Вакцинний штам інфекційної бурсальної хвороби курей – мв/5

Реферат: Винахід належить до ветеринарної вірусології і біотехнології. Вакцинний штам інфекційної бурсальної хвороби курей - МВ/5 - депонований в колекції Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (ДНКІБШМ) під реєстраційним номером 473. UA 99631 C2 (12) UA 99631 C2 UA 99631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ІБХ птахів (хвороба Гамборо) - висококонтагіозна хвороба, характеризується ураженням фабрицієвої сумки, нирок, внутрішньом'язовими геморагіями, діареєю (Kibenge et al., 1988). В основному ІБХ вражає В-лімфоцити фабрицієвої сумки, викликаючи її атрофію. Захворювання викликає великий економічний збиток за рахунок загибелі 20-70 % птахів при гострому перебігу, зниженні приростів і прояві вторинних інфекцій на тлі імунодепресивної дії вірусу на організм. Основним засобом боротьби проти ІБХ є своєчасна діагностика захворювання і специфічна вакцинопрофілактика. ІБХ може протікати в субклінічній і гострій формах. При субклінічній формі виражені симптоми, властиві вторинним інфекціям, що створює складнощі при постановці діагнозу. При гострій формі хвороби наявні характерні клінічні і патологоанатомічні ознаки. Проблема створення ефективних засобів вакцинопрофілактики ІБХ в Україні стала дуже гостро з появою цілого ряду осередків захворювання, починаючи з 2000 року. Застосування імпортних біопрепаратів в осередках інфекції не надало очікуваного ефекту або супроводжувалося значними економічними втратами внаслідок залишкової вірулентності штамів. Це пояснюється тим, що їх застосуванню не передувало вивчення антигенних властивостей циркулюючих ізолятів вірусу, не визначалися специфічні антитіла у птахів до і після вакцинації, а також рівень пасивного материнського імунітету у курчат. Суттю винаходу є атенуйований середній "плюс" клонований штам МВ/5 вірусу інфекційної бурсальної хвороби (ІБХ) курей, виділений на території України і призначений для виготовлення живих та інактивованих вакцинних препаратів і діагностиків. Штам МВ/5 депонований в колекції Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (ДНКІБШМ) під реєстраційним номером 473. Молекулярно-біологічний аналіз сегменту А генома штаму МВ/5 показує високий ступінь гомології 87,7-97 % з охарактеризованими високовірулентними українськими ізолятами і що має специфічний сайт рестрикції для рестриктази Bstell в гіперваріабельній ділянці гена VP2. Штам МВ/5 отриманий після виділення польового ізоляту і клонування на хоріоалантоїсній (ХАО) оболонці 9-10-добових ВПФ-ембріонів курей. Найближчим аналогом винаходу є патент Російської Федерації № 2127602 на винахід "ШТАММ "БГ" ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ И ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ". Вказаним штамом є авірулентний генетично однорідний вірусний матеріал, що культивується в 10-денних ембріонах курей і 4,55,5 біологічною активністю вірусу 10 10 ЕІД50/мл. Як стабілізатор використовують желатин або ГЛА. Для профілактики ІБХ птаха імунізують до 60-денного віку методом випоювання в дозі 3,04,0 10 10 ЕІД50/мл. Недолік даного штаму полягає в тому, що він має високу залишкову реактогенність і викликає необоротні деструктивні явища в бурсі. Штам винайденого вірусу ІБХ птахів має високу біологічну, імуногенну і унікальну антигенну активність в нативному вигляді та після інактивації і придатний для виробництва живої та інактивованої вакцин, що мають високу імуногенну активність і нешкідливість. Даний штам має безпечні властивості, що дозволяють застосовувати його як для пероральної вакцинації випоюванням, так і для трансоваріальної вакцинації введенням в курячий ембріон 14-19-денного віку in ovo. Відмінність запропонованого штаму також полягає в тому, що штам виділений на території України і має специфічний сайт рестрикції для рестриктази Bstell в гіперваріабільній ділянці гена VP2, що слугує маркером даного штаму. Крім того, накопичення штаму "МВ/5" йде в більш високих титрах. В порівнянні з прототипом істотною відмінною ознакою винаходу є використання як вірусовмісного матеріалу атенуйованого вітчизняного штаму МВ/5 вірусу ІБХ птахів, репродукованого на 9-10-добових ВПФ-ембріонах курей з титром біологічної активності 5,25-6,0 lg ЕІД50/0,2 мл, що має штам специфічного сайту рестрикції для рестриктази Bstell в гіперваріабельній ділянці гена VP2. В порівнянні з прототипом вірусвакцина на основі атенуйованого штаму МВ/5 має вищу імуногенну активність, нешкідлива і здатна подолати материнські трансоваріальні антитіла до 800 одиниць (ІФА, набори IDEXX) проти ІБХ, не викликаючи серйозних пошкоджень в лімфоїдних органах вакцинованого птаха. Технічний результат при використанні запропонованого винаходу полягає в підвищенні специфічної антигенної і імуногенної активності і нешкідливості засобів специфічної профілактики за рахунок використання унікального природньоослабленого українського ізоляту вірусу ІБХ. Вказаний технічний результат досягнутий створенням атенуйованого штаму МВ/5 вірусу ІБХ птахів. Штам МВ/5 є новим, раніше невідомим. Початковий вірус для отримання штаму МВ/5 1 UA 99631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виділений з фабрицієвих сумок хворих бройлерів птахофабрики в Донецькій області в 1993 році. Виробничий штам "БГ" отриманий шляхом поворотного пасажування через організм 10денних ВПФ-курчат з проміжним пасивуванням на ХАО 9-11-денних ВПФ-ембріонах курей і подальшим клонуванням граничних розведень вірусу на ХАО 9-10-денних ВПФ-ембріонах курей. В порівнянні з прототипом штам МВ/5 нешкідливий і має вищу біологічну, антигенну і імуногенну активність в нативному вигляді та після інактивації. Експериментально підтверджена його можливість використання для приготування живої (табл. 1) та інактивованої (табл. 2) вакцин. Морфологічні властивості. Штам МВ/5 вірусу ІБХ птахів належить до сімейства Birnaviridae, роду Avibirnavirus, серотипу І, має морфологічні ознаки, характерні для ІБХ: форма віріону ікосаєдрична, розмір віріону - 5860 нм. Капсид - Т13, оболонка відсутня. Антигенні властивості. За своїми антигенними властивостями штам МВ/5 належить до першого серотипу. Вірус нейтралізується гомологічною антисироваткою і реагує із специфічними моноклональними антитілами. Вірус не проявляє гемаглютинуючої активності. При вакцинації вірус індукує утворення специфічних антитіл, що виявляються в РДП в розведенні 1:4-1:64, в ІФА - 1:4001:10000 і більше. Фізичні властивості. Маса віріону - 55 • 103 kDа. Коефіцієнт седиментації - 460S в градієнті сахарози. Плавуча щільність 1,33-1,34 г/мл в градієнті CsCl. Стійкість до зовнішніх фізико-хімічних чинників. Штам МВ/5 стійкий до розчинників і детергентів (ефіру, хлороформу, фреону). Стійкий до висихання. Чутливий до бета-пропіолактону, азиридинів, формальдегіду, УФ-опромінення, гамма-опромінення. Хемо- і генотоксономічна характеристика. Штам МВ/5 містить дволанцюгову, двосегментну РНК (ds-RNA) з молекулярною масою 2,16 • 103 kDa. Вірус має безліпідну одношарову білкову оболонку, що містить 9 видів структурних білків (VP), п'ять основних з яких представлені нижче: VP1-90 kDa РНК-залежна РНКполімераза VP2 41 kDa і VP3 32 kDa - основні структурні білки; VP4-28 kDa-протеаза; VP5-15-17 kDa неструктурний білок. Штам МВ/5 проявляє генетичну стабільність. Основна маса мутацій зосереджена в VP2. Амінокислотні зміни в VP2 визначають антигенну варіабельність. Сегмент А нуклеїнової кислоти містить 2 частково перекриваючі відкриті рамки для читання малого VP5 і великого поліпротеїнового попередника білків VP2 і VP3. Сегмент В кодує VP1. Молекулярно-біологічні особливості і унікальність штаму. Молекулярно-біологічну характеристику штаму МВ/5 проводили шляхом секвенування ампліфікованої ділянки сегменту А геному вірусу, що охоплює гіперваріабельний регіон гену VP2. Порівняння ділянки генома сегменту А (744-1194 пар основ за нумерацією Bayliss та інші) охарактеризованих високовірулентних українських ізолятів вірусу ІБХ вказує на високий ступінь подібності визначених нуклеотидних послідовностей між ними. Ступінь гомології між дослідженими ізолятами та штамом складає 87,7 % - 97 % при великій кількості синонімічних нуклеотидних замін, які не впливають на амінокислотний склад білка VP2 та не змінюють антигенні властивості віруснейтралізуючих епітопів. Аналіз амінокислотних послідовностей варіабельної ділянки VP2 штаму МВ/5 вказує на високий ступінь подібності між штамом та іншими охарактеризованими українськими ізолятами вірусу ІБХ та європейськими референт-штамами. Характерними спільними амінокислотними залишками у білку VP2 штаму МВ/5 та іншими високовірулентними штамами та ізолятами є залишки глутаміну у 253-у, аланіну у 284-у положеннях (нумерація залишків амінокислот за Bayliss та інш.). Показано, що ці положення формують важливі додаткові петлі PDE та PFG, що входять до складу варіабельного домену Р білка VP2. Аналіз інших критичних для формування віруснейтралізуючих епітопів петель РВС та PHI (гідрофільні регіони білка VP2 212-224 а.к.з. та 314-325 а.к.з., відповідно) вказує на високу подібність між штамом МВ/5 та іншими високовірулентними ізолятами, а саме 100 % подібність між регіонами 314-325 а.к.з. та відмінності у 1-2 амінокислотних залишках між регіонами 212-224 а.к.з. При аналізі нуклеотидних послідовностей ампліфікованої ділянки геному штаму МВ/5 було виявлено характерний лише для цього вакцинного штаму сайт рестрикції BstEll (5'-G  GTNACC 2 UA 99631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3'), нехарактерний для інших класичних вірулентних штамів. Таким чином, наявність цього сайту рестрикції дозволяє використовувати його як генетичний маркер при виявленні РНК вірусу ІБХ у бурсах вакцинованих курчат. При рестрикційному аналізі отриманих після зворотно-транскрипційної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) ампліконів довжиною 552 пар основ (п.о.) рестриктазою BstEll утворюються фрагменти ДНК довжиною 257 п.о. та 295 п.о. Обробка цією ж рестриктазою ампліконів після ЗТ-ПЛР інших класичних вакцинних штамів не призводила до утворення фрагментів, що свідчить про відсутність в них сайту рестрикції для Bstell. (Рис. 1 Електрофореграма фрагментів ДНК у агарозному гелі після рестрикції отриманих ампліконів з різних штамів вірусу ІБХ рестриктазою BstEll. 1-D78; 2-GM97; 3-228Е; 4-Lukert; 5-Winterfield 2512; 6-Bursine 2; 7 - маркер молекулярної маси Fermentas, 50 bp.). Приклад 1 Була проведена в польових умовах імунізація живим атенуйованим штамом МВ/5 птахів у 14-денному та 21-денному віці. Через 7 днів після другої вакцинації, на 28 день було довільно відібрано в п'яти вакцинованих птахів фабрицієві бурси. З фрагментів бурс виділяли тотальну РНК за Хомчинським та ставили зворотню транскрипцію з рандомними гексануклеотидними праймерами за Sambrook та інш. Отриману кДНК використовували для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) із парою праймерів, що фланкує гіперваріабельну ділянку гену VP2 геному вірусу ІБХ. Було отримано після ЗТ-ПЛР амплікони довжиною 552 пар нуклеотидних основ, що свідчило про наявність РНК вірусу ІБХ в зразках бурс від імунізованих птахів. Отримані після ПЛР фрагменти ДНК підлягали обробці рестриктазами BstEll, Sad, Sspl, BspMl за інструкцією виробника. Результати рестрикційного аналізу наведено на електрофореграмі (Рис. 2). Наявність сайту рестрикції для Sad та відсутність для Sspl, BspMl вказує на належність виділеного ізоляту вірусу до групи класичних вірусів. Наявність сайту рестрикції для BstEll вказує на ідентичність виділеного ізоляту зі штамом МВ/5 (Рис. 2, №4). Приклад 2 Визначені нуклеотидні послідовності гіперваріабельної ділянки гену VP2 штаму МВ/5 транслювали у відповідні амінокислотні залишки та порівнювали з іншими відомими вакцинними штамами, а саме: D78, 228Е, Winterfield 2512, Bursine 2, Lukert, GM97, 'Tabic'. Методом Neighbor-Joining за допомогою програмного пакету Vector NTI, ver. 10.0 було побудовано філогенетичне дерево на основі отриманих амінокислотних послідовностей (Рис. 3). Топологія гілок відображує ступінь подібності штамів, що аналізувались та вказує на амінокислотні відмінності у варіабельній антигенно важливій ділянці капсидного білку різних вакцинних штамів вірусу. Таким чином, штам МВ/5 відрізняється від інших вакцинних штамів: (і) на генетичному рівні та за амінокислотними послідовностями антигенно важливої ділянки білка VP2; (іі) наявність у ділянці гену VP2 штаму сайту впізнавання для рестриктази Bstell, що дозволяє його використовувати як генетичний маркер для диференціації методом ЗТ-ПЛР з рестрикційним аналізом цього штаму від інших ізолятів та вакцинних штамів вірусу ІБХ. Гістологічні властивості штаму. При застосуванні живих вакцин на основі штаму МВ/5 спостерігається швидке (до 2 неділь) відновлення бурси (рис. 4). 70 % фолікулів з виснаженням 30 %. Набряк строми пелюсток, поодинокі крововиливи в стромі та на межі кіркового та мозкового шарів фолікулів. Вакуолізація мозкового шару окремих фолікулів. Після застосування запропонованих на ринку "гарячих" вакцин з інших штамів, бурса відновлюється тривалий час (Рис. 5). Після застосування 25-кратної дози вакцини з штаму Мв/5 у експериментальної групи курчат короткочасне виснаження тканин бурси склало в концентрації 50-90 мас. %; 3) стабілізатор - 10-50 мас. %. Приклад 1 Приготування атенуйованої живої ліофілізованої вакцини. На першому етапі готують матровий матеріал із штаму МВ/5 вірусу ІБХ птахів. Отриману вірусовмісну рідину використовують для масового зараження 9-10-добових ВПФ-ембріонів курей. Вірусовмісну суспензію в об'ємі 0,2 мл вводять в штучну пугу на хоріоалантоїсну оболонку (ХАО) та інкубують при 37-38 °C 72-120 годин. Загиблі ембріони охолоджують, відбирають ХАО, алантоїсну рідину і тушки ембріонів, та отриману сировину використовують для приготування вакцини. Вірусовмісний матеріал подрібнюють на колоїдному млині, екстрагують при 4 °C протягом ночі, і освітлюють центрифугуванням протягом 20 хв при 3000 об/хв. Вірусовмісну надосадову рідину зливають, а потім додають стабілізатор, котрий можна використовувати окремо або в комбінації: знежирене молоко, лактоза, цукроза, тригалоза, желатоза та ін.; фасують у флакони, і піддають ліофілізації. Ліофілізований матеріал закупорюють під вакуумом і досліджують на імуногенність (на 14-21-денних ВПФ-курчатах) та на нешкідливість (на 14-денних ВПФкурчатах). Отримана вакцина є сухою однорідною масою рожево-коричневого кольору у вигляді циліндричної пігулки, легко розчинної у воді. При розчиненні у воді до початкового об'єму вона перетворюється на стійку однорідну суспензію рожево-коричневого кольору. Отримана вакцина при титруванні на 9-денних ВПФ-ембріонах курей містить вірус в титрі 5,6+0,3 lg ЕІД50 у флаконі. Вакцину застосовують з профілактичною метою або в господарствах, де реєструють клінічні і патологоанатомічні ознаки прояву ІБХ. Курчат вакцинують з 10-14денного віку при мінімальному титрі материнських антитіл 500-800 (ІФА, IDEXX) одноразово в дозі 2,0-3,5 ЕІД50 методом випоювання. Імунітет у птахів наступає через 14-28 днів після щеплення і зберігається протягом всього сприйнятливого до ІБХ періоду. Приклад 2 Випробування сухої атенуйованої вакцини. Проведені випробування вакцини, що містить, мас. %: Вірусовмісний матеріал з атенуйованого штаму МВ/5 вірусу ІБХ птахів, репродукованого на 9-10-добових ВПФ-ембріонах курей з титром біологічної активності 6,0 lg ЕІД50 у флаконі - 90 %. Стабілізатор - 10 %. Визначення імуногенної активності вакцини проводили на курчатах. Для цього заздалегідь готували 10-кратні розведення вакцини і кожним розведенням імунізували по 10 курчат шляхом випоювання. Імуногенну активність ліофілізованої вакцини оцінювали за наслідками контрольного зараження курчат в досліджуваній і контрольній групах через 14 діб після введення вакцини. Результати досліджень приведені в табл. 1. Дані, що наведені в таблиці 1, свідчать про те, що розведена в 1000 разів вакцина забезпечує 100 %-ний захист курчат. Випоювання вакцини з водою є ефективним способом масової вакцинації птахів. Приклад 3 Приготування і випробування інактивованої колоїдної і емульсійної вакцин. 4 UA 99631 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Інактивовану колоїдну вакцину проти ІБХ птахів готують з штаму МВ/5 вірусу, вирощеного в ВПФ-ембріонах курей, що розвиваються. Вірус інактивують бінарним етиленіміном, сорбують на Аеросил-300, додають гліцерин і сапонін. Емульсійну інактивовану вакцину проти ІБХ птахів готують з штаму МВ/5 вірусу, вирощеного в ВПФ-ембріонах курей, що розвиваються. Вірус інактивують бінарним етиленіміном і емульгують в масляному ад'юванті, що містить біле мінеральне масло і поверхнево-активні речовини як емульгатори, що дають "зворотну" емульсію. Препарат вводили в дозі 0,5 мл внутрішньом'язово в область грудей. Зараження проводили на 21 день після вакцинації вірулентним штамом ІБХ "АБ". Результати досліджень за визначенням імуногенної активності інактивованої вакцини з штаму МВ/5 представлені в таблиці 2. Приклад 4 Нешкідливість. Для перевірки нешкідливості вакцини з штаму МВ/5 препарат вводили перорально 10 ВПФкурчатам 14-добового віку в дозі 2,5 lg ЕІД50. Контролем служили 10 інтактних ВПФ-курчат аналогічного віку. Спостереження проводили протягом 15 діб. Після закінчення досліду у курчат були виявлені бурсальні індекси (БІ) та індекси атрофії бурси (ІАБ). Отримані дані приведені в таблиці 3. Клінічних ознак ІБХ у птаха дослідних груп не виявилося. При розтині не було виявлено макроскопічних змін бурси, характерних для ІБХ. З даних таблиці виходить, що вакцина була нешкідлива і не впливала на деструкцію бурси, оскільки значення бурсальних індексів контрольних (5,1+0,25) і дослідних (4,4;М),31) курчат достовірно не відрізнялися. Індекс атрофії бурси мав значення 0,79, що підтверджувало відсутність реактогенної дії вірусу. Приклад 5 Порівняльна оцінка вірусовакцин проти ІБХ птахів. У дослідах були використані вакцини з штамів: "МВ/5" (Україна), "GM-97" (Іспанія), з штаму "D-78" (Голландія), і з штаму "БГ" (Росія). Вивчення ефективності вказаних вакцин проводили на ВПФ-курчатах 14-денного віку. Всім курчатам вводили орально по одній дозі однієї з вказаних вище вакцин. Оцінку ефективності вакцин проводили за наслідками контрольного зараження вірулентним штамом "АБ" ІБХ всіх груп курчат через 14 діб після їх вакцинації. Результати досліджень приведені в таблиці 4. Дані таблиці 4 свідчать про те, що при контрольному зараженні вакцинованих курчат 2,0 вірулентним штамом "АБ" в дозі 10 ЕІД50/мл 100 % захист забезпечували вакцини з штаму "БГ" (Росія) і МВ/5. Проте загальний стан і прирости курчат в групі вакцинованою вакциною з штаму МВ/5 показали кращі результати. Приклад 6 Випробування сухої атенуйованої вакцини. У лабораторних експериментах і в умовах птахогосподарств України проведена порівняльна оцінка імуногенності різних вітчизняних і імпортних живих вакцин проти ІБХ і показано, що вірусовакцина суха проти ІБХ з штаму МВ/5 є найбільш надійним і ефективним біопрепаратом в порівнянні з імпортними вакцинами. Таким чином, - штам МВ/5 вірусу ІБХ птахів і вакцина проти ІБХ птахів, що втілюють запропоновані винаходи, призначені для використання в сільському господарстві, а саме у ветеринарній медицині і біотехнології; - для запропонованих винаходів в тому вигляді, як вони охарактеризовані в незалежних пунктах формули винаходу, підтверджена можливість їх здійснення за допомогою описаних в заявці або відомих до дати пріоритету засобів і методів; - штам МВ/5 вірусу ІБХ птахів і вакцина на його основі, отримані відповідно до запропонованих винаходів, мають високу специфічну, імуногенну і антигенну активність, нешкідливість і реактогенність. 5 UA 99631 C2 Таблиця 1 Імуногенна активність люфілізованої вакцини (n=3) Доза вірусу lg ЕІД50 2,0 3,0 4,0 Контроль Титрогрупа на 14 день після імунізації (ІФА) 1-3 1-4 12-5