Спосіб репродукування клітинної тканини із jatropha curcas

Реферат: Винахід належить до способу виробництва олії, одержаної з насіння рослини Jatropha curcas, репродукованої з індивідуальних клітин, згенерованих з експлантатів рослини, де спосіб включає: одержання експлантата з насіння, поміщення експлантата, одержаного з насіння, в культуральне середовище, руйнування міжклітинних контактів тканин експлантатів, одержаних з насіння в згаданому культуральному середовищі, де експлантати генерують індивідуальні клітини, інкубування і розмноження протягом визначеного часу індивідуальних клітин, згенерованих з експлантатів, одержаних з насіння рослини, в культуральному середовищі і екстрагування олії з клітин, репродукованих з індивідуальних клітин, згенерованих з експлантатів, одержаних з насіння рослини. UA 105519 C2 (12) UA 105519 C2 UA 105519 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується репродукування клітин, одержаних з насіння олійних рослин і одержання олій, одержаних із згенерованих клітин. 2. ОПИС ПОПЕРЕДНЬОГО РІВНЯ ТЕХНІКИ Насіння олійних рослин ідентифікували як джерела у виробництві олій, які можуть служити, серед інших використань, як біодизельне паливо. Прикладом є рослина Jatropha curcas, насіння якої містить олію. Згадувану олію на додаток до її застосовування в медицині, ветеринарії і миловарній промисловості, і т.д., вважають прийнятною як високоякісне біодизельне паливо. Масло, одержане з насіння Jatropha curcas, має фізико-хімічні та вихідні характеристики, подібні дизельному паливу для двигунів (див. Murali і ін., заявка на патент США з номером публікації 2008/0194026 А1, розділ 0008-0010). Отже, у попередньому рівні техніки, були описані способи мікро-репродукування з метою генерування рослин Jatropha curcas, одержаних з органів, тканин, клітин або протопластів, (див. Murali і ін., розділи 0014,0017 і 0024). Згенеровані рослини могли би служити джерелом насіння для виробництва олії (див. Shuyi Qiu і ін., Китай (CN) Публікація Патенту Номер 11225416 А, Реферат). На жаль, можливість виробництва олії, одержаної з насіння Jatropha curcas, в більших кількостях для використання як біодизельного пального, є обмеженою, оскільки потрібні величезні області землі для врожаю рослин, згенерованих мікро-репродукуванням або звичайним репродукуванням. Даний винахід стосується способу одержання олії, одержаної з Jatropha curcas, де вирощування рослини не потрібне. Тому, спосіб представленого винаходу не потребує використання областей землі для одержання олії, одержаної з Jatropha curcas або з інших олійних рослин. СКОРОЧЕНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Представлений винахід стосується способу виробництва олії, одержаної з репродукованих клітин тканин насіння Jatropha curcas, де спосіб є прийнятним для застосування для насіння інших олійних рослин. Згадуваний спосіб включає одержання експлантату від сім'ядолі насіння Jatropha curcas, інокулюючи згаданий експлантат у культуральне середовище з ферментами, які руйнують міжклітинні контакти, таким чином, що при інкубуванні при струшуванні генеруються індивідуальні клітини, які репродукуються. Від репродукованих клітин, похідних індивідуальних клітин, одержаних від тканини сім'ядолі насіння Jatropha curcas, екстрагують олію, яка могла б використовуватися як біодизельне паливо. Зокрема, спосіб представленого винаходу включає: одержання експлантату з насіння Jatropha curcas; поміщення експлантату, одержаного з насіння Jatropha curcas в рідке культуральне середовище; руйнування міжклітинних контактів експлантатів тканин, одержаних з насіння Jatropha curcas в згадуваній культурі, де експлантати генерують індивідуальні клітини; інкубування протягом визначеного часу культурального середовища з індивідуальними клітинами, згенерованими від експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas, де згадані індивідуальні клітини репродуковані в межах визначеного часу; і екстрагування олії із клітин, репродукованих від індивідуальних клітин, згенерованих від експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas. В одному аспекті способу представленого винаходу експлантат, одержаний з насіння Jatropha curcas відповідно до процесу, який включає: дезінфекцію насіння Jatropha curcas етанолом, де згадуване насіння занурюють у етанол; гідратування згаданого продезинфікованого насіння Jatropha curcas папером, зволоженим стерильною водою, де зволоженим стерильною водою папером обгортають насіння Jatropha curcas; стерилізування гідратованого насіння Jatropha curcas гіпохлоритом натрію, де згадуване гідратоване насіння Jatropha curcas занурюють у гіпохлорит натрію; видалення шкірки простерилізованого насіння Jatropha curcas, в результаті чого, з насіння Jatropha curcas вивільнюють сім'ядолю; і одержання експлантатів з сім'ядолі насіння Jatropha curcas. Спосіб представленого винаходу може застосовуватися до будь-яких олійних рослин. Згадуваний спосіб, пристосований до будь-яких олійних рослин, включає: A. Одержання експлантату з насіння олійної рослини; B. Поміщення експлантату, одержаного з насіння в культуральне середовище; C. Руйнування міжклітинних контактів тканин експлантатів, одержаних з насіння в згаданому культуральному середовищі, де експлантати генерують індивідуальні клітини; D. Інкубування протягом визначеного часу культурального середовища з індивідуальними клітинами, згенерованими від експлантатів, одержаних з насіння, де згадані індивідуальні клітини репродуковані в межах визначеного часу; і, 1 UA 105519 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 E. Екстрагування олії з клітин, репродукованих від індивідуальних клітин, згенерованих від експлантатів, одержаних з насіння. В іншому аспекті способу представленого винаходу, переважно, культуральне середовище містить, щонайменше: NH4NO3, CaNO3, CuSO4, MnSO4, ZnSO4, H3BO3, KH2PO4, Na2MoO4, EDTA, FeSO4, CaCI2, CaCO3, NaC6H7O7 (цитрат натрію, MgSO4, K2SO4, тіамін, гліцин інозит, нікотинову кислоту, піридоксин, біотин, глутамін, нафталеноцтову кислоту, зеатин і джерело вуглецю. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити сіль, вибрану із групи, яка складається з CaNO3 і KNO3. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити сіль, вибрану із групи, яка складається з CaCI2 і KCI. В іншому аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити гормон, вибраний із групи, яка складається з: індолоцтової кислоти (IAA), нафталеноцтової кислоти (NAA) та індолмасляної кислоти (IBA). В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити гормон, вибраний із групи, яка складається з наступних: кінетин, бензиладенін (BA), Гібберелін (GA) та Зеатин. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити джерело вуглецю, вибране із групи, яка складається із сахарози (цукрози), фруктози та глюкози. В іншому аспекті культурального середовища способу представленого винаходу целюлазу, пектиназу і геміцелюлазу додають до культурального середовища, де целюлаза, пектиназа і геміцелюлаза руйнують міжклітинні контакти тканин експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas в згаданому культуральному середовищі. В одному додатковому аспекті способу представленого винаходу олію екстрагують з культурального середовища з індивідуальними клітинами, репродукованими від індивідуальних клітин, згенерованих від експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas за допомогою процесу, який включає: додавання органічного розчинника; обробку ультразвуком; центрифугування; екстрагування верхньої поверхні; і випаровування та висушування розчинника. Даний винахід також забезпечує культуральне середовище де, культуральне середовище включає: NH4NO3, CaNO3, CuSO4, MnSO4, ZnSO4, H3BO3, KH2PO4, Na2MoO4, EDTA, FeSO4, CaCI2, CaCO3, NaC6H7O7 (цитрат натрію), MgSO4, K2SO4, тіамін, гліцин інозит, нікотинову кислоту, піридоксин, біотин, глутамін, нафталеноцтову кислоту, зеатин і джерело вуглецю. В одному аспекті культурального середовища представленого винаходу, згадане культуральне середовище містить наступні: целюлаза, пектиназа і геміцелюлаза, де целюлаза, пектиназа і геміцелюлаза руйнують міжклітинні контакти тканин експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas в згаданому культуральному середовищі. В одному аспекті культурального середовища представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити сіль, вибрану із групи, яка складається з CaNO3 і KNO3. В одному аспекті культурального середовища представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити сіль, вибрану із групи, яка складається з CaCI2 і KCI. В одному аспекті культурального середовища представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити гормон, вибраний із групи, яка складається з: індолоцтової кислоти (IAA), нафталеноцтової кислоти (NAA) і індолмасляної кислоти (IBA). В одному аспекті культурального середовища представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити гормон, вибраний із групи, яка складається з наступних: кінетин, бензиладенін (BA), Гібберелін (GA) і Зеатин. В одному аспекті культурального середовища представленого винаходу згадане культуральне середовище може містити джерело вуглецю, вибране із групи, яка складається із сахарози (цукрози), фруктози і глюкози. Додаткові цілі і переваги представленого винаходу будуть більш очевидними в детальному описі винаходу і формулі винаходу. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Спосіб представленого винаходу включає: одержання експлантату з насіння Jatropha curcas; поміщення експлантату, одержаного з насіння Jatropha curcas в культуральне середовище; руйнування міжклітинних контактів експлантатів тканин, одержаних з насіння Jatropha curcas в згаданому культуральному середовищі, де експлантати генерують індивідуальні клітини; інкубування протягом визначеного часу культурального середовища з індивідуальними клітинами, згенерованими від експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas, де згадані індивідуальні клітини репродуковані в межах визначеного часу; і екстрагування олії із клітин, 2 UA 105519 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 репродукованих від індивідуальних клітин, згенерованих від експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas. У переважній формі способу представленого винаходу переважний час інкубування становить щонайменше 3 дні з моменту поміщення експлантату у культуральне середовище. У більш переважній формі, час інкубування становить щонайменше 8 днів з моменту поміщення експлантату у культуральне середовище. У більш переважній формі час інкубування становить щонайменше 14 днів з моменту поміщення експлантату у культуральне середовище. Інкубування переважно здійснюють при постійному струшуванні при кімнатній температурі у темряві. Інкубування також може бути виконане при освітленні джерелом світла, яке випромінює визначену довжину хвилі, наприклад інфрачервоне світло або джерелом світла, яке випромінює довжину хвилі, яка оптимальна для репродукування клітин, одержаних з насіння певної олійної рослини. Індивідуальні клітини, згенеровані від експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas, міжклітинні контакти яких руйнували після інкубування щонайменше протягом 3 днів у культуральному середовищі, можуть використовуватися як джерело для повторного інокулювання в свіже культуральне середовище, повторюючи реінокуляцію у свіжі культуральні середовища, таким чином, що відбувається перманентне репродукування згадуваних індивідуальних клітин. Переважна кількість індивідуальних клітин, які реінокульовані у свіже 5 культуральне середовище, є від 1 до 2 × 10 клітин на мілілітр і згадане свіже реінокульоване культуральне середовище інкубували протягом визначеного часу, поки клітини не досягали стаціонарної фази репродукування. В одному аспекті способу представленого винаходу експлантат одержували з насіння Jatropha curves відповідно до процедури, яка включає: дезінфекцію насіння Jatropha curcas етанолом, де згадане насіння занурюють у етанол; гідратування згадуваного продезинфікованого насіння Jatropha curcas з папером, зволоженим стерильною водою, де зволоженим стерильною водою папером обгортають насіння Jatropha curcas; стерилізування гідратованого насіння Jatropha curcas гіпохлоритом натрію, де згадане гідратоване насіння Jatropha curcas занурюють у гіпохлорит натрію; видалення шкірки простерилізованого насіння Jatropha curcas, де в результаті чого вивільняли сім'ядолю від насіння Jatropha curcas; і одержання експлантатів з сім'ядолі насіння Jatropha curcas. Для цілей заявки представленого винаходу термін експлантат стосується частини сім'ядолі насіння Jatropha curcas. У переважній формі експлантат, який одержаний з сім'ядолі насіння Jatropha curcas, складається із поперечно вирізаних частин сім'ядолі пластинчастої форми товщиною 1-2 мм. Експлантати могли також бути іншими видами частин сім'ядолі з різними формами, одержаними з насіння Jatropha curcas або насіння інших олійних рослин. У переважній формі представленого винаходу кількість експлантату може складати 1-7 г на кожні 100 мл культурального середовища. Спосіб представленого винаходу може застосовуватися до будь-яких олійних рослин. Згадуваний спосіб, пристосований до будь-яких олійних рослин, включає: A. Одержання експлантату з насіння олійної рослини; B. Поміщення експлантату, одержаного з насіння в культуральне середовище; C. Руйнування і міжклітинних контактів тканин експлантатів, одержаних з насіння в згаданому культуральному середовищі, де експлантати генерують індивідуальні клітини; D. Інкубування протягом визначеного часу культурального середовища з індивідуальними клітинами, згенерованими від експлантатів, одержаних з насіння, де згадані індивідуальні клітини репродуковані в межах визначеного часу; і, E. Екстрагування олії з клітин, репродукованих від індивідуальних клітин, згенерованих від експлантатів, одержаних з насіння. Термін "олійна рослина" стосується будь-якої рослини, з насіння або плода якої олія може бути екстрагована, у деяких випадках, харчового, в інших випадках промислового використання та в інших випадках медичного використання. Олійні рослини включають: Glycine max (соя) Elaeis guineensis (африканська Пальма) Elaeis oleifera (NoIi або американська олійна пальма), Arachis hypogaea (арахіс) Helianthus annuus (соняшник) Zea mays (кукурудза) Linum usitatissimum (льняне насіння) Brassica napus (рапс, канола або бруква) Olea europaea L. (маслина) 3 UA 105519 C2 5 10 15 20 25 30 35 Ricinus communis (касторова олія) Sesamum indicum (сезам) Simmondsia chinensis (жожоба) Vernicia fordii (тунг) Prunus dulcis (мигдаль) Carthamus tinctorius (сафлор або шафран) Gossypium hirsutum (бавовна) Moringa oleifera (касія) Triticum aestivum (пшениця) і всі класи рослин, насіння яких містить олію. В іншому аспекті способу представленого винаходу, переважно, культуральне середовище містить щонайменше наступні: NH4NO3, CaNO3, CuSO4, MnSO4, ZnSO4, H3BO3, KH2PO4, Na2MoO4, EDTA, FeSO4, CaCI2, CaCO3, NaC6H7O7 (цитрат натрію), MgSO4, K2SO4, тіамін, гліцин інозит, нікотинову кислоту, піридоксин, біотин, глутамін, нафталеноцтову кислоту, зеатин і джерело вуглецю. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити сіль, вибрану із групи, яка складається з CaNO3 і KNO3. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити сіль, вибрану із групи, яка складається з CaCI2 і KCI. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити гормон, вибраний із групи, яка складається з: індолоцтової кислоти (IAA), нафталеноцтової кислоти (NAA) і індолмасляної кислоти (IBA). В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити гормон, вибраний із групи, яка складається з наступних: кінетин, бензиладенін (BA), Гібберелін (GA) і Зеатин. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити джерело вуглецю, вибране із групи, яка складається із сахарози, фруктози і глюкози. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу целюлазу, пектиназу і геміцелюлазу додають до культурального середовища, де целюлаза, пектиназа і геміцелюлаза руйнують міжклітинні контакти тканин експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas в згаданому культуральному середовищі. Міжклітинні контакти тканин експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas, можуть бути зруйновані відповідно до інших процедур, ферментативних або неферментативних. У переважній формі, діапазони концентрації компонентів культурального середовища представленого винаходу є наступними: NH4NO3 CaNO3 або KNO3 CuSO4 MnSO4 ZnSO4 H3BO3 KH2PO4 Na2MoO4 EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота) FeSO4 CaCI2 або KCI CaCO3 NaC6H7O7 (цитрат натрію) MgSO4 K2SO4 тіамін гліцин інозит нікотинова кислота піридоксин біотин 100-500 мг/мл 200-400 мг/мл 0,1-5 мг/мл 10-40 мг/мл 20-50 мг/мл 10-20 мг/мл 50-200 мг/мл 0,1-5 мг/мл 10-50 мг/мл 10-50 мг/мл 50-100 мг/мл З0-50 мг/мл 0,1-10 мг/мл 50-300 мг/мл 700-1500 мг/мл 0,5-3 мг/мл 0,5-3 мг/мл 50-200 мг/мл 0,1-10 мг/мл 0,1-10 мг/мл 0,1-10 мг/мл 4 UA 105519 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 глутамін 20-50 мг/мл IAA або NAA, або IBA 0,5-10 мг/мл Зеатин або кінетин, або BA, або GA 0,5-10 мг/мл сахароза або глюкоза, або фруктоза 30000-100000 мг/мл геміцелюлаза і пектиназа, і целюлаза 3000-10000 мг/мл. У переважній формі способу представленого винаходу EDTA є динатрієвою сіллю. Мононатрієва сіль EDTA може також використовуватися в способі представленого винаходу. У переважній формі способу представленого винаходу інозит є міоінозитом. У переважній формі способу представленого винаходу культуральне середовище пристосоване до рН 4,8-6,5. В одному додатковому аспекті способу представленого винаходу олію екстрагують з культурального середовища з індивідуальними клітинами, репродукованими від індивідуальних клітин, згенерованих від експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas за допомогою процедури, яка включає: додавання органічного розчинника; обробку ультразвуком; центрифугування; екстрагування верхньої поверхні; і, випаровування і висушування розчинника. У випадку Jatropha curcas або будь-якої іншої олійної рослини, екстракцію олії від клітин, які були репродуковані від індивідуальних клітин, згенерованих від експлантатів, одержаних із сім'ядолі насіння, здійснювали, коли кількість клітин досягала стаціонарної фази в культуральному середовищі. Органічний розчинник додають до культурального середовища із репродукованими клітинами. Переважним органічним розчинником є гексан, можуть використовуватися інші розчинники, такі як ізопропіловий спирт або етанол, або інші. Стінки індивідуальних клітин руйнують, змішуючи з розчинником, культуральне середовище й індивідуальні клітини піддають обробці ультразвуком, вивільнюючи олію з клітин. Суміш розчинника і культурального середовища, яке містить зруйновані клітини і вивільнену олію, піддають центрифугуванню, яке відокремлює згадану суміш на дві фази: одну верхню та одну нижню. Верхня фаза містить розчинник і вивільнену олію і нижня фаза містить згадані залишки клітин і культуральне середовище. Верхню фазу з розчинником і олією відділяють і потім, розчинник згаданої фази випаровують роторним випарником і нагріванням, що надає очищену олію. Даний винахід також забезпечує культуральне середовище де, культуральне середовище включає наступні: NH4NO3, CaNO3, CuSO4, MnSO4, ZnSO4, H3BO3, KH2PO4, Na2MoO4, EDTA, FeSO4, CaCI2, CaCO3, NaC6H7O7 (цитрат натрію), MgSO4, K2SO4, тіамін, гліцин інозит, нікотинову кислоту, піридоксин, біотин, глутамін, нафталеноцтову кислоту, зеатин і джерело вуглецю. В одному аспекті культурального середовища представленого винаходу, згадане культуральне середовище містить целюлазу, пектиназу і геміцелюлазу, де целюлаза, пектиназа і геміцелюлаза руйнують міжклітинні контакти тканин експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas в згаданому культуральному середовищі. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити сіль, вибрану із групи, яка складається з CaNO3 і KNO3. В одному аспекті культурального середовища способу представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити сіль, вибрану із групи, яка складається з CaCI2 і KCI. В одному аспекті культурального середовища представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити гормон, вибраний із групи, яка складається з: індолоцтової кислоти (IAA), нафталеноцтової кислоти (NAA) і індолмасляної кислоти (IBA). В одному аспекті культурального середовища представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити гормон, вибраний із групи, яка складається з наступних: кінетин, бензиладенін (BA), Гібберелін (GA) і Зеатин. В іншому аспекті культурального середовища представленого винаходу, згадане культуральне середовище може містити джерело вуглецю, вибране із групи, яка складається із сахарози, фруктози і глюкози. У переважній формі діапазони концентрації компонентів культурального середовища представленого винаходу є наступними: NH4NO3 100-500 мг/мл CaNO3 або KNO3 200-400мг/мл CuSO4 0,1-5 мг/мл MnSO4 10-40 мг/мл 5 UA 105519 C2 5 10 15 ZnSO4 20-50 мг/мл H3BO3 10-20 мг/мл KH2PO4 50-200 мг/мл Na2MoO4 0,1-5 мг/мл EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота) 10-50мг/мл FeSO4 10-50 мг/мл CaCI2 або KCI 50-100 мг/мл CaCO3 З0-50 мг/мл NaC6H7O7 (цитрат натрію) 0,1-10 мг/мл MgSO4 50-300 мг/мл K2SO4 700-1500 мг/мл тіамін 0,5-3 мг/мл гліцин 0,5-3 мг/мл інозит 50-200 мг/мл нікотинова кислота 0,1-10 мг/мл піридоксин 0,1-10 мг/мл біотин 0,1-10 мг/мл глутамін 20-50 мг/мл IAA, або NAA, або IBA 0,5-10 мг/мл Зеатин або кінетин, або BA, або GA 0,5-10 мг/мл, сахароза або глюкоза, або фруктоза 30000-100000 мг/мл геміцелюлаза і пектиназа, і целюлаза 3000-5000 мг/мл. У переважній формі культурального середовища представленого винаходу EDTA є динатрієвою сіллю. Мононатрієва сіль EDTA може також використовуватися в способі представленого винаходу. У переважній формі культурального середовища представленого винаходу інозит є міоінозитом. У переважній формі культуральне середовище представленого винаходу пристосоване до рН 4,8-6,5. Хоча опис представляє переважні втілення представленого винаходу, додаткові зміни можуть бути зроблені у формі й розташуванні частин, не відхиляючись від ідей і основних принципів, охоплених формулою винаходу. ПРИКЛАДИ Дозріле насіння Jatropha curcas, попередньо очищене і вимите з водою і милом, дезінфікували, використовуючи ванни з етанолом; потім, згадане насіння гідратували обгортаючи змоченим стерильною водою папером; згодом, насіння стерилізували, використовуючи ванни з 3 % гіпохлоритом натрію; потім шкірку насіння вилучали хірургічним ножем; від одержаної сім'ядолі насіння Jatropha curcas одержували експлантати або поперечні пластинчасті частини товщиною 1-2 міліметрів. 1-3 грами експлантатів сім'ядолі насіння Jatropha curcas поміщали в 100 мл культурального середовища з наступним складом і наступними концентраціями: NH4NO3 400 мг/мл CaNO3 383 мг/мл CuSO4 0,25 мг/мл MnSO4 22,3 мг/мл ZnSO4 8,6 мг/мл H3BO3 6,2 мг/мл KH2PO4 170 мг/мл Na2MoO4 0,25 мг/мл Na2EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота) 37,3 мг/мл FeSO4 27,85 мг/мл 6 UA 105519 C2 5 10 15 CaCI2 72,5 мг/мл CaCO3 20 мг/мл NaC6H7O7 (цитрат натрію) 0,5 мг/мл MgSO4 180,7 мг/мл K2SO4 990 мг/мл тіамін 1 мг/мл гліцин 2 мг/мл міоінозит 100 мг/мл нікотинова кислота 0,5 мг/мл піридоксин 0,5 мг/мл біотин 1 мг/мл глутамін 30 мг/мл IAA 2 мг/мл Кінетин 1 мг/мл Сахароза 50000 мг/мл пектиназа і целюлаза 5000 мг/мл Культуральне середовище пристосовували до рН 5,8 з HCL та/або 0,1 N розчином NaOH. Згадане культуральне середовище інкубували при постійному струшуванні, при кімнатній температурі, у темряві протягом 15 днів, коли спостерігалося, що тканина експлантатів 5 перетворена до індивідуально репродукованих клітин із щільністю приблизно 2 × 10 індивідуальних клітин на мл. Клітини відділяли від культурального середовища і реінокулювали в 100 мл свіжого культурального середовища того ж самого складу і концентрацій, продовжуючи інкубування при постійному струшуванні, у темряві, протягом ще приблизною днів до досягнення стаціонарної 6 фази репродукування клітин (приблизно 2 × 10 індивідуальних клітин на мл). 100 мл гексану додають до 100 мл культурального середовища з індивідуальними клітинами 6 при щільності приблизно 2 × 10 індивідуальних клітин на мл. Одержану суміш піддавали обробці ультразвуком протягом 90 хвилин. Потім одержану суміш центрифугували при 2500 обертах у хвилину протягом 30 хвилин. Після центрифугування одержували верхню фазу і нижню фазу. Верхню фазу відділяли і поміщали у приймач, який піддавали випаровуванню у рото-випарнику при 70 °C і при 180 обертах у хвилину, і потім поміщали в сушарку на 1 годину при 75 °C. Зважували одержану олію - 1,978 г (вихід - 19,78 г/л). Олію піддавали аналізу і результати наведені в наступній таблиці: Таблиця 1 Оцінка складу жирних кислот зразка олії Визначений склад зразка олії (газова хроматографія з мас-спектрометрією) Жирна кислота Міристинова Азелаїнова Пальмітинова Пальмітолеїнова Стеаринова Олеїнова Лінолеїнова Ейкозаноєва 20 Час утримування (хв) 11,766 13,155 13,460 13,698 14,994 15,188 15,555 16,387 склад % (частин/частин)) 0,26 0,15 19,96 0,61 8,64 38,46 31,35 0,56 Склад олії, одержаної від індивідуальних клітин, одержаних із сім'ядолі насіння Jatropha curcas за допомогою способу представленого винаходу, подібного описаному в літературі, як це показано у наступному витягу таблиці від Akintayo, E:T:, Bioresource technology 92 (2004) 307310. 7 UA 105519 C2 Таблиця 3 Akintayo, сторінка 309 Склад жирних кислот (%) олії насіння PKBS (Parkia biglobbossa) і JTC (Jatropha curcas) Жирна кислота PKBS JTC Пальмітинова 27,5±0,5 19,5+0,8 Стеаринова 10,5±0,4 6,8±0,6 Олеїнова 14,5±0,5 41,3±1,5 Лінолеїнова 44,5±1,5 31,4±1,2 Ліноленова 3,0±0,2 Насичені 38 26,3 Ненасичені 62 72,7 Значення є середніми ± припустиме відхилення дубльованих визначень 5 Склад олії, одержаної з Jatropha curcas за допомогою способу представленого винаходу, порівнювали із складом олії, одержаної з Jatropha curcas, описаним у літературі. Тому, олія, одержана з Jatropha curcas за допомогою способу представленого винаходу, має необхідні характеристики біодизельного пального високої якості, як описано в літературі щодо олії, одержаної з Jatropha curcas. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 25 30 35 40 45 1. Спосіб виробництва олії, одержаної з насіння рослини, репродукованої з індивідуальних клітин, згенерованих з експлантатів рослини, де спосіб включає: a) одержання експлантата з насіння; b) поміщення експлантата, одержаного з насіння, в культуральне середовище; c) руйнування міжклітинних контактів тканин експлантатів, одержаних з насіння в згаданому культуральному середовищі, де експлантати генерують індивідуальні клітини; d) інкубування і розмноження протягом визначеного часу індивідуальних клітин, згенерованих з експлантатів, одержаних з насіння рослини, в культуральному середовищі; і e) екстрагування олії з клітин, репродукованих з індивідуальних клітин, згенерованих з експлантатів, одержаних з насіння рослини. 2. Спосіб виробництва олії, одержаної з насіння Jatropha curcas, репродукованої з індивідуальних клітин, згенерованих з експлантатів Jatropha curcas, де спосіб включає: a) одержання експлантата з насіння Jatropha curcas; b) поміщення експлантата, одержаного з насіння Jatropha curcas, в культуральне середовище; c) руйнування міжклітинних контактів тканин експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas в згаданому культуральному середовищі, де експлантати генерують індивідуальні клітини; d) інкубування і розмноження протягом визначеного часу індивідуальних клітин, згенерованих з експлантатів, одержаних з насіння рослини в культуральному середовищі; і e) екстрагування олії з клітин, репродукованих з індивідуальних клітин, згенерованих від експлантатів, одержаних з насіння Jatropha curcas. 3. Спосіб за пунктом 1 або 2, де експлантат одержують з насіння рослини відповідно до процедури, яка включає: а) дезінфекцію насіння рослини, використовуючи етанол, де згадане насіння занурюють в етанол; b) гідратування згаданого дезінфікованого насіння рослини змоченим стерильною водою папером, де змоченим стерильною водою папером обгортають насіння рослини; c) стерилізацію гідратованого насіння рослини, використовуючи гіпохлорит натрію, де згадане гідратоване насіння рослини занурюють у гіпохлорит натрію; d) видалення шкірки стерилізованого насіння рослини, де в результаті отримують сім'ядолю насіння рослини; і e) одержання експлантатів з сім'ядолі насіння рослини. 4. Спосіб за будь-яким одним з пунктів 1-3, де культуральне середовище містить щонайменше NH4NO3, CaNO3, CuSO4, MnSO4, ZnSO4, H3BO3, KH2PO4, Na2MoO4, EDTA, FeSO4, CaСl2, CaCO3, NaC6H7O7 (цитрат натрію), MgSO4, K2SO4, тіамін, гліцин, інозит, нікотинову кислоту, піридоксин, біотин, глутамін, нафталеноцтову кислоту, зеатин і джерело вуглецю. 8 UA 105519 C2 5 10 15 20 5. Спосіб за будь-яким одним з пунктів 1-4, де целюлазу, пектиназу і геміцелюлазу додають до культурального середовища, де целюлаза, пектиназа і геміцелюлаза руйнують міжклітинні контакти тканин експлантатів, одержаних з насіння рослини в згаданому культуральному середовищі. 6. Спосіб за будь-яким одним з пунктів 1-5, де культуральне середовище містить сіль, вибрану із групи, яка складається з CaNO3 і KNO3. 7. Спосіб за будь-яким одним з пунктів 1-5, де культуральне середовище містить сіль, вибрану із групи, яка складається з CaСl2 і KСl. 8. Спосіб за будь-яким одним з пунктів 1-7, де культуральне середовище містить гормон, вибраний із групи, яка складається з: індолоцтової кислоти (IAA), нафталіноцтової кислоти (NAA) та індолмасляної кислоти (IBA). 9. Спосіб за будь-яким одним з пунктів 1-7, де культуральне середовище містить гормон, вибраний із групи, яка складається з наступних: кінетин, бензиладенін (BA), гіберелін (GA) і зеатин. 10. Спосіб за будь-яким одним з пунктів 1-9, де культуральне середовище містить джерело вуглецю, вибране із групи, яка складається із сахарози (цукрози), фруктози і глюкози. 11. Спосіб за будь-яким одним з пунктів 1-10, де олію екстрагують з культурального середовища з індивідуальними клітинами, репродукованими з індивідуальних клітин, згенерованих від експлантатів, одержаних з насіння рослини за допомогою процедури, яка включає: а) додавання органічного розчинника; b) обробку ультразвуком; c) центрифугування; d) екстрагування верхньої фази; і e) випаровування і висушування розчинника. 25 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9