Спосіб отримання in vitro гетеродимерного білка

Формула / Реферат | Подібні патенти | МПК / Мітки | Додаткова інформація | Код посилання

Номер патенту: 113146

Опубліковано: 26.12.2016

Автори: Бремер Евалд ван ден, Вінк Том, Лабрейн Аран Франк, Беркел Патрік ван, Схююрман Яніне, ван де Вінкел Ян, Гуей Барт де, Местерс Йойсе, Нейсен Йост Й., Паррен Пауль

Є ще 106 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб отримання in vitro гетеродимерного білка, який передбачає наступні стадії: а) надання першого гомодимерного білка, який включає Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена Fc-ділянка включає першу СН3-ділянку, де зазначений перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції 409,

b) надання другого гомодимерного білка, який включає Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена Fc-ділянка включає другу СН3-ділянку, де зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, вибраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 399, 405 та 407, при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок є різними й такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СН3-ділянок,

c) інкубація зазначеного першого білка разом із зазначеним другим білком за умов відновлення, достатніх для того, щоб дати можливість цистеїнам у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідного зв'язку, і

d) отримання зазначеного гетеродимерного білка.

2. Спосіб in vitro за п. 1, який відрізняється тим, що у ньому зазначений перший гомодимерний білок і зазначений другий гомодимерний білок вибирають із групи, яка включає (і) Fc-ділянку, (іі) антитіло, (ііі) злитий білок, який включає Fc-ділянку, або (iv) Fc-ділянку, кон'юговану із проліками, пептидом, лікарським засобом або токсином.

3. Спосіб in vitro за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений перший і/або другий гомодимерний білок є повнорозмірним антитілом.

4. Спосіб in vitro за кожним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначені перший і другий гомодимерні білки - обидва - є антитілами і зв'язуються з різними епітопами.

5. Спосіб in vitro за кожним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що Fc-ділянка першого гомодимерного білка є ділянкою ізотипу, вибраного із групи, яка складається з IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4, і при цьому Fc-ділянка другого гомодимерного білка є ділянкою ізотипу, вибраного із групи, яка складається з IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4.

6. Спосіб in vitro за кожним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що Fc-ділянки обох зазначених першого й другого гомодимерних білків є ділянками ізотипу IgG1.

7. Спосіб in vitro за кожним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що одна з Fc-ділянок зазначених гомодимерних білків має ізотип IgG1 і інший ізотип IgG4.

8. Спосіб in vitro за кожним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що підвищена сила гетеродимерної взаємодії у порівнянні з кожною з гомодимерних взаємодій має місце внаслідок модифікації СН3 інших, ніж введення ковалентних зв'язків, цистеїнових залишків або заряджених залишків.

9. Спосіб in vitro за кожним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першим і другим білками в отриманому гетеродимерному білку

a) така, що обмін Fab-фрагментами не може відбуватися при 0,5 мМ GSH за умов визначення стійкості біспецифічних антитіл, отриманих обміном Fab-фрагментами, індукованими 2-МЕА; і/або

b) така, що обмін Fab-фрагментами не відбувається in vivo у мишей за умов в аналізі фармакокінетики і стійкості біспецифічних антитіл, отриманих обміном Fab-фрагментами, індукованими 2-МЕА in vivo.

10. Спосіб in vitro за кожним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першим і другим білками в отриманому гетеродимерному білку більше ніж у два рази сильніша, така, як більше ніж у три рази сильніша, наприклад, більше ніж у п'ять раз сильніша, ніж найсильніша із двох гомодимерних взаємодій, коли їх визначають при кількісному дослідженні нековалентної взаємодії CH3-CH3 у гетеродимерах IgG1.

11. Спосіб in vitro за кожним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок такі, що

a) константа дисоціації гетеродимерної взаємодії між зазначеними першим і другим білками в отриманому гетеродимерному білку становить нижче 0,05 мікромоль, коли її визначають при кількісному дослідженні нековалентної взаємодії CH3-CH3 у гетеродимерах IgG1, і/або

b) константи дисоціації обох гомодимерних взаємодій перевищують 0,01 мікромоль, такі, як вище 0,05 мікромоль, бажано, становлять від 0,01 до 10 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 10 мікромоль, краще, від 0,01 до 5, наприклад, від 0,05 до 5 мікромоль, ще краще, від 0,01 до 1 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 1 мікромоль, від 0,01 до 0,5 або від 0,01 до 0,1 мікромоль, при аналізі кількісного визначення не ковалентної взаємодії CH3-CH3.

12. Спосіб in vitro за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок містять заміни амінокислот у неідентичних позиціях.

13. Спосіб in vitro за п. 12, який відрізняється тим, що амінокислоти замінені природними амінокислотами або неприродними амінокислотами.

14. Спосіб in vitro за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначений перший гомодимерний білок має не більше однієї заміни амінокислоти в СН3-ділянці, і другий гомодимерний білок має не більше однієї заміни амінокислоти в СН3-ділянці порівняно з СН3-ділянками дикого типу.

15. Спосіб in vitro за кожним із попередніх пп. 1-14, який відрізняється тим, що

а) зазначений перший гомодимерний білок має амінокислоту в позиції 409, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, вибраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 399, 405 і 407;

b) зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 іншу амінокислоту, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має в позиції 405 іншу амінокислоту, ніж Phe;
с) зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 іншу амінокислоту, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має в позиції 405 іншу амінокислоту, ніж Phe, Arg або Gly;

d) зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 і іншу амінокислоту, ніж Lys, Leu або Met, у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає позиції 405 іншу амінокислоту, ніж Phe, і Lys у позиції 409;

є) зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 та іншу амінокислоту, ніж Lys, Leu або Met у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає в позиції 405 амінокислоту, іншу, ніж Phe, Arg або Gly, і Lys у позиції 409;

f) зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 та іншу амінокислоту, ніж Lys, Leu або Met, у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Leu у позиції 405 і Lys у позиції 409;

g) зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає в позиції 405 амінокислоту, іншу, ніж Phe, Arg або Gly, і Lys у позиції 409;

h) зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Leu у позиції 405 і Lys у позиції 409;

і) зазначений перший гомодимерний білок включає в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок включає Lys у позиції 409, Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405;

j) зазначений перший гомодимерний білок включає Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Lys у позиції 409, Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405;

k) зазначений перший гомодимерний білок включає Lys у позиції 370, Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Lys у позиції 409, Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405;

l) зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має амінокислоту, іншу, ніж Туr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr у позиції 407;

m) зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має Ala, Gly, His, Ilе, Leu, Met, Asn, Val або Trp у позиції 407;

n) зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має Gly, Leu, Met, Asn або Trp у позиції 407;

о) зазначений перший гомодимерний білок має Туr у позиції 407 і в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має в позиції 407 амінокислоту, іншу, ніж Туr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr, і Lys у позиції 409;

p) зазначений перший гомодимерний білок має Туr у позиції 407 і в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має Ala, Gly, His, Ilе, Leu, Met, Asn, Val або Trp у позиції 407 і Lys у позиції 409;

q) зазначений перший гомодимерний білок має Туr у позиції 407 і в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має Gly, Leu, Met, Asn або Trp у позиції 407 і Lys у позиції 409;

r) зазначений перший гомодимерний білок має Туr у позиції 407 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок має в позиції 407 амінокислоту, іншу, ніж Туr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr, і Lys у позиції 409;

s) зазначений перший гомодимерний білок має Туr у позиції 407 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок має Ala, Gly, His, Ile Leu, Met, Asn, Val або Trp у позиції 407 і Lys у позиції 409;

t) зазначений перший гомодимерний білок має Туr у позиції 407 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок має Gly, Leu, Met, Asn або Trp у позиції 407 і Lys у позиції 409;

u) зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і другий гомодимерний білок має

(і) амінокислоту, іншу, ніж Phe, Leu і Met у позиції 368, або

(іі) Trp у позиції 370, або

(ііі) амінокислоту, іншу, ніж Asp, Cys, Pro, Glu або Gln у позиції 399,

v) зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 Arg, Ala, His або Gly, і другий гомодимерний білок має

(і) Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val або Trp у позиції 368, або

(іі) Trp у позиції 370, або

(ііі) Ala, Gly,Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg або Туr у позиції 399,

х) зазначений перший гомодимерний білок має Arg у позиції 409, і другий гомодимерний білок має

(і) Аsр, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val або Trp у позиції 368, або

(іі) Trp у позиції 370, або

(ііі) Phe, His, Lys, Arg або Туr у позиції 399.

16. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначені перша і друга СН3-ділянки, за винятком певних мутацій, включають послідовність, представлену в SEQ ID NО: 1.

17. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що

а) ні зазначений перший, ні зазначений другий гомодимерний білок не включає послідовність Cys-Pro-Ser-Cys у шарнірній ділянці, або

b) як зазначений перший, так і зазначений другий гомодимерний білок включає послідовність Cys-Pro-Ser-Cys у шарнірній ділянці.

18. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначені перший і другий гомодимерні білки, за винятком будь-яких певних мутацій, є людськими антитілами.

19. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначені перший і другий гомодимерні білки є важколанцюговими антитілами.

20. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пп. 1-19, який відрізняється тим, що як зазначений перший, так і зазначений другий гомодимерні білки також включають легкий ланцюг; де не обов'язково зазначені легкі ланцюги є різними.

21. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначений перший і/або зазначений другий гомодимерний білок включає мутацію, яка видаляє акцепторний сайт для Asn-зв'язаного глікозилування.

22. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначені перший і другий гомодимерні білки, отримані на стадії а) і b), очищують.

23. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначений перший і/або зазначений другий гомодимерний білок кон'югований з лікарським засобом, проліками або токсином або містить акцепторну групу для них.

24. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пп. 1-23, який відрізняється тим, що

a) обидва гомодимерних білки є антитілами, і при цьому перше антитіло й друге антитіло зв'язуються з різними епітопами на одній і тій самій пухлинній клітині, або

b) обидва гомодимерних білки є антитілами, і при цьому перше антитіло зв'язується з епітопом на пухлинній клітині, і інше антитіло є нерелевантним або неактивним антитілом без будь-якої релевантної активності зв'язування in vivo для передбаченого застосування.

25. Спосіб in vitro за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що умови відновлення на стадії с) включають додавання відновника, наприклад відновника, вибраного із групи, яка складається з 2-меркаптоетиламіну, дитіотреїтолу й трис(2-карбоксіетил)фосфіну або їх хімічних похідних.

26. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що стадію с)

- виконують за умов відновлення з окисно-відновним потенціалом від -150 до -600 мВ, такому як від -250 до -400 мВ, і/або

- вона включає інкубацію протягом, щонайменше, 90 хв. за температури щонайменше 20 °С у присутності щонайменше 25 мМ 2-меркаптоетиламіну або в присутності щонайменше 0,5 мМ дитіотреїтолу.

27. Спосіб in vitro за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що стадія d) включає видалення відновника, наприклад, знесоленням.

28. Спосіб відбору біспецифічного антитіла з потрібною властивістю, який передбачає стадії

a) надання першого набору гомодимерних антитіл, які включають антитіла з різними варіабельними ділянками, при цьому зазначені антитіла із зазначеного першого набору включають ідентичні перші СН3-ділянки,

b) надання другого набору гомодимерних антитіл, які включають антитіла з різними варіабельними ділянками або ідентичними варіабельними ділянками, при цьому зазначені антитіла із зазначеного другого набору включають ідентичні другі СН3-ділянки, при цьому послідовності зазначених перших і других СН3-ділянок є різними й такими, щоб гетеродимерна взаємодія між зазначеними першими й другими СН3-ділянками була сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених перших і других СН3-ділянок,

с) інкубації комбінацій антитіл із зазначеного першого набору й зазначеного другого набору за умов відновлення, достатніх для можливості для цистеїнів у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідних зв'язків, причому в такий спосіб утворюється набір біспецифічних антитіл,

d) необов'язково, повернення до не відновлюваних умов,

е) аналізу отриманого набору біспецифічних антитіл щодо заданої потрібної властивості і

f) відбору біспецифічного антитіла з потрібною властивістю.

29. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що

a) гомодимерні антитіла із другого набору мають різні варіабельні ділянки, або

b) гомодимерні антитіла із другого набору мають ідентичні варіабельні ділянки, але мають різні амінокислотні або структурні варіації за межами антигензв'язуючої ділянки.

30. Спосіб отримання гетеродимерного білка, який передбачає наступні стадії:

а) надання першої нуклеотидної конструкції, яка кодує перший поліпептид, який включає першу Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена перша Fc-ділянка включає першу СН3-ділянку,

b) надання другої нуклеотидної конструкції, яка кодує другий поліпептид, який включає другу Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена друга Fc-ділянка включає другу СН3-ділянку, при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок є різними й такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СН3-ділянок, і при цьому зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, вибраній із групи, що включає позиції 366, 368, 370, 405 і 407, і/або при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок такі, що константи дисоціації гомодимерних взаємодій кожної з СН3-ділянок становлять від 0,01 до 10 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 10 мікромоль, краще, від 0,01 до 5, наприклад, від 0,05 до 5 мікромоль, навіть краще, від 0,01 до 1 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 1 мікромоль, від 0,01 до 0,5 або від 0,01 до 0,1 мікромоль, коли аналіз проводять так, як описано в прикладі 21,

с) коекспресія зазначених першої й другий нуклеотидних конструкцій у клітині-хазяїні та

d) отримання зазначеного гетеродимерного білка із клітинної культури.

31. Спосіб за п. 30, який відрізняється тим, що зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту, іншу, ніж Phe, у позиції 405, наприклад іншу, ніж Phe, Arg або Gly в позиції 405 або зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту, іншу, ніж Туr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr у позиції 407.

32. Спосіб за будь-яким з попередніх пп. 30-31, який відрізняється тим, що стадія с) також включає коекспресію у зазначеній клітині-хазяїні однієї або декількох нуклеотидних конструкцій, які кодують легкий ланцюг.

33. Спосіб за будь-яким з попередніх пп. 30-32, який відрізняється тим, що він також передбачає особливості за будь-яким одним або декількома пп. 2-25.

34. Експресуючий вектор, який включає нуклеотидні конструкції за кожним з пп. 30-33.

35. Клітина-хазяїн, яка включає нуклеотидні конструкції за кожним з пп. 30-33.

36 Гетеродимерний білок, який включає перший поліпептид, який включає першу Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена перша Fc-ділянка включає першу СН3-ділянку, і другий поліпептид, який включає другу Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена друга Fc-ділянка включає другу СН3-ділянку, при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок є різними й такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СН3-ділянок, і при цьому зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, вибраній із групи, що включає позиції 366, 368, 370, 405 і 407, або де зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 Arg, Ala, His або Gly, і другий гомодимерний білок має Ala, Gly, Ile Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg або Туr у позиції 399.

37. Гетеродимерний білок за п. 36, який відрізняється тим, що

зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту, іншу, ніж Phe, у позиції 405, наприклад, іншу, ніж Phe, Arg або Gly у позиції 405, або зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту, іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту, іншу, ніж Туr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr у позиції 407.

38. Гетеродимерний білок за будь-яким з попередніх пп. 36-37, який відрізняється тим, що він також включає ознаки одного або декількох пп. 2-24.

39. Гетеродимерний білок за будь-яким з пп. 36-38, який відрізняється тим, що він застосовується як лікарський засіб.

40. Гетеродимерний білок за п. 39, який відрізняється тим, що він застосовується при лікуванні раку.

41. Фармацевтична композиція, яка включає гетеродимерний білок за будь-яким з пп. 36-38 і фармацевтично прийнятний носій.

42. Спосіб інгібування росту й/або проліферації, й/або знищення пухлинних клітин, який передбачає введення індивідуумові, який цього потребує, гетеродимерного білка за будь-яким з пп. 36-38.

Текст

Реферат: Винахід стосується способу отримання in vitro гетеродимерного білка, який передбачає стадії надання першого гомодимерного білка, який включає Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена Fc-ділянка включає першу СН3-ділянку, де зазначений перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції 409, надання другого гомодимерного білка, який включає Fcділянку імуноглобуліну, причому зазначена Fc-ділянка включає другу СН3-ділянку, де UA 113146 C2 (12) UA 113146 C2 зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 399, 405 та 407, при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок є різними й такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СН3-ділянок, інкубацію зазначеного першого білка разом із зазначеним другим білком за умов відновлення, достатніх для того, щоб дати можливість цистеїнам у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідного зв'язку, і отримання зазначеного гетеродимерного білка. Також винахід стосується способу відбору біспецифічного антитіла з потрібною активністю, експресуючого вектора, гетеродимерного білка, фармацевтичної композиції, способу інгібування росту та/або проліферації пухлинних клітин. UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до нових антитіло-Fc-вмісних гетеродимерних білків, таких як біспецифічні антитіла, і нових способів отримання таких білків. Передумови створення винаходу Моноклональні антитіла в останні роки стають терапевтичними молекулами, які одержали визнання, зокрема, для лікування раку. Однак нажаль моноклональні антитіла часто не здатні лікувати захворювання, коли застосовуються як монотерапія. Біспецифічні антитіла потенційно можуть подолати деякі обмеження терапії моноклональними антитілами, наприклад, їх можна використовувати як медіатори для націлювання лікарського засобу або токсичної сполуки на клітини-мішені, як медіатори для ефекторних механізмів перенацілювання на сайти, пов'язані із захворюванням, або як медіатори для збільшення специфічності у відношенні до пухлинних клітин, наприклад, шляхом зв'язування з комбінацією молекул-мішеней, виявленою винятково на пухлинних клітинах. Різні формати й застосування біспецифічних антитіл недавно розглянуті в роботі Chames and Baty (2009), Curr. Opin. Drug Disc. Dev., 12: 276. Одною з основних перешкод для розробки біспецифічних антитіл є складність отримання матеріалу в достатній кількості й потрібної якості методами традиційних технологій, таких як методи гібридних гібридом і хімічної кон'югації (Marvin and Zhu (1005), Acta Pharmacol. Sin., 26: 649). Спільна експресія в клітині-хазяїні двох антитіл, які складаються із різних важких і легких ланцюгів, дає, крім потрібних біспецифічних антитіл, суміш можливих антитіл. Описані деякі стратегії сприяння утворенню гетеродимерного, тобто, біспецифічного, продукту після коекспресії різних конструкцій антитіл. Lindhofer et al. (1995, J. Immunol., 155: 219) повідомляють, що злиття щурячих і мишачих гібридом, які продукують різні антитіла, веде до збагачення функціональними біспецифічними антитілами внаслідок кращого видообмеженого утворення пар важкий/легкий ланцюг. Іншою стратегією промоторування утворення гетеродимерів у порівнянні з гомодимерами є стратегія "виступ в паз" ("knob-into-hole"), відповідно до якої виступаючу частину вводять на поверхню розділу першого поліпептиду важкого ланцюга й відповідної порожнини в поверхні розділу другого поліпептиду важкого ланцюга, так що виступаюча частина може розташовуватися в порожнині так, що виступає промотором утворення гетеродимера й перешкоджає утворенню гомодимера. "Виступаючі частини" конструюють шляхом заміни невеликих бічних ланцюгів амінокислот з поверхні першого поліпептиду на більші бічні ланцюги. Компенсаторні "порожнини" ідентичного або схожого розміру з виступаючими частинами створюють на поверхні розділу другого поліпептиду шляхом заміни великих бічних ланцюгів амінокислот на менші ланцюги (патент США 5731168). В ЕР1870459 (Chugal) і WO 2009089004 (Amgen) описуються інші стратегії сприяння утворенню гетеродимерів під час коекспресії різних доменів антитіл у клітині-хазяїні. У таких способах один або кілька залишків, які створюють поверхню розділу СН3-СН3 в обох СН3-доменах, заміняють зарядженими амінокислотами, так що утворення гомодимера є електростатично невигідним і електростатично вигідною є гетеродимеризація. В WO2007110205 (Merck) описується ще одна стратегія, відповідно до якої для промоторування гетеродимеризації використовують відмінності між СН3-доменами IgА і IgG. Dall'acqua et al. (1998, Biochemistry, 37: 9266) ідентифікували п'ять енергетично ключових амінокислотних залишків (366, 368, 405, 407 і 409), залучені у контактування СН3-СН3 поверхні розділу СН3-гомодимера. В WO2008119353 (Genmab) описується спосіб отримання біспецифічних антитіл in vitro, при якому біспецифічне антитіло формується обміном "Fab-фрагментів" або "напівмолекул" (обміном важкого ланцюга й приєднаного легкого ланцюга) між двома моноспецифічними IgG4 або IgG4-подібними антитілами після інкубації за умов відновлення. Така реакція обміну Fabфрагментами є результатом реакції ізомеризації дисульфідного зв'язку й дисоціації-асоціації СН3-доменів, при цьому дисульфідні зв'язки важких ланцюгів у шарнірних ділянках вихідних (початково моноспецифічних) антитіл відновлюються, і отримані вільні цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок важкого ланцюга із цистеїновими залишками молекули іншого вихідного антитіла (початково з іншою специфічністю), і одночасно СН3-домени вихідних антитіл звільняються й реформуються шляхом дисоціації-асоціації. Отриманий продукт є біспецифічним антитілом, яке має два Fab-фрагмента, які потенційно містять різні послідовності. Слід зазначити, що процес випадковий, однак і обмін Fab-фрагментами також може відбуватися між двома молекулами з ідентичною послідовністю, або дві біспецифічні молекули можуть брати участь в обміні Fab-фрагментів з регенерацією антитіл, які включають початкову специфічність моноспецифічних вихідних антитіл. 1 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Несподівано виявилося, що шляхом уведення асиметричних мутацій у СН3-ділянки двох моноспецифічних вихідних білків реакцію обміну Fab-фрагментами можна змусити стати керованою й відповідно до цього одержати високостійкі гетеродимерні білки. Сутність винаходу Відповідно до одного аспекту даний винахід відноситься до ефективного in vitro способу отримання високостійких гетеродимерних Fc-вмісних білків на основі стійких гомодимерних Fcвмісних вихідних матеріалів. Наприклад, високостійкі біспецифічні антитіла можна одержати з високим виходом і чистотою на основі двох стійких моноспецифічних антитіл як вихідного матеріалу. Таким чином, в одному аспекті винахід відноситься до способу отримання in vitro гетеродимерного білка, причому зазначений спосіб передбачає наступні стадії: а) надання першого гомодимерного білка, який включає Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена Fc-ділянка включає першу СН3-ділянку, b) надання другого гомодимерного білка, який включає Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена Fc-ділянка включає другу СН3-ділянку, при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок є різними й такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СН3-ділянок, с) інкубація зазначеного першого білка разом із зазначеним другим білком за умов відновлення, достатніх для того, щоб дати можливість цистеїнам у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідного зв'язку, і d) отримання зазначеного гетеродимерного білка. Спосіб можна використовувати, наприклад, для отримання in vitro гетеродимерних білків, таких як біспецифічні антитіла, для різних застосувань, таких як терапевтичні й діагностичні застосування. Перевагою такого способу in vitro є те, що утворення пар важкий ланцюг/легкий ланцюг під час реакції залишається інтактним, так що в продукті не утворюється небажаних комбінацій важкого ланцюга й легких ланцюгів. Це контрастує з деякими способами коекспресії, описаними на відомому рівні техніки (див. вище), де необхідно знайти спільний легкий ланцюг, який може утворювати функціональне антитіло разом з обома важкими ланцюгами для того, щоб уникнути утворення нефункціональних продуктів важкий ланцюг/легкий ланцюг внаслідок довільного утворення у клітині пар важкий ланцюг/легкий ланцюг. Крім того, спосіб in vitro можна виконувати в лабораторії, де можливо більш тонке регулювання, твердість і вихід гетеродимерного білка, ніж це допускається коекспресією. Спосіб in vitro запропонований винаходом також можна використовувати для створення бібліотек сполук більшого розміру, наприклад, у способі скринінгу для ідентифікації бажаних комбінацій специфічностей. Наприклад, для деяких комбінацій мішеней антитіл не всяке біспецифічне антитіло буде функціональним, тобто, здатним зв'язуватися з обома мішенями у той же саме час і опосередковувати потрібні функціональні дії. У таких випадках біспецифічне антитіло, яке має потрібну властивість, наприклад, оптимальне зв'язування мішені або знищення клітини, може бути ідентифіковане шляхом а) надання першого набору гомодимерних антитіл, які мають різні варіабельні ділянки, при цьому зазначені антитіла зазначеного першого набору включають першу СН3-ділянку, b) надання другого набору гомодимерних антитіл, які мають різні варіабельні ділянки, при цьому зазначені антитіла зазначеного другого набору включають другу СН3-ділянку, при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок є різними й такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СН3-ділянок, с) інкубації антитіл зазначеного першого набору й зазначеного другого набору за умов відновлення, достатніх для того, щоб дати можливість цистеїнам у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідного зв'язку, причому в такий спосіб одержують набір біспецифічних антитіл, d) необов'язково, поверненням до невідновлюваних умов е) аналізу отриманого набору біспецифічних антитіл щодо заданої потрібної властивості і f) відбору біспецифічних антитіл з потрібною властивістю. В інших аспектах даний винахід відноситься до гетеродимерних білків, отриманих або які можна одержати способом запропонованим винаходом, і до способів отримання гетеродимерних білків запропонованих винаходом шляхом коекспресії в придатній клітиніхазяїні. Короткий опис креслень Фігура 1. Отримання біспецифічних антитіл шляхом міжвидового обміну Fab-фрагментами. 2 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Утворення біспецифічних антитіл після індукованого GSН обміну Fab-фрагментами in vitro між зазначеними антитілами IgG4 специфічним до EGFR (2F8) і CD20 (7D8) визначають ELISA. В ELISA аналізують ряд концентрацій (усіх антитіл) 0-1 мкг/мл. Біспецифічне зв'язування є вищим після обміну Fab-фрагментами між антитілами IgG4 макаки-резуса (Rh) і людини (Hu), ніж між двома антитілами того самого виду. Фігура 2. Вирівнювання корових амінокислотних послідовностей шарніра (тобто, послідовності СРРС в IgG1 людини, яка включає два цистеїнових залишки, які потенційно утворюють дисульфідні зв'язки між важкими ланцюгами й відповідними залишками в інших ізотипах людини або іншого виду) і поверхні розділу СН3-СН3 ізотипів антитіл людини й макакирезуса. Фігура 3. Отримання біспецифічних антитіл з використанням мутантного людського IgG1, узятого для обміну Fab-фрагментами. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого GSН обміну Fab-фрагментами in vitro між людським антитілом IgG4, специфічним до CD20 (7D8), і людськими антитілами IgG1, специфічними до EGFR (2F8), визначають ELISA. Представлений графік показує середні числа трьох незалежних експериментів із обміну Fab-фрагментами, при якому для ELISA використовують загальну концентрацію антитіл 1 мкг/мл. Біспецифічне зв'язування є вищим після обміну Fab-фрагментами між IgG1-2F8-CPSC-ITL і IgG4-7D8, ніж між двома антитілами IgG4. Комбінування IgG4-7D8 або з IgG1-2F8-CPSC або з IgG1-2F8-ITL не призводить до біспецифічних антитіл за використаних умов. Фігура 4. Отримання біспецифічних антитіл шляхом обміну Fab-фрагментами між людськими антитілами IgG4 і мутантним IgG1 in vivo. Утворення біспецифічних антитіл після обміну Fab-фрагментами in vivo в імунодефіцитних мишей між зазначеними людськими антитілами IgG4 до CD20 (7D8) і IgG1 до EGFR (2F8) і мутантним IgG4 визначають ELISA. Представлений графік показує середні числа (n=4). Біспецифічна реакційна здатність представлена як концентрація біспецифічних антитіл у відношенні до загальної концентрації IgG (у відсотках). Людський IgG4 зі стабілізованою шарнірною ділянкою (СРРС) або мутацією R409K у СН3-домені не здатний брати участі в обміні Fab-фрагментами. IgG1 з послідовністю CPSC у шарнірі й з мутацією в СН3-домені бере участь в обміні Fab-фрагментами. (*) Біспецифічне зв'язування для сумішей, які містять IgG1-2F8 або IgG4-2F 8-СРРС або IgG4-2F8-R409K нижче межі детекції й, отже, довільно приймається за нуль. Фігура 5. Утворення біспецифічних антитіл з використанням індукованого 2меркаптоетиламін•HСl (2-МЕА) обміну Fab-фрагментами між людськими антитілами IgG1 і IgG4. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fab-фрагментами in vitro між зазначеними антитілами людини до EGFR (2F8) і до CD20 (7D8) визначають ELISA. Випробовують ряд концентрацій 2-МЕА 0-40 мм. Представлений графік показує результати ELISA, при якому використовують загальну концентрацію антитіл 20 мкг/мл. 2-МЕА ефективно викликає обмін Fab-фрагментами також між антитілами, які містять стабілізовану шарнірну ділянку (СРPС). Що стосується СН3-доменів, то комбінація людський IgG4 × людський IgG1 з потрійною мутацією Т350I-K307T-F405L призводить до більш високих рівнів біспецифічності реакційної здатності у порівнянні із двома антитілами IgG4 дикого типу. Фігура 6. Утворення біспецифічних антитіл з використанням індукованого 2-МЕА обміну Fabфрагментами між людськими антитілами IgG1 і IgG4. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fab-фрагментами in vitro між зазначеними людськими антитілами до EGFR (2F8) і до CD20 (7D8) визначають мас-спектрометрією для всіх зразків, отриманих з рядом концентрацій 2-МЕА в діапазоні 0-40 мМ. (А) Приводяться характерні приклади масспектрометричних профілів для зразків реакцій обміну Fab-фрагментами між IgG1-2F8-ITL і IgG4-7D 8-СРPС із 0 мм, 7 мм і 40 мм 2-МЕА. (В) Після кількісної обробки даних масспектрометрії обчислюють відсоток біспецифічних антитіл і будують графік залежно від концентрації 2-МЕА при реакції обміну Fab-фрагментами. IgG1-2F8-ITL × IgG4-7D 8-СРPС призводить до ~95 % біспецифічних антитіл. Фігура 7. Аналіз стійкості гетеродимерних біспецифічних антитіл, отриманих обміном Fabфрагментами, індукованим 2-МЕА. Стійкість біспецифічних зразків, отриманих індукованим 2МЕА обміном Fab-фрагментами шляхом комбінації або IgG1-2F8-ITL × IgG4-7D 8-СРPС (А) або IgG4-2F8 × IgG4-7D8 (В), випробовують шляхом вимірювання біспецифічного зв'язування EGFR/CD20 в ELISA після реакції обміну Fab-фрагментами, викликаного GSH, у присутності нерелевантного IgG4 у зазначених концентраціях. Біспецифічне зв'язування приводиться відносно біспецифічного зв'язування вихідного матеріалу (контроль), яке приймають за 100 %. (А) Біспецифічне зв'язування індукованого 2-МЕА біспецифічного продукту, утвореного IgG12F8-ITL і IgG4-7D 8-СРPС, зберігається, що вказує на те, що продукт є стійким, і не бере участь в обміні Fab-фрагментами в присутності GSH. (В) Біспецифічне зв'язування EGFR/CD20 3 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 індукованого 2-МЕА біспецифічного продукту, утвореного IgG1-2F8 і IgG4-7D8, зменшується, указуючи, що продукт бере участь в обміні Fab-фрагментами з нерелевантним IgG4 у присутності GSH. Фігура 8. Швидкість плазмового кліренсу гетеродимерних біспецифічних антитіл, отриманих обміном Fab-фрагментами, індукованим 2-МЕА. Трьом групам мишей (3 миші на групу) ін'єктують наступні антитіла: (1) 100 мкг біспецифічних антитіл, отриманих in vitro індукованим 2МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-2F8-ITL і IgG4-7D 8-СРPС; (2) 100 мкг біспецифічних антитіл + 1000 мкг нерелевантного IgG4; (3) 50 мкг IgG1-2F8-ITL+50 мкг IgG4-7D 8-СРPС. (А) Загальна концентрація антитіл із часом, визначається ELISA. Криві загальної концентрації антитіл у плазмі однакові для всіх антитіл. (В) Концентрація біспецифічних антитіл, визначається ELISA. Біспецифічність ін'єктованих антитіл є однаковою при додаванні й без додавання надлишку нерелевантного IgG4. (*) Біспецифічне зв'язування для суміші IgG1-2F8ITL+IgG4-7D 8-СРPС є нижчим від межі детекції, і тому відповідні символи не можна представити на зазначеному графіку. Приводяться середні значення ELISA для двох експериментів. Фігура 9. Чистота біспецифічних антитіл, отриманих обміном Fab-фрагментами між людськими IgG1-2F8 і IgG4-7D 8-СРPС. (А)Відновлюючий SDS-PAGE (а) видно смуги, які відповідають важким і легким ланцюгам як для біспецифічного зразка, так і для контрольного зразка IgG1. Невідновлюючий SDS-PAGE (b) (В) Пік, отриманий в аналізі НР-SEC, показує, що біспецифічний зразок на >98 % є гомогенним, і агрегати антитіл практично не виявляються. (С) Мас-спектрометрія показує, що обмін Fab-фрагментами призводить майже до 100 % біспецифічного продукту. Фігура 10. Порівняння між потрійним мутантом (ITL), подвійними мутантами (IT, IL, TL) і одинарним мутантом (L) людського IgG1-2F8 при утворенні біспецифічних антитіл шляхом обміну Fab-фрагментами з людським IgG4-7D8. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fab-фрагментами in vitro між потрійним і подвійними мутантами людського IgG-2F8 і IgG4-7D8 дикого типу із шарніром СРSP (А) або мутантом IgG4-7D 8-СРPС зі стабілізованим шарніром (В) або одинарного мутанта IgG1-2F8-F405L і IgG4-7D8 з CPSC дикого типу або стабілізованим шарніром СРPС (С) визначають ELISA. В ELISA аналізують ряд концентрацій (усіх антитіл) 0-20 мкг/мл або 0-10 мкг/мл для експериментів, що включають подвійні й одинарні мутанти, відповідно. Комбінації з подвійними мутантами IgG1-2F8-IL і –TL призводять до біспецифічного зв'язування EGFR/CD20, подібного до потрійного мутанта IgG1ITL. Комбінації з IgG1-2F 8-IТ не призводять до біспецифічного продукту. Комбінації з одинарним мутантом IgG1-2F8-F405L призводятьдо біспецифічного зв'язування EGFR/CD20. Фігура 11. Отримання біспецифічних антитіл з використанням індукованого 2-МЕА обміну Fab-фрагментами за різних температур. Утворення біспецифічних антитіл комбінуванням зазначених людських антитіл до EGFR (2F8) і до CD20 (7D8) у реакціях індукованого 2-МЕА обміну Fab-фрагментами in vitro при 0ºС, 20ºС і 37ºС супроводжується ELISA. Біспецифічне зв'язування є найбільш ефективним при 37ºС і найменш при 20ºС. При 0ºс біспецифічне зв'язування не спостерігається. Фігура 12. Отримання біспецифічних антитіл in vitro обміном Fab-фрагментами, індукованим різними відновниками. Використовують ELISA для вимірювання утворення біспецифічних антитіл шляхом комбінування людських IgG1-2F 8-IТL і IgG4-7D 8-СРРС у реакції відновлення з рядом концентрацій зазначених відновників. Біспецифічне зв'язування вимірюють після реакцій з DTT (максимум одержують при 2,5 мм DTT) і 2-МЕА (максимум одержують при 25 мм 2-МЕА), але не з GSH. (*) Дані для концентрації GSH >10 мм виключають внаслідок утворення агрегатів антитіл. Фігура 13. Індукований 2-МЕА обмін Fab-фрагментами між мутантами IgG1-2F 8-IТL і IgG17D 8- ДО409Х. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fabфрагментами in vitro між мутантами IgG1-2F 8-IТL і зазначеними мутантами IgG1-7D 8- ДО409Х визначають ELISA. (А) Аналізують ряд концентрацій (усіх антитіл) 0-20 мкг/мл. Позитивним контролем є очищена партія біспецифічних антитіл, отриманих з IgG1-2F 8-IТL і IgG4-7D 8СРРС. (В) Обмін оцінювали як біспецифічне зв'язування зразка в концентрації 20 мкг/мл відносно позитивного контролю (чорний стовпчик). Темно-сірі стовпчики представляють біспецифічне зв'язування між контролем IgG4 (IgG4-7D8 × IgG4-2F8), негативним контролем (IgG1-2F8 × IgG1-7D8-K409R) і між IgG1-2F 8-IТL і IgG4-7D 8-СРРС. Світло-сірі стовпчики представляють результати одночасно виконаних реакцій обміну Fab-фрагментами між зазначеними мутантами IgG1-7D 8- ДО409Х і IgG1-2F 8-IТL. Фігура 14. Деглікозилювання антитіл не впливає на утворення біспецифічних антитіл шляхом обміну Fab-фрагментами, індукованого 2-МЕА. Утворення біспецифічних антитіл після 4 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 індукованого 2-МЕА обміну Fab-фрагментами in vitro між зазначеними антитілами до EGFR (2F8) і до CD20 (7D8) визначають ELISA. Обмін з антитілами 7D8 порівнюють із їх ферментативно деглікозильованими варіантами. В ELISA аналізують ряд концентрацій (усіх антитіл) 0-20 мкг/мл. Реакції обміну Fab-фрагментами за участю деглікозильованих (деглік.) антитіл показані кривими біспецифічного зв'язування, які ідентичні до кривих вихідних глікозильованих варіантів. Фігура 15. Можливість участі в обміні Fab-фрагментами корелює із силою взаємодії СН3СН3. (А), (В) і (С). Утворення біспецифічних антитіл індукованим GSH обміном Fabфрагментами між конструкціями IgG1-2F8 і IgG1-7D8 (А) або IgG4-2F8 і IgG4-7D8 (У і С) із зазначеними мутаціями представляють як біспецифічне зв'язування в ELISA залежно від часу. Біспецифічність представляють відносно контролю IgG4-2F8 × IgG4-7D8 через 24 години. (D) і (Е). Співвідношення між вгадуваною KD (таблиця 2) і утворенням біспецифічних антитіл через 24 години (Фігури 15А/В/С) для молекул не основі IgG1 (D) і молекул не основі IgG4 (Е). Фігура 16. Вирівнювання послідовностей 2F8 антитіла анти-EGFR в IgG1, IgG4 і (неповного) скелету IgG3. Нумерація амінокислот наведена відповідно до Кабат і відповідно до EU-індексу (обидві нумерації описані в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Фігура 17. Утворення біспецифічних антитіл шляхом обміну Fab-фрагментами in vitro, індукованого різними відновниками. Використовують ELISA для вимірювання утворення біспецифічних антитіл шляхом комбінування людських IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R у реакції відновлення з рядом концентрацій зазначених відновників. Визначені величини OD нормалізують до сигналу біспецифічного контрольного зразка, отриманого індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-2F8-ITL і IgG4-7D 8-СРРС, який приймають за 100 %. Максимальне біспецифічне зв'язування вимірюють після реакцій з DTT в інтервалі концентрацій 0,5-50 мм, 2-МЕА в інтервалі концентрацій 25-50 мм і трис(2-карбоксиетил)фосфіном (ТСЕР) в інтервалі концентрацій 0,5-50 мм, але не з GSH. (*) Дані для концентрації GSH ≥25 мм виключають із-за утворення агрегатів антитіл. Фігура 18. Утворення біспецифічних антитіл шляхом індукованого 2-МЕА обміну Fabфрагментами між людськими IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R. (А) Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fab-фрагментами in vitro визначають ELISA. Представлений графік показує результати ELISA, у якому використовують загальну концентрацію антитіл 20 мкг/мл. 2-МЕА ефективно індукує обмін Fab-фрагментами in vitro. (В) Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fab-фрагментами in vitro визначають мас-спектрометрією для всіх зразків ряду концентрацій 2-МЕА 0-40 мМ. Після кількісної обробки даних мас-спектрометрії обчислюють відсоток біспецифічних антитіл і будують графік залежно від концентрації 2-МЕА в реакції обміну Fab-фрагментами. IgG1-2F8F405L × IgG1-7D8-K409R призводить до ~100 % біспецифічних антитіл, що підтверджує дані ELISA. Фігура 19. Чистота біспецифічних антитіл, отриманих обміном Fab-фрагментами між людськими IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R. Мас-спектрометрія показує, що обмін Fabфрагментами призводить до приблизно 100 % біспецифічного продукту. Фігура 20. Виведення із плазми біспецифічних антитіл, отриманих обміном Fabфрагментами, індукованим 2-МЕА. Трьом групам мишей (3 миші на групу) ін'єктують наступні антитіла: (1) 100 мкг біспецифічних антитіл, отриманих in vitro індукованим 2-МЕА обміном Fabфрагментами між IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R; (2) 100 мкг біспецифічних антитіл + 1000 мкг нерелевантного IgG4. (А) Загальна концентрація антитіл залежно від часу, визначається ELISA. Криві загальної концентрації антитіл у плазмі однакові для всіх антитіл. (В) Концентрація біспецифічних антитіл, визначається ELISA. Біспецифічність ін'єктованих антитіл однакова при додаванні й без додавання надлишку нерелевантного IgG4. Фігура 21. Опосередковане CDC знищення CD-20-експресуючих клітин біспецифічними антитілами, отриманими індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R. Використовують ряд концентрацій зазначених антитіл для випробування їх на здатність опосередковувати CDC на клітинах Дауди (A) і Раджі (B). Обидві клітинні лінії експресують CD-20, а не EGFR. Уведення K409R в IgG4-7D8 не впливає на його здатність індукувати CDC. Біспецифічні антитіла, отримані від індукованого 2-МЕА обміну Fabфрагментами між IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R, ще здатні індукувати CDC. Фігура 22. Опосередковане АDCC знищення EGFR-експресуючих клітин біспецифічними антитілами, отриманих індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R. Використовують ряд концентрацій зазначених антитіл для випробування їх на здатність опосередковувати АDCC на клітинах А431. IgG1-7D8 не може зв'язувати CD-20 5 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 негативні клітини А431 і отже не індукує АDCC. АDCC індукується EGFR-антитілами IgG1-2F8 також після введення мутації F405L у СН3-домен. Ефекторна функція АDCC IgG1-2F8-F405L зберігається в біспецифічному форматі, отриманому обміном Fab-фрагментами між IgG1-2F8F405L і IgG1-7D8-K409R. Фігура 23. Індукований 2-МЕА обмін Fab-фрагментами між мутантами IgG1-2F8-F405Х і IgG1-7D8-K409R. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fabфрагментами in vitro між зазначеними мутантами IgG1-2F8-F405Х і IgG1-7D8-K409R визначають ELISA. (А) В ELISA аналізують ряд концентрацій (усіх антитіл) 0-20 мкг/мл. Позитивним контролем є очищена партія біспецифічних антитіл, отриманих з IgG1-2F8-F405L × IgG4-7D8K409R. (В) Обмін представлений як біспецифічне зв'язування при концентрації антитіл 20 мкг/мл у відношенні до позитивного контролю (чорний стовпчик). Темно-сірі стовпчики представляють біспецифічне зв'язування між контролем IgG4 (IgG4-7D8 × IgG4-2F8) і негативним контролем (IgG1-2F8 × IgG1-7D8-K409R). Світло-сірі стовпчики представляють результати одночасно виконаних реакцій обміну Fab-фрагментами між зазначеними мутантами IgG1-2F8-F405Х і IgG1-7D8-K409R або контролями. Фігура 24. Індукований 2-МЕА обмін Fab-фрагментами між мутантами IgG1-2F8-Y407Х і IgG1-7D8-K409R. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fabфрагментами in vitro між зазначеними мутантами IgG1-2F8-Y407Х і IgG1-7D8-K409R визначають ELISA. (А) В ELISA аналізують ряд концентрацій (усіх антитіл) 0-20 мкг/мл. Позитивним контролем є очищена партія біспецифічних антитіл, отриманих з IgG1-2F8-F405L × IgG4-7D8K409R. (В) Обмін представлений як біспецифічне зв'язування при концентрації антитіл 20 мкг/мл щодо позитивного контролю (чорний стовпчик). Темно-сірі стовпчики представляють біспецифічне зв'язування між контролем IgG4 (IgG4-7D8 × IgG4-2F8) і негативним контролем (IgG1-2F8 × IgG1-7D8-K409R). Світло-сірі стовпчики представляють результати одночасно виконаних реакцій обміну Fab-фрагментами між зазначеними мутантами IgG1-2F8-Y407Х і IgG17D8-K409R або контролями. Фігура 25. Аналіз утворених індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами біспецифічних антитіл методом SDS-PAGE за умов не-відновлення (Фігура 25(А)) і відновлення (Фігура 25(В)). Фігура 26. Профілі НР-SEC гомодимерного вихідного матеріалу IgG1-2F8-F405L (Фігура 26(В)), гомодимерного вихідного матеріалу IgG1-7D8-K409R (Фігура 26(А)), суміші (1:1) двох гомодимерів (Фігура 26(С)) і біспецифічного продукту, утвореного індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R (Фігура 26(D)). Фігура 27. Мас-спектрометрія (ESI-MC) гомодимерного вихідного матеріалу IgG1-2F8-F405L (Фігура 27(В)), гомодимерного вихідного матеріалу IgG1-7D8-K409R (Фігура 27(А)), суміші (1:1) двох гомодимерів (Фігура 27(С)) і біспецифічного продукту, утвореного індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R (Фігура 27(D)). Фігура 28. Профілі капілярного ізоелектрофокусування (cIEF) гомодимерного вихідного матеріалу IgG1-2F8-F405L (Фігура 28(А)), гомодимерного вихідного матеріалу IgG1-7D8-K409R (Фігура 28(В)), суміші (1:1) двох гомодимерів (Фігура 28(С)) і біспецифічного продукту, отриманого індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8K409R (Фігура 28(D)). Фігура 29. Профілі ВЕРХ-CIEX гомодимерного вихідного матеріалу IgG1-2F8-F405L (Фігура 29(А)), гомодимерного вихідного матеріалу IgG1-7D8-K409R (Фігура 29(В)), суміші (1:1) двох гомодимерів (Фігура 29(С)) і біспецифічного продукту, отриманого індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R (Фігура 29(D)). Фігура 30. Мас-спектрометричний аналіз із іонізацією електронним розпиленням IgG, отриманого котрансфекцією експресуючих векторів, які кодують важкий і легкий ланцюг IgG17D8-K409R або IgG1-2F8-F405L. Піки гетеродимерів показані *. Піки гомодимерів показані †. Фігура 31. Реакція обміну гомодимерів IgG1-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R згідно із контролем методом катіонообмінної високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ-CIEX) після ін'єкції з різними інтервалами. Фігура 32. Залишкові гомодимери реакції обміну, детектовані методом CIEX, показані стрілками. Фігура 33. Утворення біспецифічних антитіл за різних концентрацій IgG, концентрацій 2МЕА, температур інкубації й часу при визначенні ELISA. Фігура 34. Утворення біспецифічних антитіл за різних концентрацій IgG, концентрацій 2МЕА, температур інкубації й часу при визначенні ELISA і в порівнянні з контролем, який довільно приймають за 100 %. Фігура 35. Утворення біспецифічних антитіл за різних концентрацій IgG, концентрацій 2МЕА, температур інкубації й часу при аналізі методом ВЕРХ-CIEX. 6 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 36. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fabфрагментами in vitro між зазначеними мутантами IgG1-2F8-L368X і IgG1-7D8-K409R визначають ELISA з використанням ряду концентрацій (усіх антитіл) 0-20 мкг/мл (Фігура 36(А)). Позитивним контролем є партія очищених біспецифічних антитіл, отриманих з IgG1-2F8-F405L × IgG1-7D8K409R. На Фіг. 36(В) показане біспецифічне зв'язування при 20 мкг/мл відносно позитивного контролю (чорний стовпчик). Темно-сірі стовпчики представляють біспецифічне зв'язування між контролем IgG4 (IgG4-7D8 × IgG4-2F8) і негативним контролем (IgG1-2F8 × IgG1-7D8-K409R). Світло-сірі стовпчики представляють результати одночасно виконаних реакцій обміну Fabфрагментами між зазначеними мутантами IgG1-2F8-L368X і IgG1-7D8-K409R. Фігура 37. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fabфрагментами in vitro між зазначеними мутантами IgG1-2F 8- ДО370X і IgG1-7D8-K409R визначають ELISA з використанням ряду концентрацій (усіх антитіл) 0-20 мкг/мл (Фігура 37(А)). Позитивним контролем є партія очищених біспецифічних антитіл, отриманих з IgG1-2F8-F405L × IgG1-7D8-K409R. На Фіг. 37(В) показане біспецифічне зв'язування при 20 мкг/мл відносно позитивного контролю (чорний стовпчик). Темно-сірі стовпчики представляють біспецифічне зв'язування між контролем IgG4 (IgG4-7D8 × IgG4-2F8) і негативним контролем (IgG1-2F8 × IgG1-7D8-K409R). Світло-сірі стовпчики представляють результати одночасно виконаних реакцій обміну Fab-фрагментами між зазначеними мутантами IgG1-2F8-D370X і IgG1-7D8K409R. Фігура 38. Утворення біспецифічних антитіл після індукованого 2-МЕА обміну Fabфрагментами in vitro між зазначеними мутантами IgG1-2F8-D399X і IgG1-7D8-K409R визначають ELISA з використанням ряду концентрацій (усіх антитіл) 0-20 мкг/мл (Фігура 38(А)). На Фіг. 38(В) показане біспецифічне зв'язування при 20 мкг/мл відносно позитивного контролю (чорний стовпчик). Темно-сірі стовпчики представляють біспецифічне зв'язування між контролем IgG4 (IgG4-7D8 × IgG4-2F8) і негативним контролем (IgG1-2F8 × IgG1-7D8-K409R). Світло-сірі стовпчики представляють результати одночасно виконаних реакцій обміну Fab-фрагментами між зазначеними мутантами IgG1-2F8-D399X і IgG1-7D8-K409R. Фігура 39. Індукований 2-МЕА обмін Fab-фрагментами in vitro між чотирма різними комбінаціями мутантів IgG1 при 15 °C після інкубації протягом 0, 30, 60, 105 і 200 хв. при визначенні сендвіч-ELISA. Фігура 40. Індукований 2-МЕА обмін Fab-фрагментами in vitro між чотирма різними комбінаціями мутантів IgG1 після інкубації при 15 °C протягом 90 хв. при визначенні сендвічELISA. Фігура 41. Фосфорилювання с-Met с-Met-специфічними антитілами. Клітини А549 інкубують протягом 15 хв. із HGF або набором різних антитіл. Білки розділяють електрофорезом у поліакриламідному гелі в присутності SDS і переносять на мембрани вестерн-блотингом. Фосфорильовану с-Met, загальну с-Met і β-актин детектують антитілами проти фосфорильованої с-Met, загальної с-Met або β-актину. Фігура 42. Аналіз проліферації із клітинами NCI-H441. Клітини NCI-H441 інкубують протягом семи діб з моновалентним біспецифічним IgG1 069/b12, контрольні антитіла (IgG1-069, UniВody069, IgG1-b12) залишають необробленими. Визначають масу клітин, і будують графік як відсоток від маси необроблених зразків (прийнятої за 100 %). Фігура 43. Опосередковане CDC знищення CD-20-експресуючих клітин біспецифічними антитілами, отриманими індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-7D8-F405L або IgG1-2F8-405L і IgG1-7D8-K409R. Використовують ряд концентрацій зазначених антитіл для випробування їх на здатність опосередковувати CDC на клітинах Дауді (A) і Раджі (B). Обидві клітинні лінії експресують CD-20, а не EGFR. Біспецифічні антитіла, отримані індукованим 2МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG1-7D8-F405L і IgG1-7D8-K409R, ефективні при індукції опосередкованого CDC лізису клітин як IgG1-7D8. Біспецифічні антитіла, отримані індукованим 2-МЕА обміном Fab-фрагментами між IgG2-2F8-F405L і IgG1-7D8-K409R, призводять до моновалентних CD-20-з′єднувальних біспецифічних антитіл, що слабо впливає на індукцію опосередкованого CDC знищення клітин. Фігура 44. Знищення клітин А431, індуковане біспецифічними антитілами HER2 × HER2, попередньо інкубованими з анти-каппа-ЕТА". Життєздатність клітин А431 після 3-денної інкубації з антитілами HER2, попередньо інкубованими з анти-каппа-ЕТА". Життєздатність клітин оцінюють кількісно з використанням Alamarblue. Наведені дані представляють інтенсивність флуоресценції (FI) в одному експерименті із клітинами А431, обробленими антитілами HER2 і біспецифічними антитілами HER2 × HER2, кон′югованими з анти-каппа-ЕТА". Як позитивний контроль використовують стауроспорин, у той час як ізотипові контрольні антитіла використовують як негативний контроль. 7 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 45. Біспецифічні молекули HER2 × HER2 індукують редукуючу модуляцію рецептора HER2. Відносний відсоток рівнів експресії HER2 у лізатах клітин AU565 після 3-денної інкубації з 10 мкг/мл mAb. Кількість HER2 визначають із використанням ELISA зі специфічним захопленням HER2 і відображають як інгібування у відсотках у порівнянні з необробленими клітинами. Наведені дані є середніми із двох експериментів плюс стандартне відхилення. Фігура 46. Аналіз спільної локалізації біспецифічних антитіл HER2 × HER2 (FITC) з лізосомним маркером LAMP1 (Cy5). Графік піксельної інтенсивності FITC перекривався з Cy5 для різних моноспецифічних антитіл HER2 і біспецифічних антитіл HER2 × HER2, (Фігура 46(В)). На графіку відображені FITC піксельні інтенсивності в LAMP1/Cy 5-позитивних пікселях для кожного випробовуваного антитіла, отримані на трьох різних зображеннях. Моноспецифічні показують менші FITC піксельні інтенсивності в LAMP1/Cy 5-позитивних пікселях у порівнянні з біспецифічними. На Фіг. 46(В) представлена середня величина піксельної інтенсивності FITC на LAMP1/Cy 5-позитивних пікселях, обчислена із трьох різних зображень. Разом такі результати показують, що після інтерналізації на LAMP1/Cy5-позитивних везикулах локалізуються більш високі рівні біспецифічних антитіл у порівнянні з моноспецифічними антитілами. Фігура 47. Інгібування проліферації моно- і біспецифічними антитілами HER2. Клітини AU565 висівають у безсироваткове культуральне середовище в присутності 10 мкг/мл антитіл HER2 або біспецифічних антитіл HER2 × HER2. Через три доби за допомогою Alamarblue визначають кількість життєздатних клітин, і життєздатність клітин представляють у вигляді відсотка відносно необроблених клітин. Ізотипові контрольні антитіла використовують як негативний контроль. Наведені дані представляють відсоток життєздатних клітин AU565 у порівнянні з необробленими клітинами, визначений п'ять разів + стандартне відхилення. * показує, що відображена тільки одна точка. Фігура 48. Зв'язування моно- і біспецифічних антитіл IgG1 і IgG1 з видаленою шарнірною ділянкою з людським і мишачим FcRn при різних рН. Планшети з людським і мишачим FcRn інкубують з молекулами різних моно- і біспецифічних антитіл IgG1 або IgG1 з видаленою шарнірною ділянкою. Зв'язування з FcRn аналізують ELISA при 405 нм. (А) Зв'язування молекул моно- і біспецифічних антитіл IgG1 і IgG1 з видаленою шарнірною ділянкою (Uni-G1) з людським FcRn при рН 7,4 і 6,0. Зв'язування з людським FcRn дуже слабке при нейтральному рН. При рН 6,0 (біспецифічні) антитіла ефективно зв'язуються з людським FcRn, якщо вони не містять мутацію Н435А. Молекули IgG1 з видаленою шарнірною ділянкою (Uni-G1) зв'язуються з людським FcRn з низькою ефективністю. (В) Зв'язування молекул моно- і біспецифічних антитіл IgG1 і IgG1 з видаленою шарнірною ділянкою (Uni-G1) з мишачим FcRn при рН 7,4 і 6,0. Зв'язування з мишачим FcRn дуже слабке при нейтральному рН. При рН 6,0 (біспецифічні) антитіла ефективно зв'язуються з мишачим FcRn, якщо вони не містять мутацію Н435А в обох Fab-фрагментах. Біспецифічна молекула, яка містить мутацію Н435А тільки в одному Fabфрагменті, ще здатна зв'язувати мишачий FcRn. Молекули IgG1 з видаленою шарнірною ділянкою (Uni-G1) зв'язуються з мишачим FcRn із проміжною ефективністю, і біспецифічна молекула IgG1 з видаленою шарнірною ділянкою (Uni-G1), що містить мутацію Н435А тільки в одному Fab-фрагменті, є дещо менш ефективною. Фігура 49. Опосередкована Т-клітинами цитотоксичність клітин AU565, індукована біспецифічними антитілами Her2 × CD3, а також мутантами N297Q біспецифічних антитіл Her2 × CD3 Докладний опис винаходу Визначення Термін "імуноглобулін" відноситься до класу структурно споріднених глікопротеїнів поліпептидних ланцюгів, які складаються із двох пар – однієї пари легких (L) низькомолекулярних ланцюгів і однієї пари важких (Н) ланцюгів, і всі чотири з'єднані між собою дисульфідними зв'язками. Структура імуноглобулінів добре охарактеризована. Див., наприклад, Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul W., ed., 2nd ed., Raven Press, N.Y. (1989)). Коротко, кожний важкий ланцюг, як правило, складається з варіабельної ділянки важкого ланцюга (у даному випадку скорочено VH) і константної ділянки важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга, як правило, складається із трьох доменів СН1, СН2 і СН3. Важкі ланцюги з'єднуються між собою дисульфідними зв'язками в так званій "шарнірній ділянці". Кожний легкий ланцюг як правило складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга (у даному випадку скорочено VL) і константної ділянки легкого ланцюга. Константна ділянка легкого ланцюга, як правило, складається з одного домена CL. Як правило, нумерацію амінокислотних залишків у константній ділянці виконують згідно EU-індексу, як описано в Kabat et al., Sciences of Proteins of th Immunological Interest, 5 Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Фігура 16 дає загальне уявлення про нумерацію EU і Кабат для різних за ізотипом форм 8 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла 2F8 (WO 02/100348). Ділянки VH і VL також можуть бути підрозділені на ділянки гіперваріабельності (або гіперваріабельні ділянки, які можуть бути гіперваріабельними за послідовністю й/або за формою структурно визначених петель), які також називаються ділянками, які визначають комплементарність (CDR), що чергуються з ділянками, які є більш консервативними, і які називаються каркасними ділянками (FR). Кожний VH і VL, як правило, складається із трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (див. також Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)). Термін "Fab-фрагмент", який використовується у даному описі, відноситься до однієї пари важкий ланцюг – легкий ланцюг. Термін "Fc-ділянка", який використовується у даному описі, відноситься до ділянки антитіла, яка включає, щонайменше, шарнірну ділянку, домен СН2 і домен СН3. Термін "антитіло" (Ab) у контексті даного винаходу відноситься до молекули імуноглобуліну, фрагменту молекули імуноглобуліну або його будь-якому похідному, яке має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном за типових фізіологічних умов з часом на півжиття, який становить істотний період часу, такий як, щонайменше, приблизно 30 хв., щонайменше, приблизно 45 хв., щонайменше, приблизно одну годину, щонайменше, приблизно дві години, щонайменше, приблизно чотири години, щонайменше, приблизно 8 годин, щонайменше, приблизно 12 годин, приблизно 24 години або більше, приблизно 48 годин або більше, приблизно 3, 4, 5, 5, 7 або більше доби тощо, або в будь-який інший релевантний функціонально визначений період (такий як час, достатній для індукції, промоторування, посилення й/або модуляції фізіологічної реакції, зв'язаної зі зв'язуванням антитіла з антигеном, і/або час, достатній для здійснення ефекторної активності антитіла). Варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів молекули імуноглобуліну містять зв′язуючий домен, який взаємодіє з антигеном. Константні ділянки антитіл (Ab) можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (такі як ефекторні клітини) і компонента системи комплементу, такі як C1q – перший компонент у класичному шляху активації комплементу. Антитіло також може бути біспецифічне антитіло, диантитіло або подібну молекулу. Термін "біспецифічне антитіло", який відноситься до антитіл з специфічністю у відношенні, щонайменше, двох різних епітопів, як правило епітопів, які не перекриваються. Як зазначено вище, термін "антитіло" у даному описі, якщо не зазначене або чітко не випливає з контексту іншого, включає фрагменти антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном. Такі фрагменти можуть бути отримані будь-яким відомим методом, таким як ферментативне розщеплення, пептидний синтез і рекомбінантні методи синтезу. Показано, що антигензв′язуюча функція може бути виконана фрагментами повнорозмірного антитіла, наприклад, фрагментом F(ab")2. Також слід мати на увазі, що термін "антитіло", якщо не зазначене інше, також охоплює поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (mАb), антитілоподібні поліпептиди, такі як химерні антитіла й гуманізовані антитіла. Отримане антитіло може мати будь-який ізотипом. Термін "повнорозмірне антитіло", використовуваний у даному описі, відноситься до антитіла, яке містить усі константні й варіабельні домени важкого та легкого ланцюгів, які звичайно виявляють в антитілі зазначеного ізотипа. Термін "ізотип", коли використовується в даному описі, відноситься до класу імуноглобулінів (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, Igd, IgА, Ige або Igm), який кодований генами константної ділянки важкому ланцюга. Передбачається, що термін "людське антитіло", використовуваний у даному описі, включає антитіла, що мають варіабельні й константні ділянки, утворені з послідовностей імуноглобулінів людської зародкової лінії. Людські антитіла за винаходом можуть включати амінокислотні залишки, не кодовані послідовностями імуноглобулінів людської зародкової лінії (наприклад, мутації, уведені неспецифічним або сайтнаправленим мутагенезом in vitro, або соматичну мутацію in vivo). Однак термін "людське антитіло", використовуваний у даному описі, не припускає включення антитіл, у яких послідовності CDR, отримані із зародкової лінії іншого виду ссавців, такого як миша, щеплені на людські послідовності кістяка. Термін "важколанцюгове антитіло", коли використовується в даному описі, відноситься до антитіла, яке складається тільки із двох важких ланцюгів і позбавлене легких ланцюгів, що звичайно виявляються в антитілах. Важколанцюгові антитіла, які зустрічаються в природі, наприклад, у камелід, можуть зв'язувати антигени, незважаючи на наявність тільки Vh-доменів. Термін "епітоп" позначає білкову детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з антитілом. Епітопи звичайно складаються з молекул, що групуються на поверхні, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукрів, і звичайно мають специфічні тривимірні характеристики, а також 9 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічні зарядні характеристики. Конформаційні та неконформаційні епітопи різняться в тому, що зв'язування з першими, але не з останніми, втрачається в присутності денатуруючих розчинників. Епітоп може включати амінокислотні залишки, безпосередньо залучені у зв'язування (які також називають імунодомінантним компонентом епітопа), і інші амінокислотні залишки, які не залучені безпосередньо у зв'язування, такі як амінокислотні залишки, які ефективно блоковані специфічним антигензв′язуючим пептидом (іншими словами, амінокислотний залишок перебуває усередині сліду специфічного антигензв′язуючого пептиду). Термін "зв'язування", коли використовується в даному описі в контексті зв'язування антитіла з попередньо встановленим антигеном, як правило відноситься до зв'язування з афінністю, що відповідає KD приблизно 10-6 М або менш, наприклад, 10-7 М або менш, такий як приблизно 108 або менш, такий як приблизно 10-9 М або менш, або приблизно 10-10 М або навіть менше, при визначенні, наприклад, технологією поверхневого плазмонного резонансу (SPR) на приладі Biacore 3000 з використанням антигену як ліганда й антитіла як аналіта, і зв'язування з попередньо встановленим антигеном з афінністю, що відповідає KD, яка, щонайменше, вдесятеро менше, настільки як, наприклад, в 100 раз менше, наприклад, щонайменше, в 1000 раз менше, настільки як, наприклад, в 10000 раз менше, наприклад, щонайменше, в 100000 раз менше, ніж його афінність у випадку зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, BSA, казеїном) іншим, ніж попередньо встановлений антиген або близькоспоріднений антиген. Величина, на яку афінність менше, залежить від KD антитіла, так що коли KD антитіла дуже низька (тобто, антитіло є високоспецифічним), тоді величина, на яку афінність до антигену менше, ніж афінність до неспецифічного антигену, може становити, щонайменше, 10000 раз. Термін "KD" (М), використовуваний у даному описі, відноситься до константи рівноваги дисоціації певної взаємодії антитіло-антиген. Термін "гетеродимерна взаємодія між першою і другою СН3-ділянками", коли використовується в даному описі, відноситься до взаємодії між першою СН3-ділянкою та другою СН3-ділянкою в гетеродимерному білку з першою СН3/другою СН3. Термін "гетеродимерні взаємодії першої та другої СН3-ділянок", коли використовується в даному описі, відноситься до взаємодії між першою СН3-ділянкою та іншою першою СН3ділянкою в гомодимерному білку з першою СН3/першою СН3 і взаємодії між другою СН3ділянкою та іншою другою СН3-ділянкою в гомодимерному білку із другою СН3/другою СН3. Термін "ізольоване антитіло", використовуваний у даному описі, означає, що матеріал вилучений з його початкового навколишнього середовища (наприклад, природного навколишнього середовища, якщо воно зустрічається в природі, або клітини-хазяїна, якщо воно є експресованим рекомбінантно). Також вигідно, коли антитіла перебувають в очищеній формі. Термін "очищений" не вимагає абсолютної чистоти; швидше передбачається, що це відносне визначення, що вказує на зростання концентрації антитіла відносно концентрації домішок у композиції при порівнянні з вихідним матеріалом. Передбачається, що термін "клітина-хазяїн", використовуваний у даному описі, відноситься до клітини, у яку введений експресуючий вектор, наприклад, експресуючий вектор, що кодує антитіло запропоноване винаходом. Рекомбінантні клітини-хазяї включають, наприклад, трансфектоми, такі як клітини СНО, клітини НЕК293, клітини NS/0 і лімфоцити. Коли використовується в даному описі, термін "коекспресія" двох або більшого числа нуклеотидних конструкцій відноситься до експресії двох конструкцій в одній хазяїн^-хазяїнухазяїнові-клітині-хазяїні. Термін "білок пухлинної клітини" відноситься до білка, локалізованого на клітинній поверхні пухлинної клітини. Термін "ефекторна клітина", використовуваний у даному описі, відноситься до імунної клітини, яка залучена в ефекторну фазу імунної реакції на противагу когнітивної й активаційної фазам імунної реакції. Приклади імунної клітини включають клітину мієлоїдного або лімфоїдного походження, наприклад, лімфоцити (такі як В-клітини й Т-клітини, включаючи цитотоксичні Т-клітини (CTL)), клітини-кілери, природні клітини-кілери, макрофаги, моноцити, еозинофіли, поліморфоядерні клітини, такі як нейтрофіли, гранулоцити, гладкі клітини й базофіли. Деякі ефекторні клітини експресують специфічні Fc-рецептори й виконують специфічні імунні функції. У деяких втіленнях ефекторна клітина здатна індукувати антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC), така як природна клітина-кілер, здатна індукувати ADCC. У деяких втіленнях ефекторна клітина може здійснювати фагоцитоз антигенумішені або мішень^-мішені-клітинки-мішені. Термін "умови відновлення" або « навколишнє середовище, що відновлює, » відноситься до умови або навколишнього середовища, у якому субстрат, де цистеїновий залишок у шарнірній області антитіла, імовірніше стає відновленим, ніж окисненим. 10 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "ізомеризація дисульфідного зв'язку" відноситься до обміну дисульфідними зв'язками між різними цистеїнами, тобто, зрушенню дисульфідних зв'язків. Інші аспекти та втілення винаходу Як описано вище, у першому аспекті винахід відноситься до способу отримання in vitro гетеродимерного білка, причому зазначений спосіб передбачає наступні стадії: а) надання першого гомодимерного білка, який включає Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена Fc-ділянка включає першу СН3-ділянку, b) надання другого гомодимерного білка, який включає Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена Fc-ділянка включає другу СН3-ділянку, при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок є різними й такі, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СН3-ділянок, с) інкубація зазначеного першого білка разом із зазначеним другим білком за умов відновлення, достатніх для того, щоб дати можливість цистеїнам у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідного зв'язку, і d) отримання зазначеного гетеродимерного білка. Біспецифічний формат можна використовувати в багатьох способах отримання потрібних комбінацій біспецифічних антитіл. Крім можливості комбінування антитіл, селективно націлених на різні антигени, його можна використовувати для зміни потрібної властивості, наприклад, для підвищення CDC, шляхом комбінування двох різних антитіл, націлених на той самий антиген. Крім того, його можна використовувати для видалення часткової агоністичної активності антагоністичного антитіла або перетворення агоністичного антитіла в антагоністичне антитіло шляхом отримання його біспецифічного антитіла з нерелевантним (неактивним) антитілом. В одному втіленні гомодимерні білки вибирають із групи, що включає (i) Fc-ділянку, (ii) антитіло, (iii) злитий білок, що включає Fc-ділянку, таку як Fc-ділянка, злиту з рецептором, цитокіном або гормоном, і (iv) Fc-ділянка, кон′югована із проліками, пептидом, лікарським засобом або токсином. У деяких втіленнях зазначені перший і/або другий гомодимерний білок включає, крім Fcділянки, один або декілька або всі інші ділянки антитіла, тобто, СН 1-ділянка, VН-ділянка, Clділянка й/або Vl-ділянка. Так, в одному втіленні зазначений перший гомодимерний білок є повнорозмірним антитілом. В іншому втіленні зазначений другий гомодимерний білок є повнорозмірним антитілом. У важливому втіленні зазначені перший і другий гомодимерні білки обидва є антитілами, бажано, повнорозмірними антитілами, і зв'язують різні епітопи. У такому втіленні отриманий гетеродимерний білок є біспецифічним антитілом. Зазначені епітопи можуть бути локалізовані на різних антигенах або на тому самому антигені. Однак в інших втіленнях тільки один з гомодимерних білків є повнорозмірним антитілом, а інший гомодимерний білок не є повнорозмірним антитілом, наприклад, Fc-ділянкою без варіабельної ділянки, експресованим разом з іншим білком або пептидною послідовністю, подібної до рецептора, цитокіну або гормону, або кон′югованим із проліками, лікарським засобом або токсином. В іншому втіленні жоден з гомодимерних білків не є повнорозмірним антитілом. Наприклад, обидва гомодимерних білки можуть бути Fc-ділянкам, злитими з іншим білком або пептидною послідовністю, подібної до рецептора, цитокіну або гормону, або кон′юговані із проліками, лікарським засобом або токсином. В одному втіленні Fc-ділянка першого гомодимерного білка є ділянкою ізотипа, обраного із групи, яка включає IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4, і Fc-ділянка другого гомодимерного білка з ізотипа, обраного із групи, що включає IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4. У кращому втіленні Fc-ділянки обох зазначених першого й другого гомодимерних білків є ділянками ізотипа IgG1. В іншому кращому втіленні одна з Fc-ділянок зазначених гомодимерних білків є ділянкою ізотипа IgG1, а інша ізотипа IgG4. В останньому втіленні отриманий гетеродимер включає Fc-ділянку ізотипа IgG1 і Fc-ділянку ізотипа IgG4, і таким чином, може мати проміжні властивості, що представляють інтерес, відносно активації ефекторних функцій. Подібний продукт можна одержати, якщо зазначений перший і/або зазначений другий гомодимерний білок включає мутацію, що видаляє акцепторний сайт для Asn-зв'язаного глікозилювання, або оброблений інакше для зміни властивостей глікозилювання. В іншому втіленні один або обидва гомодимерних білки піддають глікоінженерії для відновлення фукози й у такий спосіб підсилюють ADCC, наприклад, шляхом додавання сполук до культурального середовища під час продукування антитіл, як описано в US2009317869, або як описано в van Berket et al. (2010), Biotechnol. Bioeng., 105: 350, або з використанням нокаутованих FUTB клітин, наприклад, як описано в Yamane-Ohnuki et al. (2004), Biotechnol. 11 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Bioeng., 87: 614. З іншого боку, ADCC можна оптимізувати за допомогою способу, описаного в Umaña et al (1999), Nature Biotech., 17: 176. В іншому втіленні один або обидва гомодимерних білки конструюють так, щоб підсилити активацію комплементу, як це описано в Natsume et al (2009) Cancer Sci. 100:2411. В іншому втіленні один або обидва гомодимерних білки піддають методам інженерії для зменшення або посилення зв'язування з неонатальним Fc-рецептором (FcRn) для того, щоб маніпулювати часом напівжиття в сироватці гетеродимерного білка. В іншому втіленні один або обидва гомодимерних білки піддають методам інженерії для незв'язування з білком А, причому в такий спосіб створюється можливість відділення гетеродимерного білка від зазначеного гомодимерного вихідного білка шляхом пропущення продукту через колонку з білком А. Зокрема, це може бути застосовне для втілень, у яких використовують надлишок одного гомодимерного білка відносно іншого гомодимерного білка як вихідного матеріалу. У таких втіленнях може бути придатним створення гомодимерного білка, який перебуває в такому надлишку, що він втрачає свою здатність зв'язувати білок А. Потім після реакції гетеродимеризації гетеродимерний білок можна відокремити від надлишку гомодимерного білка, який не прореагував шляхом пропущення через колонку з білком А. В іншому втіленні один або обидва гомодимерних білки є Fc-ділянкою або повнорозмірним антитілом, яке впізнає нерелевантний епітоп або повнорозмірне антитіло, що містить послідовності, які походять із зародкової лінії, які не зазнали соматичної гіпермутації й не зв'язуються з аутоантигенами. У такому втіленні гетеродимерний білок функціонує як одновалентне антитіло. В іншому втіленні обидва гомодимерних білки включають ту саму важкий ланцюг, але тільки один з гомодимерних білків містить легкий ланцюг, який утворює функціональний антигензв′язуючий активний центр антитіла із зазначеним важким ланцюгом, у той час як інший гомодимерний білок містить нефункціональний легкий ланцюг, який не зв'язує ніякий антиген у комбінації із зазначеним важким ланцюгом. У такому втіленні гетеродимерний білок функціонує як моновалентне антитіло. Такий нефункціональний легкий ланцюг може бути, наприклад, послідовність, що відбувся від зародкової лінії, яка не зазнала соматичної гіпермутації й не зв'язує аутоантигени. Антитіла, використані як гомодимерний вихідний матеріал відповідно до даного винаходу, можна одержати, наприклад, методом гібридом, уперше описаним Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975), або можна одержати методами рекомбінантних ДНК. Моноклональні антитіла також можна виділити з фагової бібліотеки антитіл з використанням методів, описаних, наприклад, в Clackson et al., Nature, 352, 624-628 (1991), і в Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 581-597 (1991). Моноклональні антитіла можна одержати з будь-якого придатного джерела. Так, наприклад, моноклональні антитіла можна одержати з гібридом, отриманих з В-клітин селезінки миші, отриманих від мишей, імунізованих антигеном, що представляють інтерес, наприклад, у вигляді клітин, які експресують антиген на поверхні, або нуклеїнової кислоти, що кодує антиген, що представляє інтерес. Моноклональні антитіла також можна одержати з гібридом, отриманих з клітин, які експресують антитіло імунізованих людей або ссавців, які не відносяться до людини, таких як пацюки, собаки, примати тощо. Антитіла, використані як гомодимерний вихідний матеріал відповідно до даного винаходу, можуть бути, наприклад, химерними або гуманізованими антитілами. В іншому втіленні один або обидва гомодимерних вихідних білка, за винятком будь-яких специфічних мутантів, є людськими антитілами. Людські моноклональні антитіла можна одержувати з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, наприклад, мишей Humab, які несуть частини імунної системи людини, а не системи миші. Миша Humab містить мінілокуси гена імуноглобуліну людини, який кодує неперебудовані послідовності важкого ланцюга (μ і γ) і κ легкого ланцюга імуноглобуліну людини, разом з мутаціями-мішенями, які інактивують ендогенні локуси ланцюга μ і κ (Lonberg N. et al., Nature, 368, 856-859 (1994)). Відповідно, миші проявляють знижену експресію мишачого Igm або κ, і у відповідь на імунізацію, з уведеними трансгенами важкого й легкого ланцюга людини відбувається перемикання класу й соматична мутація з утворенням високоафінних моноклональних людських антитіл IgG, κ (Lonberg N. et al. (1994), цит. вище; огляд в Lonberg N. Handbook of Experimental Pharmacology, 113, 49-101 (1994); Lonberg N. and Huszar D., Intern. Rev. Immunol., Vol. 13, 65-93 (1995), і в Harding F. and Lonberg N., Ann. N.Y. Acad. Sci., 764, 536-546 (1995)). Отримання мишей Humab докладно описане в Taylor L. et al., Nucleic Acids Research., 20, 6287-6295 (1992); Chen J. et al., International Immunology, 5, 647-656 (1993); Tuaillon et al., J. Immunol., 152, 2912-2920 (1994); Taylor L. et al., International Immunology, 6, 579-591 (1994); Fishwild D. et al., Nature Biotechnology, 14, 845-851 (1996). Див. також US 5545806, US 5569825, US 5625126, US 5633425, US 5789650, US 5877397, US 5661016, US 5814318, US 5874299, US 5770429, US 5545807, WO 98/24884, WO 12 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 і WO 01/09187. Спленоцити від таких трансгенних мишей можна використовувати для створення гібридом, які секретують людські моноклональні антитіла, згідно з добре відомими методами. Крім того, людські антитіла запропоновані даним винаходом або антитіла запропоновані даним винаходом інших видів можна ідентифікувати за допомогою технологій дисплейного типу, у тому числі, без обмеження, фагового дисплея, ретровірусного дисплея, рибосомного дисплея, дисплея ссавця, і інших методів, з використанням методів, добре відомих з рівня техніки, і отримані молекули можна піддати додатковому дозріванню, такому як афінне дозрівання, тому що такі методи добре відомі в техніці. В іншому втіленні винаходу антитіло або його частина, наприклад, один або декілька CDR, походять від виду родина верблюжих, див. WO2010001251, або виду хрящових риб, такого як акула-нянька, або є важколанцюговими або доменними антитілами. В одному втіленні способу запропонованого винаходом зазначені перший і другий гомодимерні білки, представлені на стадії а) і b), очищають. В одному втіленні зазначений перший і/або другий гомодимерний білок кон′югований з лікарським засобом, проліками або токсином або містить акцепторну групу для них. Така акцепторна група може бути, наприклад, неприродну амінокислоту. Як описано вище, послідовності першої й другої СН3-ділянок гомодимерних вихідних білків є різними й такі, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожне з гомодимерних взаємодії зазначених першої й другої СН3-ділянок. В одному втіленні підвищена сила гетеродимерної взаємодії в порівнянні з кожним з гомодимерних взаємодій має місце через модифікації СН3 інших, ніж введення ковалентних зв'язків, цистеїнових залишків або заряджених залишків. У деяких втіленнях продукт за винаходом є високостійким і не піддається обміну Fabфрагментами в помірних умовах реакції in vitro або, що важливо, in vivo після введення в організм людини. Так, в одному втіленні гетеродимерна взаємодія між зазначеними першим і другим білками в отриманому гетеродимерному білку така, що обмін Fab-фрагментами може відбуватися при 0,5 мм GSH за умов, описаних у прикладі 13. В іншому втіленні гетеродимерна взаємодія між зазначеними першим і другим білками в отриманому гетеродимерному білку така, що обмін Fab-фрагментами відбувається in vivo у мишей за умов, описаних у прикладі 14. В іншому втіленні гетеродимерна взаємодія між зазначеними першим і другим білками в отриманому гетеродимерному білку сильніша більше ніж у два рази, наприклад, сильніша більше ніж у три рази, наприклад, сильніша більше ніж у п'ять раз ніж найсильніша із двох гомодимерних взаємодій, наприклад, при визначенні таким чином, як описано в прикладі 30. В іншому втіленні послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок такі, що константи дисоціації гетеродимерної взаємодії між зазначеними першим і другим білками в отриманому гетеродимерному білку нижче 0,05 мікромолей, коли аналіз проводять так, як описано в прикладі 30. В іншому втіленні послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок такі, що константи дисоціації обох гомодимерних взаємодій перевищують 0,01 мікромоль, такі як вище 0,05 мікромоль, бажано, від 0,01 до 10 мікромоль, такі як від 0,05 до 10 мікромоль, краще, від 0,01 до 5 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 5 мікромоль, навіть краще, від 0,01 до 1 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 1 мікромоль, від 0,01 до 0,5 або від 0,01 до 0,1, коли аналіз проводять так, як описано в прикладі 21. Втілення, у яких гомодимерні вихідні білки є відносно стійкими, можуть мати перевага в тому, що легше одержати велику кількість вихідного білка й, наприклад, уникнути агрегації або помилкового укладання. У деяких втіленнях стійкий гетеродимерний білок можна одержати з високим виходом з використанням способу запропонованого винаходом на основі двох гомодимерних білків, що містять тільки декілька фактично консервативних асиметричних мутацій у СН3-ділянках. Так, в одному втіленні послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок містять заміни амінокислот у неідентичних позиціях. Амінокислотні заступники можуть бути природними амінокислотами або неприродними амінокислотами. Прикладами неприродних амінокислот є, наприклад, амінокислоти, розкритих в Xie J. and Schultz P. G., Current Opinion in Chemical Biology (2005), 9: 548-554, і Wang Q. et al., Chemistry & Biology (2009), 16: 323-336. В одному втіленні амінокислоти є природними амінокислотами. В одному втіленні зазначений перший гомодимерний білок має не більш однієї заміни амінокислот у СН3-ділянці, і другий гомодимерний білок має не більш однієї заміни амінокислот у СН3-ділянці відносно СН3-ділянок дикого типу. 13 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному втіленні перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 399, 405, 407 і 409, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 399, 405, 407 і 409, і при цьому зазначений перший гомодимерний білок і зазначений другий гомодимерний білок не заміняються в тих самих позиціях. В одному втіленні перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції 366, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 368, 370, 399, 405, 407 і 409. В одному втіленні амінокислоту в позиції 366 вибирають із Arg, Lys, Asn, Gln, Tyr, Glu і Gly. В одному втіленні перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції 368, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 370, 399, 405, 407 і 409. В одному втіленні перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції 370, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 399, 405, 407 і 409. В одному втіленні перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції 399, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 405, 407 і 409. В одному втіленні перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції 405, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 399, 407 і 409. В одному втіленні перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції 407, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 399, 405 і 409. В одному втіленні перший гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 399, 405 і 407. Відповідно, в одному втіленні послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок містять асиметричні мутації, тобто, мутації в різних позиціях у дві СН3-ділянках, наприклад, мутацію в позиції 405 в одному зі СН3-ділянок і мутацію в позиції 409 в іншому СН3-ділянці. В одному втіленні перший гомодимерний білок має амінокислоту в позиції 409 іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, яка складається з позицій 366, 368, 370, 399, 405 і 407. В одному такому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має в позиції 405 амінокислоту іншу, ніж Phe. В іншому такому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має в позиції 405 амінокислоту іншу, ніж Phe, Arg або Gly. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 та іншу амінокислоту, ніж Lys, Leu або Met, у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає в позиції 405 амінокислоту іншу, ніж Phe, і Lys у позиції 409. В іншому такому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 та іншу амінокислоту, ніж Lys, Leu або Met у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає в позиції 405 амінокислоту іншу, ніж Phe, Arg або Gly, і Lys у позиції 409. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 та іншу амінокислоту, ніж Lys, Leu або Met, у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Leu у позиції 405 і Lys у позиції 409. В іншому такому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає в позиції 405 амінокислоту іншу, ніж Phe, Arg або Gly, і Lys у позиції 409. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Leu у позиції 405 і Lys у позиції 409. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок включає Lys у позиції 409, Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Lys у позиції 409, Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405. І в ще одному втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Lys у позиції 370, 14 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Lys у позиції 409, Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок включає Lys у позиції 409 і а) Ile у позиції 350 і Leu у позиції 405 або b) Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Lys у позиції 409 і а) Ile у позиції 350 і Leu у позиції 405 або b) Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Thr у позиції 350, Lys у позиції 370, Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Lys у позиції 409 і а) Ile у позиції 350 і Leuу позиції 405 або b) Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок включає Thr у позиції 350, Lys у позиції 370, Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок включає Ile у позиції 350, Thr у позиції 370, Leu у позиції 405 і Lys у позиції 409. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має амінокислоту іншу, ніж Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr у позиції 407. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val або Trp у позиції 407. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має Gly, Leu, Met, Asn або Trp у позиції 407. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має Tyr у позиції 407 і в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має в позиції 407 амінокислоту іншу, ніж Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr і Lys у позиції 409. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має Tyr у позиції 407 і в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val або Trp у позиції 407 і Lys у позиції 409. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має Tyr у позиції 407 і в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має Gly, Leu, Met, Asn або Trp у позиції 407 і Lys у позиції 409. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має Tyr у позиції 407 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок має в позиції 407 амінокислоту іншу, ніж Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr, і Lys у позиції 409. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має Tyr у позиції 407 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок має Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val або Trp у позиції 407 і Lys у позиції 409. В іншому втіленні зазначений перший гомодимерний білок має Tyr у позиції 407 і Arg у позиції 409, і зазначений другий гомодимерний білок має Gly, Leu, Met, Asn або Trp у позиції 407 і Lys у позиції 409. В одному втіленні перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і другий гомодимерний білок має (i) амінокислоту іншу, ніж Phe, Leu і Met у позиції 368, або (ii) Trp у позиції 370, або (iii) амінокислоту іншу, ніж Asp, Cys, Pro, Glu або Gln у позиції 399. В одному втіленні перший гомодимерний білок має в позиції 409 Arg, Ala, His або Gly, і другий гомодимерний білок має (i) Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val або Trp у позиції 368, або (ii) Trp у позиції 370, або (iii) Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg або Tyr у позиції 399. В одному втіленні перший гомодимерний білок має Arg у позиції 409, і другий гомодимерний білок має (i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val або Trp у позиції 368, або (ii) Trp у позиції 370, або (iii) Phe, His, Lys, Arg або Tyr у позиції 399. Крім вищевказаних замін амінокислот зазначені перший і другий гомодимерні білки можуть містити інші заміни, делеції або вставки амінокислот відносно Fc-послідовностей дикого типу. 15 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У першім втіленні зазначені перша і друга СН3-ділянки, за винятком специфічних мутацій, включають послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1 (IgG1m(a)): SEQ ID NO:1: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK. В іншому втіленні зазначені перша і друга СН3-ділянки, за винятком специфічних мутацій, включають послідовність, представлену в SEQ ID NO: 2 (IgG1m(f)): SEQ ID NO:2: GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK В іншому втіленні зазначені перша і друга СН3-ділянки, за винятком специфічних мутацій, включають послідовність, представлену в SEQ ID NO: 3 (IgG1m(ах)): SEQ ID NO:3: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK В інших втіленнях отримані гомодимерні білки можуть бути антитілом щурів й мишачем антитілом, які краще утворюють пари, як описано в Lindhofer et al. (1995), J. Immunol., 155: 219 (див. вище), або так звані варіанти антитіл виступ-в-комірку, як описано в патенті США 5731168 (див. вище). Однак у деяких випадках останні гомодимерні вихідні білки можуть бути більш важкими для отримання через занадто слабкі гомодимерних взаємодій СН3-СН3. Таким чином, описані в даному описі варіанти з мутаціями в позиціях 350, 370, 405 і 409, можуть бути кращими. Послідовність шарнірної ділянки гомодимерних вихідних білків може змінюватися. Однак при деяких обставинах отриманий гетеродимерний білок може бути більш стійким, якщо шарнірна ділянка не є IgG4-подібною, і бажано є IgG 1-подібною. Так, в одному втіленні ні зазначений перший ні зазначений другий гомодимерний білок не включає послідовність Cys-Pro-Ser-Cys в (коровому) шарнірній ділянці. В іншому втіленні як зазначений перший, так і зазначений другий гомодимерний білок включають послідовність Cys-Pro-Ser-Cys в (коровій) шарнірній ділянці. У багатьох втіленнях, у яких перший і зазначений другий гомодимерні білки є антитілами, зазначені антитіла також включають легкий ланцюг. Як пояснювалося вище, зазначені легкі ланцюги можуть бути різними, тобто, різнитися в послідовності, і кожна утворює функціональний антигензв′язуючий домен тільки з однієї з важких ланцюгів. Однак в іншому втіленні зазначені перший і другий гомодимерні білки є важколанцюговими антитілами, які не мають потреби в легкому ланцюзі для зв'язування антигену, див., наприклад, Hamers-Casterman (1993), Nature, 363: 446. Як описано вище, стадія с) способу запропонованого винаходом включає інкубацію зазначеного першого білка разом із зазначеним другим білком за умов відновлення, достатніх для того, щоб дозволити цистеїнам у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідних зв'язків. Приклади придатних умов приводяться в даному описі. Мінімальні вимоги до цистеїнам у шарнірній ділянці для того, щоб проходити ізомеризацію дисульфідних зв'язків, можуть різнитися залежно від гомодимерних вихідних білків, зокрема, залежно від точної послідовності в шарнірній ділянці. Важливо, що відповідні гомодимерні взаємодії зазначених перших і других СН3-ділянок досить слабкі для того, щоб дозволити цистеїнам у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідних зв'язків у даних умовах. В одному втіленні умови відновлення на стадії с) включають додавання відновника, наприклад, відновника, обраного із групи, що включає 2-меркаптоетиламін (2-МЕА), дитіотреїтол (DTT), дитіоеритреїтол (DTE), глутатіон, трис (2-карбоксиетил)фосфін (ТСЕР), LЦистеїн і бета-меркаптоетанол, бажано, відновник вибирають із групи, що включає 2меркаптоетиламін, дитіотреїтол і трис (2-карбоксиетил)фосфін. В одному втіленні умови відновлення, що дають можливість регульованого обміну Fabфрагментами, описуються в плані необхідного окисно-відновного потенціалу. Трипептид глутатіон (GSH) є основним низькомолекулярним тіолом у клітинах і регулює окисно-відновний стан тіол-дисульфід, яке суттєво для нормальної передачі сигналу окиснення-відновлення in vivo. Динаміка клітинного окисно-відновного балансу досягається підтримкою стану тіолдисульфід відновленого GSH і його окисненої форми GSSG. Величини відбудовного потенціалу можна виміряти як описано в Rost and Rapoport, Nature, 201: 185 (1964), і Aslund et al., J. Biol. Chem., 272: 30780-30786 (1997). Окисно-відновний потенціал Eh, який ураховує стехіометрію два окиснені GSH на GSSG, є кількісним заходом для стану відбудови-окиснюваннявідновлення. Eh обчислюють по рівнянню Нернста Eh=Eo + (RT/nf)ln ([GSSG 16 UA 113146 C2 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (oкис)]/[GSH(відн.)] ). Ео є стандартний потенціал для окисно-відновної пари при певному рН, R є газову постійну, Т є абсолютну температуру, F є постійну Фарадея, і n є число стерпних електронів. Оцінки Eh in vivo для пари GSH/GSSG перебувають в інтервалі від -260 до -200 мВ (Aw T., News Physiol. Sci., 18: 201-204 (2003)). Остаточно диференційовані клітини відповідно до цього зберігають Eh порядку -200 мВ, у той час як клітини, які активно профілюються підтримують більш низький Eh приблизно в -260 мВ. Стандартний окисно-відновний потенціал для DTT рівний -330 мВ (Cleland et al., Biochemistry, 3: 480-482 (1964)). Показано, що ТСЕР відновлює DTT у розчині й, отже, має більш негативний окисно-відновний потенціал, ніж DTT. Однак точна величина не повідомляється. Умови відновлення, що дають можливість регулювати умови обміну Fab-фрагментами, тому можна описати в плані необхідного окисно-відновного потенціалу Eh, який оптимально нижче величини, яка досягається при нормальних умовах у плазмі in vivo, і яка є вищевказаний окисновідновний потенціал, який відновлює дисульфідні зв'язки антитіла крім зв'язків, локалізованих у шарнірній ділянці й залучених в утворення дисульфідних зв'язків між важкими ланцюгами. Так, в іншому втіленні стадію с) виконують за умов відновлення з окисно-відновним потенціалом, що коливаються на рівні нижче -50 мВ, такому як нижче -150 мВ, бажано, нижче 150 і до -600 мВ, такому як від -100 до -500 мВ, краще, від -250 до -450 мВ, такому як від -250 до -400 мВ, навіть краще, від -200 до -300 мВ. В іншому втіленні стадія с) включає інкубацію протягом, щонайменше, 90 хв. за температури, щонайменше, 20ºС у присутності, щонайменше, 25 мм 2-меркаптоетиламіна або в присутності, щонайменше, 0,5 мм детіотреїтолу. Інкубацію можна виконувати при рН від 5 до 8, наприклад, при рН 7,0 або при рН 7,4. В іншому втіленні стадія с) включає відновлення умов для відсутності відновлення й меншого відновлення, наприклад, шляхом видалення відновника, наприклад, шляхом знесолення. У деяких втіленнях спосіб запропонований винаходом дає продукт антитіла, у якому більш 80 %, наприклад, більш 90 %, наприклад, більш 95 %, наприклад, більш 99 % молекул антитіл є потрібними біспецифічними антитілами. Наступна обробка є більш гнучкої й легкою для регулювання в порівнянні зі способами відомого рівня техніки, заснованими на коекспресії. Характер наступної обробки при одержанні біспецифічних антитіл обміном Fabфрагментами за умов відновлення (таких як додавання 2-МЕА), як розкривається в даному описі, робить його досить придатною стратегією для (високопродуктивного) скринінгу численних комбінацій специфічностей для виявлення біспецифічних антитіл. Крім того, in vitro спосіб можна виконати в лабораторії, що дає можливість для більшого регулювання, гнучкості й виходу гетеродимерного білка, ніж це дозволяє коекспресія. Додатковою перевагою такої стратегії є те, що скринінг можна здійснити в кінцевому терапевтичному форматі, усуваючи необхідність конструювання після відбору. Як пояснюється вище, в іншому аспекті спосіб запропонований винаходом можна використовувати для "матричного" скринінгу, тобто, для отримання великої кількості різних комбінацій специфічностей зв'язування на основі двох наборів антитіл, причому один набір має ідентичні перші СН3-ділянки, і інший набір має ідентичні другі СН3-ділянки, при цьому послідовності зазначених перших і других СН3-ділянок є різними й такі, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першими й другими СН3-ділянками сильніше, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених перших і других СН3-ділянок. Таким чином, в одному втіленні винахід відноситься до способу відбору гетеродимерного білка з потрібною властивістю, причому зазначений спосіб передбачає стадії а) надання першого набору гомодимерних білків, які включають Fc-ділянку, при цьому гомодимерні білки мають ідентичні СН3-ділянки, b) надання другого набору гомодимерних білків, які включають Fc-ділянку, при цьому гомодимерні білки мають ідентичні СН3-ділянки, при цьому послідовності зазначених перших і других СН3-ділянок є різними й такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першими й другими СН3-ділянками сильніша, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених перших і других СН3-ділянок, с) інкубації гомодимерних білків із зазначеного першого набору й зазначеного другого набору за умов відновлення, достатніх для можливості для цистеїнів у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідних зв'язків, причому в такий спосіб утворюється набір біспецифічних антитіл, d) необов'язково, повернення до відновлюючих умов е) аналізу отриманого набору гетеродимерних білків на задану потрібну властивість і 17 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 f) відбору гетеродимерного білка з потрібною властивістю. В одному втіленні винахід відноситься до способу відбору біспецифічного антитіла з потрібною властивістю, причому зазначений спосіб передбачає стадії а) надання першого набору гомодимерних антитіл, що включають антитіла з різними варіабельними ділянками, при цьому зазначені антитіла із зазначеного першого набору включають ідентичні СН3-ділянки, b) надання другого набору гомодимерних антитіл, що включають антитіла з різними варіабельними ділянками або ідентичними варіабельними ділянками, при цьому зазначені антитіла із зазначеного другого набору включають ідентичні СН3-ділянки, при цьому послідовності зазначених перших і других СН3-ділянок є різними й такі, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першими й другими СН3-ділянками сильніше, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених перших і других СН3-ділянок, с) інкубації комбінацій антитіл із зазначеного першого набору й зазначеного другого набору за умов відновлення, достатніх для можливості для цистеїнів у шарнірній ділянці проходити ізомеризацію дисульфідних зв'язків, причому в такий спосіб утворюється набір біспецифічних антитіл, d) необов'язково, повернення до відновлюючих умов е) аналізу отриманого набору біспецифічних антитіл на задану потрібну властивість і f) відбору біспецифічного антитіла з потрібною властивістю. В одному втіленні гомодимерні антитіла із другого набору мають різні варіабельні ділянки. В одному втіленні гомодимерні антитіла із другого набору мають ідентичні варіабельні ділянки, але мають різні амінокислотні або структурні варіації поза антигензв′язуючої ділянки. Два набори можна скласти багатьма різними способами як бажане. Так, два набори можна націлити на той самий епітоп або різні епітопи на тому самому антигені. Два набори також можна націлити на різні антигени, і кожний набір може містити антитіла, що зв'язуються з тим самим епітопом або різними епітопами на розглянутому антигені. Крім того, один з наборів або обидва набори можуть містити антитіла, що мають метою різні антигени. В іншому втіленні зазначеною потрібною властивістю є знищення клітин, лізис клітин, інгібування клітинної проліферації або зв'язування із клітинами, які експресують обидва антигени-мішені. Стратегія скринінгу включає дві панелі векторів, що кодують антитіл, з різними специфічностями, де одна панель клонується в кістяк, який здатний брати участь в обміні Fabфрагментами за умов відновлення (таких як додавання 2-МЕА) з кістяками антитіл другої панелі. Наприклад, першу панель клонують у кістяк IgG1-F405L, і другу панель клонують у кістяк IgG 1- ДО409R (про інших можливих комбінаціях кістяків див. також приклади 19, 28, 29, 30, 35, 36, 37, 38 і 39). Кожний член двох панелей векторів, що кодують антитіла потім експресується окремо в невеликому масштабі. Наприклад, вектори, що кодують антитіла, тимчасово трансфікуються в клітини НЕК293 і експресуються в 2, 3-мл культурах в 24-коміркових планшетах. З іншого боку, можна використовувати інші придатні (малого масштабу) системи отримання, відомі в техніку. Потім експресовані антитіла двох панелей антитіл змішують попарно в еквімолярних співвідношеннях як у матриці. Наприклад, окремі антитіла очищають хроматографією з білком А в малому масштабі, і концентрацію антитіл вимірюють поглинанням при довжині хвилі 280 нм. З іншого боку, можна використовувати інші придатні (у малому масштабі) способи очищення або способи визначення концентрації білка, відомі в техніку. В іншому втіленні стадія очищення може бути виключена, якщо на подальші застосування на впливає експресійне середовище. Потім концентрації антитіл нормалізують таким чином, що придатний об'єм містить еквімолярні кількості обох антитіл. Наприклад, панель із 8 антитіл у кістяку з F405L змішують окремо з 8 антитілами в кістяку з ДО409R таким чином, що 64 суміші по 100 мкл містять 80 мкг/мл антитіла А (F405L) і 80 мкг/мл антитіла В (ДО409R). З іншого боку, якщо стратегія містить наступну стадію специфічного очищення біспецифічних антитіл, стадія нормалізації кількостей антитіл може бути виключена. До сумішей антитіл додають придатна кількість відновника й проводять інкубацію протягом придатного періоду часу при рекомендованій температурі. Наприклад, до 100 мкл суміші, що містить 80 мкг/мл антитіла А (F405L) і 80 мкг/мл антитіла В (K409R), додають 25 мкл 125 мм розчину 2-МЕА (кінцева концентрація 25 мм 2-МЕА) і проводять інкубацію протягом ночі при 25ºС. Слідом за цим відновник видаляють із сумішей (які містять тепер біспецифічні антитіла) для промоторування окиснення дисульфідних зв'язків і для того, щоб уникнути впливу відновника в процесі скринінг аналізу. Наприклад, 2-МЕА видаляють, виконуючи буферний обмін 64 сумішей 18 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з використанням 96-коміркових планшетів для знесолення Zeba Spin (Pierce Biotechnology, #89807). З іншого боку, можна використовувати інші придатні способи для видалення відновника, відомі в техніку. Потім біспецифічні антитіла характеризують біохімічно або функціонально для ідентифікації провідних кандидатів. Наприклад, 64 біспецифічних антитіла оцінюють на інгібування проліферації придатних клітинних ліній або зв'язування з придатними клітинними лініями. Ідентифіковані провідні кандидати потім одержують у більшому масштабі й характеризують докладніше. Отримання шляхом коекспресії Гетеродимерні білки запропоновані винаходом також можна одержати коекспресією конструкцій, що кодують перший і другий поліпептиди в одній клітині. Таким чином, у першому аспекті винахід відноситься до способу отримання гетеродимерного білка, причому зазначений спосіб передбачає наступні стадії: а) надання першої нуклеотидної конструкції, що кодує перший поліпептид, що включає першу Fc-ділянку імуноглобуліну, при цьому зазначена перша Fc-ділянка включає першу СН3ділянку, b) надання другий нуклеотидної конструкції, що кодує другий поліпептид, що включає другу Fc-ділянку імуноглобуліну, при цьому зазначена друга Fc-ділянка включає другу СН3-ділянку, при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок є різними й такі, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СН3-ділянок, і при цьому зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, що включає позиції 366, 368, 370, 399, 405 і 407, і/або при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок такі, що константи дисоціації гомодимерних взаємодій кожної зі СН3-ділянок становлять від 0,01 до 10 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 10 мікромоль, краще, від 0,01 до 5 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 5 мікромоль, навіть краще, від 0,01 до 1 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 1 мікромоль, від 0,01 до 0,5 або від 0,01 до 0,1 мікромоль, коли аналізуються так, як описано в прикладі 21, с) коекспресія зазначених першої й другий нуклеотидних конструкцій у клітині-хазяїні й d) отримання зазначеного гетеродимерного білка із клітинної культури. Придатні експресуючі вектори, включаючи промотори, енхансери і т.д. клітини, що й підходять, хазяї для отримання антитіл добре відомі в техніку. Приклади клітин-хазяїв включають дріжджові й бактеріальні клітини й клітини ссавців, такі як клітини СНО або НЕК. В одному втіленні такого способу зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту іншу, ніж Phe, у позиції 405, і/або послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок такі, що константи дисоціації гомодимерних взаємодій кожної зі СН3-ділянок становлять від 0,01 до 10 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 10 мікромоль, краще, від 0,01 до 5 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 5 мікромоль, навіть краще, від 0,01 до 1 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 1 мікромоль, від 0,01 до 0,5 або від 0,01 до 0,1 мікромоль, коли аналізуються так, як описано в прикладі 21. В іншому втіленні такого способу зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту іншу, ніж Phe, у позиції 405, наприклад, іншу ніж Phe, Arg або Gly у позиції 405, або зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту іншу, ніж Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr у позиції 407. У деяких втіленнях зазначені перший і другий поліпептиди є повнорозмірними важкими ланцюгами двох антитіл, які зв'язують різні епітопи (тобто, зазначені перша й друга нуклеотидні конструкції кодують повнорозмірні важкі ланцюги двох антитіл, які зв'язують різні епітопи), і таким чином, гетеродимерний білок є біспецифічним антитілом. Таке біспецифічне антитіло може бути важколанцюгове антитіло, або зазначена клітина-хазяїн також може експресувати одну або декілька нуклеотидних конструкцій, що кодують легкий ланцюг. Якщо з важколанцюговими конструкціями коекспресується тільки одна легколанцюгова конструкція, тоді функціональне біспецифічне антитіло утворюється тільки якщо послідовність легкого ланцюга 19 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 така, що вона може утворювати функціональний антигензв′язуючий домен з кожної з важких ланцюгів. Якщо з важколанцюговими конструкціями коекспресуються дві або більше різних легколанцюгових конструкцій, буде утворюватися кілька продуктів. В інших втіленнях спосіб коекспресії за винаходом включає кожну з інших особливостей, описаних вище в способі in vitro. В іншому аспекті винахід відноситься до експресуючого вектору, що включає першу й другу нуклеотидні конструкції, описані в даному описі вище. У ще одному аспекті винахід відноситься до клітини-хазяїнові, що включає першу й другу нуклеотидні конструкції, описані в даному описі вище. Гетеродимерні білки В іншому аспекті винахід відноситься до гетеродимерному білку, отриманому або який можна одержати способом запропонованим винаходом. Крім того, спосіб запропонований винаходом створює можливість для утворення асиметричних молекул, молекул з різними характеристиками кожного з Fab-фрагментів або кожного зі СН3-доменів або молекул з одмінними модифікаціями в молекулах, наприклад, молекули із заміною(ами) амінокислоти(амінокислот) на неприродну(і) для кон'югації. Такі асиметричні молекули можна одержувати будь-якими придатними комбінаціями. Це також пояснюється нижче деякими необмежувальними прикладами. Біспецифічні антитіла можна використовувати для попереднього націлювання на клітинумішень, що представляє інтерес, у тому числі, але без обмеження, на пухлинну клітину. Попереднє націлювання на клітину-мішень можна використовувати для досліджень із візуалізацією або для цілей імунотерапії. В одному втіленні способу запропонованого винаходом перший Fаb-фрагмент біспецифічної молекули зв'язується з пухлинною клітиною, такий як білок на поверхні пухлинної клітини або вуглевод на поверхні пухлинної клітини, наприклад, одним з білків на поверхні пухлинної клітини, перерахованих у даному описі, і другий Fаb-фрагмент впізнає радіоактивну ефекторну молекулу, у тому числі, але без обмеження, радіоактивну мітку, у комбінації або з'єднану (через хелатор) з пептидом або гаптеном. Прикладом такого міченого радіоактивною міткою пептиду є мічена індієм диетилентриамінпентаоцтова кислота (anti-dpta(In), van Schaijk et al., Clin. Cancer Res., 2005, 11: 7230s-7126s). Іншим прикладом є використання колоїдних часток міченого гаптену, таких як ліпосоми, наночастки полімерних міцел, що містять радіонуклеїди, такі як, наприклад, технецій-99 (Jestin et al., Q J.Nucl. Med. Mol. Imaging, 2007, 51: 51-60). В іншому втіленні використовують іншу пов'язану з гаптеном цитостатичну молекулу, таку як токсин. В іншому втіленні способу запропонованого винаходом перший Fаb-фрагмент біспецифічної молекули глікозильований у позиції N297 (нумерація EU), і другий Fаb-фрагмент біспецифічної молекули є аглікозильованим (неглікозильованим, наприклад, шляхом мутування N297 у мутації Q або А або Е (Bolt S. et al., Eur. J. Immunol., 1993, 23: 403-411)). Асиметричне глікозилювання в Fc-ділянці впливає на антитілозалежну цитотоксичну дію антитіла на клітину (Ha et al., Glycobiology, 2011, April, 5), а також на взаємодію з молекулами з іншими ефекторними функціями, такі як C1q. В іншому втіленні способу запропонованого винаходом перший Fаb-фрагмент біспецифічної молекули взаємодіє з FcRn – неонатальним Fc-рецептором (Roopenian D.C. et al.,Nat. Rev. Immunol., 2007, 7: 715-725), і в другого Fаb-фрагмента погіршене зв'язування з FcRn за рахунок мутації сайту взаємодії з FcRn на молекулах, наприклад, шляхом створення мутації Н435А (Shields R.L. et al., J. Biol. Chem., 2001; Firan M. et al., Int. Immunol., 2001). В іншому втіленні способу запропонованого винаходом перший Fаb-фрагмент біспецифічної молекули взаємодіє зі стафілококовим білком А (білок А, Deisenhofer et al., Biochemistry, 20, 2361-2370 (1981)) і стрептококовим білком G (білок G, Derrick et al., Nature, 359, 752-754 (1992)), часто використовуваними для очищення антитіл, і в другого Fаb-фрагмента біспецифічної молекули погіршена взаємодія з білком А або G. У результаті видалення залишкових кількостей гомодимера з погіршеним зв'язуванням білка А або G після обміну до гетеродимера легко здійснюється шляхом очищення біспецифічних молекул за допомогою білка А або G. В іншому втіленні зв'язування з кожним з Fcγ-рецепторів або FcRn поліпшується або знижується на одному із двох Fаb-фрагментів біспецифічної молекули. В іншому втіленні зв'язування з C1q поліпшується або знижується на одному із двох Fаbфрагментів біспецифічної молекули. В іншому втіленні білок створюють для посилення активації комплементу на одному або двох Fаb-фрагментах молекули. В іншому втіленні кожний з Fаb-фрагментів, що присутні у біспецифічній молекулі, 20 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержують із IgG різних підкласів. В іншому втіленні кожний з Fаb-фрагментів, що присутні у біспецифічній молекулі, містить різні алотипічні мутації (Jefferis & Lefranc, 2009, Mabs, 1: 332-8). В іншому втіленні іншу категорію асиметричних імунотерапевтичних молекул одержують шляхом заміни Fаb одного з Fаb-фрагментів біспецифічної молекули імуноактивним, що стимулюють або інгібуючим цитокіном. Необмежувальними прикладами таких цитокінів є IL-2, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF- α, G-CSF, GM-CSF, IL-10, IL-4, IL-6, IL-13. З іншого боку, у молекули включається фактор (росту) або гормоностимулятор або інгібітор. В іншому втіленні Fаb одного з Fаb-фрагментів заміняють літичним пептидом, тобто, пептидами, які здатні лізувати пухлинні клітини, бактерії, гриби тощо, у тому числі, але без обмеження, антимікробними пептидами, подібними до маганіну, мелітину, цекропіну, KLAKKLAK та його варіантів (Schweizer et al., Eur. J. Pharmacology, 2009, 625: 190-194; Javadpour, J. Med. Chem., 1996, 39: 3107–3113; Marks et al., Cancer Res., 2005, 65: 2373-2377; Rege et al., Cancer Res., 2007, 67: 6368-6375) або катіонними літичними пептидами (технологія CLYP, US2009/0269341). В іншому втіленні один або обидва Fаb Fаb-фрагментів заміняють рецепторами для цитокінів і/або факторів росту, створюючи так звані рецептори-принади, з яких добре відомими ® ® прикладами є енбрел (Enbrel ) (етанерцепт), що направляє на TNF-α, і Vegf-пастку, що направляє на VEGF. Об'єднання таких двох рецепторів-принад в одну молекул показує активність, що перевершує окремі рецептори-принади (Jung, J. Biol. Chem., 2011, 286: 1441014418). В іншому втіленні іншу категорію асиметричних імунотерапевтичних молекул одержують шляхом злиття імуноактивних, що стимулюють або інгібуючих цитокінів з N-кінцем або С-кінцем одного або обох Fаb-фрагментів, що присутні у біспецифічній молекулі. Це може позитивно вплинути на протипухлинну активність біспецифічної молекули. Прикладами таких молекул, однак не обмеженими перерахованим нижче, є IL-2 (Fournier et al., 2011, Int. J. Oncology, doi: 10.3892/ijo.2011.976), IFN-α, IFN-β або IFN-γ (Huan et al., 2007, J.Immunol. 179:6881-6888; Rossie et al., 2009, Blood, 114: 3864-3871), TNF-α. З іншого боку, N-кінцеве або C-кінцеве злиття цитокінів, таких як, наприклад, G-CSF, GM-CSF, IL-10, IL-4, IL-6 або IL-13, може позитивно вплинути на ефекторну функцію молекули антитіла. З іншого боку, у молекули за N-кінцем або С-кінцем включається фактор (росту) або гормоностимулятор або інгібітор. В іншому втіленні підсилити активність молекули може злиття одного або обох Fаbфрагментів за N-кінцем або С-кінцем з літичним пептидом, таким як, наприклад, антимікробні пептиди, подібні маганіну, мелітину, цекропіну, KLAKKLAK і його варіантам (Schweizer et al., Eur. J. Pharmacology, 2009, 625: 190-194; Javadpour, J. Med. Chem., 1996, 39: 3107–3113; Marks et al., Cancer Res., 2005, 65: 2373-2377; Rege et al., Cancer Res., 2007, 67: 6368-6375), або катіонні літичні пептиди (технологія CLYP, US2009/0269341). В іншому втіленні інша категорія асиметричних імунотерапевтичних молекул є моновалентні антитіла, молекули яких взаємодіють із одним Fаb-фрагментом для вибору мішені. У такій молекулі один з Fаb-фрагментів, що присутні у біспецифічній молекулі, спрямований проти обраної молекули-мішені, другий Fаb-фрагмент молекули не містить Fab або не має зв′язуючого/функціонального Fаb, як описано для Metmab (Genetech, WO 96/38557). З іншого боку, можна одержати мономерні Fc-злиті білки, такі як описані для фактора VIII IX (Peters et al., Blood, 2010,115: 2057-2064). З іншого боку, способом запропонованим винаходом можна одержувати комбінації будьяких з вищевказаних асиметричних молекул. У ще одному аспекті винахід відноситься до гетеродимерному білку, що включає перший поліпептид, що включає першу Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена перша Fc-ділянка включає першу СН3-ділянку, і другий поліпептид, що включає другу Fc-ділянку імуноглобуліну, причому зазначена друга Fc-ділянка включає другу СН3-ділянку, при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок відрізняються і є такими, що гетеродимерна взаємодія між зазначеними першою і другою СН3-ділянками є сильнішою, ніж кожна з гомодимерних взаємодій зазначених першої й другої СН3-ділянок, і при цьому зазначений перший гомодимерний білок має в позиції 409 іншу амінокислоту, ніж Lys, Leu або Met, і зазначений другий гомодимерний білок має заміну амінокислоти в позиції, обраній із групи, що включає позиції 366, 368, 370, 399, 405 і 407, і/або при цьому послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок такі, що константи дисоціації гомодимерних взаємодій кожної зі СН3-ділянок становлять від 0,01 до 10 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 10 мікромоль, краще, від 0,01 до 5 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 5 21 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мікромоль, навіть краще, від 0,01 до 1 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 1 мікромоль, від 0,01 до 0,5 або від 0,01 до 0,1 мікромоль, коли аналізуються так, як описано в прикладі 21. В одному втіленні зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту іншу, ніж Phe, у позиції 405, і/або послідовності зазначених першої й другої СН3-ділянок такі, що константи дисоціації гомодимерних взаємодій кожної зі СН3-ділянок становлять від 0,01 до 10 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 10 мікромоль, краще, від 0,01 до 5 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 5 мікромоль, навіть краще, від 0,01 до 1 мікромоль, наприклад, від 0,05 до 1 мікромоль, від 0,01 до 0,5 або від 0,01 до 0,1 мікромоль, коли аналізуються так, як описано в прикладі 21. В іншому втіленні гетеродимерного білка зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту іншу, ніж Phe, у позиції 405, наприклад, іншу ніж Phe, Arg або Gly у позиції 405, або зазначена перша СН3-ділянка має в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка має амінокислоту іншу, ніж Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser або Thr у позиції 407. В інших втіленнях гетеродимерний білок запропонований винаходом включає кожну з інших особливостей, описаних вище для способів отримання. Так, в іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначений перший поліпептид є повнорозмірну важкий ланцюг антитіла, бажано, людського антитіла. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначений другий поліпептид є повнорозмірну важкий ланцюг антитіла, бажано, людського антитіла. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначені перший і другий поліпептиди є повнорозмірними важкими ланцюгами двох антитіл, бажано, двох людських антитіл, які зв'язують різні епітопи, і таким чином, гетеродимерний білок є біспецифічним антитілом. Таке біспецифічне антитіло може бути важколанцюгове антитіло, або антитіло, яке крім важких ланцюгів включає два повнорозмірні легкі ланцюги, які можуть бути однаковими або різними. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом Fc-ділянка першого поліпептиду з ізотипа, обраного із групи, яка складається з IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4 (за винятком установлених мутацій), і Fc-ділянка другого поліпептиду з ізотипа, обраного із групи, яка складається з IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4 (за винятком установлених мутацій). В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом Fc-ділянки обох зазначеного першого й зазначеного другого поліпептидів є ділянками ізотипа IgG1. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом одна з Fc-ділянок зазначених поліпептидів з ізотипа IgG1 і іншої з ізотипа IgG4. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом підвищена сила гетеродимерної взаємодії в порівнянні з кожним з гомодимерних взаємодій має місце через модифікації СН3 інших, ніж введення ковалентних зв'язків, цистеїнових залишків або заряджених залишків. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом гетеродимерна взаємодія між зазначеними першим і другим поліпептидами в гетеродимерному білку таке, що обмін Fab-фрагментами може відбуватися при 0,5 мм GSH за умов, описаних у прикладі 13. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом гетеродимерна взаємодія між зазначеними першим і другим поліпептидами в отриманому гетеродимерному білку таке, що обміну Fab-фрагментами в мишей in vivo не відбувається за умов, описаних у прикладі 14. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначена перша СН3-ділянка включає Phe у позиції 405 і в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка включає в позиції 405 амінокислоту іншу, ніж Phe, і Lys у позиції 409. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначена перша СН3-ділянка включає Phe у позиції 405 і в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка включає Leu у позиції 405 і Lys у позиції 409. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначена перша СН3-ділянка включає Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначена друга СН3-ділянка включає Leu у позиції 405 і Lys у позиції 409. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначена перша 22 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 СН3-ділянка включає в позиції 409 амінокислоту іншу, ніж Lys, Leu або Met, і зазначена друга СН3-ділянка включає й Lys у позиції 409 і а) Ile у позиції 350 і Leu у позиції 405 або b) Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначена перша СН3-ділянка включає Arg у позиції 409, і зазначена друга СН3-ділянка включає Lys у позиції 409 і а) Ile у позиції 350 і Leu у позиції 405 або b) Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначена перша СН3-ділянка включає Thr у позиції 350, Lys у позиції 370, Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначена друга СН3-ділянка включає Lys у позиції 409 і а) Ile у позиції 350 і Leu у позиції 405 або b) Thr у позиції 370 і Leu у позиції 405. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначена перша СН3-ділянка включає Thr у позиції 350, Lys у позиції 370, Phe у позиції 405 і Arg у позиції 409, і зазначена друга СН3-ділянка включає Ile у позиції 350, Thr у позиції 370, Leu у позиції 405 і Lys у позиції 409. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом ні зазначений перший ні зазначений другий поліпептид не включає послідовність Cys-Pro-Ser-Cys у шарнірній ділянці. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом як зазначений перший, так і зазначений другий поліпептид включає послідовність Cys-Pro-Ser-Cys у шарнірній ділянці. В іншому втіленні гетеродимерного білка запропонованого винаходом зазначений перший і/або зазначений другий поліпептид включає мутацію, що видаляє акцепторний сайт для Asnзв'язаного глікозилювання. Антигени-Мішені Як пояснювалося вище, у важливому втіленні винаходу гетеродимерний білок є біспецифічним антитілом, що включає дві варіабельні ділянки, які різняться по специфічності зв'язування, тобто, зв'язують різні епітопи. У принципі можлива будь-яка комбінація специфічностей. Як вказувалося вище, біспецифічні антитіла потенційно можна використовувати для подолання деяких обмежень моноспецифічних антитіл. Одним з можливих обмежень моноспецифічних антитіл є втрата специфічності відносно потрібних клітин-мішеней через експресію антигену-мішені на інших типах клітин, з якими зв'язування антитіл небажане. Наприклад, антиген-мішень, гіперекспресований на пухлинних клітинах, також може експресуватися на здорових тканинах, що може привести до небажаного побічного дії після обробки антитілами, спрямованими проти такого антигену. Біспецифічне антитіло з додатковою специфічністю проти білка, який експресується винятково на типі клітини-мішені, потенційно може поліпшити специфічне зв'язування з пухлинними клітинами. Так, в одному втіленні винаходу зазначені перший і другий епітопи локалізовані на одній і тій же клітині, наприклад, пухлинній клітині. Придатні мішені на пухлинних клітинах включають, але не обмежуються зазначенням, що випливає: erbВ1 (EGFR), erbВ2 (HER2), erbВ3, erbВ4, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, білок оболонки HERV, периостин, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFRviii, L1-CAM, AXL, тканевий фактор (TF), CD74, Epcam і MRP3. Можливі комбінації мішеней пухлинних клітин включають, але не обмежуються зазначеним, erbВ1+erbВ2, erbВ2+erbВ3, erbВ1+erbВ3, CD19+CD20, CD38+CD34, CD4+CXCR5, CD38+RANKL, CD38+CXCR4, CD20+CXCR4, CD20+CCR7, CD20+CXCR5, CD20+RANKL, erbВ2+AXL, erbВ1+cМet, erbВ2+c-Met, erbВ2+Epcam, c-Met+AXL, c-Met+TF, CD38+CD20, CD38+CD138. В іншому втіленні зазначені перший і другий епітопи можуть бути локалізовані на тому самому антигені, при цьому місце розташування двох епітопів на антигені-мішені таке, що зв'язування антитіла з одним епітопом не перешкоджає зв'язуванню антитіла з іншим епітопом. В іншому такому втіленні зазначені перший і другий гомодимерні білки є антитілами, які зв'язуються із двома різними епітопами, локалізованими на тому самому антигені-мішені, але мають різний тип дії для знищення клітини-мішені, наприклад, пухлинної клітини. Наприклад, в одному втіленні антиген-мішень є erbВ2 (HER2), і біспецифічне антитіло поєднує антигензв′язуючі сайти пертузумаба й трастузумаба. В іншому втіленні антиген-мішень є erbВ1 (EGFR), і біспецифічне антитіло поєднує антигензв′язуючі сайти залутумумаба й нимотузумаба. Біспецифічні антитіла також можна використовувати як медіатори для перенацілювання ефекторних механізмів на тканині, пов'язані із захворюванням, наприклад, пухлини. Так, в іншому втіленні зазначений перший або зазначений другий епітоп локалізований на пухлинній клітині, наприклад, у білку пухлинної клітини або вуглеводі пухлинної клітини, і інший епітоп локалізований на ефекторної клітині. 23 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному втіленні ефекторна клітина є Т-клітиною. Можливі мішені на ефекторних клітинах включають наступне: Fcgammari (CD64), експресований на моноцитах і макрофагах і активованих нейтрофілах; Fcgammariii (CD16), експресований на природному кілерові й макрофагах; CD3, експресований на циркулюючих аклітинах; CD89, експресований на PMN (поліморфонуклеарні нейтрофіли), еозинофілах, моноцитах і макрофагах; CD32а, експресований на макрофагах, нейтрофілах, еозинофілах; Fcεri, експресований на базофілах і гладких клітинах. В одному втіленні епітоп локалізований на CD3, експресованому на Т-клітинах. В іншому втіленні перше антитіло має специфічність зв'язування відносно патогенного мікроорганізму, і друге антитіло має специфічність зв'язування відносно білка ефекторної клітини, такого як CD3, CD4, CD8, CD40, CD25, CD28, CD16, CD89, CD32, CD64, Fcεri або CD1. Крім того, біспецифічні антитіла можна використовувати для націлювання хіміотерапевтичного засобу специфічно на клітини, на які засіб повинний діяти. Так, в одному втіленні один з гомодимерних білків є антитіло, яке впізнає невелику молекулу або пептид або здатне утворювати ковалентний зв'язок з такою молекулою, наприклад, згідно із принципом, описаним в Rader et al., (2003), PNAS, 100: 5396. В іншому втіленні способу запропонованого винаходом перше антитіло має специфічність зв'язування у відношенні (тобто, зв'язується з епітопом на) пухлинної клітини або білка на поверхні клітини, такого як erbВ1, erbВ2, erbВ3, erbВ4, EGFR3viii, CEA, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38, EPCAM, c-Met, AXL, L1-CAM, тканевий фактор, CD74 або CXCR5, і друге антитіло має специфічність зв'язування у відношенні хіміотерапевтичного засобу, такого як токсин (включаючи мічений радіоізотопом пептид), лікарський засіб або проліки. Біспецифічні антитіла також можна використовувати для націлювання на пухлину везикули, наприклад, електронно-щільних везикул, або міні-клітини, що містить токсин, лікарський засіб або проліки. Див., наприклад, Macdiarmid et al. (2009), Nature Biotech., 27: 643. Міні-клітини є ахромосомними клітинами, які є продуктами аберрантного розподілу клітин, які не містять хромосомної ДНК. Так, в іншому втіленні зазначений перший або зазначений другий епітоп локалізований на пухлинній клітині, наприклад, у білку пухлинної клітини або вуглеводі пухлинної клітини, і інший епітоп локалізований на електронно-щільній везикулі або міні-клітині. Крім того, час напівжиття антитіла в кров'яному руслі може бути змінене шляхом включення в біспецифічне антитіло специфічності зв'язування відносно сироваткового білка. Наприклад, час напівжиття можна продовжити шляхом включення в біспецифічне антитіло специфічності зв'язування із сироватковим альбуміном. Так, в іншому втіленні способу запропонованого винаходом перше антитіло має специфічність зв'язування відносно пухлинної клітини або білка пухлинної клітини, такого як erbВ1 (EGFR), erbВ2 (HER2), erbВ3, erbВ4, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, білок оболонки HERV, периостин, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFRviii, L1-CAM, AXL, тканевий фактор (TF), CD74, Epcam або MRP3, CEA, і друге антитіло має специфічність зв'язування відносно білка крові, такого як сироватковий альбумін. Другу специфічність зв'язування також можна використовувати для націлювання антитіла на певну тканину, таку як тканина центральної нервової системи або головного мозку (через гематоенцефалічний бар'єр). Так, в іншому втіленні способу запропонованого винаходом перше антитіло має специфічність зв'язування відносно специфічної мішені в головному мозку, такий як амілоїд-бета (наприклад, для лікування хвороби Альцгеймера), Her-2 (наприклад, для лікування метастазів рака молочної залози в головному мозку), EGFr (наприклад, для лікування первинного раку головного мозку), Nogo A (наприклад, для лікування ушкодження головного мозку), TRAIL (наприклад, для лікування ВІЛ), альфа-синуклеїн (наприклад, для лікування хвороби Паркінсона), Htt (наприклад, для лікування хвороби Гентингтона), пріон (наприклад, для лікування коров'ячого сказу), білок вірусу лихоманки Західного Нила, і друге антитіло має специфічність зв'язування відносно білка гематоенцефалічного бар'єра, такого як трансфериновий рецептор (TfR), інсуліновий рецептор, меланотрансфериновий рецептор (МTfR), лактофериновий рецептор (LfR), рецептор 2 аполіпопротеїну Е (ApoER2), споріднений з LDL-рецептором білок 1 і 2 (LRP1 і LRP2), рецептор для кінцевих продуктів прогресивного глікозилювання (RAGE), рецептор дифтерійного токсину = фактор росту, подібний до гепаринзв′язуючого епідермальному факторові росту (DTR=HB-EGF), gp190 (Abbott et al., Neurobiology of Disease, 37 (2010), 13-25). Специфічність зв'язування відносно білка гематоенцефалічного бар'єра також можна використовувати для іншої мішені-молекули не-антитіла для певної тканини, такий як тканина центральної нервової системи або головного мозку (через гематоенцефалічний бар'єр). Так, в іншому втіленні один з гомодимерних білків є повнорозмірним антитілом зі специфічністю зв'язування відносно білка гематоенцефалічного бар'єра (такого як TfR, інсуліновий рецептор, 24 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 МTfR, LfR, ApoER2, LRP1, LRP2, RAGE, DTR (= HB-EGF) або gp190), і інший гомодимерний білок є Fc-ділянкою, з'єднаний N- або С-кінцем з іншим білком, таким як цитокін, розчинним рецептором або іншим білком, таким як, наприклад, VIP (вазоактивний інтестинальний пептид), BDNF (нейротрофічний фактор з головного мозку), FGF (фактор росту фібробластів), множинні FGF, EGF (епідермальний фактор росту), PNA (пептиднуклеїнова кислота), NGF (фактор росту нервів), нейротрофін (NT)-3, NT 4/5, нейротрофічний фактор гліального походження, війчастий нейротрофічний фактор, нейртурин, нейрегуліни, інтерлейкіни, трансформуючий фактор росту (TGF) альфа, TGF-бета, еритропоетин, фактор росту гепатоцитів, тромбоцитарний фактор росту, артемін, персефін, нетрини, кардіотрофін-1, фактор стовбурових клітин, мідкін, плейотрофін, кісткові морфогенні білки, сапозіни, семафорини, лейкоцитарний інгібуючий фактор, альфа-L-ідуронідаза, ідуронат-2-сульфатаза, N-ацетилгалактозамін-6-сульфатаза, арилсульфатаза В, кисла альфа-глюкозидаза ілісфінгомієліназа (Pardridge, Biopharmaceutical drug targeting to the brain, Journal of Drug Targeting, 2010, 1-11; Pardridge, Re-engineering Biopharmaceuticals for delivery to brain with molecular Trojan horses. Bioconjugate Chemistry, 2008, 19: 1327-1338). Крім того, другу специфічність зв'язування можна використовувати для націлювання факторів згортання крові в певне потрібне місце дії. Наприклад, біспецифічне антитіло з першою специфічністю зв'язування для пухлинної клітини й другою специфічністю зв'язування для фактора згортання крові може направити згортання крові на пухлину й у такий спосіб зупинити ріст пухлини. Так, в іншому втіленні способу запропонованого винаходом перше антитіло має специфічність зв'язування відносно пухлинної клітини або білка пухлинної клітини, такого як erbВ1, erbВ2, erbВ3, erbВ4, MUC-1, CD19, CD20, CD4 або CXCR5, і друге антитіло має специфічність зв'язування відносно білка, задіяного при згортанні крові, такого як тканинний фактор. Зокрема, інші комбінації специфічностей зв'язування, які представляють інтерес, включають CD3+HER2, CD3+CD20, IL-12+IL18, IL-1a+IL-1b, VEGF+EGFR, Epcam+CD3, GD2+CD3, GD3+CD3, HER2+CD64, EGFR+CD64, CD30+CD16, NG2+CD28, HER2+HER3, CD20+CD28, HER2+CD16, Bcl2+CD3, CD19+CD3, CEA+CD3, EGFR+CD3, Ige+CD3, Epha2+CD3, CD33+CD3, MCSP+CD3, PSMA+CD3, TF+CD3, CD19+CD16, CD19+CD16a, CD30+CD16a, CEA+HSG, CD20+HSG, MUC1+HSG, CD20+CD22, HLA-DR+CD79, PDGFR+VEGF, IL17a+IL23, CD32b+CD25, CD20+CD38, HER2+AXL, CD89+HLA class II, CD38+CD138, TF+cМet, Her2+EpCAM, HER2+HER2, EGFR+EGFR, EGFR+c-Met, c-Met + незв′язуючий фрагмент і комбінації рецепторів у комбінації з G-білком. В іншому втіленні біспецифічні антитіла за винаходом можна використовувати для виведення із кровообігу патогенів, патогенних антитіл або шкідливих сполук, таких як отрути й токсини, шляхом націлювання на еритроцити, по суті, так, як описано в Taylor et al., J. Immunol., 158: 842-850 (1997), і в Taylor and Ferguson, J. Hematother., 4: 357-362, 1995. Зазначений перший епітоп локалізується на білку еритроцита (червона клітина крові), у тому числі, але без обмеження, рецепторі 1 еритроцитарного комплементу, і зазначений другий епітоп локалізується на сполуці або організмі, що є мішенню для очищення. В іншому втіленні другий Fab-фрагмент включає злитий білок, що представляє аутоантиген або сайт кон'югації для приєднання аутоантигена, такого як дпДНК. Націлювання на патогени, аутоантитіла або шкідливі сполуки за допомогою біспецифічних антитіл за винаходом з наступним опосередкованим еритроцитами очищенням може мати терапевтичну застосовність при лікуванні різних захворювань і синдромів. Кон'югація В інших втіленнях винаходу перший і/або другий гомодимерний білок з'єднують зі сполукою, обраним із групи, яка складається з токсину (який включає радіоізотоп), проліків або лікарського засобу. Така сполука може вбивати клітини-мішені ефективніше, наприклад, при лікуванні раку. Отриманий гетеродимерний білок є, таким чином, імунокон′югатом. З іншого боку, сполуку можна з'єднати з отриманим гетеродимерним білком, тобто, після того, як відбудеться обмін Fab-фрагментами. Придатні сполуки для утворення імунокон′югатів запропонованих даним винаходом включають таксол, цитохалазин В, граміцидін D, етидію бромід, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксиантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин, антиметаболіти (такі як метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тіогуанин, цитарабін, флударабін, 5-флуороурацил, декарбазин, гідроксисечовину, аспарагіназу, гемцитабін, кладрибін), алкілюючі агенти (такі як мехлоретамін, тіоепу, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (ССNU), 25 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 циклофосфамід, бусульфан, дибромманіт, стрептозотоцин, дакарбазин (DTIC), прокарбазин, мітоміцин С, цисплатин і інші похідні платини, такі як карбоплатин), антибіотики (такі як дактиноміцин (колись актиноміцин), блеоміцин, даунорубіцин (колись дауноміцин), доксорубіцин, ідарубіцин, мітраміцин, мітоміцин, мітоксантрон, плікаміцин, антраміцин (АМС)), дифтерійний токсин і споріднені молекули (такі як дифтерійний ланцюг А і її активні фрагменти й гібридні молекули), токсин рицин (такий як токсин ланцюги рицину А або деглікозильованого рицину А), холерний токсин, Shiga-подібний токсин (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), токсин LT, токсин С3, токсин Shiga, коклюшний токсин, правцевий токсин, соєвий інгібітор Bowman-Birk протеази, екзотоксин Pseudomonas, алорин, сапорин, модекцин, желанін, ланцюг А абріну, ланцюг А модекцину, альфа-сарцин, білки Aleurites fordii, білки dianthin, білки фітолаки американської (PAPI, PAPII і PAP-S), інгібітор momordica charantia, курцин, кротин, інгібітор sapaonaria officinalis, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин і токсини еноміцину. Інші придатні кон′юговані молекули включають рибонуклеазу (Рназа), Дназу I, стафілококовий ентеротоксин А, антивірусний білок фітолакі американської, дифтерійний токсин, ендотоксин Pseudomonas, мейтанзиноїди, ауристатини (ММАЕ, ММАF), аналоги каліхеаміцинів і дуокарміцину (Ducry and Stump, Bioconjugate Chem., 2010, 21: 5-13), долостатин-10, долостатин-15, іринотекан або його активні метаболіти SN38, піролобензодіазепіни (PBD). В іншому втіленні винаходу перший і/або другий гомодимерний білок з'єднують із альфавипромінювачем, включаючи, але не обмежуючись зазначеним, торій-227, радій-223, вісмут-212 і актиній-225. В іншому втіленні винаходу перший і/або другий гомодимерний білок з'єднують із бетавипромінюючим радіонуклідом, включаючи, але не обмежуючись зазначеним, іодим-313, іттрий90, фтор-18, реній-186, галій-68, технецій-99, індій-111 і лютецій-177. В іншому втіленні сполука, яка кон′югує, включає нуклеїнову кислоту або молекулу, асоційовану з нуклеїновою кислотою. В одному такому аспекті даного винаходу кон′югована нуклеїнова кислота є цитотоксичною рибонуклеазою, антизначеннєвою нуклеїновою кислотою, яка інгібує молекулу РНК (наприклад, молекулу іРНК), або імуностимулюючу нуклеїнову кислоту (наприклад, імуностимулюючу молекулу ДНК, що містить мотив Cpg). Можна використовувати будь-який спосіб кон'югації, відомий з рівня техніки, включаючи способи, описані Hunter et al., Nature, 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40, 219 (1981); і Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30, 407 (1982). Кон′югати можна одержати хімічно, кон′югуючи іншу групу з боку N-кінця або С-кінця білка (див., наприклад, Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)). Такі кон′юговані похідні антитіл також можна одержувати шляхом кон'югації внутрішніх залишків або цукрів у відповідному випадку. Речовини можна з'єднувати з білком запропонованим даним винаходом або безпосередньо або побічно. Одним із прикладів непрямого приєднання другої речовини є приєднання за допомогою спейсерної групи. Технології приєднання для лікарських засобів-кон′югатів недавно описані Ducry and Stump (2010), Bioconjugate Chem., 21:5. Композиції та застосування В іншому основному аспекті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що включає гетеродимерний білок запропонований винаходом, описаний у даному описі, і фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичні композиції можна одержати згідно зі звичайними методами, таким як методи, th розкриті в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 Edition, Gennаro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Фармацевтична композиція запропонована даним винаходом може включати, наприклад, розріджувачі, наповнювачі, солі, буфери, детергенти (наприклад, неіоногенний детергент, такий як твін-20 або твін-80), стабілізатори (наприклад, цукри або безбілкові амінокислоти), консерванти, фіксатори тканин, солюбілізатори й/або інші матеріали, що підходять для включення у фармацевтичну композицію. Фармацевтично прийнятні носії включають будь-який і всі придатні розчинники, дисперсні середовища, покриття, антибактеріальні й протигрибкові засоби, засоби, які регулюють ізотонічність, антиоксиданти й засоби, які уповільнюють абсорбцію, і подібні засоби, які фізіологічно сумісні зі сполукою запропонованою даним винаходом. Приклади придатних водних і неводних носіїв, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях запропонованих даним винаходом, включають воду, фізіологічний розчин, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, етанол, декстрозу, поліолі (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь). Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водяні розчини або дисперсії й стерильні порошки для готування перед застосуванням стерильних розчинів або дисперсій для ін'єкції. Відповідну плинність можна зберегти, наприклад, шляхом використання 26 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 матеріалів, що утворюють покриття, таких як лецитин, шляхом підтримки потрібного розміру часток у випадку дисперсії й шляхом використання поверхнево-активних речовин. Фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом також можуть включати фармацевтично прийнятні антиоксиданти, наприклад, (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію тощо; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутильований гідроксианізол, бутильований гідрокситолуол, лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол тощо; і (3) речовини, які утворюють комплекси з металами, такі як лимонна кислота, етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕДТК), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота тощо. Фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом також можуть включати засобу, що регулюють тонічність, такі як цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт, гліцерин, або хлорид натрію в композиціях. Фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом також можуть містити один або декілька ад′ювантів, придатних для способу введення, такі як консерванти, змочувальні речовини, емульгатори, диспергуючі речовини або буфери, які можуть збільшувати період напіввиведення або ефективність фармацевтичної композиції. Сполуки запропоновані даним винаходом можна ввести в препарат з носіями, які будуть захищати сполуку від швидкого вивільнення, такими як композиції з регульованим вивільненням, у тому числі, імпланти, трансдермальні пластирі й мікрокапсульовані системи доставки. Такі носії можуть включати желатин, гліцерилмоностеарат, гліцерилдистеарат, біосумісні полімери здатні до біологічного розкладу, такі як співполімер етилену й вінілацетату, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоефіри й поліоцтова кислота, одні або з воском, або інші матеріали, добре відомі з рівня техніки. Способи отримання таких композицій загалом відомі фахівцям у даній галузі техніки. Стерильні розчини для ін'єкцій можна одержати, включаючи активну сполуку в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, наприклад, перерахованих вище, по необхідності, з наступною стерилізацією мікрофільтрацією. Фактичні рівні дозування активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях можуть змінюватися для того, щоб одержати кількість інгредієнта, яка ефективно для досягнення потрібної терапевтичної реакції в певного пацієнта, композиції й способу введення, що не є токсичним для пацієнта. Обраний рівень дозування буде залежати від різних фармакокінетичних факторів, включаючи активність використовуваної певної композиції запропонованої даним винаходом, спосіб уведення, час уведення, шлях екскреції використовуваного певного сполуки, тривалість лікування, інші лікарські засоби, сполуки й/або матеріали, які використовуються в комбінації з використовуваними певними композиціями, вік, підлогу, масу, загальний стан здоров'я й попередню історію хвороби пацієнта, якого лікують, і фактори, добре відомі в галузі медицини. Фармацевтичну композицію можна вводити будь-яким придатним шляхом і способом. В одному втіленні фармацевтичну композицію запропоновану даним винаходом вводять парентерально. Визначення "вводиться парентерально", яке використовується в даному описі, позначає інші способи введення, ніж ентеральне й місцеве введення, як правило, уведення шляхом ін'єкції, і включає епідермальну, внутрішньовенну, внутрішнм'язову, інтраартеріальну, інтратекальну, інтракапсулярну, інтраорбітальну, інтракардиальну, інтрадермальну, інтраперитонеальну, внутрішньосухожильну, транстрахеальну, підшкірну, субкутикулярну, інтраартикулярну, субкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспинальну, інтракраніальну, інтраторакальну, епідуральну й інтрастернальну ін'єкцію або інфузію. В одному втіленні зазначену фармацевтичну композицію вводять внутрішньовенною або підшкірною ін'єкцією або інфузією. У головному аспекті винахід відноситься до гетеродимерного білку запропонованого винаходом, такого як біспецифічне антитіло запропоноване винаходом, для застосування як лікарського засобу. Гетеродимерний білок запропонований винаходом можна використовувати для ряду цілей. Зокрема, як пояснювалося вище, гетеродимерні білки запропоновані винаходом можна використовувати для лікування різних форм рака, включаючи метастатичний рак і рефракторний рак. Таким чином, в одному аспекті винахід відноситься до способу інгібування росту й/або проліферації й/або способу знищення пухлинної клітини, що включає введення індивідуумові, що бідує в цьому, гетеродимерного білка запропонованого винаходом, описаного вище. В іншому втіленні гетеродимерні білки запропоновані винаходом використовують для лікування імунних і аутоімунних захворювань, запальних захворювань, інфекційних хвороб, серцево-судинних захворювань, хвороб ЦНС і кістково-м'язової системи. 27 UA 113146 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Схеми лікування у вищевказаних способах лікування й застосування регулюються для забезпечення оптимальної бажаної реакції (наприклад, терапевтичної реакції). Наприклад, можна вводити один болюс, можна вводити за часом кілька роздільних доз, або дозу можна пропорційно зменшувати або збільшувати, як вимагає терапевтична ситуація. Ефективні дозування й схеми приймання гетеродимерних білків залежать від захворювання або стану, від якого лікують, і можуть бути встановлені фахівцями в даній галузі техніки. Наприклад, необмежувальний інтервал терапевтично ефективної кількості біспецифічного антитіла запропонованого даним винаходом становить приблизно 0,1-100 мг/кг, такий як приблизно 0,1-50 мг/кг, наприклад, приблизно 0,1-20 мг/кг, такий як 0,1-10 мг/кг, наприклад, приблизно 0,5, приблизно 0,3, приблизно, 1, приблизно 3, приблизно 5 або приблизно 8 мг/кг. Лікар або ветеринар, як фахівці у своїй галузі, можуть легко визначити й установити ефективну необхідну кількість фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар або ветеринар може використовувати початкові дози гетеродимерного білка у фармацевтичній композиції на рівнях нижче необхідного для того, щоб добитися потрібного терапевтичного ефекту, і поступово підвищувати дозу доти, поки не буде досягнутий потрібний ефект. Взагалі придатна добова доза, композиції запропонованої даним винаходом буде такою кількістю сполуки, яка є найменшою ефективною дозою для отримання терапевтичного ефекту. Уведення може бути, наприклад, парентеральним, таким як внутрішньовенне, внутрішньом'язове або підшкірне. Гетеродимерний білок запропонований винаходом також можна вводити профілактично для того, щоб зменшити небезпеку розвитку захворювання, такого як рак, відтермінувати початок виникнення події при розвитку захворювання й/або зменшити небезпеку рецидиву, коли захворювання, таке як рак, перебуває у стадії ремісії. Гетеродимерні білки запропоновані даним винаходом, такі як біспецифічні антитіла, також можна вводити при комбінованій терапії, тобто, у комбінації з іншими терапевтичними засобами, релевантними для захворювання або стану, від якого лікують. Відповідно, в одному втіленні лікарський засіб, який містить гетеродимерний білок, є засобом для комбінації з одним або декількома іншими терапевтичними засобами, такими як цитотоксичні, хіміотерапевтичні або антиангіогенні засоби. Таке комбіноване введення може бути одночасним, роздільним або послідовним. В іншому втіленні даний винахід відноситься до способу лікування або попередження захворювання, такого як рак, який включає введення суб'єктові, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості гетеродимерного білка, такого як біспецифічне антитіло запропоноване даним винаходом, у комбінації із променевою терапією й/або хірургічним лікуванням. Гетеродимерні білки запропоновані даним винаходом, такі як біспецифічні антитіла, також можна використовувати для діагностичних цілей. Приклади Приклад 1. Експресуючі вектори для експресії людських IgG1-2F8 і IgG1-7D8 Клонують VH- і Vl- ділянки, які кодують, Humab 2F8 (WO 02/100348) і Humab 7D8 (WO 04/035607) в експресуючий вектор pcong1f (який містить геномну послідовність константної ділянки алотипу людського IgG1f (Lonza Biologiсs)) для отримання важкого ланцюга людського IgG1 і pconkappa (який містить константну ділянку людського легкого ланцюга каппа, Lonza Biologiсs) для отримання легкого ланцюга каппа. У випадку антитіл IgG4 VН-ділянки вбудовують у вектор ptomg4 (який містить геномну послідовність константної ділянки людського IgG4 у векторі рЕЕ12.4 (Lonza Biologiсs)). З іншого боку, у наступних конструкціях використовують вектори, які містять повністю оптимізовані за кодонами ділянки, які кодують важкий ланцюг (IgG1 або IgG4) у векторі рЕЕ12.4 або людський легкий ланцюг каппа Humab 2F8 або Humab 7D8 у векторі рЕЕ6.4 (Lonza Biologiсs). Приклад 2. Експресуючі вектори для експресії IgG1-2F8 з видаленою шарнірною ділянкою й людського IgG1 і фрагментів СН2-СН3 IgG4, які містять мутації. Для введення мутацій у шарнірну і СН3-ділянки важких ланцюгів антитіла використовують набір для сайтнаправленого мутагенезу Quickchange (Stratagene, La Jolla, CA) згідно з рекомендаціями виробника. З іншого боку, повністю синтезовані конструкції або VН-ділянки клонують у векторі, який вже містить специфічні заміни, які кодують амінокислоти. Конструкції, що кодують фрагменти СН2 і СН3, або конструюють методом ПЛР або синтезують повністю кодоноптимізованими. Такі конструкції мають N-кінцевий сигнальний пептид і мітку His 6 амінокислот і містять амінокислоти 341-447 константної ділянки людського IgG1/4. Конструкції клонують у рЕЕ12.4. Для того, щоб сконструювати молекули IgG1 з видаленою шарнірною ділянкою (Uni-G1), одержують синтетичну конструкцію ДНК, яка кодує формат Uni-G1 для ізотипів людського IgG1 з EGFR-специфічністю. У такій конструкції видалена природна шарнірна ділянка (обумовлена 28

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof

Автори англійською

Labrijn, Aran, Frank, Meesters, Joyce, Bremer, Ewald van den, Neijssen, Joost, J., Berkel, Patrick van, Goeij, Bart de, Vink, Tom, van de Winkel, Jan, Schuurman, Janine, Parren, Paul

Автори російською

Лабрейн Аран Франк, Местерс Йойсе, Бремер Эвалд ван ден, Нейсен Йост Й., Беркел Патрик ван, Гуэй Барт дэ, Винк Том, ван дэ Винкел Ян, Схююрман Янине, Паррен Паул

МПК / Мітки

МПК: C07K 16/46, C07K 16/10, C07K 16/32, C07K 16/28

Мітки: vitro, спосіб, отримання, білка, гетеродимерного

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/114-113146-sposib-otrimannya-in-vitro-geterodimernogo-bilka.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб отримання in vitro гетеродимерного білка</a>

Подібні патенти