, 5.2); фіг. 5 показує ступінь гідролізу ацетату d, l- токоферилу і d, l- -токоферолу залежно від часу інкубації в умовах, описаних у прикладі 5, 5.1). Відомості, які підтверджують можливість здійснення винаходу Приклад 1. Вплив емульгаторів на всмоктування ацетату вітаміну E (ацетат d, І- токоферилу) у клітинній системі in vitro При проведенні дослідів in vitro на відповідній клітинній моделі визначали кількість ацетату d, І- токоферилу, виражену в еквіваленті вітаміну Е, і ту яка зв'язується клітиною при інкубації відповідної клітинної культури, по-перше, у присутності тільки одного ацетату d, l- -токоферилу і, по-друге, у присутності ацетату d, l- -токоферилу та одного або декількох кормових емульгаторів відповідно до винаходу. Клітинна модель, яка застосовувалася, була лінією СаСО-2, доступною під номером НТВ-37 у American Type Culture Collection (ATCC). Клітинну культуру зазначеної лінії інкубували протягом 3 годин з міцелами ацетату d, l - токоферилу у воді. Кількість міцел, що зв'язалися з клітинною культурою визначали в нмолях/см2. Зазначена кількість складала від 4 до 60 нмолей/см2. За кожною концентрацією ацетату d, l- токоферилу, введеною до клітинної культури, вимірювали кількість ацетату d, l- -токоферилу, зв'язаного клітинною культурою, виражену в екві 7 валенті вітаміну E в нмолях/см2, з одного боку, без введеного в цю культуру емульгатора і, з іншого боку, при вмісті 0,05% (маса/об'єм) емульгатора сорбітану моноолеату, при цьому зазначений процентний вміст був отриманий розподілом маси введеного до культури емульгатора на об'єм міцел, введених до цієї ж культури. Графік на фіг. 1 показує кількість зв'язаного ацетату d, І- -токоферилу, виражену в еквіваленті вітаміну E в нмолях/см2 відносно кількості інкубованого ацетату d, l- -токоферилу в нмолях/см2, при цьому порожні стовпчики відносяться до міцел, введених без моноолеату, заштриховані стовпчики - до міцел, введених з використанням 0,05% моноолеату. При цьому встановлено, що чим більша кількість інкубованого ацетату d, І- токоферилу, тим більшою є відповідна еквівалентна кількість вітаміну Е, причому в останньому досліді спостерігалося зв'язування ацетату d, І- токоферилу клітинами, яке у шість разів перевищувало зв'язування при використанні емульгатора моноолеату. Приклад 2. Вплив емульгаторів на всмоктування ацетату вітаміну E (ацетату d, І- токоферилу) і вітаміну E в клітинній системі in vitro 2.1) Протокол експерименту Досліди з всмоктування проводилися з тією ж лінією клітин, що. і описана вище, при інкубації клітин протягом 3 годин у фізіологічному середовищі, близькому до середовища кишковика і такому, яке містило холестерин-естерогідралазу (СЕН), панкреатитний фермент, гідролізуючий ацетат d, l- -токоферилу в організмі тварин у вітамін Е, і таурохолат натрію, який відноситься до жовчних солей. Це середовище має вигляд емульсії «олія у воді», вигляд міцел, і відоме під комерційною маркою М20. У нього вносили ацетат d, І- токоферилу і за необхідності досліджуваний емульгатор. Еквівалентна концентрація вітаміну Е, введеного в кожну лунку у вигляді ацетату d, l- токоферилу, склала 156 мкМ. Для кожного досліду застосували по три планшети з 6 лунками (площа кожної лунки 9,6см2), які містили зазначене вище середовище і відповідно різні емульгатори. Кожен дослід проводився тричі. 2.2) Вагове співвідношення доданого в ацетат d, l- -токоферилу емульгатора (в еквівалентній кількості вітаміну E) середовища М20 склало близько 6 У даному досліді концентрація емульгатора, введеного до середовища М20, склала 0,05%, маса емульгатора (емульгаторів) до об'єму середовища 20М, що приблизно відповідає ваговому відношенню емульгатора, доданого до ацетату d, l- токоферилу середовища 20М, рівному близько 6. Було проведено шість дослідів, кожний з який здійснювали тричі, при цьому протоколом передбачалася інкубація протягом 3 годин у такий спосіб: 1) тільки середовище 20M з розрахунку 2 мМ середовища М20 на лунку; отже, ацетат d, l- токоферилу застосовувався без емульгатора; 2) середовище М20 + емульгатор монолаурат 92137 8 сорбітану; 3) середовище М20 + емульгатор монопальмітат сорбітану; 4) середовище М20 + емульгатор поліоксиетильований монолаурат сорбітану; 5) середовище М20 + суміш з 150 мкМ ацетату d, І - -токоферилу і 156 мкМ d, l - -токоферолу; 6) внутрішній стандарт, так званий ацетат ретинілу, який використовується як контроль в аналізі. На графіку фіг. 2 показані результати кожного досліду в нмолях еквівалента вітаміну Е, зв'язаного лункою: - кількість ацетату ретиніли, приведена в чорному стовпчику, - кількість ацетату d, І- -токоферилу, зв'язана клітинами і приведена в заштрихованих колонках, - кількість вітаміну Е, отримана гідролізом з наступним зв'язуванням, приведена в порожніх колонках. Як було виявлено під час дослідів 2) і 3), кількість вітаміну Е, зв'язана клітинною культурою, зросла приблизно на 50% у порівнянні з кількістю зв'язаною з застосуванням тільки одного середовища М20. Навпаки, за допомогою досліду 4) було встановлено, що з порівнянні з дослідом 1) без емульгатора емульгатор поліоксиетильований монолаурат сорбітану, який відповідає етоксильованому емульгатору (монолаурат сорбітану) у досліді 2), перешкоджає всмоктуванню ацетату d, І- токоферилу і вітаміну Е. Несподівано було встановлено, що етоксилювання емульгатора знижує позитивний вплив емульгатора відповідно до винаходу на всмоктування ацетату d, l - -токоферилу і вітаміну E. 2.3) Вагове відношення емульгатора, доданого в ацетат a, l- -токоферилу (в еквівалентній кількості вітаміну E) середовища М20, склало близько 1. У даному досліді концентрація емульгатора, введеного ло середовища М20, склала 0,01%, виражена в масі емульгатора (емульгаторів) до об'єму середовища 20М, що приблизне відповідає ваговому відношенню емульгатора, доданого до ацетату d, l- -токоферилу середовища 20М, рівному близько 1. Було проведено шість дослідів, кожний з який здійснювали тричі, при цьому протоколом передбачалася інкубація протягом 3 годин у такий спосіб: 1) тільки середовище 20M з розрахунку 2 мМ середовища М20 на лунку; отже застосовувалися тільки таурохолат натрію й ацетат d, l- токоферилу; 2) середовище М20 + емульгатор монолаурат сорбітану; 3) середовище М20 + емульгатор монопальмітат сорбітану; 4) середовище М20 + емульгатор монолаурат сорбітану і емульгатор монопальмітат сорбітану; 5) середовище М20 + емульгатор моноолеат сорбітану; 6) внутрішній еталон, так званий ацетат ретинілу, як контроль аналізу. Графік на фіг.3 показує по кожному досліді в 9 92137 нмолях еквівалента вітаміну E для кожної лунки: - кількість ацетату ретиніли, приведену в чорному стовпчику, - кількість ацетату d, l- -токоферилу, зв'язану клітинами і приведену в заштрихованих колонках, - кількість вітаміну Е, отриману гідролізом з наступним зв'язуванням, приведену в порожніх колонках. Навіть при низькому співвідношенні емульгатора до кількості ацетату d, l- -токоферилу (у порівнянні з 2.2)) відзначається вплив емульгатора відповідно до винаходу на всмоктування ацетату d, І- -токоферилу або вітаміну Е. Приклад 3. Порівняння впливу емульгаторів відповідно до винаходу з впливом відповідних етоксильованих емульгаторів на всмоктування ацетату d, І- -токоферилу і вітаміну E в клітинній системі in vitro 3.1) Протокол експерименту Загальні умови протоколу проведення експерименту були ідентичними до умов для приклада 2, 2.1), різними були тільки площа поверхні лунок і концентрація ацетату d, l- -токоферилу, введеного до середовища 20М. Площа поверхні лунок 10 склала 6,5 см2, концентрація ацетату d, І- токоферилу - 23,7 мкМ/см2. 3.2) Порівняння монолаурату сорбітану, монопальмітату сорбітану і поліоксиетильованого монолаурату сорбітану Було проведено чотири досліди, кожний з який здійснювали тричі, при цьому протоколом передбачалася інкубація протягом 1 години при 37°С у такий спосіб: 1) тільки середовище 2OM з розрахунку 2 мМ; отже використовувався тільки ацетат d, І- токоферилу без емульгатора; 2) середовище М20 + емульгатор монолаурат сорбітану; 3) середовище М20 + емульгатор монопальмітат сорбітану; 4) середовище М20 + емульгатор етоксильований монолаурат сорбітану; За кожним з дослідів 2), 3) і 4) вагове співвідношення емульгатора, доданого до ацетату d, l- токоферилу (в еквівалентній кількості вітаміну E) склало 1:6,9. Отримані результати представлені в таблиці 1. Таблиця 1 1) Контрольний зразок 2) Контрольний зразок + монолаурат сорбітану 3) Контрольний зразок + монопальмітат сорбітану 4) Контрольний зразок + етоксильований монолаурат сорбітану d, l- -токоферол 1, 77 Всмоктування, нмоль/см2 Ацетат d, l- - токоферилу 1, 68 Вітамін E 3,45 3,75 2,81 6, 56 4,06 2, 08 6,15 1, 66 0, 97 2, 63 На основі цих результатів можна зробити висновок, що емульгатори відповідно до винаходу дозволяють збільшити всмоктування d, l- токоферолу й ацетату d, l- -токоферилу при еквівалентній кількості вітаміну E в 1,9 рази при використанні монолаурату сорбітану та в 1,78 рази при використанні монопальмітату сорбітану у порівнянні з дослідом 1), у якому застосовувався контрольний зразок без емульгатора. Навпаки, було відзначено, що етоксильований емульгатор (поліоксиетильований монолаурат сорбітану) знижує в с м о к т ув а н н я вітаміну E в 0,76 рази в порівнянні з дослідом 1). 3.3) Порівняння монолаурату сорбітану, монопальмітату сорбітану і етоксильованого моноолеату сорбітану Було проведено чотири досліди, кожний з який здійснювали тричі, при цьому протоколом перед бачалася інкубація протягом 1 години при 37 C у такий спосіб: 1) тільки середовище 20M; отже використовувався тільки ацетат d, І- -токоферилу без емульгатора; 2) середовище М20 + емульгатор монолаурат сорбітану; 3) середовище М20 + емульгатор монопальмітат сорбітану; 4) середовище М20 + емульгатор етоксильований моноолеат сорбітану; У кожному з дослідів 2), 3) і 4) вагове відношення емульгатора, доданого до ацетату d, І- токоферилу (в еквівалентній кількості вітаміну E) склало 1:6,9. Отримані результати представлені в таблиці 2. 11 92137 12 Таблиця 2 1) Контрольний зразок 2) Контрольний зразок + монолаурат сорбітану 3) Контрольний зразок + монопальмітат сорбітану 4) Контрольний зразок + етоксильований моноолеат сорбітану d, І- -токоферол 1,29 Всмоктування, нмоль/см2 Ацетат d, І- -токоферилу 2,31 Вітамін E 3, 60 3,05 3,88 6,93 3,33 3,18 6,51 2,47 2,46 4,93 Ha основі цих результатів можна знову зробити висновок, що емульгатори відповідно до винаходу дозволяють істотно збільшити всмоктування d, І- -токоферолу й ацетату d, І- -токоферилу при еквівалентній кількості вітаміну E в 1,92 рази при використанні монолаурату сорбітану та в 1,81 рази при використанні монопальмітату сорбітану в порівнянні з дослідом 1), у якому застосовувався контрольний зразок без емульгатора. Також було виявлено, що етоксильований емульгатор (етоксильований моноолеат сорбітану) незначно поліпшує всмоктування вітаміну E в порівнянні з дослідом 1). Приклад 4, Вплив емульгатора відповідно до винаходу на вивільнення ацетату d, І- токоферилу зі свого носія У даному прикладі досліджували вплив емульгатора відповідно до винаходу, моноолеату сорбітану, на вивільнення ацетату d, І- -токоферилу, зв'язаного двооксидом кремнію. З цією метою на носили ацетат d, І- -токоферилу на носій із двооксиду кремнію при ваговому відношенні 1:1 для проведення досліду без емульгатора й ацетат d, І-токоферилу + емульгатор (моноолеат сорбітану) на двооксиді кремнію при ваговому відношенні 50:5:45. Інкубували 10 г ацетату d, І- -токоферилу (за необхідності + моноолеат сорбітану) на згаданому вище двооксиді кремнію ''при цьому кінцева концентрація ацетату d, І- -токоферилу склала 10мМ) протягом 2,5 год при перемішуванні при 38°С в умовах з різними значеннями показника рН у наступних розчинах: - або розчин фосфату при 35 мМ, рН 6,5, NaCl 0,15 мМ, - або HCl / гліцин при 35 мМ, рН 2,5. Отримані результати приведені в таблиці 3 Таблиця 3 Ацетат d, І- -токоферилу без емульгатора Ацетат d, І- -токоферилу + моноолеат сорбітану 46,5 % 54, 9 % 59,6 % 72 % % вітаміну Е, який вивільнився при рН 2,5 % вітаміну Е, який вивільнився при рН 6,5 При рН 2,5 додавання моноолеату сорбітану збільшило вивільнення ацетату d, І- -токоферилу від свого носія (двооксиду кремнію) у 1,18 рази, тобто більш ніж на 18%. При рН 6,5 збільшення відбулося в 1,21 рази (тобто на 21%). Приклад 5. Вплив емульгатора відповідно до винаходу на гідроліз ацетату d,І- -токоферилу з утворенням d, І- -токоферолу, in vitro 5.1) Вплив моноолеату сорбітану У даному прикладі досліджували вплив емульгатора моноолеату сорбітану на гідроліз ацетату d, І- -токоферилу з утворенням d, І- -токоферолу. Для цього в досліді без емульгатора застосували ацетат d, І- -токоферилу й ацетат d, І- токоферилу + моноолеат сорбітану при ваговому відношенні 10:1. 0,5 г ацетату d, І- -токоферилу (за необхідності + моноолеат сорбітану), тобто при кінцевій концентрації ацетату d, І- -токоферилу 10 мМ, інку бували протягом 16 годин при перемішуванні при 38 C в наступному розчині: фосфат 35 мМ, pH 6,5, NaCl 0,15 мМ, панкреатин при ваговому співвідношенні між панкреатином і ацетатом d, І- -токоферилу 2:1, вагове співвідношення між жовчними солями й ацетатом d, І-токоферилу становило 5:1. Панкреатин є панкреатиновою витяжкою, яка містить, зокрема, холестерин-естерогідролазу, при цьому жовчні солі містять активатор холестеринестерогідролази. У різний час інкубації, яка проводилася за вказаних вище умов, вимірювали ступінь вивільнення вітаміну E відносно початкової кількості ацетату d, І- -токоферилу. Ha фіг. 5 показаний ступінь гідролізу, виражений концентрацією d, І- -токоферолу в % (процентне співвідношення маси) у розчині залежно від часу інкубації. Можна відзначити, що моноолеат сорбітану ( ) 13 92137 підвищив ступінь гідролізу ацетату d, І- токоферилу з утворенням d, І- -токоферолу на 22% (розраховано на основі нахилу кривих гідролізу) у порівнянні з дослідом без емульгатора (♦). 5.2) Вплив моноолеату сорбітану залежно від концентрації жовчних кислот в інкубаційному розчині У даному досліді досліджували вплив емульгатора відповідно до винаходу, моноолеату сорбітану, на гідроліз ацетату d, І- -токоферилу з утворенням d, І- -токоферолу. Для цього застосували ацетат d, І- -токоферилу в досліді без емульгатора й ацетат d, І- -токоферилу + моноолеат сорбітану при ваговому співвідношенні 10:1. 4 мг ацетату d, І- -токоферилу (при необхідності + моноолеат сорбітану), тобто при кінцевій концентрації ацетату d, І- -токоферилу 8,45 мкМ, інкубували протягом 3 годин при перемішуванні при 37 C в наступному розчині: фосфат 35 мМ, рН 6,5, NaCl 0,15 мМ, панкреатин 2 мг, ТОБТО вагове співвідношення між панкреатином і ацетатом d, І- -токоферилу склало 1:2, жовчні солі мали різну концентрацію. Проводилися наступні досліди: 1) ацетат d, І- -токоферилу без емульгатора з застосуванням жовчних солей при 10 мМ, 2) ацетат d, І- -токоферилу + моноолеат сорбітану з застосуванням жовчних солей при 10 мМ, 3) ацетат d, І- -токоферилу без емульгатора з застосуванням жовчних солей при 20 мМ, 4) ацетат d, І- -токоферилу + моноолеат сорбітану з застосуванням жовчних солей при 20 мМ, 5) ацетат d, І- -токоферилу без емульгатора з застосуванням жовчних солей при 50 мМ, 6) ацетат d, І- -токоферилу + моноолеат сорбітану з застосуванням жовчних солей при 50 мм. Перед інкубацією і після інкубації протягом відповідно 1 і 3 годин за приведених вище умов виміряли ступінь вивільнення вітаміну E відносно початкової кількості ацетату d, І- -токоферилу. Ha фіг. 4 показаний ступінь гідролізу, вираже 14 ний в % (процентне співвідношення маси d, І- токоферолу в розчині. Знову було виявлено, що моноолеат сорбітану істотно підвищує ступінь гідролізу ацетату d, І- токоферилу з утворенням d, І- -токоферолу, активуючи при цьому холестерин-естерогідролазу. Таке підвищення визначається концентрацією жовчних солей: воно зростає в два рази при концентрації жовчних солей 50 мМ, у 4,1 рази при концентрації 20 мМ і в 4,7 рази при концентрації 10 мМ. Приклад 6. Вплив емульгатора відповідно до винаходу на біологічну доступність вітаміну E в ацетаті d, І- -токоферилу, виміряну сукупним впливом емульгатора на вивільнення ацетату d, І-токоферилу зі свого носія і гідролізом ацетату d, І- -токоферилу з вивільненням d, І- -токоферолу У цьому прикладі досліджували вплив емульгатора відповідно до винаходу, тобто моноолеату сорбітану. Для цього застосували ацетат d, І- токоферилу на носії з двооксиду кремнію при ваговому відношенні 1:1 для проведення досліду без застосування емульгатора й ацетат d, І- токоферилу + емульгатор моноолеат сорбітану на двооксиді кремнію при ваговому відношенні 50:5:45. 8 мг ацетату d, І- -токоферилу (за необхідності + моноолеат сорбітану) на зазначеному вище двооксиді кремнію (тобто при кінцевій концентрації ацетату d, І- -токоферилу 16,9 мкМ) інкубували протягом 3 годин при перемішуванні при 370C в наступних розчинах: фосфат 35 мМ, рН 6,5, NaCl 0,15, панкреатин (2 мг) і жовчні солі (20 мМ). Перед інкубацією і після інкубації протягом відповідно 1 і 3 годин за вказаних умов виміряли концентрацію вітаміну E в розчині відносно початкової кількості ацетату d, І- -токоферилу. Отримані результати приведені в таблиці 4. Таблиця 4 Час,хв. 0 60 90 Ацетат d, І- -токоферилу без емульгатора 1,21 1,30 5,25 Добавка моноолеату сорбітану підвищила біологічну доступність ацетату d, І- -токоферилу, яка визначається за доступністю вивільнення ацетату d, І- -токоферилу зі свого носія з двооксиду кремнію і за доступністю гідролізу ацетату d I- токоферилу з утворенням d, I- -токоферолу. Таке підвищення склало більше 90% через три години інкубації, що виявилося наслідком зростання вивільнення і прискорення гідролізу. Приклад 7. Вплив емульгаторів на екскрецію вітаміну E в організмі півнів Провели дві серії дослідів на півнях. У першій серії використовувалося 32 півня, у другий - 51. Їх Ацетат d, І- -токоферилу + моноолеат сорбітану 6,27 11,56 9,84 відгодовували «вологим кормом» зі вмістом у ньому ацетату d, І- -токоферилу (ацетату вітаміну E) або ацетату d, І- -токоферилу із вмістом одного або двох кормових емульгаторів відповідно до винаходу в різних пропорціях. Ацетат d, І- токоферилу або ацетат d, І- -токоферилу з емульгаторами приготували у вигляді желатинових капсул, які одержали нанесенням певної кількості ацетату d, І- -токоферилу або ацетату d, І- токоферилу з емульгаторами за допомогою піпетки на половинку капсули, яку потім закривали іншою половинкою. Через 48 годин після дачі корму фекальні маси 15 92137 зібрали в банку і визначили екскрецію вітаміну в них. Для цього вітамін E вилучили розчинником, наприклад, гексаном, потім визначили видалену кількість за допомогою високоефективної рідинної 16 хроматографії. Кількість перевареного вітаміну E відняли від кількості, яка виділилася. 7.1) Перша серія Таблиця 5 Обробка Кількість півнів Ацетат d, І- -токоферилу 2 9 40 мл 1 8 40 мл Емульгатор Доза емульгатора Середня засвоюваність,% Стандартна похибка Дельта,% 3 9 40 мл 4 6 40 мл Монолаурат сорбі- Моноолеат сорбі- Моноолеат сорбітану тану тану 40 мл 20 мл 4 мл 24,8 32,5 29,2 32 1,77 2,20 31, 0 2,23 17,9 2, 94 29, 0 Звідси випливає, що спосіб відповідно до винаходу забезпечує засвоюваність вітаміну E аж до 31% відносно контрольного зразка. 7.2) Друга серія Таблиця б Обробка Кількість півнів Ацетат d, І- токоферилу 1 9 2 9 3 9 4 9 5 9 б б 40 мл 40 мл 4 0 мл 4 0 мл 4 0 мл 4 0 мл Монолаурат сорбітану монололеат сорбітану 10 мл Монолаурат сорбітану Монолаурат сорбітану Монолаурат сорбітану 20 мл 10 мл 20 мл Емульгатор Доза емульгатора Середня засвоюваність, % Стандартна похибка Дельта,% Монолаурат сорбітану + моно олеат сорбітану 20 мл 26,1 35,5 32,8 30,5 29 36,6 1,80 2,63 36,6 1,60 25,71 2,73 17,1 1,50 11,3 1,55 40,5 Як і в першій серії, у цій серії була виявлена зросла засвоюваність вітаміну E після його введення відповідно до винаходу. Таке збільшення може досягти 40,5% від засвоюваності, одержуваної тільки за допомогою одного ацетату d, І- токоферилу. Приклад 8. Вплив емульгаторів на гідроліз похідних вітаміну E 8.1) Досліди проводилися за наступних умов: - клітинна модель: клітки CaCo 2 - площа поверхні лунок: 6,5 см - кількість ацетату d, І- -токоферилу: 67 нмоль/см 2 - розчин, який застосовувався: міцела М40 Mathias Mathias і ін. (Mathias, P.M., Harries, J.Т., Muller, D.P.R., 1981 p., Optimization and validation of assays to estimate pancreatic ester activity using well-characterized micellar solutions of chole steryl.oleate and tocopheryl acetate. Journal of Lipid Research 22, стор. 177 - 184) у поєднанні з 1,34 нмоль/см2 холестерин-естерогідролази (EC 3.1.1.13). Обробка: А: без застосування емульгатора; В: із застосуванням емульгатора (суміш з монолаурату сорбітану і моностеарату сорбітану при співвідношенні 1:1), співвідношення між ацетатом d, І- -токоферилу і емульгатором: 100:1; С: із застосуванням емульгатора (суміш з монопальмітату сорбітану і моноолеату сорбітану при співвідношенні 1:1), співвідношення між ацетатом d, І- -токоферилу і емульгатором: 100:1. Тривалість інкубації: 1 год. при 37 0 C. Аналіз: аналіз ацетату d, І- -токоферилу в середовищі для розрахунку ступеня гідролізу. Результати приведені в таблиці 7. 17 92137 18 Таблиця 7 А Без емульгатора В Монолаурат сорбітану + моностеарат сорбітану C Монопальмітат сорбітану + моноолеат сорбітану 10,7 20, 9 21,1 Обробка Гідроліз ацетату d, І- токоферилу,% З таблиці випливає, що присутність емульгаторів збільшила в два рази ступінь гідролізу ацетату d, І- -токоферилу. Емульгатори відповідно до винаходу поліпшили умови гідролізу холестеринестерогідролазою. 8.2) Досліди проводилися за наступних умов: - клітинна модель: клітки СаСо-2 - площа поверхні лунок: 4,2 см2 - кількість ацетату d, І- -токоферилу: 67 нмоль/см2 - розчин, який застосовувався: міцела M 40 ві дповідно до Mathias та ін. Обробка: А: без застосування емульгатора; В: із застосуванням емульгатора (суміш з монопальмітату сорбітану і моноолеату сорбітану при співвідношенні 1:1), співвідношення між ацетатом d, І- токоферилу і емульгатором: 100:1; тривалість інкубації: 2 години при 37°С. Аналіз: аналіз ацетату d, І- -токоферилу в середовищі над клітинами для розрахунку ступеня гідролізу. Результати приведені в таблиці 8. Таблиця 8 А Обробка Гідроліз ацетату d, І- токоферилу, % Без емульгатора 9,7 Присутність емульгаторів поліпшило гідроліз ацетату d, І- -токоферилу на 44%. Як і в 8.1) емульгатори поліпшили умови проведення гідролізу В Монолаурат сорбітану + моностеарат сорбітану 14 холестерин-естерогідрол азою. 19 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 92137 Підписне 20 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601