Біологічно активна добавка “колікоректин”

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до біологічно активних добавок, що нормалізують мікрофлору в організмі людини й інгібують розвиток патогенних мікроорганізмів. Чисельні епідеміологічні дослідження показують, що значна кількість населення має порушення якісного та/або кількісного складу мікрофлори в організмі, які узагальнено називають дисбактеріозами. Причинами дисбактеріозів є антибіотикотерапія, гормонотерапія та хіміотерапія, гіповітамінози, неповноцінне і нераціональне харчування, несприятливі соціально-економічні та екологічні умови. Для проведення активної профілактики та ефективного лікування дисбактеріозів використовують різноманітні біопрепарати, що містять біфідобактерії, лактобактерії, термофільні стрептококи тощо, а також бактерійні концентрати та більш складні композиції. Відомі біопрепарати, що нормалізують мікрофлору в організмі людини: лактобактерин, ацилакт, біфідумбактерин, біфікол, біоспорин, споробактерин тощо (Воробьев А.А. и др. Дисбактериозы - актуальная проблема медицины/ Вестник РАМН -1997. -№3. -С.3-5). Вони містять один або декілька штамів мікроорганізмів, що нормалізують мікрофлору в організмі людини й інгібують розвиток патогенних мікроорганізмів. Проте, навіть такий значний асортимент не забезпечує всі сучасні потреби профілактики та лікування дисбактеріозів. Деякі з названих біопрепаратів створені з використанням штамів, що були знайдені у віддалених від України регіонах з іншими кліматичними та екологічними умовами. Інші - є недоступними для пересічного громадянина України. За прототип вибрано найближчий за досягнутим технічним результатом відомий лікувальний бактерійний препарат "Колібактерин сухий" (див. інструкцію для медичного застосування препарату Колібактерин сухий (Colibacterinum siccum), затверджену Головним державним санітарним лікарем України 7 лютого 2001p.). Колібактерин містить штам бактерій Escherichia coli M17, а також стабілізуючі добавки. Його призначають для лікування дорослих і дітей, починаючи з 6-місячного віку, а також при затяжному і хронічному перебігу дизентерії, післядизентерійному коліті, доліковуванні реконвалесцентів після гострих кишечних інфекцій, при тривалій кишковій дисфункції невизначеної етіології, при неспецифічних і специфічних хронічних колітах і ентероколітах тощо. Спільними ознаками з винаходом, що заявляється, є наявність у складі колібактерину штаму бактерій Escherichia coli і стабілізуючих добавок. Причинами, що перешкоджають одержанню потрібного технічного результату, є помірні властивості прототипу, обумовлені властивостями штаму бактерій Escherichia coli M17, що віднайдений понад 50 років тому, недостатньо адаптований до сучасних умов навколишнього середовища, має порівняно низьку стійкість до дії фізико-хімічних факторів. В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу шляхом зміни компонентів створити біологічно активну добавку "Колікоректин" (далі коректин), що адаптована до умов регіонів України, з високою адгезивною активністю до різних відділів кишечнику і антагоністичною активністю відносно патогенних й умовно-патогенних мікроорганізмів. Поставлена задача вирішується тим, що біологічно активна добавка, яка містить штам Escherichia coli і стабілізуючі добавки, згідно з винаходом, в якості такого штаму містить штам Escherichia coli HM-2, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України з реєстраційним номером ІMB В7049, а також додатково містить штам Enterococcus faecium НМ-5, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України з реєстраційним номером ІMB В-7029, і порошок, вибраний з наступного ряду: порошок листя та стебел Silybum marianum, порошок коренів солодки, порошок яблук, порошок капусти, порошок петрушки, порошок кропу, порошок бананів, порошок ананасів, а також цукор молочний і стеарат кальцію при такому співвідношенні компонентів, % мас.: штам Escherichia coli HM-2 5,0-20,0 штам Enterococcus fаecium HM-5 2,0-12,5 порошок 38,0-69,0 цукор молочний 20,0-35,0 стеарат кальцію 1,0-2,0. Технічним результатом винаходу, що заявляється, є адаптованість властивостей колікоректину до умов України, а також забезпечення розмноження та накопичення у просвіті кишечнику непатогенних бактерій, що входять до складу колікоректину. Для виготовлення колікоректину використовували: - штам Escherichia coli HM-2, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України з реєстраційним номером ІMB В-7049; - штам Enterococcus faecium HM-5, депонований в Депозитарії Інституту мікробіологи і вірусології НАН України з реєстраційним номером ІMB В-7029; - середовища для культивування Escherichia coli HM-2 (середовища Ендо, МПА і МПБ, стерильне знежирене молоко, відновлене 10% знежирене молоко); - середовища для культивування Enterococcus faecium HM-5 (МРС, МПА і МПБ з 1% глюкози, стерильне знежирене молоко, відновлене 10% знежирене молоко); - питна вода за ГОСТ 2874; - магній сірчанокислий 7-водний за ГОСТ 4523; - натрію гідроксид за ГОСТ 4328; - натрій лимоннокислий за ГОСТ 22280; - молоко знежирене сухе за ГОСТ 10970; - порошок листя та стебел Silybum marianum; - порошок коренів солодки; - порошок яблук; - порошок капусти; - порошок петрушки; - порошок кропу; - порошок бананів; - порошок ананасів; - цукор молочний; - стеарат кальцію; - капсули желатинові тверді. Здійснення винаходу підтверджується наступними прикладами: Приклад 1 Для накопичення біомаси мікроорганізмів виготовляли середовище культивування, основою якого є відновлене знежирене молоко, білки якого гідролізовані протосубтиліном, з додаванням лактози, лимоннокислого натрію, сірчанокислого заліза та стимуляторів росту. У підготовлене поживне середовище вносили посівний матеріал. Для виготовлення посівного матеріалу (інокуляту) бактерій Escherichia coli HM-2, 5% добової культури, що була вирощена у середовищі Ендо, додавали у виготовлене середовище культивування для накопичення біомаси. Культивування здійснювали протягом 36 годин при температурі 35±1°С. Накопичену біомасу мікроорганізмів Escherichia coli НМ-2 відокремлювали від культурального середовища на центрифузі і зважували. Посівна доза Enterococcus faecium НМ-5 у ферментер становила 7%. Інокулят бактерій Enterococcus faecium НМ-5 готували на стерилізованому знежиреному молоці з посівною дозою 1% при температурі 37±1°С протягом 16 годин. Накопичену біомасу мікроорганізмів відокремлювали від культурального середовища на центрифузі, зважували і змішували з біомасою бактерій Escherichia coli HM-2 у співвідношенні 1:4. Одержану суміш мікроорганізмів суспендували у стерильному водному розчині захисного середовища, що містило 5% сухого знежиреного молока, 8% сахарози, 4,5% натрію лимоннокислого. Одержану таким чином суспензію заморожували в морозильній шафі при температурі мінус (35±5)°С і висушували в сублімаційній сушарці. Одержаний сипучий порошок змішували із стеаратом кальцію, цукром молочним і порошком листя та стебел Silybum marianum у такому співвідношенні, % мас.: ліофілізована суміш мікроорганізмів Escherichia coli HM-2 і Enterococcus faecium НМ-5 10,0 стеарат кальцію 1,0, цукор молочний 20,0 порошок листя та стебел Silybum marianum 69,0. Виготовлений порошок колікоректину мав такий склад, % мас.: штам Escherichia coli HM-2 8,0 штам Enterococcus faecium HM-5 2,0 порошок листя та стебел Silybum marianum 69,0 цукор молочний 20,0 стеарат кальцію 1,0. Далі одержаний порошок колікоректину після перевірки властивостей відправляли для спорядження желатинових капсул, на фасування, пакування, маркування та зберігання готової продукції. Одержаний колікоректин - сірувато-зелений порошок, з характерним приємним смаком і запахом. Приклади 2-9 Колікоректин готували так, як описано у прикладі 1, за винятком того, що змінювали співвідношення компонентів. Склад колікоректину наведено у прикладах 2-9 таблиці. Колікоректин мав сірувато-зелений колір, приємний специфічний запах і смак. За мікробіологічними показниками колікоректин відповідає таким вимогам: загальна кількість життєздатних мікроорганізмів становить 1×106-1×108КУО/г (відсутність патогенних мікроорганізмів в тому числі бактерій роду Сальмонела, St. aureus, B. cereus). У желатинових капсулах маса порошку колікоректину становить 0,21-0,28г. Разова доза - 1 або 2 капсули за 30 хвилин до приймання їжі протягом 3-5 тижнів. Таблиця 1 Кількісний склад біологічно активної добавки "Колікоректин" № прикладу Штам Escherichia coli HM-2 1 8,0 2 5,0 3 6,0 4 20,0 5 15,0 6 12,5 7 12,0 8 9,0 9 7,5 Вміст компонентів у колікоректині, % мас. Штам Enterococcus Порошок Цукор молочний faecium HM-5 2,0 69,0 20,0 5,0 69,0 20,0 4,0 69,0 20,0 5,0 38,0 35,0 10,0 38,0 35,0 12,5 38,0 35,0 3,0 58,5 25,0 6,0 58,5 25,0 7,5 58,5 25,0 Стеарат кальцію 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 1,5 1,5 1,5 Зразки колікоректину, виготовлені за прикладами 1, 4, 7, були взяті для визначення за стандартною методикою антагоністичної активності колікоректину у відношенні патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, а також для дослідження адгезивної активності, колікоректину на епітеліальних клітинах кишечнику пацюків. У таких же умовах для порівняння провели такі ж дослідження зразків прототипу, що були придбані в аптеці. Властивості зразків колікоректину, виготовлених за прикладами 1, 4, 7, порівнювали з відповідними властивостями прототипу (антагоністична активність, адгезивна активність). Результати дослідження наведені у таблицях 2 і 3. Дані таблиць показують, що колікоректин має більш широкий спектр антагоністичної активності відносно патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів, а також більш виражену адгезивну активність, ніж прототип. Приклади 10-16 Колікоректин готували так, як описано у прикладі 1, за винятком того, що брали різні порошки, які урізноманітнюють властивості колікоректину. У прикладах 10-16 таблиці 4 наведено властивості колікоректину, що містить різні порошки. Таблиця 2 Антагоністична активність колікоректину у відношенні патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів Тест культури S. sonnei S. flexneri S. typhi S. typhimurium Proteus vulgaris S. aureus C. albicans 1 23,5 25,7 17,6 15,2 18,4 8,9 3,9 Антагоністична активність у відношенні тест культур (у мм) Колікоректин, приклади № Прототип 4 7 24,2 24,9 23 26,1 25,9 25,5 18,4 17,8 17,5 15,6 15,0 14,5 19,8 19,1 17,6 10,3 9,6 8,2 4,7 4,1 3 Таблиця 3 Адгезивна активність, колікоректину і прототипу на епітеліальних клітинах кишечнику пацюків Епітеліальні клітини кишечнику Ентероцити Ентероцити зони пейєрових бляшок Колоноцити Показник адгезивності (М+m) Колікоректин, приклади № 1 4 7 5,7+0,8 5,9+0,7 5,8+0,8 5,9+1,4 6,4+1,1 6,1+1,3 10,6+1,3 12,1+1,3 11,2+1,2 Прототип 5,4+0,8 5,6+1,3 9,7+1,2 Таблиця 4 Властивості колікоректину з різними порошками № прикладу 10 11 12 13 14 15 16 Порошок Деякі особливості властивостей колікоректину порошок коренів солодки містить тритерпеновий сапонін гліцирризин, флавоноїди, полісахариди, вітаміни; застосовують як протизапальний, спазмолітичний, антиалергічний засіб. містить пектини, органічні кислоти, флавоноїди, вітаміни, органічні сполуки порошок яблук заліза та фосфору, дубильні речовини, катехіни; використовують при дискінезії жовчних шляхів, при спастичному коліті, при авітамінозах містить білки, цукри, органічні кислоти, мінеральні речовини, вітаміни, у тому Порошок числі так званий вітамін U, який дає добрий терапевтичний ефект при капусти виразковій хворобі шлунка та дванадцятипалої кишки, при ентеритах, колітах тощо містить флавоноїди, вітаміни, білки, збуджує апетит, поліпшує травлення, Порошок пригнічує процеси бродіння у кишечнику; сприяє виділенню молока у матерівпетрушки годувальниць містить флаваноїди, вітаміни, мінеральні речовини, проявляє багатогранний порошок кропу позитивний вплив на організм Порошок містить фолієву кислоту, мінеральні солі, вуглеводи, вітаміни А, В, С, знижує бананів апетит, викликає відчуття насичення. Порошок містить білки, вуглеводи, вітаміни, ферменти, у тому числі фермент бромелайн, що має унікальні властивості прискорювати розщеплення жирів в організмі ананасів Колікоректин має загальнозміцнюючі і адаптогенні властивості, сприяє нормалізації мікрофлори кишечнику людини шляхом пригнічення та витіснення патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів та збільшення кількості непатогенних ентерококів та кишкової палички. Колікоректин може використовуватись з високим ефектом у профілактичному та дієтичному харчуванні при: - застосуванні антибіотиків та хіміотерапевтичних препаратів; - променевій терапії; - хворобах шлункова-кишкового тракту, що пов'язані з дисбіозами кишечнику; - харчових алергозах; - кишкових інфекціях; - вторинних імунодефіцитах; - при лікуванні онкологічних захворювань. Собівартість колікоректину значно менша, ніж відомих імпортних біологічно активних добавок, бактерійних препаратів та бактерійних концентратів. Тому колікоректин може мати значний попит у пересічних громадян України.