Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку synchytrium endobioticum (schilb.) perc.

Реферат: Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку включає зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями збудника хвороби і їх аналіз, виділення білків, ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0, підбір вихідних батьківських форм для схрещування за виявленими білковими компонентами в інтервалі рН 4,2; 5,3; 6,5; 8,1, отримання стійких нащадків. UA 80825 U (12) UA 80825 U UA 80825 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від негативної дії шкідливих організмів та хвороб. В сільському господарстві відомий метод інфрачервоної мікроскопії для діагностики ушкодження і стійкості зернових до шкідників [1]. В картоплярстві відомі польові та лабораторні способи визначення стійкості сортів та гібридів картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. [2, 3, 4]. Польовий спосіб визначення ракостійкості картоплі, заснований на безпосередньому зараженні зразків картоплі зимовими зооспорангіями збудника раку у природних польових умовах [2]. Лабораторний спосіб включає в себе зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями зі свіжих ракових наростів (найближчий аналог) [3]. Спосіб, що вирішується у найближчому аналозі, полягає в тому, що він включає в себе зараження паростків картоплі літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів при 11-13 °C. Після 21 дня проводився облік реакції рослин на дію зооспор з ракових наростів картоплі. У сприйнятливих сортів картоплі спостерігається деформація паростків картоплі та поява ракових наростів, а у стійких - поява поодиночних сорусів та некротичне відмирання тканини паростків картоплі. Згадані способи та найближчий аналог мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. 2. Їх використання пов'язане з затратою часу, який займає цілий вегетаційний період розвитку рослин картоплі та патогену. 3. Їх використання потребує зараження зразків картоплі збудником раку, який є регульованим шкідливим організмом і потребує строгого дотримання правил щодо роботи з карантинними об'єктами. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку шляхом аналізу білків ізоелектрофокусуванням в поліакриламідному гелі вихідних батьківських форм картоплі, а також отриманих після схрещування гібридів. Поставлена задача досягається тим, що у запропонованому способі шляхом виділення білків з вихідних батьківських форм картоплі, а також з отриманих після схрещування гібридів, з наступним аналізом білків шляхом ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі в градієнті рН 3,5-10,0 вдається визначити характерні білкові компоненти у стійких до раку зразках картоплі і таким чином відібрати стійкі вихідні батьківські форми отримати стійкі нащадки без використання збудника раку, який є карантинним організмом. 1. Для аналізу не використовується інфекційний матеріал (зооспори збудника раку), який є карантинним організмом. 2. Запропонований спосіб дозволяє визначити успадкування стійкості за значно коротший термін часу - 2 доби (при найближчому аналозі - протягом 21 доби). 3. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що шляхом ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі вдається відбирати стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі і отримувати стійкі нащадки. Отже, спосіб, що заявляється, відповідає критерію корисної моделі "новизна" та "суттєві відміни". Приклади здійснення способів Приклад 1. Зразки бульб сортів та гібридів картоплі, коли паростки досягають 1-2 мм, заражають літніми зооспорангіями зі свіжих ракових наростів протягом 24 годин при 11-13 °C. Для цього на верхівку бульби картоплі навколо паросткової частини приліплюють паперове кільце за допомогою суміші парафіну та вазеліну (1:1). В кільце наливають дистильовану воду, кладуть шматочки свіжого ракового наросту. Зразки залишають у клімо-камері з підвищеною вологістю і температурі 11-13 °C. Час експозиції становить 24 години. Інфекцію з паперовими кільцями знімають з бульб і залишають зразки картоплі при температурі 17-18 °C протягом 20 діб, після чого відзначають реакцію паростків картоплі на зараження патогеном. Для цього їх аналізують під бінокулярною лупою і відрізняють ступінь ураження: 1 - некротизована тканина паростка, одиничні соруси; 2 - розсіяні соруси (якщо більше 5), щільні соруси без деформації паростка; 3 - щільні соруси з деформацією паростка, раковий наріст. В результаті проведених досліджень з вивчення стійкості до раку різних комбінацій схрещування вихідних батьківських форм картоплі виявлено, що в комбінації схрещування 1 UA 80825 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 стійкий х стійкий (Гітте (♀) х 81 459с19 (♂) до раку з 17 отримано 17 (100 %) гібридів картоплі стійких до звичайного патотипу збудника раку. В результаті досліджень комбінації схрещування стійкий х сприйнятливий проти раку (Гітте (♀) х Поліська рожева (♂) з 17 отримано 9 стійких до хвороби гібридів (П95 9-6, П95 9-7, П95 924, П95 9-25, П95 9-26, П95 9-27, П95 9-28, П95 9-31, П95 9-32). При схрещуванні вихідних батьківських форм сприйнятливий х стійкий (Поліська рожева (♀) х 81 459с19 (♂) з 18 виявлено 9 (50 %) стійких проти раку гібридів картоплі (П95 49/3, П95 49/21, П95 49/25, П95 49/28, П95 49/53, П95 49/55, П95 49/57, П95 49/58, П95 49/60). При дослідженні комбінації схрещування батьківських форм картоплі сприйнятливий х сприйнятливий (Поліська рожева (♀) х Тетерів (♂) з 15 отримано 1 - П95 11/57, або (6,9 %) стійких проти раку гібридів. Даний гібрид був стійкий, оскільки вихідна батьківська форма, сприйнятлива до раку, в свою чергу була отримана при схрещуванні сприйнятливої до стійкої до раку форм. Дані представлені в таблиці 1. Приклад 2. Ізоелектрофоретичні дослідження білків бульб картоплі проводили в ультратонких пластинах поліакриламідного гелю (при С - відношення маси метиленбісакриламіду до загальної маси обох полімерів: акриламід + метиленбісакриламід - 3 %, Т - відношення сумарної маси обох полімерів до об'єму їх розчину - 5 %) з амфолітом інтервалу рН 3,5-10,0. В основі методу лежить принцип розділення білків за ізоелектричними точками в градієнті рН (оборотний логарифм концентрації іонів водню в розчині) (4). Для дослідницької роботи використовували три вихідні форми картоплі: Гітте, Поліська рожева, гібрид П 81 459 с 19, а також 42 гібрида, одержаних в результаті схрещування даних форм. Для виділення білків тканину бульб розтирали в фарфоровій ступці і центрифугували, супернатант в кількості 7 мкл наносили за допомогою аплікатора на поліакриламідному гелі. Розгонку білків в електричному полі проводили на охолоджуючому столику при напрузі 600 В. Час стабілізації - 2 години [4]. Гелі від амфоліту відмивали в розчині трихлороцтової кислоти: етанолу: води (10:25:65). Фарбування білкових треків проводилось за допомогою барвника Commassi blue G-250. Відмивку надлишків фарби проводили розчином оцтової кислоти: етанолу: води (10:25: 65) [4, 5]. В результаті аналізу білкових спектрів вихідних форм картоплі та їх гібридів встановлено, що білкові спектри вихідних форм наслідуються гібридами. У варіанті схрещування стійкий х стійкий до раку картоплі сорту Гітте (♀) х гібрид 81.459с19 (♂) із 19 досліджених гібридів виділяються комплексом білкових компонентів спектру - а + b + с + d при рН 4,2; 5,3; 6,5; 8,1 - (фіг. 1). Поліморфізм білків стійких до раку вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів, отриманих після схрещування стійкий х стійкий (Гітте (♀) х 81 459с 19 (♂)) 1 - Гітте (♀) – материнська форма (стійка); 2 - П 94 27-11 (стійкий); 3 - П 94 27-12 (стійкий); 4 - П 94 27-21 (стійкий); 5 - П 94 27-22 (стійкий); 6 - П 94 27-26 (стійкий); 7 - П 94 27-39 (стійкий); 8 - П 94 27-46 (стійкий); 9 - П 94 27-49 (стійкий); 10 - П 94 27-52 (стійкий); 11 - П 94 27-53 (стійкий); 12 - П 94 27-54 (стійкий); 13 - П 94 27-55 (стійкий); 14 - П 94 27-56 (стійкий); 15 - П 94 27-57 (стійкий); 16 - П 94 27-58 (стійкий); 17 - П 94 27-57 (стійкий); 18 - П 94 27-58 (стійкий); 19 - батьківська форма – 81459с19 (♂) (стійка). При схрещуванні вихідних батьківських стійкий х сприйнятливий проти раку (Гітте (♀) х Поліська рожева (♂) у 9 стійких до хвороби гібридів (П95 9-6, П95 9-7, П95 9-24, П95 9-25, П95 9 2 UA 80825 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 26, П95 9-27, П95 9-28, П95 9-31, П95 9-32) виділено білкові компоненти з рН 4,2; 5,3; 6,5; 8,1; що характерні для стійкої форми Гітте (фіг. 2). Поліморфізм білків різних за стійкістю до раку вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів, отриманих після схрещування стійкий х сприйнятливий (Гітте (♀) х Поліська рожева (♂)) 1. (Гітте (♀) – материнська форма (стійка до раку); 2. П 95 9-1 (сприйн.); 3. П 95 9-6 (стійкий); 4. П 95 9-7 (стійкий); 5. П 95 9-8 (сприйн.); 6. П 95 9-10 (сприйн.); 7. П 95 9-12 (сприйн.); 8. П 95 9-22 (сприйн.); 9. П 95 9-23 (сприйн.); 10. П 95 9-24 (сприйн.); 11. П 95 9-25 (стійкий); 19. Батьківська форма – Поліська рожева (♂) (сприйнятлива). В результаті досліджень комбінації схрещування сприйнятливий х стійкий (Поліська рожева (♀) х 81 459с 19 (♂) виявлені білкові компоненти у цьому ж інтервалі рН у 9 стійких проти раку гібридів картоплі - П95 49/3, П95 49/21, П95 49/25, П95 49/28, П95 49/53, П95 49/55, П95 49/57, П95 49/58, П95 49/60 (фіг. 3). Поліморфізм білків різних за стійкістю до раку вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів, отриманих після схрещування сприйнятливий х стійкий (Поліська рожева (♀) 81459с19 (♂)) 1. Поліська рожева (♀) – материнська форма (сприйнятлива до раку); 2. П95 49/3 (стійка); 3.П95 49/5 (сприйнятливий); 4.П95 49/21 (стійка); 5.П95 49/25 (стійка); 6. П95 49/28 (стійкий); 7. П95 49/35 (сприйнятливий); 8. П95 49/48 (сприйн.); 9. П95 49/53 (стійкий); 10. П95 49/54 (сприйн.); 11. П95 49/55 (стійкий); 12. П95 49/56 (сприйн.); 13. П95 49/57 (стійкий); 14. П95 49/58 (сприйн.); 15. П95 49/59 (стійкий); 16. П95 49/60 (стійкий); 17. П95 49/61 (сприйн.); 18. П95 49/62 (стійка); 19. П95 49/63 (сприйн.); 20.81459с19 (♂) – батьківська форма (стійка). При дослідженні комбінації схрещування батьківських форм картоплі сприйнятливий х сприйнятливий (Поліська рожева (♀) х Тетерів (♂) дані білкові компоненти зустрічається лише у стійкого гібриду П95 11/57 (фіг. 4). Поліморфізм білків сприйнятливих до раку вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів, отриманих після схрещування сприйнятливий х сприйнятливий (Поліська рожева (♀) х Тетерів (♂)) 1. Поліська рожева (♀) – материнська форма (сприйнятлива до раку); 2. П95 11/16 (сприйн.); 3. П95 11/22 (сприйн.); 4. П95 11/26 (сприйн.); 5. П95 11/28 (сприйн.); 6. П95 11/30 (сприйн.); 7. П95 11/37 (сприйн.); 8. П95 11/43 (сприйн.); 9. П95 11/46 (стійкий); 10. П95 11/47 (стійкий); 3 UA 80825 U 5 10 15 11. П95 11/57 (сприйн.); 12. П95 11/67 (сприйн.); 13. П95 11/68 (сприйн.); 14. П95 11/69 (сприйн.); 15. П95 11/70 (сприйн.); 16. П95 11/77 (сприйн.); 17. Батьківська форма – Тетерів (♂) (сприйнятлива). Таким чином, в результаті проведених досліджень встановлено, що гібриди картоплі отримані після різних комбінацій схрещування стійкий х стійкий до раку, стійкий х сприйнятливий до раку наслідують компоненти білкових спектрів вихідних батьківських форм картоплі. Виявлені білкові спектри у гібридів картоплі, отриманих при комбінації схрещування стійкі х стійкий до раку відсутні у гібридів, отриманих в результати комбінації сприйнятливий х стійкий до раку гібридів. За комплексом компонентів білкових спектрів, які розташовані в інтервалі рН 4,2; 5,3; 6,5; 8,1 у вихідних батьківських форм картоплі та отриманих після схрещування гібридів можна визначити успадкування стійкості картоплі до збудника раку. Методом ізоелектрофокусування білків картоплі в поліакриламідному гелі вдається встановити відмінності в білковому спектрі у контрастних за стійкістю до раку вихідних батьківських форм картоплі та у отриманих після їх схрещування гібридів. За такою ознакою можна відібрати стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі для схрещування і отримати стійкі нащадки. 20 25 30 35 Літературні джерела 1. Вилкова Н.А., Шапиро И.Д., Борщева Т.А. Использование инфракрасной микроскопии для диагностики повреждения и устойчивости зерновок к клопам. В сб. Методы исследований патологических изменений растений. - М.: Колос, 1976. - С. 216-219. 2. Зеля А. Г., Методологія оцінки та відбору селекційного матеріалу картоплі стійкого до раку./ А.Г. Зеля, П.О. Мельник //Методичні рекомендації - Чернівці - 2007.-20 с. 3. Патент України на корисну модель № 10504 МКВ A01H3/00, G01 N33/00. A01C1/00. G01J3/28 від 15.11.2005 р. Спосіб визначення наслідування стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. /Зеля А.Г., Костишин С.С., Мельник П.О., Осипчук А.А., Підгаєцький А.А., Бондарчук А.А., Сидорчук В.І., Сологуб О.С. заявл. 05.05.2005 р., опубл. 15.11.2005 р. // Офіційний бюлетень. Промислова власність, Бюл. № 11. С. 56. 4. Патент України на корисну модель № 17048 МКВ А01С 1/00 від 15.09.2006 р. Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. /Зеля А.Г., Костишин С.С., Мельник П.О.,Тома З.Г., Барбакар М.І. заявл. 16.02.2006 р., опубл. 15.09.2006 р. // Офіційний бюлетень. Промислова власність, Бюл. № 9 С. 78. 5. Ригетти Т… Изоэлектрофокусирование белков в ПААГ. Теория, методы, применение… 1984. - М., Мир, 326 с. Таблиця 1 Реакція гібридів картоплі та їх батьківських форм на зараження збудником раку (2012 р.) Ступінь стійкості № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Сорти, гібриди картоплі Ступінь стійкості бульб Кількість уражених бульб 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Гітте (♀) (стійка) П94 27-11 П94 27-12 П94 27-21 П94 27-22 П94 27-26 П94 27-39 П94 27-46 П94 27-49 П94 27-52 П94 27-53 П94 27-54 П94 27-55 П94 27-56 4 Відсоток зараження контролю 100 92,4±0,56 97,6±0,77 94,9±0,54 97,6±0,77 94,4±0,66 88,3±0,53 96,4±0,54 92,5±0,49 91,1±0,57 94,4±0,66 97,6±0,33 86,7±0,43 91,1±0,57 UA 80825 U Таблиця 1 Реакція гібридів картоплі та їх батьківських форм на зараження збудником раку (2012 р.) Ступінь стійкості № п/п 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. Ступінь стійкості бульб П94 27-57 П 94 27-58 П 94 27-59 П 94 27-60 81 459с19 (♂) (стійка) Поліська рожева (сприйнятлива) П95 49/3 П95 49/5 П95 49/21 П95 49/25 П95 49/28 П95 49/35 П95 49/48 П95 49/53 П95 49/54 П95 49/55 П95 49/56 П95 49/57 П95 49/58 П95 49/59 П95 49/60 П95 49/61 П95 49/62 П95 49/63 81 459с19 (♂) (стійка) Гітте (♀) (стійка) П95 9-1 П95 9-6 П95 9-7 П95 9-8 П95 9-10 П95 9-12 П95 9-22 П95 9-23 П95 9-24 П95 9-25 П95 9-26 П95 9-27 П95 9-28 П95 9-29 П95 9-30 П95 9-31 П95 9-32 Поліська рожева (сприйнятлива) Поліська рожева (сприйнятлива) П95 11/16 П9511/22 Кількість уражених бульб 2 1 1 1 1 0 0 0 0 0 Відсоток зараження контролю 94,1±0,66 97,6±0,77 96,3±0,33 97,6±0,77 88,3±0,53 3 5 97,6±0,77 1 3 2 1 1 3 3 2 3 1 3 1 1 3 1 3 1 3 1 1 3 2 2 3 3 3 2 2 1 1 1 1 1 3 3 1 2 Сорти, гібриди картоплі 0 3 0 0 0 3 3 0 5 0 5 0 0 3 0 3 0 3 0 0 3 0 0 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 3 3 0 0 93,8±0,56 91,7±0,72 86,7±0,43 93,8±0,54 97,8±0,56 96,3±0,74 96,3±0,74 98,4±0,42 97,7±0,77 86,7±0,43 97,6±0,77 96,3±0,74 96,6±0,33 96,3±0,74 96,6±0,33 96,3±0,74 86,7±0,43 94,9±0,69 97,8±0,56 97,8±0,56 94,9±0,69 90,2±0,46 94,3±0,43 93,6±0,73 97,7±0,76 89,0±0,66 92,5±0,49 91,2±0,46 93,6±0,73 89,0±0,66 91,2±0,46 93,6±0,73 94,3±0,43 91,2±0,46 94,2±0,46 91,2±0,66 93,6±0,73 3 5 97,8±0,66 3 5 97,8±0,56 3 3 3 3 86,9±0,52 85,6±0,51 (♀) (♂) (♀) 5 UA 80825 U Таблиця 1 Реакція гібридів картоплі та їх батьківських форм на зараження збудником раку (2012 р.) Ступінь стійкості № п/п Сорти, гібриди картоплі Ступінь стійкості бульб Кількість уражених бульб 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 0 3 3 3 3 3 0 62. П95 11/26 63. П95 11/28 64. П95 11/30 65. П95 11/37 66. П95 11/43 67. П95 11/46 68. П95 11/47 69. П95 11/57 70. П95 11/68 71. П95 11/70 72. П95 11/75 73. П95 11/76 74. П95 11/77 75. Тетерів (♂) (сприйнятлива) HIP ≤ 0,6 Відсоток зараження контролю 86,3±0,76 91,7±0,72 95,8±0,53 93,1±0,76 90,4±0,74 91,7±0,72 93,1±0,76 97,8±0,57 91,0±0,66 97,7±0,76 93,6±0,73 91,0±0,66 93,1±0,76 99,2±0,57 1,8 Примітка. 1, 2, 3 - ступінь ураження зразків картоплі збудником раку ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку, що включає зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями збудника хвороби і їх аналіз, який відрізняється тим, що з вихідних батьківських форм картоплі, а також з гібридів, отриманих від різних комбінацій схрещування виділяють білки, проводять їх ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0, за виявленими білковими компонентами в інтервалі рН 4,2; 5,3; 6,5; 8,1 підбирають стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі для схрещування і отримують стійкі нащадки. 6 UA 80825 U 7 UA 80825 U 8 UA 80825 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9