Композиція штамів роду lactobacillus і застосування композиції штамів роду lactobacillus

1. Композиція, що містить штами роду Lactobacillus: Lactobacillus fermentum, депонованого у РСМ під номером В/00007, Lactobacillus plantarum, депонованого у РСМ під номером В/00008, Lactobacillus gasseri, депонованого у РСМ під номером В/00009, відносні кількості яких визначає пропорція 0,5:0,5:1, яка характеризується тим, що зазначена композиція, має особливі влас C2 2 96744 1 3 дів, таких як: L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. acidophilus sensu stricto, L. gasseri, L. johnsoni. Застосовуючи сучасні молекулярні методи, у тому числі методи секвенування ДНК, а також поліпшені процедури розведення, довели, що види, які зустрічаються частіше інших у правильному середовищі піхви у здорових жінок, - це види з комплексу acidophilus, такі як L. johnsoni, L. gasseri, L. acidophilus, L. crispatus, і, крім того, L. plantarum і L. fermentum. Механізми дії бактерій роду Lactobacillus у середовищі піхви ще не до кінця пізнані. Але повсюдно вважається, що вони: - синтезують протимікробні речовини, такі як молочну, оцтову й піроглутамінову кислоти, знижуючи, таким чином, рН середовища піхви до рівня 3,7-4,6; - синтезують короткі пептиди й/або білки з більш складною будовою, схожі на бактерицин, які кріпляться до рецепторів на поверхні чутливих бактерій, призводячи до їхнього лізису, а згодом до загибелі бактерії, - мають здатність суперничати з іншими мікроорганізмами, головним чином хвороботворними, за доступ до живильних компонентів і рецепторів на епітелії піхви, - модифікують токсини й рецептори для них, - створюють перекис водню - деякі види Lactobacillus, що створюють Н2О2, домінують у культурах мікробів здорових піхв, - впливають різним чином, модулюючи імунітет хазяїна. Завдяки цим різноманітним особливостям, бактерії роду Lactobacillus утримують певний стан біологічної рівноваги піхви, завдяки цьому не допускають розмноження хвороботворних культур мікроорганізмів, що живуть у жіночих родових шляхах, що сприяє зниженню ризику появи бактеріального вагінозу. Оскільки зараження сечостатевих шляхів у жінок у великій мірі є наслідком порушення рівноваги мікрофлори піхви, способи як попередження, так і лікування спрямовані на відновлення розладженої рівноваги. В 1992 році в США було проведене дослідження (Hilton E. Isenberg HD., Alperstein P., France К., Borenstein MT. Ingestion of yogurt containing Lactobacillus acidophilus as prophylaxis for candidal vaginitis. Ann Intern. Med. 1992; 116; 353-357), що полягає в тому, що 35 пацієнток з рецидивом кандидозу вульви й піхви щодня протягом 6 місяців приймали йогурт із Lactobacillus acidophilus з метою попередження рецидиву хвороби. Кінцевим пунктом дослідження була колонізація піхви й анального отвору Candida і Lactobacillus, а також кандидоз. Дослідження закінчило 13 хворих, але аналіз був зроблений для 33. Було констатовано істотне зниження числа заражень Candida протягом 6 місяців у пацієнток, заражених Candida (в анальному отворі й піхві). Дослідження проводили із застосуванням звичайного йогурту, який містив L. acidophilus, що синтезує середні кількості Н2О2. Не були ідентифіковані штами L. acidophilus, які були б ізольовані від жінок. Група жінок також була мінімальною, зате була визначена точна залеж 96744 4 ність між присутністю L. acidophilus в анальному отворі й у піхві: якщо в анальному отворі не було L. acidophilus, імовірність його присутності в піхві становила 15,5 %, якщо ж L. acidophilus був в анальному отворі, імовірність, що буде в піхві, становила 54,8 % (Р105 бактерій/мл сечі). Кінцевим параметром була поява рецидиву запалення. Ефект дії Lactobacillus GG у порівнянні із соком із журавлини/брусниці не був визначений. Можливо, що Lactobacillus GG, як типовий кишковий штам, не колонізував устя уретри/піхви. В 2003 році (Reid О., Charbonneau D., Erb J., Kochanowski В., Beuerman D., Poehner R., Bruce AW. Oral use of Lactobacillus rhamnosus GR-1 and L. fermentum RC-14 signficantly alters vaginal flora: randomized, placebo-controlled trial in 64 healthy women. FEMS Immunol Med. Microbiol. 2003; 35: 131-134) були проведені - із застосуванням плацебо - рандомізовані клінічні дослідження впливу Lactobacillus rhamnosus GR-1 і L. fermentum RC-14, що вводили перорально протягом 60 днів, на піхвову флору в 64 здорових жінок. Мікроскопний аналіз показав повернення до нормальної флори в 37 % жінок з досліджуваної групи в порівнянні з 13 % жінок з контрольної групи. Вирощування дало чітку картину істотного збільшення числа Lactobacillus і зниження числа дріжджів і кишкових паличок. Пробіотик був безпечний при щоденному вживанні. В 2004 році ці ж автори провели наступне дослідження із застосуванням цих же штамів (Reid G., Burton J., Hammond JA., Bruce AW. Nucleic acid 5 based diagnosis of bacterial vaginosis and improved management using probiotic lactobacilli. J. Med. Food 2004; 7: 223-228) в 59 жінок з безсимптомним бактеріальним вагінозом, який був діагностований за допомогою DGGE. Відзначене повернення мікрофлори піхви, подавленої присутністю Lactobacillus, після закінчення 2 місяців від застосування пробіотику. Перехід (cross-colonisation) бактерій з анального отвору в піхву стосується також таких патогенів як Streptococcus agalactiae, уропатогенні штами Escherichia coli або Staphylococcus aureus. У недавно опублікованій статті (Warner JE., Onderdonk AB. Diversity of toxic shock syndrome toxin I-positive Staphylococcus aureus isolates. Apel. Environ Microbiol. 2004; 70: 6931-6935) за допомогою методу PFGE показана наявність ідентичних штамів S. aureus, присутніх в обох місцях в 59 % досліджуваних жінок. Необхідно звернути увагу на те, що в науковій літературі немає доказів переходу або перехресної колонізації анального отвору й піхви штамами Lactobacillus. Можливо, перешкоджала цьому нестача відповідних молекулярних методів. Крім того, застосування Lactobacillus у вигляді молочних продуктів неможливо для всіх пацієнтів за дієтичними причинами. Описувані штами Lactobacillus, застосовувані перорально, проявляли недостатню життєздатність у стравоході й вимагали захисту у вигляді спеціальних капсул. З опису винаходу Патенту Польщі № 189577 відоме застосування сполучення бактерій молочної кислоти виду Lactobacillus brevis і Lactobacillus salivarius, підвид salicinius, для створення фармацевтичної композиції, яку застосовують для внутріпіхвового лікування вагінозу й запалення піхви. Даний патент описує також фармацевтичну композицію сполучення бактерій молочної кислоти виду Lactobacillus brevis і Lactobacillus salivarius, підвид salicinius. Дослідження (Strus M., Podstawy stosowania probiotykow dopochwowych w zakazeniach narzajdu moczowo-plciowego, Zakazenia, 2005, 4, 40-43 - Струс М. Підстави застосування піхвових пробіотиків у зараженнях сечостатевих органів. Зараження, 2005, 4, 40-43) показують, що в мікрофлорі піхви в здорових жінок часто Lactobacillus є присутнім у декількох видах. Найчастіше можна виділити штами, що належать до комплексу L. acidophilus, і, крім того, види: L. fermentum і L. plantarum. Застосовані згідно з патентом № 189577 штами, однак, не типові для польських жінок. Також спосіб застосування (внутріпіхвовий) незручний для щоденного застосування. З польського патентного опису Р-373518 відомі нові штами: Lactobacillus fermentum 57А, депонований під номером В/00007, Lactobacillus plantarum 57B, депонований під номером В/00008, Lactobacillus gasseri 57C, депонований під номером В/00009, Lactobacillus plantarum 78B, депонований під номером В/00010. Предметом даного винаходу є композиція нових штамів роду Lactobacillus, у тому числі штамів Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus 96744 6 plantarum 57B, Lactobacillus gasseri 57C, відносні кількості яких визначає пропорція 0,5:0,5:1. Вищевказані штами були одержані із заднього склепіння піхви здорової жінки з нормальною флорою піхви. Дослідження доводять, що штами Lactobacillus plantarum 57В, Lactobacillus fermentum 57А і Lactobacillus gasseri 57С задовольняють усім вимогам для пробіотичних продуктів. На підставі проведених тестів можна констатувати, що нові штами більш корисні в порівнянні з іншими дослідженими штамами. Додатково, кожний з відібраних і депонованих штамів має сильну суттєву ознаку. Штам Lactobacillus plantarum 57B характеризується сильними антагоністичними властивостями, особливо до патогенів, таких як Gardnerella vaginalis і Escherichia coli, Lactobacillus fermentum 57А дуже добре прилягає до клітин організму хазяїна, a Lactobacillus gasseri 57С синтезує велику кількість перекису водню. Задачею винаходу була розробка композицій штамів роду Lactobacillus для застосування в ефективному відновленні відповідної бактеріальної флори піхви в зручній для прийому формі. Винахід належить до композиції штамів роду Lactobacillus і її застосування. Композиція, до складу якої входять штами Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B і Lactobacillus gasseri 57С, має особливі властивості, такі як сильне диференціювання в сфері спорідненості до епітелію стравоходу й до епітелію піхви, що дає можливість колонізації піхви й анального отвору після проходу через кишечник, і коагрегація, яка обумовлює можливість синергічної дії компонентів. Композиція з'єднується з довільним, фармацевтично прийнятним носієм і/або допоміжними речовинами. Композиція застосовується перорально. Композиція має вигляд капсули. Винахід належить також до застосування композиції нових штамів роду Lactobacillus, яка містить Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B і Lactobacillus gasseri 57С, що відрізняються різними властивостями, такими як: сильна спорідненість з епітелієм стравоходу й епітелієм піхви, що дає можливість колонізації піхви й анального отвору після проходу через кишечник, і коагрегація, яка дає можливість сінергічної дії компонентів, для виготовлення фармацевтичного препарату для перорального застосування з метою відновлення відповідної бактеріальної флори піхви й анального отвору. Застосування композиції полягає у виготовленні у вигляді капсули порції фармацевтичного препарату, що складається з ліофілізату штамів бактерій Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B і Lactobacillus gasseri 57С і фармацевтично прийнятного носія й/або наповнювачів. Зненацька було знайдено, що композиція штамів роду Lactobacillus має унікальну здатність одночасної колонізації піхви й анального отвору. Застосовані в композиції штами роду Lactobacillus не підпадають під зовнішній вплив при проході через стравохід, тому в цьому випадку композицію можна приймати перорально. 7 96744 Зненацька було знайдено, що штами роду Lactobacillus, що входять до складу композиції, мають унікальну властивість взаємної коагрегації. Штам Lactobacillus fermentum 57А проявляє дуже гарну спорідненість із кишковим епітелієм і має здатність прилягання до цього епітелію, створюючи умови для його колонізації. Тому, що штам Lactobacillus gasseri 57 С проявляє дуже гарну спорідненість із епітелієм піхви й не має ознак сильної спорідненості з кишковим епітелієм, він не зумів би самостійно колонізувати кишечник. Явище коагрегації з іншими штамами дає йому можливість побічно брати участь у колонізації кишкового епітелію й, отже, анального отвору. Таким чином, у стравоході виникають численні популяції Lactobacillus gasseri, які можуть перейти на епітелій піхви, який є натуральним середовищем для цього виду й до якого він проявляє більший ступінь спорідненості. Отже, завдяки коагрегації полегшений перехід Lactobacillus gasseri 57 C та інших двох штамів в екосистему піхви провокує швидку колонізацію епітелію піхви. 8 I. Дослідження стійкості композиції, що містить штами Lactobacillus, в умовах стравоходу. 1. Живучість штамів Lactobacillus при низькій рН, яка відповідає рН шлункового соку. Живучість штамів Lactobacillus при низькій рН визначили шляхом застосування модифікованої методики Lankaputra і Shah (1995). Досліджувані штами Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57В, Lactobacillus gasseri 57С розмножували в рідкому живильному MRS середовищі. Вирощування культури проводили в безкисневих умовах при температурі 37 °C протягом 24 годин. Після закінчення цього часу, методом серійних розведень визначили одержану концентрацію окремих штамів бактерій. Потім, за допомогою 1N HCl, рівень рН робочого середовища знижували до величини 1,2, що дорівнює рівню рН шлункового соку. Далі культуру інкубували протягом 20 хвилин у безкисневих умовах при температурі 37 °C, а потім посіяли з метою визначення ступені зменшення досліджуваних популяцій бактерій, підданих впливу низької рН. Результати показані в таблиці № 1. Таблиця 1 Стійкість штамів Lactobacillus при низькій рН Досліджуваний штам L fermentum 57А Lactobacillus plantarum 57 Lactobacillus gasseri 57С Контрольна культура L. rhamnosus GG Концентрація бактерій у КУО/1 мл Концентрація після закінчення 20 Вихідна концентрація хв. при рН 1,2 8 6 2 × 10 1 × 10 9 7 1 × 10 2,2 × 10 8 6 2,5 × 10 3 × 10 8 7 1 × 10 2. Живучість штамів Lactobacillus у штучному шлунковому соку. Живучість штамів Lactobacillus у штучному шлунковому соку визначали шляхом застосування модифікованої методики Pedersen & со. (2004). Досліджувані штами Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B, Lactobacillus gasseri 57С розмножували в рідкому живильному MRS середовищі. Вирощування культури проводили в безкисневих умовах, при температурі 37 °C протягом 24 годин. Потім переносили по 100 мкл кожного штаму з концентра 1 × 10 8 9 цією порядку 10 10 КУО/1 мл в 10 мл штучного шлункового соку (7 мл 36 % НСl, 3,6 г пепсину [Difco], 2 г NaCl на 1 л дистильованої води) з рН 2,5, одержаної за допомогою 1N HCl. Визначали вихідну концентрацію розведення окремих штамів бактерій за допомогою методу серійних розведень. Далі культуру інкубували протягом 20 хвилин у безкисневих умовах при температурі 37 °C, а потім посіяли з метою визначення ступені зменшення досліджуваних популяцій бактерій, підданих впливу штучного шлункового соку. Результати показані в таблиці № 2. Таблиця 2 Живучість штамів Lactobacillus у штучному шлунковому соку з пепсином Досліджуваний штам L fermentum 57А Lactobacillus plantarum 57В Lactobacillus gasseri 57С Контрольна культура L. rhamnosus GG Концентрація бактерій у КУО/1 мл Концентрація після20 хв. при pH Вихідна концентрація 1,2 7 6 1,3 × 10 8 × 10 7 6 1,4 × 10 9,1 × 10 6 5 2 × 10 9 × 10 6,9 × 10 7 2,5 × 10 7 9 96744 3. Визначення стійкості штамів Lactobacillus до солей жовчних кислот. Для визначення стійкості досліджуваних штамів Lactobacillus до солей жовчних кислот використовували методику Dashkevicz & Feighner (1989). Ця методика полягала в тому, що в агар MRS [Oxoid] додавали індикатор, що змінює колір, - бромкрезоловий пурпур [РОСН] - у кількості 0,17 г/л і солі жовчних кислот [OXGAL фірми Difco] у п'ятьох різних концентраціях: 1 г/л, 2 г/л, 5 г/л, 10 г/л, 20 г/л. На приготовлені в такий спосіб середовища MRS засіяли методом редукції 10 10 мкл раніше приготовлених рідких культур досліджуваних штамів Lactobacillus, які інкубували в стандартних безкисневих умовах протягом 48 годин. Після закінчення інкубації культури штамів, що не піддалися впливу даної концентрації солей жовчних кислот, здобували ясно-жовтий колір, також живильне середовище змінювало свій колір з фіолетового на жовтий. Інтенсивність росту досліджуваних штамів і зміни кольору живильного середовища на жовтий визначили за напівкількісною шкалою від - до +++. Результати показані в таблиці № 3. Таблиця 3 Стійкість штамів Lactobacillus до солей жовчних кислот у концентраціях: 1, 2,5, 10, 20 г/л Концентрація солей жовчних кислот 1 г/л 2 г/л 5 г/л 10 г/л 20 г/л Lactobacillus fermentum 57A +++ +++ +++ +++ +++ Lactobacillus plantarum 57B +++ +++ +++ +++ +++ 4. Дослідження адгезійних властивостей штамів 57А, 57В, 57С, а також суміші цих штамів, з лініями людських клітин кишечника СаСо2. Вирощування культури тканинної лінії СаСо2 проводили методом багаторазових пасажів протягом 20 днів до одержання монолітного шару (monolayer). Застосовували середовище DMEM (Dulbecco Minimal Essential Medium) (Gibco), збагачене шляхом додавання 10 % інактивованої ембріональної телячої сироватки. Крім того, середовище містило 3 мМ/мл L-глютаміну й антибі-1 -1 отики: 100 мкг/мл стрептоміцину й 100 U/мл пеніциліну. Вирощування культури проводили при температурі 37 °C у атмосфері підвищеної вологості, що містила 10 % СО2, двічі на тиждень змінюючи живильне середовище. Досліджувані штами Lactobacillus (кожний окремо, а потім у вигляді суміші) вирощували протягом 48 годин в 5 мл бульйону MRS в інкубаторі при температурі 37 С у безкисневих умовах, а потім усе разом обертали на центрифузі (швидкість 2 тис. обертів протягом 10 хвилин). Супернатант зливали, а бактерії, що залишилися на дні пробірки, заливали свіжим MRS у кількості 1 мл і перевіряли їхню концентрацію за допомогою десяткових розведень, записуючи результат у вигляді КУО/мл. Вихідна концентрація для штаму 7 8 57А становила 8 × 10 , для штаму 57В - 2,5 × 10 , 7 9 для штаму 57С - 8 × 10 , а для суміші - 2 × 10 . Потім взяли 100 мкл досліджуваних суспензій бактерій і додали до 900 мкл живильного середо Lactobacillus gasseri Контрольна культу57C ра L. rhamnosus GG +++ +++ + +++ +++ +++ +++ вища DMEM. Приготовлену в такий спосіб суміш додавали в ямки, що містять клітини лінії СаСо2. Клітини тканинної лінії разом з досліджуваними штамами інкубували при температурі 37 С в атмосфері, збагаченій 10 % СО2, протягом 30 хвилин. Після інкубації клітини двічі промивали за допомогою PBS для усунення бактерій, що не причепилися, а потім фіксували 3,7 % формальдегідом при кімнатній температурі протягом 1 години. Після фіксування клітини знову промивали за допомогою PBS і красили кристалічним фіолетовим протягом 3 хвилин. Препарат оцінювали під мікроскопом при збільшенні 1000х. Рахували клітини Lactobacillus і Bifidobacterium в 20 полях препарату, визначаючи середнє арифметичне значення з 20 полів. Інтерпретацію отриманих результатів провели за наступним протоколом: Опис ступеня адгезії досліджуваних бактерій роду Lactobacillus до тканини кишечника СаСо2. Ступінь адгезії +++ II + Число бактеріальних клітин Понад 80 Межа 60-80 Межа 40-60 Менш 40 11 96744 12 Таблиця 4 Результати визначення адгезії до тканини СаСо2 бактерій роду Lactobacillus 57А, 57В, 57С і суміші цих штамів у присутності контрольної культури GG Штам Lactobacillus fermentum 57А Lactobacillus plantarum 57В Lactobacillus gasseri 57С Суміш штамів Lactobacillus 57А, 57В, 57С Контрольна культура L. rhamnosus GG Досліджувані штами L. fermentum 57A, L. plantarum 57В, L. gasseri 57С виявили більшу стійкість як при низькому рН (рівень рН близький до рівня в шлунковому соку), так і в штучному шлунковому соку, що містить пепсин - ензим, присутній у шлунковому соку. У випадку стійкості до солей жовчних кислот штами L. fermentum 57A, L. plantarum 57B проявляють схожу високу стійкість до солей жовчних кислот на відміну від штаму L. gasseri 57С, який уже при концентрації солей жовчних кислот 2 г/л втрачає свою життєздатність. Аналізуючи вищевказані результати, можна припускати, що штами L. fermentum 57A, L, plantarum 57B, L. gasseri 57С без помітного зменшення їхнього числа переживають несприятливі умови у людському шлунку. У випадку дії солей жовчних кислот штами L. fermentum 57A, L. plantarum 57B не повинні суттєво змінити чисельність, тільки штам L. gasseri 57С, що проявляє більшу чутливість до солей жовчних кислот, може зменшити свою чисельність. Вищевказаний аналіз свідчить про можливість застосування уведених перорально штамів L. fermentum 57А, L. plantarum 57В, L. gasseri 57С для колонізації піхви й анального отвору. Досліджувані штами L. fermentum 57A, L. plantarum 57В, L. gasseri 57С виявили дуже диференційовану адгезію до кишкової лінії СаСо2. Здається, що тільки штам L. fermentum 57А може зв'язуватися з епітелієм кишечника людини, інші штами не мають такої здатності. Опираючись на ці результати, можна припустити, що концентрація Lactobacillus у кінцевому відрізку товстої кишки відносно до концентрації препарату, що вводиться перорально, може знизитися в невеликому ступені не тільки в наслідок дії шлункового соку, але також завдяки гарним адгезійним властивостям штаму L. fermentum 57А. II. Демонстрація властивостей коагрегації штамів Lactobacillus, що входять до складу композиції. Виділені штами Lactobacillus мають унікальну властивість взаємної коагрегації, завдяки якій можуть виступати в природному комплексі (коагрегаті), який є сумішшю 2 або 3 штамів, об'єднаних разом завдяки поверхневому впливу. Така спорідненість між натурально відібраними шта Тканина СаСо2** ++ + ++ +++ мами, що заселяють ту саму екологічну нішу, веде до взаємодії в сфері захоплення рецепторів на поверхні епітелію, антагонізму перед іншими, часто патологічними компонентами мікрофлори, і кращому використанню доступних джерел енергії. Приклади явища коагрегації показані на фігурах, де: Фіг. 1 представляє коагрегацію штамів, що входять до складу композиції. Макроскопічна фотографія колонії показує присутність двох морфологічно різних складових однієї колонії (ліворуч - L. fermentum, праворуч - L. plantarum). Фіг. 2 представляє зображення смужок в електрофорезному гелі після реакції PCR (ДНК, ізольована з коагрегату) зі стартером для виду L. plantarum, що підтверджує присутність штаму L. plantarum 57В у коагрегаті, представленому на Фіг. 1. Фіг. 3 представляє зображення смужок в електрофорезному гелі після реакції PCR (ДНК, ізольована з коагрегату) зі стартером для виду L. plantarum, що підтверджує присутність штаму L. fermentum 57А в коагрегаті, представленому на Фіг. 1. III. Здатність до колонізації анального отвору й піхви. Композиція штамів Lactobacillus має унікальну здатність колонізації стравоходу й піхви, що є результатом неоднорідності й взаємодії його окремих компонентів. Це було яскраво виражене в дослідженні колонізації епітелію анального отвору й піхви методом in vivo під час клінічних досліджень - одні компоненти комплексу (Lactobacillus fermentum 57А і Lactobacillus plantarum 57В) при пероральному введенні з'являються у великій кількості на поверхні епітелію анального отвору, інші (Lactobacillus gasseri 57С) - у великій кількості з'являються на епітелії піхви. Макроскопічна фотографія на Фіг. 4 показує морфологічно диференційовані колонії, що представляють популяції Lactobacillus, що заселяють епітелій анального отвору (ліва фотографія - домінування L. plantarum 57B) і піхви (права фотографія - домінування L. gasseri 57С). Зразок був отриманий від жінки, яка приймала композицію штамів Lactobacillus протягом 21 дня. Тут ми бачимо диференційовану спорідненість видів Lactobacillus до обох місць у вигляді різниці в кількостях окремих колоній. 13 96744 14 Таблиця 5 Кількість штамів Lactobacillus у мазках з піхви й анального отвору пацієнтки, що застосовує композицію за даним винаходом Кількість колоній - піхва 8 1 × 10 4 3 × 10 Lactobacillus gasseri 57С Lactobacillus plantarum 57В Приклад виконання І. Клінічне дослідження пацієнтів. Клінічні дослідження були проведено на групі 18 здорових жінок без клінічних ознак запалення полових шляхів, але з історією рецидивних запальних станів піхви. Кількість колоній - анальний отвір 3 1 × 10 5 1 × 10 Дослідження показали, що після перорального введення композиції штамів Lactobacillus за даним винаходом: 1. знижується рН піхви до 0,4 2. знижується показник по шкалі Нугента на 2 одиниці, 3. зростає кількість штамів Lactobacillus на епітелії піхви на два логарифми (log КУО/мл). Таблиця 6 Вплив застосування композиції штамів Lactobacillus на рН піхви № пацієнтки 1. 7 2. 9 3. 27 4. 29 5. 5 6. 6 7. 1 8. 25 9. 10 10. 8 11. 11 12. 16 13. 13 14. 12 15. 19 16. 14 17. 21 18. 23 Середнє значення pH Візит I 5,5 4,9 4,9 5,5 4,6 4,6 5,5 4,0 4,9 5,2 4,4 4,4 4,9 4,6 5,5 5,5 4,9 5,5 5,0 Примітка: відсутність візиту Візит III-10 Візит IV-20 Візит V-31 Візит VI-50 5,2 4,9 4,6 4,6 4,6 4,6 5,2 4,2 5,2 5,5 4,9 4,9 5,5 4,6 5,5 4,9 4,6 5,5 4,9 5,5 4,9 4,4 4,6 4,9 5,2 5,5 4,4 4,6 4,9 4,0 4,6 4,9 4,9 5,2 4,9 4,6 4,4 4,8 5,5 5,5 4,2 4,2 4,9 5,5 4,9 4,0 4,6 4,9 4,2 4,6 4,9 4,9 5,5 4,9 4,9 4,9 4,8 5,2 4,9 4,4 4,2 4,6 5,2 4,9 4,2 4,6 4,6 4,2 4,4 4,9 4,6 4,9 4,9 4,9 4,4 4,6 Візит VII62 5,2 4,9 4,6 4,6 4,6 4,6 4,0 4,9 4,4 4,2 4,2 4,2 4,6 4,9 4,6 4,4 4,6 4,6 Візит VIII70 4,6 4,6 4,2 4,4 5,5 5,2 4,4 4,4 4,4 4,6 4,4 4,6 4,9 4,4 4,6 4,6 15 96744 16 Таблиця 7 Вплив застосування композиції штамів Lactobacillus на показник по шкалі Нугента (0-3 нормальна флора, 4-6 сумнівний результат, 7-10 бактеріальний вагіноз) № пацієнтки 1. 7 2. 9 3. 27 4. 29 5. 5 6. 6 7. 1 8. 25 9. 10 10. 8 11. 11 12. 16 13. 13 14. 12 15. 19 16. 14 17. 21 18. 23 Середнє значення шкалі Нугента Візит I Візит III-10 Візит IV-20 Візит V-31 Візит VI-50 5 6 1 6 1 1 4 0 2 4 1 0 3 2 2 1 1 5 по 3 6 0 5 1 1 3 0 3 6 1 1 4 3 2 1 0 3 11 6 1 4 3 2 3 1 0 3 1 1 3 1 2 1 1 0 0 3 0 1 3 3 4 0 0 3 0 0 1 1 3 1 0 0 0 0 0 1 1 1 4 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 2,50 (3) 2,39 (2) 1,8 (2) 1,28 (1) 0,76 (1) Візит VII- Візит VIII62 70 2 -1 1 1 1 1 0 0 0 1 2 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 2 1 1 1 1 0 1 1 0,69 (1) 1,1 (1) Примітка: відсутність візиту Таблиця 8 Вплив застосування композиції штамів Lactobacillus на загальну кількість штамів Lactobacillus (КУО/мл), що колонізують епітелій піхви № пацієнтки 1. 7 2. 9 3. 27 4. 29 5. 5 6. 6 7. 1 8. 25 9. 10 10. 8 11. 11 12. 16 13. 13 14. 12 15. 19 16. 14 17. 21 18. 23 Середнє значення загальної кількості Lactobacillus Візит I Візит III-10 Візит IV-20 Візит V-31 Візит VI-50 Візит VII- Візит VIIIКУО/мл КУО/мл КУО/мл КУО/мл КУО/мл 62 КУО/мл 70 КУО/мл 1 5 4 5 4 6 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 4 4 0 3 3 7 3 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 3 5 8 5 5 5 3 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 3 4 6 5 4 5 3 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 0 0 3 5 0 3 0 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 2 5 5 5 5 7 3 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 3 0 0 0 0 4 4 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 7 7 6 7 7 7 6 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 5 4 7 7 6 5 5 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 0 4 6 3 3 3 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 4 5 6 6 6 5 4 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 4 5 4 3 3 4 5 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 4 4 6 5 7 6 7 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 5 4 5 5 6 6 5 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 3 5 6 5 4 5 5 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 0 0 7 0 0 5 3 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 5 8 6 7 3 7 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 0 6 5 6 7 5 6 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 1 × 10 3 1 × 10 Примітка: відсутність візиту 4 1 × 10 5 1 × 10 5 1 × 10 4 1 × 10 5 1 × 10 4 1 × 10 17 Приклад виконання II (фармацевтичний препарат). Одна капсула фармацевтичного препарату містить: 9 - активна речовина - 10 ліофілізованих штамів Lactobacillus у наступних пропорціях: 50 % Lactobacillus gasseri 57C, 25 % Lactobacillus fermentum 57A, 25 % Lactobacillus plantarum 57В, 96744 18 - додаткові речовини: лактоза, манітол, глютамінат натрію, стеарат магнію. Препарат застосовують перорально у вигляді 1-2 капсул 1 раз у день, запиваючи водою. Препарат застосовують як допоміжний засіб з метою відновлення й/або поповнення правильної бактеріальної флори сечостатевих органів і встановлення правильного рівня рН піхви. 19 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 96744 Підписне 20 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601