Кератиноцити, придатні для застосування як біологічно активна субстанція при лікуванні ран

1. Кератиноцити, які являють собою клітини з культури KC-BI-1 (DSM ACC 2514) або є їх похідними, які є неімморталізованими і які являють собою біологічно активну субстанцію для лікування ран. 2. Кератиноцити за п. 1, які відрізняються тим, що вони допускають можливість подвоєння їх кількості принаймні 150 разів при їх вирощуванні методом культивування клітин in vitro. 3. Кератиноцити за п. 1 або 2, які відрізняються тим, що вони виділені з епідермальних ділянок крайньої плоті. 4. Кератиноцити за будь-яким з пп. 1-3, які відрізняються тим, що подвоєння їх кількості неможливе а) за відсутності фетальної телячої сироватки і/або б) за відсутності клітин, які підгодовують, і/або в) за відсутності епідермального фактора росту (EGF-фактора). 5. Кератиноцити за будь-яким з пп. 1-4, які відрізняються тим, що теломеразна активність вказаних кератиноцитів принаймні в 2 рази нижча в порівнянні з клітинами лінії HaCaТ. 6. Кератиноцити за будь-яким з пп. 1-5, які відрізняються тим, що вони допускають можливість подвоєння їх кількості принаймні 200 разів при їх вирощуванні методом культивування клітин in vitro. 7. Кератиноцити за будь-яким з пп. 1-6, які відрізняються тим, що вони допускають можливість подвоєння їх кількості принаймні 250 2 (19) 1 3 81398 4 а) насамперед полі-L-лактид, полі-D,L-лактид, співполімер L-лактиду і D,L-лактиду, полігліколід, співполімер L-лактиду і гліколіду, співполімер Lлактиду і триметиленкарбонату або полідіоксанон, при цьому б) вказані полімери є перфорованими або в) неперфорованими. 16. Продукт за будь-яким з пп. 12-15 для застосування в медицині. 17. Спосіб кріоконсервації кератиноцитів за будьяким з пп. 1-8 або продукту за будь-яким з пп. 1115, який полягає в тому, що кератиноцити або продукт кріоконсервують шляхом їх/його охолодження до температури в межах від -20 до 196°C, переважно в межах від -60 до -80°C. 18. Продукт із кератиноцитів і носія за будь-яким з пп. 11-15, оброблений способом за п. 17. 19. Застосування кератиноцитів за будь-яким з пп. 1-8 або продукту за будь-яким з пп. 12-15 для отримання лікарського засобу для лікування ран. 20. Застосування за п. 19, при якому ранами переважно є опіки і/або виразки. 21. Застосування за п. 19, при якому ранами переважно є опіки другого ступеня. 22. Застосування за п. 19, при якому ранами переважно є виразки гомілки, які перейшли в хронічну форму, і які погано гояться, типу Ulcus cruris, переважно Ulcus cruris venosum. 23. Застосування за п. 19, при якому ранами переважно є зумовлені діабетом виразки. 24. Застосування за п. 19, при якому ранами переважно є пролежні. 25. Застосування за будь-яким з пп. 19-24, яке здійснюється додатково до застосування або в сполученні із застосуванням одного або декількох інших матеріалів, які позитивно впливають на процес загоєння ран. 26. Застосування за п. 25, при якому іншим матеріалом є гідроколоїдні перев'язні матеріали. 27. Застосування за п. 25, при якому іншим матеріалом є протимікробні речовини, такі, наприклад, як антибіотики. Даний винахід стосується нових культивованих in vitro кератиноцитів, а також їх переважного застосування для одержання продукту, який може використовуватися для лікування свіжих ран і ран, які перейшли в хронічну форму. Винахід стосується, таким чином, галузі медицини, насамперед загоєння ран методами тканинної інженерії. Алогенні кератиноцити протягом багатьох років успішно використовуються для лікування ран, головним чином виразок і/або опіків [Маіеr, 1993; Schonfeld і ін., 1993]. Рани, які протягом тривалого періоду часу не піддаються лікуванню традиційними терапевтичними методами, досить часто можна успішно лікувати з застосуванням алогенних кератиноцитів [Phillips і Gilchrest, 1993; Beele і ін., 1991; Leigh і ін., 1991; Lindgren і ін., 1998]. Спочатку основна увага при застосуванні алогенних кератиноцитів приділялася в основному заміщенню шкірного покриву, тобто регенерації трансплантованого епідермісу. Однак незабаром було встановлено, що ефект терапевтичного лікування визначається в першу чергу стимуляцією ендогенного процесу реепіталізації, а не "приростанням" алогенного клітинного трансплантата в рйні. За результатами численних експериментів в остаточному підсумку було встановлено, що трансплантовані кератиноцити залишаються в рані лише протягом певного періоду часу, а потім за клінічно не виявленими причинами виводяться з організму [Kawai і ін., 1993]. Таким чином, ендогенне загоєння ран стимулюється в першу чергу в результаті оптимального в просторі і часі вивільнення алогенними кератиноцитами багатьох різних факторів росту, цитокинів, позаклітинного матриксу (ІЖМ), більш дрібних молекул і протеаз [Lang і ін., 1996; Marcusson і ін., 1992]. Складністю і великою розмаїтістю факторів, які вивільняються, зумовлена при цьому терапевтична перевага перед традиційними терапевтичними методами, заснованими на застосуванні індивідуальних субстанцій окремо, наприклад виділених факторів росту. Поряд з основним ефектом реепітелізації при лікуванні кератиноцитами в грануляційній тканині відбуваються й інші зміни, які виявляються на макроскопічному і мікроскопічному рівні [Lang і ін., 1996]. Ще один ефект, який сприятливо впливає на пацієнта і широко описаний у літературі, що спостерігається при застосуванні кератиноцитів, полягає в прояві ними яскраво вираженої анальгетичної дії після їх трансплантації [Schonfeld і ін., 1993]. Для загоєння ран переважно використовувати недиференційовані кератиноцити, які активно діляться, оскільки саме кератиноцити, які активно діляться, як передбачають, мають комплексний секреторний профіль, який сприяє загоєнню ран. За винятком стовбурових клітин недиференційовані кератиноцити при природному диференціюванні втрачають in vivo свій проліферативний потенціал уже через кілька циклів клітинного поділу, що дотепер завжди спостерігалося при культивуванні кератиноцитів in vitro [Barrandon і Green, 1987]. Тому кератиноцити, що активно діляться, які дотепер розглядалися як найбільш придатні для загоєння ран, допускали можливість їх остаточного культивування тільки in vitro, що значно ускладнювало і приводило до подорожчання їх застосування в медицині. У терапевтичних цілях алогенні кератиноцити використовують або безпосередньо у вигляді так званих "шарів кератиноцитів", які представляють собою багатошарове "скупчення" клітин, відділених від чашки для культивування за допомогою ферментів, або разом з біосумісними носіями у вигляді так званої "біологічно активної пов'язки на рану". Перевага останньої полягає у 5 відсутності необхідності попередньої ферментативної обробки клітин, метою якої є відділення клітин перед їх застосуванням від дна чашки для культивування. Крім цього застосування біосумісних мембран як носіїв для культивування кератиноцитів (ЕР 0462462, US 5658331, US 5693332, ЕР 0518920) дозволяє завчасно заготовлювати біологічно активні пов'язки на рани, оскільки в цьому випадку більше не потрібно утворення замкнутого "скупчення" клітин. При цьому існує можливість використовувати для лікування ран носії, які уже покриті вирослими на них клітинами в результаті їх субзлиття. Ще одна перевага, пов'язана з застосуванням пов'язок із клітинами, які субзлилися, полягає крім можливості їх завчасного заготовлення в тому, що культивовані у відповідних умовах кератиноцити диференційовані в меншому ступені і тому виявляються більш ефективними при лікуванні ран. Кератиноцити допускають можливість їх кріоконсервації індивідуально або в сполученні з біосумісними носіями шляхом охолодження до температури в межах від -30 до -196°С, переважно, однак, від -70 до -90°С, без зниження їх ефективності при загоєнні ран [De Luca і ін., 1992; Теере і ін., 1993]. Подібна можливість додатково підвищує терапевтичну цінність кератиноцитів, оскільки дозволяє у певних обсягах виготовляти біологічно активні пов'язки на рани "про запас". Задача винаходу Відомі з рівня техніки кератиноцити, а також виготовлені на їх основі ι біологічно активні пов'язки на рани мають на даний час певні недоліки, подолання яких і є покладеною в основу даного винаходу задачею. Очевидний недолік відомих на даний час кератиноцитів первинного походження полягає в тому, що подвоєння кількості таких клітин при їх вирощуванні методом культивування in vitro можливо без втрати їх високої активності, що виявляється в готовності до поділу, і тим самим без погіршення їх переважних властивостей, якими визначається їх придатність для виготовлення біологічно активних пов'язок на рани, лише протягом невеликого числа їх поколінь. Відповідно до рівня техніки кількість клітин можна збільшити шляхом їх культивування in vitro лише приблизно в 103-104 разів [Tanczos і ін., 1999]. Ще один, пов'язаний з описаним вище недолік полягає в необхідності частого і трудомісткого повторного виділення нових клітин через обмежену здатність вказаних кератиноцитів до розмноження при культивуванні in vitro, і тому виділений і розмножений клітинний матеріал не має однорідності, а виготовлені на його основі пов'язки на рани тим самим з високим ступенем імовірності відрізняються або принаймні можуть відрізнятися одна від одної за своїми якісними показниками. Ще один недолік полягає в тому, що з повторним виділенням нових кератиноцитів у різних донорів пов'язаний підвищений ризик інфікування реципієнта, якому на рану накладають 81398 6 пов'язку, яка містить ці кератиноцити. Як можливий приклад при цьому можна назвати підвищений ризик зараження ВІЛ або гепатитом. У даному винаході пропонуються кератиноцити, які мають високий проліферативний потенціал, які є не імморталізованими і допускають можливість подвоєння їх кількості принаймні 150 разів при їх вирощуванні методом культивування клітин in vitro. Звідси випливає, що кількість клітин зростає приблизно в 1044 разів. При цьому відповідні кератиноцити зберігають свої позитивні властивості, які дозволяють використовувати їх для загоєння ран. Запропоновані у винаході кератиноцити являють собою первинно виділені в донора і культивовані in vitro кератиноцити, для виділення і початкового культивування яких може використовуватися, наприклад, метод, описаний Rheinwald і Green, 1975. У переважному варіанті здійснення винаходу кератиноцити виділяють з епідермальних ділянок крайньої плоті. Найбільш переважні кератиноцити людини і насамперед кератиноцити з культури КСВІ-1, які відповідно до Будапештського договору були задепоновані для цілей патентування 27 червня 2001р. у Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Брауншвейг, Німеччина) під реєстраційним номером DSM ACC2514. В обсяг винаходу включені також ті кератиноцити, які є похідними клітин з культури КС-ВІ-1 (DSM ACC2514). Об'єктом винаходу є, таким чином, також усі ті клітини і культури, які одержують і/або які можна одержати шляхом субпасивування і/або субклонування вихідної культури КС-ВІ-1. Культивування запропонованих у винаході кератиноцитів розглянуто нижче на прикладі кератиноцитів КС-ВІ-1 (приклад 1). Для культивування клітин переважно використовувати комплексне середовище вказаного в прикладі 1 складу, а також клітини, які підгодовують, (які називаються також "клітинами-фідерами"), як які переважно застосовувати опромінені летальною дозою мишині фібробласти ЗТЗ. Вміст фетальної телячої сироватки (ФТС) у культуральному середовищі повинен становити від 2 до 10%. Методи одержання клітин, які підгодовують, добре відомі фахівцям у даній галузі, наприклад їх можна одержувати описаним у прикладі 2 методом. Запропоновані у винаході кератиноцити найбільш переважно при цьому вирощувати шляхом їх субкультивування (пересівання) при максимальному ступені їх злиття, що дорівнює 80%. Запропоновані у винаході кератиноцити можна культивувати при температурі від 35 до 38°С, переважно при 37°С, і при відносній вологості повітря, що становить більше 90%, переважно 95%, в атмосфері, насиченій СО2 на 59%. При культивуванні кератиноцитів, насамперед кератиноцитів людини, виділених з епідермальних ділянок крайньої плоті, описаним у прикладі 1 методом час подвоєння їх кількості становить від 1-го до 2-х днів (Фіг.1). При цьому швидкість 7 подвоєння кількості культивованих клітин навіть при їх багаторазовому пасивуванні залишається приблизно на постійному рівні (Фіг.2). Очевидно, що даний винахід не обмежений застосуванням тільки кератиноцитів КС-ВІ-1, а при відповідних умовах припускає можливість його здійснення згідно з пп. 1-8 формули винаходу з використанням кератиноцитів усіх типів. Вираз "не імморталізовані" у контексті даного винаходу означає, що первинно виділені кератиноцити, а також внесені в культуру кератиноцити не є спонтанно трансформованими і/або не були трансформовані відомими з рівня техніки молекулярно-біологічними, хімічними або фізичними методами.' В останньому випадку передбачається, що клітини не піддавалися обробці з застосуванням, наприклад, вірусних факторів або послідовностей, хімічних мутагенів або, наприклад, опромінення або обробці декількома такими методами в їх сполученні. Під "не імморталізованими" маються на увазі також кератиноцити, які не мають або зовсім мають значно більш низьку теломеразну активність в порівнянні з лініями трансформованих пухлинних клітин [Härle-Bachor і Boukamp, 1993] або в порівнянні з лініями імморталізованих клітин, переважно в порівнянні з клітинами лінії HeLa (див. Фіг.3). Сказане стосується, зокрема, і теломеразної активності не імморталізованих кератиноцитів у порівнянні з імморталізованими кератиноцитами клітинної лінії HaCat. Вираз "не імморталізовані" означає далі, що подвоєння кількості вказаних кератиноцитів на відміну, наприклад, від імморталізованих кератиноцитів (Schoop і ін., 1999) неможливо за відсутності фетальної телячої сироватки і/або під час відсутності клітин, які підгодовують, і/або під час відсутності епідермального фактора росту (EGF-фактора від англ. "epidermal growth factor"). Вираз "не імморталізовані" означає також, що вказані кератиноцити не змінюють характерний для них фенотип зі збільшенням числа циклів подвоєння їх кількості (див. Фіг.4). Вираз "не імморталізовані" означає, крім того, що вказані кератиноцити після їх трансплантації безшерстим мишам (безтимусним мишам з мутацією nude), переважно мишам лінії BALB/c, виявляють нормальний профіль ι диференціювання. Під "нормальним профілем диференціювання" при цьому мається на увазі наявність у кератиноцитів здатності розвиватися до остаточно диференційованих кератиноцитів і здатності до утворення надбазальних епідермальних шарів, а також рогового шару (Stratum corneum) аналогічно до аутологічних кератиноцитів. Об'єктом винаходу є також ті кератиноцити, які є не імморталізованими і допускають можливість подвоєння їх кількості принаймні 200 разів при їх вирощуванні методом культивування клітин in vitro. Винахід стосується також кератиноцитів, які є не імморталізованими і допускають можливість подвоєння їх кількості принаймні 250 разів при їх вирощуванні методом культивування клітин in vitro. Крім цього у винаході пропонуються також 81398 8 такі кератиноцити, які є не імморталізованими і допускають можливість подвоєння їх кількості принаймні 300 разів при їх вирощуванні методом культивування клітин in vitro. Одна з основних переваг даного винаходу полягає в можливості розмноження вказаних вище кератиноцитів, взятих тільки в одного або невеликого числа донорів. Так, наприклад, потомство від однієї взятої в донора клітини після 150-кратного подвоєння кількості клітин досягає 1044 клітин, після 250-кратного подвоєння кількості клітин досягає 1077 клітин, а після 300-кратного подвоєння кількості клітин досягає 1090 клітин. Відповідно до цього згідно із даним винаходом вперше стає можливим одержувати у великих обсягах стандартизований клітинний матеріал для виготовлення біологічно активних пов'язок на рани постійної і контрольованої якості. Необхідну кількість стандартизованого клітинного матеріалу можна одержувати, наприклад, розмноженням кріоконсервованих клітин з банку клітин, які у свою чергу отримані з кератиноцитів, які мають властивостями, що відповідають даному винаходу. Використання стандартизованого клітинного матеріалу як вихідного матеріалу для одержання біологічно активних пов'язок на рани дозволяє також знизити ризик інфікування можливого реципієнта, оскільки число донорів, у яких виділяють кератиноцити, залишається обмежено невеликою кількістю людей, переважно однією людиною. Тим самим даний винахід дозволяє подолати істотний недолік, який у даний час полягає в можливості пасивування відомих на сьогодні кератиноцитів лише обмежене число раз. Об'єктом винаходу є далі продукт, який складається з носія, покритого запропонованими у винаході кератиноцитами. Вираз "покритий" у контексті даного винаходу означає, що носій частково або повністю покритий на його поверхні вирослими на ньому запропонованими у винаході кератиноцитами. Найбільш переважний частково покритий вирослими на ньому кератиноцитами носій, оскільки в цьому випадку скорочується проміжок часу, який потрібно витрачати на культивування клітин і відповідно на одержання придатного для загоєння ран носія. Один із придатних для застосування в передбачених винаходом цілях носіїв відрізняється тим, що він являє собою біосумісний матеріал, який допускає можливість його застосування для одержання відповідного лікарського засобу. Як такий носій можна використовувати, наприклад, гідрофобні біосумісні матеріали, описані, зокрема, у WO 91/13638. Разом з тим як носій можна використовувати і матеріали, які мають переважно гідрофільні властивості. В одному з переважних варіантів здійснення даного винаходу як носій пропонується використовувати полімерні матеріали з етерифікованої гіалуронової кислоти. Відповідно до особливо переважного варіанта як носій використовується полімер з етерифіковоної гіалуронової кислоти у вигляді перфорованої 9 полімерної плівки певної геометрії. Така полімерна плівка має, наприклад, товщину від 10 до 500мкм і перфорована отворами розміром від 10 до 1000мкм, при цьому перфоровані отвори мають певний і постійний розмір і розташовані у вигляді впорядкованого ряду з постійним кроком між ними, що становить від 50 до 1000мкм. Полімерна плівка подібного типу описана в ЕР 0462426. Застосування перфорованих носіїв найбільш доцільно з тієї причини, що вони не вимагають точно вивіреного накладення на рану біологічно активної пов'язки. Одержання перфорованої матриці-носія з етерифікованої гіалуронової кислоти, яка має певну геометрію і покрита вирослими на ній запропонованими у винаході кератиноцитами, описано нижче в прикладі 3. Як подібна матриця-носій використовується продукт фірми Fidia Advanced Biopolymers Ltd., АбаноТерме, Італія, що продається у Німеччині за назвою "Laserskin". Особливо висока придатність такого носія для одержання біологічно активних пов'язок на рани з використанням кератиноцитів уже була підтверджена в експериментах на тваринах (Lam і ін., 1999), а також у дослідженнях на людях (Harris і ін., 1999). Поряд із забезпеченням поліпшеної міграції і диференціювання епітеліальних клітин матриця з ефіру гіалуронової кислоти позитивно впливає на розвиток кровоносних судин (ангіогенез) і продукування колагену. Однак застосовувані в даний час пов'язки на рани з матрицею з ефіру гіалуронової кислоти покриті аутологічними кератиноцитами і/або еквівалентними замінниками шкіри, які мають складну структуру, на основі кератиноцитів і фібробластів. Тим самим таким пов'язкам на рани властиві розглянуті вище при описі рівня техніки недоліки. Усунути ці недоліки вдається насамперед за рахунок застосування переважних запропонованих у винаході алогенних кератиноцитів. Згідно із ще одним переважним варіантом здійснення винаходу запропонований у ньому продукт містить запропоновані у винаході кератиноцити в сполученні з резорбованими (що розсмоктуються) полімерами, як які використовуються складні поліефіри, полікарбонати, поліангідриди, складні поліортоефіри, полідепсипептиди, складні ефіри простих поліефірів, поліамінокислоти або поліфосфазени, насамперед полі-L-лактид, поліО,Ь-лактид, співполімер L-лактиду і D,L-лактиду, полігліколід, співполімер L-лактиду і гліколіду, співполімер L-лактиду і триметиленкарбонату або полідіоксанон. При цьому вказані полімери можуть бути як перфорованими, так і неперфорованими. Даний винахід стосується також способу кріоконсервації запропонованих у ньому кератиноцитів шляхом їх охолодження до температури в межах від -20 до -196°С, переважно до температури -180°С. Для консервації вказаних кератиноцитів шляхом їх заморожування можуть використовуватися стандартні і відомі фахівцям методи. Як кріозахисне середовище можна використовувати, зокрема, ДМСО 81398 10 (диметилсульфоксид). Разом з тим можливо також застосування й інших кріозахисних середовищ, таких, наприклад, як гліцерин, гідроксіетилкрохмаль або обидва ці кріозахисні середовища в сполученні між собою, а також у сполученні з ДМСО. Відповідні методи описані, наприклад, у WO 96/24018, US 5891617 або ж у US 5298417. Об'єктом даного винаходу є також спосіб кріоконсервації покритих запропонованими у винаході кератиноцитами носіїв, який відрізняється тим, що кератиноцити з відповідними носіями кріоконсервують шляхом їх охолодження до температурив межах від -20 до -196°С, переважно в межах від -60 до -80°С. Одна з основних переваг кріоконсервації полягає в можливості порівняно тривалого зберігання продукції, яка випускається у великих обсягах, і тим самим у можливості перевірки на однорідність її якості перед її медичним застосуванням за типом вибіркового контролю. Створення ж певного запасу продукції, яка направляється на зберігання, в остаточному підсумку дозволяє в короткий термін надати в розпорядження вказані пов'язки на рани для медичних цілей. Як кріозахисне середовище при кріоконсервації запропонованого у винаході продукту можна використовувати, наприклад, гідроксіетилкрохмаль у концентрації від 7 до 13% (маса/маса). Крім цього як кріозахисне середовище можна також використовувати ДМСО або гліцерин, а також комбінацію різних кріозахисних середовищ, насамперед гідроксіетилкрохмалю, ДМСО і/або гліцерину. Як кріозахисне середовище можливо також застосування трегалрзи. При кріоконсервації запропонований у винаході продукт, який складається з носія і кератиноцитів, спочатку охолоджують, швидко знижуючи температуру протягом 2-5хв із 37°С до температури в межах від -5 до -10°С, переважно від -6 до -8°С, а потім витримують при цій температурі протягом 15-30хв, переважно 23-26хв, даючи йому прийти в рівноважний стан. Після цього продукт охолоджують до температури в межах, наприклад, від -60 до -80°С, знижуючи температуру зі швидкістю менше 1°С/хв, переважно зі швидкістю від 0,2 до 0,6°С/хв, найбільш переважно зі швидкістю 0,4°С/хв. Один з можливих процесів кріоконсервації покритої клітинами КС-ВІ-1 матриці-носія з ефіру гіалуронової кислоти описаний нижче в прикладі 4. Однак для кріоконсервації можна використовувати й інші методи, наприклад описані в WO 95/07611, WO 96/24018, ЕР 0296475, при цьому перелік можливих методів кріоконсервації продуктів, які складаються з біосумісних носіїв і кератиноцитів, не вичерпується описаними в цих публікаціях, а лише вказує на популярність подібних методів з існуючого рівня техніки. Даний винахід стосується далі застосування в медицині представлених у даному описі запропонованих у винаході кератиноцитів і/або запропонованого у винаході продукту, який складається з вказаних кератиноцитів і носія, 11 насамперед їх застосування для лікування ран. В одному з варіантів здійснення винаходу запропоновані в ньому кератиноцити і/або запропонований у ньому продукт, який складається з вказаних кератиноцитів і носія, застосовують для лікування опіків і/або виразок. У випадку опіків, для лікування яких можуть використовуватися запропоновані у винаході кератиноцити і/або запропонований у винаході продукт, який складається з вказаних кератиноцитів і носія, мова переважно йде про опіки другого ступеня, а у випадку виразок переважно про ті виразки гомілки, які перейшли у хронічну форму і які погано загоюються, типу Ulcus crwris, переважно Ulcus cruris venosum, або ж про зумовлені діабетом виразки, а також про пролежні. Застосування в медицині вказаних вище кератиноцитів і/або запропонованого у винаході продукту, який складається з кератиноцитів і носія, припускає їх комбіноване і/або доповнююче застосування класичними, відомими фахівцям терапевтичними методами лікування, які позитивно впливають на процес загоєння ран. При цьому мається на увазі застосування запропонованих у винаході кератиноцитів і/або запропонованого у винаході продукту на додаток до застосування або в сполученні з застосуванням одного або декількох інших матеріалів, які позитивно впливають на процес загоєння ран. Як приклад при цьому можна назвати застосування запропонованих у винаході кератиноцитів і/або запропонованого у винаході продукту для лікування Ulcus cruris venosum на додаток і/або в сполученні з гідроколоїдними перев'язними матеріалами і/або на додаток до застосування протимікробних речовин, наприклад на додаток до прийому антибіотиків. Об'єктом винаходу є також застосування запропонованих у ньому кератиноцитів і/або продукту, який складається з біосумісного носія і вказаних кератиноцитів, для одержання медичного виробу, призначеного для лікування ран, насамперед для лікування опіків і/або виразок, наприклад для лікування опіків другого ступеня, Ulcus cruris (venosum), зумовлених діабетом виразок або пролежнів. Об'єктом винаходу є також спосіб лікування вказаних вище ран, який відрізняється тим, що запропоновані у винаході кератиноцити і/або запропонований у винаході продукт, який складається з кератиноцитів і носія, накладають на. рани, що заліковуються. Вказані кератиноцити і вказаний продукт можна при цьому використовувати або відразу після їх одержання, або після їх кріоконсервації. Відповідний спосіб лікування ран описаний у прикладі 5. Короткий опис креслень На Фіг.1 показана залежність подвоєння кількості кератиноцитів КС-ВІ-1 від тривалості їх культивування. При цьому на графіку показане число подвоєнь кератиноцитів КС-ВІ-1 (КПП, кумулятивне подвоєння популяції) залежно від тривалості культивування, що дорівнює 94-м дням. Під час спостережень протягом 94-днів кількість клітин подвоювалася приблизно 75 разів. Ця 81398 12 величина відповідає середній тривалості подвоєння кількості клітин, що дорівнює 1,25 дні з розрахунку на однократне подвоєння кількості клітин, або 12,5 дні з розрахунку на 10-кратне подвоєння кількості клітин. На Фіг.2 показана діаграма, яка відображає подвоєння кількості кератиноцитів КС-ВІ-1 за 10 місяців. При цьому подвоєння кількості кератиноцитів КС-ВІ-1 за 10 місяців представлено у вигляді числа подвоєнь популяції (ПП) при пасивуванні культури клітин з 1-го по 67-й раз. На Фіг.3 у табличному вигляді представлені результати визначення відносної теломеразної активності. При цьому наведені дані про відносну теломеразну активності для кератиноцитів КС-ВІ-1 після 1-го, 12-го, 18-го, 40-го і 57-го пасивування в порівнянні з активністю клітин лінії HeLa. З наведених у цій таблиці даних випливає, що в кератиноцитів КС-ВІ-1 майже не спостерігається, відповідно спостерігається лише незначна теломеразна активність у порівнянні з імморталізованими клітинами лінії HeLa. На Фіг.4 показана морфологія кератиноцитів КС-ВІ-1 після 5-го і 60-го пасивування. На отриманих за допомогою оптичного мікроскопа зображеннях видно, що в кератиноцитів КС-ВІ-1 відсутні які-небудь морфологічні відмінності між клітинами, отриманими при 5-му пасивуванні (тривалість культивування становить 25 днів), і клітинами, отриманими при 60-му пасивуванні (тривалість культивування становить 300 днів). Приклади здійснення винаходу Приклад 1: Спосіб культивування запропонованих ν винаході кератиноцитів на прикладі клітин з культури КС-ВІ-1 (DSM ACC2514) 1. Матеріал Кератиноцити КС-ВІ-1, опромінені мишині фібробласти ЗТЗ (клітини, які підгодовують, що одержували відповідно до описаного в прикладі 2 методу), культуральне середовище КУ1 (склад вказаний нижче), ЕДТК (0,02%), трипсин/ЕДТК (0,05%/0,01%), чашки для культивування клітин (чашки для культивування тканинних культур, що скорочено називаються Т-чашками) площею 25, 80 і 175см2 2. Розморожування клітин 2.1. Розморожування клітин, які підгодовують Клітини повільно розморожують і переносять у 5-10мл підігрітого середовища К/1. Відповідну кількість клітин, що підгодовують, переносять у чашки для культивування і додають середовище К/1: Т-чашка площею 25см2 0,5х 106 клітин кінцевий об'єм середовища 5-6мл Т-чашка площею 80см2 1,5х 106 клітин кінцевий об'єм середовища 20мл Т-чашка площею 175см2 3,5х106 клітин кінцевий об'єм середовища 50мл Клітини, які підгодовують, можна використовувати відразу ж або протягом 24год після розморожування. 2.2. Розморожування кератиноцитів Клітини повільно розморожують і переносять у 5-10мл підігрітого середовища К/1. Відповідну кількість клітин переносять у чашки для культивування з попередньо поміщеними в них 13 клітинами, які підгодовують, і заповнюють свіжим середовищем: Т-чашка площею 25см2 0,15х106 клітин кінцев. об'єм середовища 6-10мл Т-чашка площею 80см2 0,4х 106 клітин кінцев. об'єм середовища 20мл Тчашка площею 175см2 1х106 клітин кінцев. об'єм середовища 50мл 3.0. Культивування Клітини інкуюуть при 35-39°С, переважно при 37°С. Клітини інкубують в атмосфері з вологістю повітря, що становить більше 90%, переважно 95%, і з концентрацією СО2, що дорівнює 5-9%. Кератиноцити субкультивують при максимальному ступені злиття, що дорівнює 80%. З цією метою надосадову рідину клітинної культури відкидають. Клітини, які підгодовують, після двократного промивання 0,02%-ною ЕДТК (210мл) і інкубації протягом 5-10хв при 37°С відокремлюють шляхом наступного постукування (або шляхом струшування) від чашок для культивування. Потім після обробки кератиноцитів трипсином/ЕДТК (0,05%/0,01%, 1-6мл) протягом 510хв при 37°С їх обережно відокремлюють шляхом постукування. При необхідності клітини, які залишилися, обережно відокремлюють за допомогою відповідного скребка. Розчин трипсину/ЕДТК нейтралізують додаванням середовища К/1 і клітини обережно розділяють за допомогою піпетки. Клітини висівають у кількостях, вказаних вище в п. 2.2. Культуральне середовище К/1 заміняють на свіже на 3-й день, а потім кожні два дні. 4.0. Приготування середовища К/1 Усі компоненти, а також вихідні розчини послідовно додають у вказаному в таблиці 1 порядку. Об'єм суміші доводять до 1л додаванням води для ін'єкцій (ВДІ). Після цього значення рН встановлюють на 7,0-7,2 за допомогою NaOH або НСl. Осмотичний тиск повинен становити від 320 до 400 мосмолів/кг. На завершення середовище К/1 стерилізують фільтрацією. 4.1. Приготування вихідних розчинів Трийодотиронін 13,6мг трийодотироніну розчиняють у 1 мл 0,1молярного NaOH і додають 99мл забуференого фосфатом фізіологічного розчину (ЗФР). Готовий до застосування розчин розбавляють ЗФР у пропорції 1:100. На літр середовища необхідно використовувати 1 мл цього розчину. EGF-фактор 1мг EGF-фактора розчиняють у 100мл ВДІ. На літр середовища необхідно використовувати 1мл цього розчину. rh-Інсулін (тільки розчинний при рН менше 4,0) 5м rh-інсуліну додають у 0,9л ВДІ і значення рН встановлюють на 2,5 за допомогою 6-молярної НСl. Після розчинення rh-інсуліну значення рН встановлюють на 8,0 за допомогою 1-молярного NaOH. Об'єм суміші доводять до 1л додаванням ВДІ. На літр середовища необхідно використовувати 1мл цього розчину. 4.2. Склад середовища 81398 14 В іншому варіанті культивувати клітини можна також виходячи зі свіжого біоптату, наприклад виходячи з матеріалу, взятого з епідермальних ділянок крайньої плоті. Для первинного виділення недиференційованих проліферуючих кератиноцитів при цьому можна використовувати метод, описаний у Rheinwald і Green, 1975. Як клітини, які підгодовують, можна використовувати описані в прикладі 2 клітини. Крім цього можна використовувати також інші, загиблі фібробласти, переважно інші мишині фібробласти, найбільш переважно клітини, які є похідними клітин лінії ЗТЗ. Приклад 2: Одержання опромінених живильних клітин ЗТЗ для культивування кератинощггів 1. Матеріал Мишині фібробласти ЗТЗ (наприклад АТСС CCL 92, контактно-інгібовані фібробласти ЗТЗ мишей альбіносів лінії Swiss), які одержують з Американської колекції типових культур (American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevar, Manassas, VA, USA), модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла (DMEMсередовище) плюс 10% фетальної телячої сироватки (ФТС), ЗФР, 0,2%-ний розчин трипсину, 0,04%-ний розчин ЕДТК, чашки для культивування (Т-чашки) площею 25, 80 і 175см2. 2. Розморожування клітин Клітини повільно розморожують і переносять у 5-10мл підігрітого середовища. Середовище, яке містить ДМСО, видаляють після центрифугування. Клітини суспендують у 5-10мл середовища. Після визначення кількості клітин їх висівають у відповідні чашки для культивування з щільністю 103-104 клітин/см2. Клітини інкубують при 35-39°С, переважно при 37°С. Інкубацію проводять в атмосфері з вологістю повітря, яка становить більше 90%, яка переважно становить 95%, і з концентрацією СО2, що дорівнює 5-9%. 3. Культивування клітин Клітини щодня досліджують на предмет їх росту. Щільність клітин не повинна перевищувати максимальний ступінь їх злиття, що дорівнює 7080%. Субкультивування здійснюють виходячи з власного досвіду кожні 2-4 дні. З цією метою середовище відкидають, а клітини промивають певною кількістю суміші ЕДТК і трипсину (0,5-5мл) у співвідношенні 1:2. Потім клітини, які відокремилися, переносять у 3,5-20мл 15 середовища. Клітини повторно висівають із щільністю 103-104 клітин/см2. 4. Опромінення клітин, які підгодовують Доза опромінення клітин, які підгодовують, становить приблизно 60 Гр (6000 рад у джерелі 137 Cs). Опромінені, так само як і неопромінені клітини можна кріоконсервувати у рідкому азоті відповідно до стандартних процедур і зберігати в такому вигляді протягом тривалого періоду часу. Приклад 3: Спосіб покриття матрилі-носія, у даному випадку матеріалу Laserskin. кератинопитами з культури КС-ВІ-1 (DSM ACC2514) Нижче як приклад розглянутий один з можливих варіантів одержання запропонованої у винаході біологічно активної пов'язки на рану. Описана в цьому прикладі пов'язка на рану складається з запропонованих у винаході кератиноцитів КС-ВІ-1 і матеріалу Laserskin, який представляє собою біорезорбовану матрицю-носій з ефіру гіалуронової кислоти. При цьому слід зазначити, що винахід не обмежений застосуванням розглянутої в цьому прикладі комбінації кератиноцитів і носія. Більш того, для покриття носія можуть використовуватися всі ті кератиноцити, які мають вказані в пп. 1-8 формули винаходу властивості. Крім цього як носій можуть використовуватися й інші прийнятні матриці-носії, але за умови, що вони виготовлені з біосумісного матеріалу, який допускає можливість його застосування для одержання відповідного лікарського засобу. Як такий носій можна використовувати, наприклад, гідрофобні біосумісні матеріали, описані, зокрема, у WO 91/13638. Разом з тим як носій можна використовувати і матеріали, які мають переважно гідрофільні властивості. Згідно із ще одним переважним варіантом здійснення винаходу передбачене застосування кератиноцитів у сполученні з резорбованими полімерами, як які використовуються складні поліефіри, полікарбонати, поліангідриди, складні поліортоефіри, полідепсипептиди, складні ефіри простих поліефірів, поліамінокислоти або поліфосфазени, насамперед полі-L-лактид, поліD,L-лактид, співполімер L-лактиду і D,L-лактиду, полігліколід, співполімер L-лактиду і гліколіду, співполімер L-лактиду і триметиленкарбонату або полідіоксанон, а також застосування перфорованих плівок із вказаних полімерів. 1. Матеріал Середовище К/1 (див. приклад 1), ЗФР, 0,04% ЕДТК (розбавляють за допомогою ЗФР до концентрації, що дорівнює 0,02%), трипсин/ЕДТК (0,05%/0,01%), стерильні чашки Ру (Т-чашки площею 25, 80 і 175см2), матеріал Laserskin (фірма Fidia Advanced Biopolymers srl, АбаноТерме, Італія) у 144x21 чашках Петрі (площею 145см2), клітини ЗТЗ, які підгодовують, запропоновані у винаході кератиноцити, наприклад, КС-ВІ-1. 2. Культивування клітин для одержання біологічно активної пов'язки на рану 2.1. Матеріал 81398 16 Опромінені клітини, які підгодовують, наприклад вказані в прикладі 2 мишині фібробласти ЗТЗ, запропоновані у винаході кератиноцити з вихідного місця їх зберігання, шматки матеріалу Laserskin розміром 8,5(8,5см у чашці Петрі (готовий продукт), середовище К/2. 2.2. Посів клітин ЗТЗ, які підгодовують Клітини, які підгодовують, отримані відповідно до прикладу 2, наносять на матеріал Laserskin, висіваючи їх із щільністю приблизно від 15000 до 25000 клітин/см2 (відповідає приблизно 3x106 клітин/чашку Петрі). Потім клітини в чашці Петрі інкубують у термостаті при 35-37°С в атмосфері з вологістю повітря, що становить більше 90%, і із вмістом СО2, що дорівнює 5-11%, переважно 79%. Кератиноцити висівають на шар клітин, які підгодовують, або в цей же день, або найпізніше на наступний день (через 24 год). 2.3. Посів і культивування кератиноцитів З використанням запропонованих у винаході кератиноцитів виготовляють біологічно активні пов'язки на рани. Субкультивування кератиноцитів можна проводити, наприклад, за описаною нижче методикою. Культури, які субзлилися, однократно промивають 0,02%-ною ЕДТК (у кількості 8мл для культур, які знаходяться в чашці Ру площею 80см2, і 10мл для культур, що знаходяться в чашці Ру площею 175см2). Після цього клітини, що підгодовують, протягом 5-10хв інкубують при 37°С з 0,02%-ною ЕДТК (використовуючи 8мл при інкубації клітин у чашці Ру площею 80см2 і 10мл при інкубації клітин у чашці Ру площею 175см2) і потім відокремлюють шляхом обережного струшування. Кератиноцити відповідно до прикладу 1 розбавляють сумішшю трипсин/ЕДТК (0,05%/0,01%) (у кількості 2-3мл для кератиноцитів, що знаходяться в чашці Ру площею 80см2, і 5-6мл для кератиноцитів, що знаходяться в чашці Ру площею 175см2), після чого до них додають культуральне середовище (у кількості 78мл для кератиноцитів, що знаходяться в чашці Ру площею 80см2, і 14-15мл для кератиноцитів, що знаходяться в чашці Ру площею 175см2) і обережно розділяють за допомогою піпетки. На підготовлену плівку з матеріалу Laserskin із клітинами, які підгодовують, наносять запропоновані у винаході кератиноцити, висіваючи їх із щільністю приблизно від 15000 до 25000 клітин/см2 (відповідає приблизно 3х106 клітин/чашку Петрі). Після цього клітини інкубують при 35-39°С, переважно при 37°С, до ступеня їх злиття, що дорівнює 30-100%, переважно 80100%. Інкубацію проводять в атмосфері з вологістю повітря, що становить більше 90%, що переважно становить 95%, і з концентрацією СО2 5-9%. Приклад 4: Спосіб кріоконсервації запропонованої у винаході біологічно активної пов'язки на рану Після утворення на матриці-носії покриття з кератиноцитів, які виросли на ній, із ступенем їх злиття, що становить 30-100%, переважно 80100%, запропонований у винаході продукт можна 17 заморожувати в контрольованих умовах у прийнятній упаковці, наприклад у поліпропіленових пакетах, що запечатуються зварюванням. З цією метою обережно видаляють культуральне середовище і заміняють його на 20мл охолодженого до 2-6°С середовища для заморожування К/2. Після цього продукт упаковують у стерильних умовах і заморожують за наступною схемою. Спочатку продукт охолоджують, швидко знижуючи температуру протягом 2-5хв до температури в межах від -5 до -10°С, переважно від -6 до -8°С, а потім витримують при цій температурі протягом 15-30хв, переважно 23-25хв, даючи йому прийти в рівноважний стан. Після цього продукт охолоджують до температури в межах, наприклад, від -60 до -80°С, знижуючи температуру із швидкістю менше 1°С/хв, переважно із швидкістю від 0,2 до 0,6°С/хв, найбільш переважно із швидкістю 0,4°С/хв. Заморожений продукт зберігають при температурі в межах від -60 до -80°С. Середовище для заморожування К/2 Як середовище для заморожування використовують живильне середовище К/1 (див. приклад 1) з додаванням до нього 7-13мас.% гідроксіетилкрохмалю. Приклад 5: Приклад застосування покритої вирослими на ній запропонованими у винаході кератиноцитами матриці-носія для закриття ран на прикладі Ulcus cruris venosum 1. Транспортування пов'язок на рани відразу ж після їх одержання Після утворення на матеріалі Laserskin покриття з вирослих на ньому кератиноцитів зі ступенем їх злиття, що становить 30-100%, переважно 80-100%, культуру одно-, відповідно багатократно промивають певною кількістю, переважно 30мл, середовища для транспортування К/3. Біологічно активну пов'язку на рану транспортують у певній кількості, переважно в 20мл, середовища для транспортування К/3. Верхній простір чашки Петрі короткочасно продувають повітрям з 5-10%-ним вмістом СО2, закупорюють клейкою стрічкою, наприклад парафільмом, і відразу ж відправляють у клініку в транспортувальному контейнері. Середовище для транспортування К/3 Як середовище для транспортування використовують живильне середовище К/1 (див. приклад 1) без фетальної телячої сироватки (ФТС). У принципі як середовище для транспортування можна використовувати також прості фізіологічні розчини, наприклад на основі фосфату-борату, зокрема ЗФР, або ж на основі HEPES (N-2-гідроксіетилпіперазин-N¢-2етансульфонова кислота) або MES ([2-Nморфоліно]етансульфонова кислота). 2. Транспортування кріоконсервованих пов'язок на рани Кріоконсервовані пов'язки на рани звичайно можна постачати в клініки з охолодженням сухим льодом. Разом з тим для транспортування пов'язок на рани можуть використовуватися й інші засоби, за умови, що вони при транспортуванні пов'язок на рани 81398 18 забезпечують підтримання їх температури нижче 60°С. При підготовці до застосування кріоконсервовані пов'язки на рани повільно розморожують. Після цього видаляють середовище для заморожування і пов'язку одноабо багатократно промивають середовищем для транспортування К/3 (див. вище) або іншим придатним для цієї мети фізіологічним розчином, наприклад розчином Рінгера. 3. Терапевтичне застосування Після виконання описаних вище операцій пов'язку накладають на рану. При застосуванні як носія неперфорованих матеріалів пов'язку необхідно накладати на рану тією її стороною, з якої знаходяться клітини. При застосуванні перфорованих носіїв, які допускають можливість двостороннього їх покриття вирощуваними на них кератиноцитами (наприклад при застосуванні матеріалу Laserskin), запропоновану у винаході пов'язку можна накладати на рану, що заліковується, будь-якою її стороною. Залежно від терапевтичного ефекту лікування рани з використанням вказаної вище пов'язки можна повторювати багатократно. Приклад 6: Визначення генетичних характеристик кератиноцитів КС-ВІ-1 (DSMACC2514) Клітини КС-ВІ-1 субкультивували описаним вище запропонованим у винаході способом у декілька стадій пасивування (пасажів). Клітини, отримані при 4-му, 13-му і 121-му пасивуванні, потім піддавали генетичному аналізу, досліджуючи поліморфізм довжини 15-ти різних локусів (CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, Penta D, Penta Ε, ΤΗ01, ТРОХ і vWA). Аналіз проводили за відомим з рівня техніки методом. З цією метою відповідні алелі ампліфікували з використанням тест-набору для визначення батьківства (система PowerPlex®16) фірми Promega (Маннгейм, Німеччина) відповідно до інструкцій виробника. Алелі можна ідентифікувати визначенням довжини фрагментів (стандарт довжини ILS 600 є компонентом вказаного вище набору). Дані про частоти алелів у популяції вибираються з відповідних таблиць. За результатами аналізу для клітин із усіх проаналізованих стадій їх пасивування був виявлений збіг довжин у всіх алелів у всіх локусах. Тим самим отримані дані дозволяють віднести проаналізовані клітини на основі їх генетичних характеристик до клітин КС-ВІ-1. Імовірність такої відповідності проаналізованих клітин клітинам КСВІ-1, визначена на основі частот алелів, становила більше 99,999%. Визначення поліморфізму довжини ДНК 19 Література Вееіе Н., Naeyaert J.M., Goeteyn Μ., De Mil Μ., Kint Α., Repeated cultured epidermal allografts in the treatment of chronic leg ulcers of various origins, Dermatologica, 183 (1), 1991, стор. 31- 35. De Luca Μ., Albanese Ε., Cancedda R., Viacava Α., Faggioni Α., Zambruno G., Giannetti Α., Treatment of leg ulcers with cryopreserved allogeneic cultured epithelium, A multicenter study, Archives of Dermatology, 128 (5), 1992, стор. 633-638. Harle-Bachor C, Boukamp P., Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes, PNAS 93,1993, стор. 6476-6481. Falanga V. і ін., Rapid Healing of venous ulcers and lack of clinical rejection with an allogeneic cultured human skin equivalent, Archives of Dermatology, 134, 1998, стор. 293-300. Harris P.A., Di Franncesco F., Barisoni D., Leigh I.M., Navasaria, Use of hyaluronic acid and cultured autologous keratinocytes and fibroblasts in extensive burns, Lancet, 353,1999, стор. 35-36. Kswai K., Ikarashi Y. і ін., Rejection of cultured keratinocyte allografts in persensitized mice, Transplantation 56,1993, стор. 265-269. Lam P.K., Chan E.S.Y., Edward W.H. і ін., Developement and evaluation of a new composite Laserskin graft, J. of Trauma: Injury, Infection and Critical Care, 47, 1999, стор. 918-922. Lang E., Schafer B.M., Eickhoff U., Hohl H.P., Kramer M.D., Maier-Reif K., Rapid Normalization of epidermal integrin expression after allografting of human keratinocytes, Journal of Investigative Dermatology, 107,1996, стор. 423-427. Leigh I.M., Navsaria H., Purkis P.E., McKay I., Clinical practice and biological effects of keratinocyte grafting, Annals of the Academy of Medicine, 20 (4), 1991. Lindgren C, Marcusson J.A., Toftgard R., Treatment of venous leg ulcers with cryopreserved cultured allogeneic keratinocytes: a prospective open 81398 20 controlled study, British Journal of Dermatology, 139 (2), 1998, стор. 271-275. Maier K., Transplantation von in vitro Epidermis Chancen und Risiken, Quintessenz, 3,1993, стор. 289-304. Phillips T.J., Gilchrest B.A., Cultured allogenic keratinocyte grafts in the ι management of wound healing: prognostic factors, Journal of Dermatologic Surgery and Oncology, 15 (11), 1989. Reinwald J.G. і Green, Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratmizing colonies from single cells, Cell 6, 1975, стор. 331-344. Schonfeld M., Moll L, Maier K., Jung E.G., Keratinozyten aus der Zellkultur zur Therapie von Hautdefekten, Hautarzt, 44,1993, стор. 281-289. Schopp V.M, Mirancea N., Fusenig N.E., Epidermal Organization. and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human dermal Fibroblasts, J. Invest. Dermatology, 112,1999, стор. 343-353. Tanczos E., Horch R.E., Bannasch H.s Andree C, Walgenbach K.J., Voigt M., Stark G.B., Keratinozytentransplantation und Tissue Engineering, Neue Ansatze in der Behandlung chronischer Wunden, Zentralbl. Chir., 124, доповн. 1 , 1999, стор. 81-86. Teepe R.G.C., Roseeuw D.I., Hermans J., Koebrugge E.J., Altena Т., De Coninck Α., Ponec M., Jan Vermeer В., Randomized trial comparing cryopreserved cultured epidermal allografts with hydrocolloid dressings in healing chronic venous ulcers, Journal of the American Academy of Dermatology, 29/6,1993, стор. 982-988. Wagner G., Horch R., Debus M., Tanczos E., Jiao X.J., Saied S., Stark GJB., Human keratinocytes cultured subconfluent on esterified hyaluronic acid membranes for resurface full thickness nude mice wounds, European Journal of Cell Biology, 74, №47,1997, стор. 61. 21 81398 22